Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn xuẫt có hoạt tính sinh học từ pectin phân lập từ cây cúc quỳ Tithonia diversifolia

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

BÙI VŨ THỤC UYÊN

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT CÓ
HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ PECTIN PHÂN LẬP TỪ
CÂY CÚC QUỲ TITHONIA DIVERSIFOLIA

Chu n ng nh H hữu cơ
s
8310630

TÓM TẮT UẬN V N THẠC S H

Đ N ng - Năm 2018

HỌC


Công trình được hoàn thành tại
Trường Đại học Sư Phạm – ĐHĐN

Ngƣời hƣớng dẫn ho học
HD1: TS. GIANG THỊ KIM LIÊN
HD2: TS. TRẦN THỊ THANH THỦY

Phản biện 1: Đặng Quang Vinh
Phản biện 2: Nguyễn Trần Nguyên

Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp

thạc sĩ Khoa học họp tại Đại học Đà Nẵng vào ngày 31 tháng 03
năm 2018.

Có thể tìm hiểu luận văn tại:
- Trung tâm Thông tin- Học liệu, Đại học Đà Nẵng
- Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng


1
MỞ ĐẦU
1. ý do chọn đề t i
Các hợp chất thiên nhiên hiện nay và trong tương lai vẫn luôn
có vai trò vô cùng quan trọng trong việc cung cấp các dược chất mới
hay là những chất dẫn đường để tạo ra các dược chất mới.
Polysaccharide, một trong những thành phần phổ biến trong các loài
thực vật đã được sử dụng từ rất lâu và đóng vai trò quan trọng trong
công nghiệp thực phẩm, hóa mỹ phẩm. Gần đây, các polysaccharide
được quan tâm nhiều trong các ứng dụng y dược học nhờ các hoạt
tính sinh học đặc biệt như hoạt tính chống ung thư, chống tiểu
đường, hạ mỡ máu…Điều đáng nói là các polysaccharide thường thể
hiện các hoạt tính tốt mà không có tác dụng phụ, không gây hại đến
các tế bào bình thường. Do đó, việc tìm kiếm các nguồn
polysaccharide từ thực vật và các dẫn xuất mới có hoạt tính sinh học
hiện đang được phát triển tương đối mạnh.
Với điều kiện tự nhiên nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có một hệ
sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây
thuốc với khoảng 3900 loài đã được sử dụng làm thuốc trong số 12000
loài đã được điều tra. Trong số đó, nhiều loài vẫn còn chưa được
nghiên cứu hoặc chưa được nghiên cứu đầy đủ về thành phần hoá học
cũng như mối liên quan giữa cấu trúc hóa học và tác dụng dược lý của

chúng. Do đó, việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh
học của các cây thuốc nói riêng và cây cỏ nói chung nhằm tìm kiếm
các chất có hoạt tính sinh học có giá trị là rất cần thiết.
Hiện nay, nghiên cứu về polysaccharide nói chung và pectin nói
riêng đang thu hút sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học trên
thế giới. Nhiều công trình về pectin và các dẫn xuất của chúng từ
nhiều loài thực vật khác nhau như chè xanh, lá hồng… đã được công
bố. Các ứng dụng trong y học cổ truyền và các nghiên cứu hiện đại


2
đều cho thấy dịch chiết nước của cúc quỳ có nhiều hoạt tính đáng
chú ý, gợi ý rằng pectin phân lập từ dịch chiết nước của cây này là
đối tượng nghiên cứu hứa hẹn nhiều kết quả triển vọng.Vì vậy việc
nghiên cứu phân lập pectin và tổng hợp các dẫn xuất có hoạt tính
sinh học từ cây cúc quỳ là rất cần thiết, có ý nghĩa khoa học và thực
tiễn. Hơn thế nữa, đây là loài mọc phổ biến ở Tây Nguyên nên nguồn
liệu rất sẵn có và dồi dào. Định hướng ứng dụng nguồn pectin từ cúc
quỳ mở ra khả năng nâng cao giá trị sử dụng của loài thực vật này.
Cúc quỳ (Tithonia diversifolia) họ Cúc (Asteraceae) là một
trong những cây thuốc được sử dụng trong y học cổ truyền Châu Mỹ
để điều trị nhiều bệnh khác nhau như sốt rét, chống u.... Cây có
nguồn gốc từ Mehico hiện nay phân bố rộng khắp trong các khu vực
cận nhiệt đới và nhiệt đới, chẳng hạn như Châu Phi, Trung Mỹ và
Đông Nam Á. Ở Việt Nam, cây cúc quỳ hiện nay đã được tự nhiên
hóa, mọc phổ biến ở rất nhiều nơi, đặc biệt là ở vùng Tây Nguyên.
Các nghiên cứu cho thấy dịch chiết nước của cây cúc quỳ, là dịch
chiết chứa nhiều polysaccharide, cụ thể là pectin, có nhiều hoạt tính
đáng quan tâm. Tuy nhiên, cho đến nay cấu trúc và hoạt tính sinh học
của pectin hiện vẫn chưa được nghiên cứu. Luận văn này tập trung

giải quyết nội dung: “Nghiên cứu tổng hợp một s dẫn xuẫt có
hoạt tính sinh học từ pectin phân lập từ cây cúc quỳ Tithonia
diversifolia”.
2.
ục ti u nghi n cứu
Phân lập pectin đồng thời bán tổng hợp dẫn xuất có hoạt tính
gây độc tế bào từ cây Tithonia diversifolia, là hướng chưa từng được
nghiên cứu nhằm đóng góp vào kho tàng hóa học các hợp chất thiên
nhiên của Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung, tạo cơ sở khoa
học để có thể đề xuất khả năng ứng dụng và khai thác loài này phục
vụ ngành y, dược, thực phẩm chức năng.


3
3. Đ i tƣợng, phạm vi nghi n cứu
Nghiên cứu quy trình phân lập pectin và tổng hợp dẫn xuất
pectinSulfat hoá và Selen hoá.
Các sản phẩm sẽ được chứng minh cấu trúc bằng các phương
pháp phổ IR, MS và NMR, hoạt tính sinh học xác định phương pháp
thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ
(NCI).
4. Nội dung nghi n cứu
4.1. Thu thập tài liệu, thông tin
Thu thập các tài liệu đã công bố trong nước và trên thế giới liên
quan đến cây Cúc quỳ Tithonia diversifolia, qui trình phân lập
pectin, bán tổng hợp dẫn xuất Sulfat, Selen hoá và hoạt tính sinh học
của chúng.
4.2. Tiến hành thực nghiệm
Trên cơ sở so sánh các phương pháp tổng hợp, dựa trên những
khảo sát về các tác nhân, điều kiện và hiệu suất phản ứng với những

điều kiện khả thi về thiết bị, phòng thí nghiệm chúng tôi đã lựa chọn
phương pháp thích hợp để nghiên cứu phân lập pectin, bán tổng hợp
dẫn xuất Sulfat hóa, Selen hoá. Các sản phẩm sẽ được chứng minh
cấu trúc bằng các phương pháp phổ IR, MS và NMR, khảo sát hoạt
tính sinh học. Qua đó lựa chọn được điều kiện và quy trình tối ưu
cho quá trình phân lập pectin, bán tổng hợp dẫn xuất Sulfat, Selen
hoá.
- Thu thập mẫu thực vật và xác định tên khoa học.
- Xử lý mẫu và chiết mẫu thực vật.
- Phân lập và xác định cấu trúc pectin từ dịch chiết.
- Tổng hợp các dẫn xuất Sulfat hóa và Selen hóa của pectin.
- Thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập và
tổng hợp được.


4
5. Ý nghĩ ho học v thực tiễn củ đề t i
Tìm ra các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào trong thành
phần hóa học của cây nghiên cứu, tạo cơ sở cho việc ứng dụng vào
thực tế.
Đóng góp vào kho tàng hóa học các hợp chất thiên nhiên của
Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung.
6. B cục luận văn
Nội dung luận văn chia làm 3 chương.
Mở đầu : (04 trang).
Chương 1: Tổng quan (08 trang).
Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (14 trang).
Chương 3: Kết quả và thảo luận (18 trang).
Kết luận và kiến nghị : 01 trang.
Tài liệu tham khảo: 06 trang, gồm: 56 tài liệu trong đó có 05 tài

liệu tiếng việt, 48 tài liệu tiếng anh và 03 websites.


5
CHƢƠNG 1
TỔNG QU N
1.1. CÂY CÚC QUỲ (TITHONIA DIVERSIFOLIA)
1.1.1. Đặc điểm hình thái
1.1.2. Nguồn g c v phân b
1.1.3. Kh i thác v sử dụng
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC
VỀ PECTIN
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC
VỀ DẪN XUẤT SU F T H
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC
VỀ DẪN XUẤT SELEN HÓA


6
CHƢƠNG 2
NGUYÊN IỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN IỆU
2.2. H
CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.2.1. H chất
2.2.2. Thiết bị
2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phƣơng pháp phân lập chất hữu cơ
2.3.2. Phƣơng pháp bán tổng hợp chất hữu cơ
2.3.3. Phƣơng pháp tinh chế

2.3.4. Phƣơng pháp xác định th nh phần h
học củ
polysaccharide
2.3.5. Phƣơng pháp xác định cấu trúc h học các hợp chất
hữu cơ
2.3.6. Phƣơng pháp hảo sát hoạt tính gâ độc tế b o
2.4. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phân lập v tinh chế pectin
2.4.2. Tổng hợp dẫn xuất Sulf t h từ pectin
2.4.3. Tổng hợp dẫn xuất Selen h từ pectin
2.5. QUY TRÌNH TỔNG HỢP
2.5.1. Phân lập v tinh chế pectin
2.5.2. Qu trình tổng hợp v tinh chế dẫn xuất pectin Sulf t
hóa
2.5.3. Qu trình tổng hợp v tinh chế dẫn xuất Selen h


7
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO UẬN
3.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC PECTIN
3.1.1. Th nh phần củ pectin
Bảng 3.1. Thành phần hóa học của cây cúc quỳ
Độ ẩm (%)

3,74 0,22

Tro (%)

4,98 0,88

Protein (%)

3,32 0,15

Chất béo (%)

1,77 0,32

Đƣờng (% w/w)

85,78 2,15

Bảng 3.2. Th nh phần mono s cch ride (%)
Mannose

3,11 0,15

Glucorunic acid

1,15 0,71

Xylose

3,08 0,37

Galacturonic acid

47,59 0,59

Rhamnose

23,94 0,91

Galactose

3,04 0,11

Glucose

3,29 0,16

Arabinose

11,14 0,91

Fucose

0,57 0,08

Thành phần hóa học của mẫu phân lập từ cây cúc quỳ (TDP)
được thể hiện trong bảng 3.1. Tổng hàm lượng đường trong mẫu
phân lập được từ cây cúc quỳ là 85,78%, kết luận rằng cacbohydrat
là thành phần chính trong TDP.
Sắc kí đồ HPLC của dung dịch thủy phân TDP được trình
bày trên hình 3.1 Các pic trên sắc kí đồ được xác định thông qua việc
so sánh với thời gian lưu của monosaccharide chuẩn đã được xây


8

dựng từ trước. Thành phần monosaccharide của TDP phân lập từ cây
cúc quỳ được trình bày ở bảng 3.2.
Kết quả phân tích này tương đồng với một số tác giả chỉ ra
rằng monosaccharide chính trong polysaccharides từ thành tế bào là
axit galacturonic, tiếp theo là rhamnose. Hàm lượng lớn axit
galacturonic và rhamnose cho thấy sự có mặt của homogalacturonan
và rhamnogalacturonan trong TDP. Sự có mặt đáng kể của arabinose
chỉ ra sự tồn tại của các chuỗi arabinan trên mạch nhánh. Ngoài ra,
một lượng đáng kể arabinose có thể chứng minh sự tồn tại của
arabinan phân nhánh cao trong mạch của TDP. Kết quả này cho phép
khẳng định TDP phân lập từ cây cúc quỳ có thành phần cấu trúc của
pectin.

Hình 3.1. Sắc í đồ HP C củ dịch thủ phân mẫu TDP
3.1.2. Phổ hồng ngoại củ TDP
Phổ hồng ngoại của TDP phân lập từ cúc quỳ được trình bày
trên hình 3.2.
Đối với pectin, vùng dao động trong khoảng 1200-1800 cm-1
trên phổ IR được xem là vùng “vân tay” của mẫu. Tại đây, ta có thể
quan sát trạng thái đặc trưng của các nhóm carboxylic (khoảng 17501350 cm-1). Dải dao động ở vùng 1733 cm-1 đặc trưng cho dao động
hóa trị của nhóm C=O của gốc carboxylic acid không được ion hóa


9
(tồn tại dưới dạng methyl hóa hay gốc acid). Sự ion hóa gốc này (tạo
thành muối) dẫn đến việc suy giảm tín hiệu này trên phổ và làm xuất
hiện tín hiệu dao động hóa trị của COO- tương ứng trong vùng 16001650 (bất đối xứng) và 1400-1450cm-1 (đối xứng).

Hình 3.2. Phổ hồng ngoại củ pectin từ câ cúc quỳ
Mức độ ester hóa (DE) được định nghĩa là tỷ số giữa số

lượng nhóm ester so với tổng số nhóm acid và nhóm ester và được
đánh giá trực quan thông qua cường độ tín hiệu của dải 1733 cm-1.
Hình 3.2 cho thấy pectin thu được từ cây cúc quỳ là loại pectin có
mức độ este hóa (mức độ methyl hóa) thấp.
3.1.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H NMR và 13C NMR
củ TDP
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của mẫu TDP thu được từ
cúc quỳ được trình bày trên hình 3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
proton của mẫu pectin thu được từ cúc quỳ được trình bày trên hình
2 có rất nhiều điểm tương đồng với phổ 1H-NMR của
polysaccharide giàu arabinan phân lập từ Opuntia ficus-indica. Vùng
các tín hiệu anome trên phổ cho thấy các tín hiệu ở độ dịch chuyển
hóa học 5,18, 5,03 và 5,01 được gán tương ứng cho α-(1→5)
arabinofuranosyl, α-(1→2) rhamnopyranosyl, và α- (1→4)galactopyranosylacid. Sự có mặt của proton H6 của các đơn vị


10
rhamnose thể hiện qua các tín hiệu cộng hưởng ở độ dịch chuyển
1,12 và 1,23. Tín hiệu ở 1,12 ppm tương ứng với gốc rhamnose liên
kết (1 →2) với một galacturonic acid còn tín hiệu ở 1,23 ppm là của
gốc rhamnose liên kết (2 →1) với một galacturonic acid và tạo nhánh
ở O-4.Tín hiệu có cường độ cao ở 3,70 ppm là tín hiệu của nhóm
methyl liên kết với gốc GalA. Kết quả thu được hoàn toàn phù hợp
với các nghiên cứu trước đây đã xác định rằng thành phần cấu trúc
của pectin chủ yếu chứa các đơn vị galacturonic acid (GalA).
Rhamnose (Rha) là thành phần nhỏ trong mạch chính của pectin
trong khi các đường khác như arabinose (Ara), galactose (Gal), và
xylose (Xyl) nằm trên các mạch nhánh.

Hình 3.3. Phổ 1H N R củ TDP từ câ cúc quỳ

Hình 3.4. Phổ13C N R củ TDP từ câ cúc quỳ


11
Trên hình 3.4, phổ 13C NMR của pectin cho thấy các tín hiệu
anome đặc trưng của rhamnose và glacturonic acid trong các khối
cấu tạo của mạch chính rhamnogalacturonan ở 100,1 và 98,6 ppm
được gán tương ứng cho C1 của các đơn vị (1→2)- rhamnose và (1
→4)-galacturonic acid. Các tín hiệu ở 175,9 và 175,2 ppm đặc trưng
cho các nhóm chức carboxylic C6 tương ứng của các đơn vị (1 →4)galacturonicacid và galacturonicacid(1→2)-rhamnose. Trong khi đó,
tín hiệu ở 17,2 ppm đặc trưng cho các nhóm methyl của các đơn vị
rhamnose. Bên cạnh đó, phổ 13C NMR của pectin còn thể hiện những
tín hiệu đặc trưng của các đơn vị (1 →5) arabinose qua các cộng
hưởng có độ dịch chuyển hóa học 108,5, 83,4, 78,3,84,9 và 67,6 ppm
tương ứng với C-1 − C-5.
Kết quả thu được cho thấy pectin từ cúc quỳ là loại pectin giàu
arabinan với các dữ liệu phổ phù hợp với các nghiên cứu trước đây
đã xác định rằng thành phần cấu trúc của pectin chủ yếu chứa các
đơn vị galacturonic acid (GalA). Rhamnose (Rha) là thành phần nhỏ
trong mạch chính của pectin và arabinose (Ara) là thành phần đường
có hàm lượng đáng kể ở mạch nhánh.
3.1.4. Sắc kí thẩm thấu gel GPC
Sắc kí đồ thẩm thấu gel của mẫu pectin được trình bày trên hình
3.5.
Kết quả GPC của mẫu pectin cho phép xác định các thông số
cấu trúc quan trọng bao gồm khối lượng phân tử trung bình Mw =
1,39 x 104 g/mol, khối lượng phân tử trung bình số Mn = 1,15 x 104
g/mol, khối lượng phân tử trung bình Mz = 1,74 x 104 g/mol và đặc
trưngvề chỉ số phân tán PDI = MW/Mn = 1,2. Điều này cho thấy độ

phân tán khối lượng của pectin từ cúc quỳ có tương đối nhỏ.


12

.

Hoạt tính quét gốc hydroxyl
tự do (%)

Hình 3.5. Sắc í đồ thẩm thấu gel - GPC củ mẫu TDP từ câ
cúc quỳ
3.1.5. Hoạt tính ch ng oxi hóa
Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin
từ cúc quỳ được trình bày trên hình 3.6.
Khi nồng độ pectin tăng, khả năng quét gốc tự do của pectin tăng dần
và đạt đến 88% khi nồng độ pectin đạt 10 mg/ml. Giá trị IC50 tương
ứng của pectin và vitamin C lần lượt là 4,73 mg/ml và 1,30 mg/ml.
Kết quả này cho thấy có thể xem pectin là một nguồn chất chống oxi
hóa từ tự nhiên đầy hứa hẹn.
120
100
80

Pectin

60

40
20

0
0

5

10

15

Nồng độ (mg/ml)

Hình 3.6. Khả năng quét g c h drox l tự do củ TDP từ cúc quỳ


13
3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC DẪN XUẤT SU F T H
TỪ
PECTIN
3.2.1. Cấu trúc củ dẫn xuất pectin Sulf t h
Khối lượng phân tử trung bình khối lượng (Mw), khối lượng
phân tử trung bình số(Mn), khối lượng phân tử trung bình z (Mz) và
đặc trưng về chỉ số phân tán PDI = MW/Mn của các mẫu được trình
bày trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kh i lƣợng phân tử củ pectin v các dẫn suất Sulf t
h v h m lƣợng Sulf t
Mẫu
Pectin
Pectin
Sulfat hóa 1
(TDP-S1)

Pectin
Sulfat hóa 2
(TDP-S2)

Hàm
lƣợng
DS
0

Mw x 104

Mn x 104

Mz x 104

Mw/Mn

1,39

1,15

1,74

1,21

15,20

2,45

1,90

3,23

1,28

18,31

1,45

1,69

1,26

1,15

Kết quả cho thấy các dẫn xuất pectin Sulfat hóa có giá trị DS và
trọng lượng phân tử khác nhau thu được bằng cách thay đổi các điều
kiện phản ứng.
Giá trị Mw của các mẫu Sulfat hóa cũng tăng nhẹ so với pectin
ban đầu. Điều này có thể là do các gốc hydroxyl trong phân tử pectin
đã được thay thế bằng các gốc Sulfat. Tuy nhiên so với mẫu TDP-S1
(thời gian phản ứng 30 phút), mẫu TDP-S2 (thời gian phản ứng 90
phút) có các giá trị Mw, Mn, Mz và Mw/Mn giảm đi nhưng hàm
lượng DS tăng lên, điều này có thể giải thích là khi thời gian phản
ứng Sulfat hóa tăng, một mặt giúp tăng hàm lượng Sulfat trong dẫn
xuất nhưng mặt khác lại thủy phân một phần phân tử.


14

Hình 3.7. Phổ FT-IR củ mẫu TDP (tr n) v TDP-S (dƣới)
Phổ IR của TDP và TDP-S được trình bày trên Hình 3.7. So
sánh hai phổ này, chúng tôi thấy rằng, phổ của TDP-S thể hiện sự
xuất hiện mới của tín hiệu hấp thụ tại vùng 800-880cm-1 đặc trưng
cho nhóm Sulfate ở vị trí axial, đồng thời có sự giảm cường độ hấp
thụ của tín hiệu tại ~3261-3370cm-1 là đặc trưng cho dao động của
nhóm OH.
So sánh phổ 13C-NMR của TDP và TDP-S (Hình 3.8), ta thấy
trên phổ 13C-NMR của TDP-S xuất hiện tín hiệu mới ứng với độ
chuyển dịch hóa học ở δ=77,2 ppm, được gán cho carbon ở vị trí C-2
của rhamnose, có sự dịch về phía trường thấp hơn so với tín hiệu C-2


15
của vị trí carbon không thế, điều đó chứng tỏ mẫu TDP-S bị Sulfate
hóa tại vị trí C-2 của rhamnose.

Hình 3.8. Phổ 13 C-N R củ các mẫu TDP (tr n) so với TDP-S (dƣới)
Như vậy, các phân tích cấu trúc trên đây cho thấy quá trình tạo
dẫn xuất Sulfat hóa của pectin đã được thực hiện.
3.2.2. Hoạt tính ch ng ox h củ pectin v dẫn xuất Sulf t h
Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin
từ cúc quỳ và dẫn xuất Sulfat hóa được trình bày trên hình 3.9.
Từ đồ thị cho thấy, trong khoảng nồng độ nghiên cứu từ 0,01 –
5 mg/mL, khi nồng độ pectin TDP và dẫn xuất TDP-S tăng, khả năng
quét gốc tự do của pectin và các dẫn xuất tăng dần. Hoạt tính của dẫn
quét gốc hydroxyl của mẫu TDP-S1 là cao nhất so với pectin và
TDP-S2. Tại nồng độ nghiên cứu 5 mg/mL, khả năng quét gốc
hydroxyl tự do của các mẫu TDP-S1, TDP-S2 lần lượt là 55,3, và

16
47,8% trong khi đó khả năng quét gốc tự do của pectin ở nồng độ
này chỉ đạt 42,8%. Kết quả cho thấy rằng quá trình Sulfat hóa giúp
tăng cường hoạt tính chống oxy hóa của pectin.
100

TDP
TDP-S1
TDP-S2
Vitamin C

Scavenging effect(%)

80

60

40

20

0
0

1

2

3

4

5

Concentration (mg/mL)

Hình 3.9. Khả năng quét g c h drox l tự do củ pectin v các
dẫn xuất Sulf t h
3.2.3. Xác định hả năng gâ độc tế b o ung thƣ củ pectin
v dẫn xuất Sulf t h
Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các mẫu TDP-S1, TDP-S2
và TDP được khảo sát bằng các thử nghiệm SBR trên các dòng tế
bào MKN7. Kết quả thử nghiệm được trình bày trên bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hoạt tính gâ độc tế b o ung thƣ
TDP và TDP-S
Nồng độ
(µg/ml)
400
200
100
50
IC50

TDPS1
49,02
22,07
10,12
-2,25
>100

TDPS2
46,35
28,31
17,74
8,32
>100

TDP
45,96
22,13
10,79
3,7
>100

KN7 củ các mẫu

Nồng độ
(µg/ml)
10
2
0,4
0,08
IC50

Ellipticine
96,47
90,28
55,11
19,79

0.35 ± 0.03


17
Kết quả cho thấy quá trình tạo dẫn xuất Sulfat hóa của pectin có
tác dụng tăng hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư
MKN7 không đáng kể so với polysaccharide ban đầu. Điều này đặt
ra yêu cầu cần tìm con đường tạo dẫn xuất để nâng cao hoạt tính gây
độc tế bào ung thư hiệu quả hơn. Qua tham khảo tài liệu, chúng tôi
đã tiếp tục triển khai quá trình tạo dẫn xuất Selen hóa pectin.
3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC DẪN XUẤT SE EN H
TỪ
PECTIN
3.3.1. Cấu trúc củ dẫn xuất pectin Selen h
Khối lượng phân tử trung bình khối lượng (Mw), khối lượng
phân tử trung bình số(Mn), khối lượng phân tử trung bình z(Mz), độ
phân tán (PDI, Mw / Mn) cho tất cả các mẫu được trình bày trong
Bảng 3.5. Kết quả cho thấy các dẫn xuất pectin Selen hóa có hàm
lượng Se và trọng lượng phân tử khác nhau thu được bằng cách thay
đổi các điều kiện phản ứng. Kết quả cho thấy các mẫu dẫn xuất có độ
phân tán tăng nhẹ so với pectin không được Selen hóa.
Bảng 3.5. Kh i lƣợng phân tử của pectin và các dẫn suất Selen hóa
Mẫu
Pectin
Pectin Selen
hóa 1
Pectin Selen
hóa 2
Pectin Selen
hóa 3

Hàm
lƣợng Se Mw x 104 Mn x 104 Mz x 104 Mw/Mn
(μg/g)
0
1,39
1,15
1,74
1,21
1887

2,47

1,90

3,23

1,30

1695

2,45

1,92

3,20

1,28

1203

2,34

1,87

3,03

1,25

Giá trị Mw tăng có thể là do các -OH mà đã được thay thế
bởi

. Vì vậy, có thể giả định rằng Mw của các mẫu pectin


18
Selen hóa cao hơn có thể là do sự hiện diện của các nhóm chức chứa
Selen mới thêm vào thay thế nhóm hydroxyl trong pectin.

Hình 3.10. Phổ FT-IR củ TDP (tr n) v dẫn xuất pectin Selen
hóa TDP-Se (dƣới)
Phổ FT-IR của pectin và dẫn xuất pectin Selen hóa khá tương
đồng được minh họa trong Hình 3.11. Đỉnh khoảng 3400 và 2930
cm-1 trong TDP và Se-TDP tương ứng sự hấp thụ C-H và dao động
kéo dài O-H. Các dao động thuộc vùng từ 2200 đến 950 cm-1, được
coi là "dấu vân tay" của cacbohydrat, đặc trưng cho từng loại
polysaccharide. Các dải 1722 và 1651 cm-1 được quy kết tương ứng


19

với nhóm cacbonyl (C = O) dao động hóa trị của các nhóm methyl
este hóa và không este hóa và carboxyl pectin. Đặc biệt, so sánh phổ
hồng ngoại của pectin và pectin Selen hóa cho thấy, trên phổ của dẫn
xuất Selen hóa xuất hiện thêm một dải hấp thụ ở 640 cm-1, trong khi
đó vạch hấp thụ này không xuất hiện trong phổ của TDP. Theo
nghiên cứu trước đây, dải đặc trưng giữa 600 - 700 cm-1 biểu hiện
dao động kéo dài Se-O-C bất đối xứng. Điều này chứng tỏ rằng dẫn
xuất pectin Selen hóa đã được tổng hợp thành công theo quy trình.
Qua so sánh Phổ 13C NMR của mẫu TPD-Se hoàn toàn giống phổ
13
C NMR của mẫu TDP-S, nên chúng tôi tiến hành khảo sát thêm
phổ khối lượng của mẫu TDP-Se so với mẫu TDP.
Như đã biết, phổ khối lượng ESI-MS là một trong những công
cụ nghiên cứu cấu trúc hữu hiệu đối với các hợp chất hữu cơ nói
chung và các polysaccharide nói riêng. Con đường phân mảnh chính
để tạo nên các ion trong quá trình ion hóa các phân tử polysaccharide
dựa trên sự phân ly của liên kết C-O giữa các đơn vị saccharide của
chuỗi phân tử. Trong phổ MS của TDP (Hình 3.11), đỉnh cơ bản
(đỉnh có cường độ cao nhất) tại m/z 177 và đỉnh tại m/z 189 chỉ ra
rằng axit galacturonic là thành phần chính trong phân tử TDP. Thêm
vào đó, đỉnh 358 chỉ ra sự tồn tại của các đơn vị rhamnose
galacturonic liên kết trong phân tử.Trong phổ này, đỉnh tại m/z 475
có cường độ thấp được gán cho phân mảnh [(GalA - OH + Na)
RhaAra] + cho thấy sự thay thế của arabinose ở các chuỗi bên trái của
xương sống rhamnogalacturonan. Tuy nhiên, trong phổ MS của
TDP-Se (Hình 3.12), đỉnh m/z 475 này có cường độ cao nhất là do sự
góp mặt đáng kể của ion mới [(GalA-O) (NaSeO3) Rha + H+]. Bên
cạnh đó, trên phổ Se-TDP còn xuất hiện một số ion mới trong như
521, 645, điều này không chỉ chứng minh sự thành công của quá
trình Selenyl hóa mà còn khẳng định mối liên kết homogalacturan và

20
rhamnogalacturonan của TDP (Bảng 3.6.). Nói tóm lại, các kết quả
trên đã chứng minh rằng các nhóm Selenyl đã được thay thế thành
công trên TDP trong quá trình Selenyl hóa.

Hình 3.11. Phổ ESI- S củ mẫu TDP

Hình 3.12. Phổ ESI- S củ mẫu TDP-Se1


21
Bảng 3.6. Các phân mảnh chính trên phổ kh i ESI-MS của các
mẫu pectin và pectin Selen hóa
m/z

Phân mảnh

TDP

177
189
340
358
475

[GalA – OH]+
[GalA –CO + Na]+
[GalARha ]+

[GalARha + H2O]+
[(GalA–O–H+
+Na+)RhaAra ]+
[{(GalA–O )(NaSeO3)}
Rha +H+ ]+
[GalA{(GalA–OH)
(NaSeO3)} + H2O]+
[GalAGalARha + H2O]+

x
x

521
534
645

[GalA{(GalAOH)(NaSeO3)}Rha – Na+
+ H3O]+
3.3.2. Hoạt tính ch ng ox h

x
x

x

TDPSe1
x
x
x
x

x

TDPSe2
x
x
x
x
x

TDPSe3
x
x
x
x
x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

củ pectin v dẫn xuất Selen

hóa
Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin từ
cúc quỳ và các dẫn xuất Selen hóa được trình bày trên hình 3.14.
Từ đồ thị cho thấy, trong khoảng nồng độ nghiên cứu từ 0,01 –
5 mg/mL, khi nồng độ pectin TDP và dẫn xuất TDP-Se tăng, khả
năng quét gốc tự do của pectin và các dẫn xuất tăng dần. Hoạt tính
của dẫn quét gốc hydroxyl của mẫu TDP-Se1 là cao nhất so với
pectin va các dẫn xuất. Tại nồng độ nghiên cứu 5 mg/mL, khả năng
quét gốc hydroxyl tự do của các mẫu TDP-Se1, TDP-Se2, TDP-Se3
lần lượt là 65,7, 59,5 và 55,3% trong khi đó khả năng quét gốc tự do
của pectin ở nồng độ này chỉ đạt 42,8%. Kết quả cho thấy rằng quá
trình Selen hóa giúp tăng cường rõ rệt hoạt tính chống oxy hóa của
pectin.


22

100

TDP
TDP-Se1
TDP-Se2
TDP-Se3
Vitamin C

Scavenging efect (%)

80

60

40

20

0
0

1

2

3

4

5

Concentration (mg/ml)

Hình 3.14. Khả năng quét g c h drox l tự do củ pectin v các
dẫn xuất Selen hóa
3.3.3. Xác định hả năng gâ độc tế b o ung thƣ củ pectin
v dẫn xuất Selen h
Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các mẫu TDP-Se và TDP
được khảo sát bằng các thử nghiệm SBR trên các dòng tế bào
MKN7. Kết quả được trình bày trên bảng 3.7.
Bảng 3.7. Hoạt tính gâ độc tế b o ung thƣ
TDP và TDP-Se

KN7 của các mẫu

Nồng
độ
(µg/ml)

TDPSe1

TDPSe2

TDPSe3

TDP

Nồng
độ
(µg/ml)

Ellipticine

200

89,94

80,96

77,65

22,13

10

96,47

100

64.98

61,95

59,67

10,79

2

90,28

50

51,15

47,85

43,76

3,7

0,4

55,11

20

21,12

20,09

18,87

-2,5

0,08

19,79

IC50

72.93
± 0,07

83,59
± 0,10

92,58
± 0,05

>100

IC50

0,35 ±
0,03


23
Kết quả cho thấy chỉ ra rằng TPD-Se có thể ức chế sự gia tăng
tế bào ung thư dạ dày người MKN7, tỷ lệ ức chế của Se-TDP tăng
đáng kể khi tăng liều và tỷ lệ ức chế của Se-TDP cao hơn hẳn so với
TDP. Ngoài ra, TDP với liều thấp có thể tạm thời gây ra sự tăng sinh
tế bào. Giá trị IC50 của TDP-Se1 (72.93 μg/mL), TDP-Se2 (83.59
μg/mL), TDP-Se3 (92.58 μg/mL) thu được từ tỷ lệ ức chế. Điều này
cũng gợi ý rằng Seleno-polysaccharide thu được từ Selenyl hóa có
thể tăng lên đáng kể độc tế bào đối với tế bào khối u, hứa hẹn là một
trong những giải pháp tạo dẫn xuất có hoạt tính chống ung thư.