Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested PCR chẩn đoán nhiễm nấm c neoformans trong dịch não tủy tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG

TRẦN THỊ QUỲNH LIÊN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT
CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM NESTED-PCR CHẨN ĐOÁN
NHIỄM NẤM Cryptococcus neoformans TRONG DỊCH NÃO TỦY

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

HÀ NỘI - 2019


Công trình được hoàn thành tại:
Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Cao Trường Sinh
PGS.TS. Nguyễn Thị Hương Bình
Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp
tại Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương.
Vào hồi giờ ngày tháng năm 2019

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia
- Thư viện Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng-Trung ương


DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ
1. Tran Thi Quynh Lien, Cao Truong Sinh, Nguyen Thi Huong Binh, Do
Ngoc Anh (2018), “Establish and optimization nested PCR reaction
determine Cryptococcus neoformans in cerebrospinal fluid'', Tạp chí
Phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 6/2018.
2. Tran Thi Quynh Lien, Cao Truong sinh, Nguyen Thi Huong Binh,
Nguyen Khac Luc (2018), “Evaluation sensitivity, specificity and stable
of nested-PCR kit detect cryptococcus neoformans in cerebrospinal
fluid” Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số
6/2018.
3. Trần Thị Quỳnh Liên, Cao Trường Sinh, Nguyễn Thị Hương Bình,
Trần Thanh Dương (2019), "Đánh giá khả năng chẩn đoán Cryptococcus
neoformans trong dịch não tủy của bộ sinh phẩm nested-PCR với kỹ
thuật nuôi cấy, soi tươi và bộ sinh phẩm pcr chẩn đoán của norgen'' Tạp
chí Phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 61/20194.


-1-

ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm não, màng não là tình trạng nhiễm trùng thần kinh trung ương gây
ra bởi các căn nguyên khác nhau như vi khuẩn, virus, vi nấm hoặc ký
sinh trùng. Trong một số trường hợp biểu hiện lâm sàng của viêm não,
màng não do các căn nguyên khác nhau khá giống nhau nên dựa vào lâm

sàng khó phân biệt. Do vậy, để xác định căn nguyên gây viêm não, màng
não cần phải dựa vào các xét nghiệm cận lâm sàng.
Trong số các loài vi nấm gây viêm não màng não, nấm Cryptococcus
neoformans được xác định là loài gây viêm màng não phổ biến nhất, đặc biệt
là ở bệnh nhân HIV/AIDS, ung thư, bệnh nhân suy kiệt....
Trên lâm sàng, biểu hiện viêm màng não do nấm C. neoformans rất giống
với các căn nguyên vi sinh vật khác. Ngoài ra, cũng giống như các vi
nấm gây bệnh khác, viêm màng não do C. neoformans thường được nghĩ
tới sau các căn nguyên khác nên thường chẩn đoán muộn, khi các triệu
chứng đã trở nên trầm trọng. Trong khi, viêm màng não do nấm C.
neoformans là một bệnh nguy hiểm, tiến triển nhanh, nếu không được
chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời có thể để lại di chứng trầm trọng có
khi tử vong nhanh.
Trong các kỹ thuật chẩn đoán dựa trên phản ứng PCR, nested – PCR là
một trong những kỹ thuật có độ nhạy, độ đặc hiệu cao nhất, không sử
dụng trang thiết bị đắt tiền như real-time PCR do đó chúng tôi lựa chọn
tiến hành đề tài "Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ
sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans trong
dịch não tủy".
Với 02 mục tiêu:
1. Xây dựng được quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR
chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy.
2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm được
tạo ra trong chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy.


-2-

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI VỀ MẶT KHOA HỌC
VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN

1. Ý nghĩa khoa học của luận án
Đề tài đã áp dụng các phương pháp nghiên cứu có tính khoa học
chuẩn mực hiện đang áp dụng rộng rãi tại Việt Nam và Thế giới như: Hoàn
thiện được quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR định loài nấm C.
neoformans trong dịch não tủy của người Việt Nam;Trên cơ sở áp dụng
tổng hợp các phương pháp nghiên cứu truyền thống và hiện đại, phù
hợp, bố trí thí nghiệm, tính toán thống kê một cách khoa học nên các kết
quả của để tài có giá trị và độ tin cậy cao. Đây là nghiên cứu đầu tiên
nghiên cứu xây dựng bộ sinh phẩm chẩn đoán nấm C. neoformans trên
dịch não tủy bằng phương pháp nested-PCR ở Việt Nam. Nghiên cứu đã
xây dựng được quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR dựa
trên sự kết hợp mới giữa 2 bộ mồi ITS1, ITS4 và CN4, CN5.
2. Ý nghĩa thực tiễn của luận án
Kết quả của đề tài đã bước đầu khẳng định việc các cơ sở nghiên
cứu khoa học của Việt Nam có thể sản xuất được các bộ sinh phẩm chẩn
đoán có độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện tương đương với các
nghiên cứu tương tự trên thế giới.
Bộ sinh phẩm đã được đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu tính ổn định
tại phòng thí nghiệm và tại thực địa hẹp (02 bệnh viện) đảm bảo tính chính
xác và khả năng áp dụng trên diện rộng hơn của bộ sinh phẩm.
Là cơ
sở để tiếp tục triển khai, sản xuất, ứng dụng bộ sinh phẩm trong chẩn
đoán nhiễm nấm C. neoformans tại các đơn vị xét nghiệm chẩn đoán lâm
sàng, cung cấp kết quả xét nghiệm nhanh, chính xác từ đó đề xuất
phương án điều trị sớm, hiệu quả phù hợp. Qua đề tài này, các cán bộ
nghiên cứu có thể tiếp tục mở rộng xây dựng các bộ sinh phẩm chẩn
đoán với các đối tượng nghiên cứu khác dựa trên kỹ thuật sinh học phân
tử.

-3-

CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN
Luận án có 134 trang (không kể phụ lục) bao gồm các phần: Đặt vấn đề
(2 trang); chương 1: Tổng quan tài liệu (34 trang); chương 2: Đối tượng
và phương pháp nghiên cứu (31 trang); chương 3: Kết quả nghiên cứu
(41 trang); chương 4: Bàn luận (24 trang); Kết luận (2 trang); các công
trình đã công bố của tác giả có liên quan đến nội dung luận án (1 trang);
những đóng góp mới của luận án (1 trang); tài liệu tham khảo 113 (13
trang, gồm 10 tài liệu tiếng việt, 103 tài liệu tiếng Anh) và phụ lục (35
trang). Luận án được trình bày với 39 bảng, 17 hình.


-4-

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm sinh học và vai trò y học của nấm C. neoformans
Giống nấm Cryptococcus có khoảng hơn 70 loài được định loại
dựa vào hình thái nhưng loài gây bệnh chủ yếu là C. neoformans chiếm
80% [18],[19]. Bệnh do nấm C. neoformans gây ra gọi là
Cryptococcosis. Triệu chứng bệnh được Zenker miêu tả đầu tiên năm
1861, nhưng đến năm 1864, hai nhà bác học Busse và Buschkle người
Đức đã phân lập và nuôi cấy được nấm C. neoformans từ bệnh nhân có
triệu chứng giống như đã được Zenker miêu tả [18],[20],[21]. Ngoài
C.neoformans, loài C. albidus và C. laurentii cũng có khả năng gây bệnh
nhưng ít gặp [19].
1.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm C. neoformans.
1.1.1.1. Đặc điểm hình thể.
C. neoformans là nấm men, đường kính tế bào khoảng 5-10 µm, được
bao ngoài bởi một nang (capsule) hình cầu hoặc hình bầu dục, kích

thước nang thay đổi từ 2-40µm.
1.1.1.2. Môi trường sống
C. neoformans là sinh vật sống hoại sinh, ngoài cơ thể vật chủ, có thể
sống tự do bên ngoài môi trường. Nấm phân bố toàn cầu có thể tìm thấy
trong chất thải của gia cầm, chim bồ câu, vẹt, yến. Trong các hang động,
nước trái cây lên men, sữa, đường ruột của một số động vật ăn cỏ, trên
cơ thể dơi, gián, trong đất và các hốc cây khác nhau. Nấm còn được tìm
thấy trong thân gỗ mục của một số loài cây như: cây bạch đàn, cây cao
su màu đỏ [18], [24], [26].
1.1.1.3. Tính chất nuôi cấy
Nấm C. neoformans có thể mọc trên thạch Sabouraud dextrose, thạch máu
cừu, thạch chocolate và các môi trường khác ở nhiệt độ từ 20-370C, nấm bắt
đầu mọc trong vòng khoảng 72 giờ, nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát
triển là 300C [27]. C. neoformans triển tốt trong môi trường chứa khoảng 5
% CO2, pH hơi kiềm và một lượng nhỏ chất sắt [28].


-5-

Trên môi trường thạch Sabouraud dextrose ở 25-370C, nấm C. neoformans
mọc thành các khuẩn lạc lồi, mịn, nhày, màu trắng hoặc màu kem, đường
kính có thể đến vài milimet [28].
1.1.2. Vai trò y học
Do tế bào nấm C. neoformans có thể có mặt trong không khí,
trong đất và trong phân gia cầm nên người rấ t dễ bi ̣ nhiễm loa ̣i nấ m này
khi hít vào qua đường hô hấp. Tuy nhiên, không phải cơ thể nào bi ̣
nhiễm cũng biể u hiê ̣n thành bê ̣nh mà bê ̣nh thường biể u hiê ̣n ở những cơ
thể có hê ̣ thố ng miễn dich
̣ bi ̣tổ n thương như bệnh nhân AIDS, phải dùng
các thuốc ức chế miễn dịch, ung thư, ghép tạng, ghép tủy xương... Mức

độ nặng của các triệu chứng lâm sàng phụ thuộc vào tình trạng suy giảm
miễn dịch của cơ thể người nhiễm [3], [18], [22], [30].
Nấm thường gây bệnh ở não màng não do nấm có đặc tính ưa tổ
chức thần kinh. Ngoài ra nấm có thể gây bệnh ở các cơ quan bộ phận
khác như phổi, da, hệ tiết niệu…
1.1.3. Tình hình viêm màng não do nấm C. neoformans ở trên thế
giới và Việt Nam
1.1.3.1. Viêm màng não do nấm C. neoformans ở trên thế giới
Từ cuối những năm 1970 đến đầu những năm 1980, sự gia tăng mạnh các
trường hợp nhiễm nấm C. neoformans tại Kinshasa và ở những người
Zairian nhập cư tại Châu Âu.
Hiện nay, viêm màng não do nấm C. neoformans trên bệnh nhân
HIV/AIDS vẫn còn là vấn đề ở các nước phương Tây. Tại Nam và
Trung châu Phi nhất là vùng sa mạc cận Sahara [11], [20], [36], ngoài
việc là nguyên nhân hàng đầu gây viêm màng não, nó còn 13-44% tổng
số ca tử vong liên quan đến AIDS.
Theo kết quả một loạt các nghiên cứu của Park và cs (2009) thấy tỉ
lệ mắc thay đổi từ 0,04-12% mỗi năm trên các bệnh nhân HIV/AIDS.
Một số vùng như Đông Âu, Trung Á, Bắc Phi và Trung Đông có tỉ lệ
tương tự nhau (1,7% mỗi năm). Vùng biển Caribbean và Mỹ Latin có tỉ


-6-

lệ khoảng 3,4% mỗi năm. Trên toàn cầu hàng năm có khoảng 957.900
trường hợp nhiễm bệnh [20].
Ước tính rằng có khoảng 624.725 ca (từ 124.956-1.124.494) tử
vong bởi viêm màng não do nấm C. neoformans [20]. Châu Đại Dương
ít nhất (9 ca tử vong) trong khi khu vực châu Phi cận Sahara nhiều nhất
(504.000 ca (từ 100.800 - 907.200)) [20].

Rajasingham và cs, (2017) mặc dù đã được điều trị bằng thuốc chống
nấm, nhưng năm 2007 ước tính có đến 223.100 trường hợp viêm màng
não do cryptococcus và 181.100 ca tử vong do bệnh này trên toàn thế
giới [38], [39].
1.1.3.2. Viêm màng não do nấm C. neoformans ở Việt Nam
Ở Việt Nam, chưa có con số thống kê rõ ràng về tình hình viêm
màng não do nấm C. neformans của bệnh nhân AIDS trên cả nước.
Năm 1928, tại BV Bệnh Nhiệt Đới có 1 ca nhiễm C. neoformans đầu
tiên được báo cáo với biểu hiện viêm màng não;
Trong một nghiên cứu của Trần Phủ Mạnh Siêu và cs, (2006) về
tình hình nhiễm vi nấm nội tạng trên bệnh nhân HIV/AIDS tại Bệnh viện
Bệnh Nhiệt đới Thành phố - Hồ Chí Minh từ năm 2003-2005 đã cho
thấy C. neoformans là căn nguyên phổ biến (chiếm trên 90% nhiễm
trùng thần kinh ở bệnh nhân HIV/AIDS) [41].
Thực tế tình hình nhiễm nấm nội tạng ở bệnh nhân HIV/AIDS tại Bệnh
viện Nhiệt đới Tp. HCM từ 11/2008 đến 6/2009 có 98 trường hợp viêm
não, màng não do C. neoformans [41].
1.2. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans
1.2.1. Soi phát hiện nang nấm dưới kính hiển vi
Phát hiện nang polysaccharide của nấm Cryptococcus trong mẫu xét
nghiệm khi quan sát dưới kính hiển vi thấy C. neoformans là những tế
bào nấm men, hình cầu hoặc hình bầu dục, bao quanh là một lớp vỏ dày.
1.2.2. Nuôi cấy phát hiện nấm trên môi trường chọn lọc


-7-

Nuôi cấy được coi là một phương pháp quan trọng để chẩn đoán viêm
màng não do Cryptococcus, nhưng có một số nhược điểm như: Đòi hỏi
cơ sở hạ tầng phòng thí nghiệm, điện, và kỹ thuật viên được đào tạo bài

bản [13]. Nuôi cấy cần ít nhất 2 ngày để nấm phát triển và đến 10 ngày
để có được số liệu đáng tin cậy. Các phương pháp nuôi cấy cũng có thể
tạo ra kết quả âm tính giả khi mật độ nấm thấp. Sử dụng 100 μL dịch não
tủy không pha loãng so với 10 μl pha loãng ở tỷ lệ 1:10 đã làm tăng độ
nhạy từ 82,4% đến 94,2%, với mức tối thiểu đơn vị khuẩn lạc CFU cần
thiết cho sự tăng trưởng giảm từ 100 xuống còn 10 CFU/ml [43].
1.2.2. Chẩn đoán miễn dịch học phát hiện kháng nguyên
Độ nhạy của phương pháp này là cao nhất khi xét nghiệm trên mẫu
dịch não tủy, đặc biệt là mẫu dịch não tủy của các bệnh nhân nhiễm
HIV. Hầu hết các bệnh nhân HIV có nhiễm C. neoformans đều có
phản ứng dương tính khi xét nghiệm miễn dịch bằng dịch não tủy [43].
Tuy nhiên tỷ lệ này chỉ đạt 60% ở các bệnh nhân nhiễm nẫm không có
HIV.
Những phương pháp xét nghiệm miễn dịch học thông thường có: Thử
nghiệm đông kết latex (Latex agglutination assay - LAT); thử nghiệm
miễn dịch enzym (enzym immunoassay – IEA), thử nghiệm miễn dịch
dòng chảy (Lateral Flow Assay - LFA).
1.2.3. Chẩn đoán bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Sinh học phân tử là một trong những công cụ chẩn đoán bệnh với độ
nhạy, độ đặc hiệu cao và thời gian chẩn đoán nhanh. Các kỹ thuật này có
tính đặc hiệu cao do việc thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho từng đối
tượng nghiên cứu và có độ nhạy cao vì chỉ cần một lượng rất nhỏ (vài
picrogam) ADN cũng có thể cho kết quả chẩn đoán. Có nhiểu phương
pháp sinh học phân tử có thể áp dụng để chẩn đoán nấm C. neoformans.
Mitchell và cs (1994) là những người đầu tiên sử dụng kỹ thuật PCR để
định loại nấm C. neoformans [46]. Prariayachatigul và cs (1996) dùng PCR
để định loại nấm này dựa trên trình tự gen đích 18S [47].


-8-

SH Mirhendi và cs (2001) áp dụng kỹ thuật RFLP-PCR xác định, phân
biệt một số nấm men Candida spp., nấm Aspergillus và nấm
C.neoformans gây bệnh ở người. Leal AL và cs, (2008) đã ứng dụng kỹ
thuật multiplex-PCR để xác định và phân biệt 2 loài C. neoformans và
C. gattii. Veron và cs, (2009); Satoh và cs, (2011) đã phát triển kỹ thuật
PCR thời gian thực TaqMan để chẩn đoán cryptococcosis có độ nhạy và
độ đặc hiệu cao. Trong số các kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR thì
nested-PCR được sử dụng nhiều nhất để phân biệt C.neoformans và C.
gattii. Theo Shahindokht (2006) và Paola (1998) ngưỡng phát hiện nấm
C.neoformans trong dịch não tủy là trên 102 tế bào nấm/ml [52], [54].
1.3. Nghiên cứu xây dựng và chuẩn hóa các bộ sinh phẩm PCR
chẩn đoán tác nhân gây bệnh
Nguyên lý chung khi phát triển các bộ sinh phẩm PCR để chẩn đoán tác
nhân gây bệnh mong muốn cụ thể như sau [72]:
- Thiết kế mồi để xác định tác nhân gây bệnh mong muốn;
- Xây dựng quy trình tiến hành phản ứng PCR (nhiệt độ bám mồi, thời
gian của mỗi giai đoạn trong chu kỳ tiến hành phản ứng, nồng độ của
các loại hóa chất trong cùng một hỗn hợp phản ứng: dNTPs, Taq
polymerase, MgCl2, đệm phản ứng);
- Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện của phản ứng PCR;
- Tạo chuẩn dương cho bộ kit;
- So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện của kỹ thuật và bộ sinh
phẩm với các phương pháp đã đang được sử dụng với bộ kit chuẩn đã
được thương mại hóa trên thị trường;
- Đóng gói bộ sinh phẩm với thành phần và số lượng phù hợp. Thông
thường đóng gói bộ sinh phẩm cho 25, 50 hoặc 100 phản ứng.
1.4. Nghiên cứu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ
sinh phẩm PCR chẩn đoán tác nhân gây bệnh
Để đánh giá một phương pháp xét nghiệm cũng như một bộ sinh phẩm

trước khi áp dụng vào chẩn đoán lâm sàng thì các chỉ số về độ nhạy, độ


-9-

đặc hiệu, ngưỡng phát hiện và tính ổn định của xét nghiệm và bộ sinh
phẩm được coi là các chỉ số tiên phong, bắt buộc phải có.
- Độ nhạy (Se - sensitivity) [79], [80]: Là tỷ lệ người mang bệnh có kết
quả xét nghiệm dương tính.
- Độ đặc hiệu (Sp - specificity) [77], [81]: Là tỷ lệ người không mang
bệnh có kết quả xét nghiệm âm tính.
Để xác định Se, Sp người ta so sánh kết quả chẩn đoán của phương pháp
cần xác định với phương pháp chuẩn (được gọi là chuẩn vàng, gold
standard) [77].
Hetal và cs, (2011) đã xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp
nhuộm mực tàu là 83,3% và 96,49%. Trong khi đó các giá trị này ở
phương pháp Latex là 100% và 94,7% so với phương pháp chuẩn vàng
là phương pháp nuôi cấy [84]...
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
- 01 chủng nấm C. neoformans chuẩn mã số ATCC® 90113
- 51 chủng nấm C. neoformans được phân lập từ dịch não tủy ở Bệnh viện
Quân y 103, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, Bệnh viện Chợ rẫy
và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch
- 30 mẫu DNT của bệnh nhân có biểu hiện VMN nhưng không nhiễm
nấm C. neoformans
- 120 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng lâm VMN thu thập
ở Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch.
2.2. Địa điểm nghiên cứu
Bệnh viện Quân y 103, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Chợ

Rẫy, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương
2.3. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3/2014 đến tháng 10/2017
2.4. Nội dung nghiên cứu


- 10 -

2.4.1. Xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn
đoán nấm C. neoformans
- Xây dựng quy trình kỹ thuật nested-PCR xác định nấm C. neoformans
- Xây dựng bộ sinh phẩm nested-PCR xác định C. neoformans
2.4.2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm
- Chuẩn bị mẫu để đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu
- Thực hiện kỹ thuật nested – PCR để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ
tương đồng với các xét nghiệm khác, độ ổn định của bộ sinh phẩm.
2.5. Phương pháp nghiên cứu: NC thực nghiệm phòng thí nghiệm.
Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu:Thu thập dịch não tủy, nuôi
cấy, soi tươi nhuộm mực tàu, tách chiết AND, tạo panel, kỹ thuật PCR,
kỹ thuật điện di…
2.6. Phân tích và xử lý số liệu: phần mềm Blast và ClustalX, BioEdit,
Mega 7.0.9, SPSS 20.0
2.7. Đạo đức trong nghiên cứu: Tuân thủ các quy định nghiên cứu y,
sinh học.
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm
nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans
3.1.2.1. Kết quả lựa chọn trình tự cặp mồi cho phản ứng nested PCR
Cặp mồi cho phản ứng PCR1 theo Mitchell TG và CS, 1994; SH
Mirhendi và CS, 2001:
ITS1 F: 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’

ITS4 R:5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’
Khuếch đại đoạn gen có kích thước 555-556 bp đặc trưng cho nấm C.
neoformans
Cặp mồi cho phản ứng PCR 2 theo Guizhen Luo và CS, 2002:
CN4 F: 3’-ATC ACC TTC CCA CTA ACA CAT T-5’
CN5 R: 3’-GAA GGG CAT GCC TGT TTG AGA G-5’


- 11 -

Khuếch đại đoạn ADN có kích thước 135-136 bp nằm trong đoạn giao
gen ITS1-ITS2.
3.1.3. Kết quả xác định các điều kiện cho kỹ thuật nested-PCR chẩn
đoán nhiễm nấm C. neoformans
Bảng 3.10. Kết quả chuẩn hóa từng thành phần phản ứng cho PCR1
TT Thành phần
Nồng độ, hàm Thể tích sử dụng cho
lượng cuối cùng
1 phản ứng (µl)
1
Nước khử ion
Vừa đủ tới 25 µl
8,5
2
Master Mix 2 X có 1X
12,5
chứa MgCl2 nồng
độ 4 mM
3
Mồi xuôi PCR1

0,02 µM
1
4
Mồi ngược PCR1
0,02 µM
1
5

ADN khuôn
Tổng

100pg –
100ng/25µl

2
25

Bảng 3.11. Kết quả chu trình nhiệt của phản ứng PCR1
Bước phản ứng
Nhiệt độ 0C
Thời gian
Số chu kỳ
Tách sợi ban đầu
94
5 phút
01
Tách sợi
94
40 giây
Bám mồi

56
40 giây
25
Kéo dài mồi
72
40 giây
ổn định mồi
72
7 phút
01
3.1.3.4. Kết quả xác định các điều kiện cho phản ứng PCR2
- Kết quả chuẩn hóa nồng độ Mg2+
Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm nồng độ Mg2+ trong phản ứng PCR2
TT Nồng độ Số lượng mẫu lên băng 135bp với nồng độ Mg2+
ADN
khác nhau (mM)
khuôn
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
1
1 pg
0/8
6/8
7/8
7/8
7/8

7/8


- 12 -

2
10 pg
1/8
6/8
8/8
7/8
7/8
6/8
3
100 pg
1/8
7/8
8/8
7/8
6/8
8/8
4
1000 pg 1/8
7/8
8/8
7/8
6/8
6/8
2+
Kết quả bảng 3.13 cho thấy ở Mg nồng độ 2,0 mM và nồng độ ADN ≥

10 pg thì tất cả mẫu xét nghiệm đều có sản phẩm PCR.
3.1.3.5. Xác định ngưỡng phát hiện và tính đặc hiệu của kỹ thuật
nested-PCR

Hình 3.14. Kết quả PCR theo nồng độ ADN khuôn
Ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested -PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.
neoformans trong dịch não tủy ở nghiên cứu này là 10pg.
3.1.4. Kết quả chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm
nấm C. neoformans
Bảng 3.25. Thành phần bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm
C. neoformans
TT Tên dung dịch
Bản chất
Số lượng Thể tích/ống (µl)
1 Dung dịch MC-CR1 Master mix 02 ống
1012
2 Dung dịch MC-CR2 Master mix 01 ống
720
3 Dung dịch CR1
Master mix 02 ống
1012
4 Dung dịch CR2
Master mix 01 ống
840
5 Dung dịch M100
Marker
01 ống
200
100bp
6 Dung dịch LD100

Loading dye 01 ống
200


- 13 -

7 Chứng dương

ADN nấm
C.neoforma
ns
ADN người

01 ống

200

8 Chứng âm
01 ống
200
9 Hướng dẫn sử dụng
01 tờ
Bộ sinh phẩm được đóng gói gồm 08 thành phần với 10 ống hóa
chất kèm theo một bản hướng dẫn sử dụng bằng tiếng Việt (Phụ lục).

Hình 3.16. Bộ sinh phẩm nested - PCR chẩn đoán C. neoformans
Ngoài hộp gồm có nhãn hộp có đầy đủ thông tin về lô sản xuất, ngày hết
hạn, điều kiện bảo quản, nơi sản xuất.
3.2. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh
phẩm chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans trong DNT

Bảng 3.27. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên
các mẫu chuẩn
Kết quả kit
Mẫu chuẩn
Tổng
nested–
số
PCR
Có
C. Không có C.neoformans
neoformans
Dương tính 60
0
60
Âm tính
0
40
40
Tổng số
60
40
100
Độ nhạy Se = 100%, Độ đặc hiệu Sp = 100%


- 14 -

Bộ sinh phẩm nested PCR thử nghiệm trên của chủng chuẩn độ nhạy, độ
đặc hiệu đều là 100%.
3.2.2.2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên DNT nhiễm giả định

Bảng 3.32. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên
các mẫu nhiễm giả định nồng độ từ 102CFU/ ml trở lên
Kết quả kit
Mẫu chuẩn
Tổng
Nested – PCR
số
Có
C. Không
có
C.
neoformans
neoformans
Dương tính
74
0
74
Âm tính
6
40
46
Tổng số
80
40
120
Độ nhạy Se = 92,5%; Độ đặc hiệu Sp = 100% ;
Giá trị tiên đoán dương: 100%
Giá trị tiên đoán âm: 87%
Bảng 3.34. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên
các chủng C. neoformans phân lập ở Việt Nam

Kết quả kit
C.neoformans phân lập ở VN
Tổng số
nested – PCR Có C. neoformans Không
có
C.neoformans
Dương tính
102
0
102
Âm tính
0
40
40
Tổng số
102
40
142
Độ nhạy Se = 100%; Độ đặc hiệu Sp = 100%
3.2.2.2. Kết quả đánh giá độ tương đồng của bộ sinh phẩm trên mẫu
DNT bệnh nhân VMN
Bảng 3.36. Độ nhạy, độ đặc hiệu so với phương pháp nuôi cấy
Kết quả kit
Phương pháp nuôi cấy
Tổng số
nested – PCR
Dương tính
Âm tính
Dương tính
7

0
7
Âm tính
1
112
113


- 15 -

Tổng số
8
112
120
Độ nhạy Se = 87,5%; Độ đặc hiệu Sp = 100%;
Giá trị tiên đoán dương: 100%; Giá trị tiên đoán âm: 99,1%
Bảng 3.37. Độ tương đồng so với phương pháp soi tươi
Kết quả kit
Phương pháp soi tươi nhuộm mực Tổng số
nested – PCR tàu
Dương tính
Âm tính

Dương tính
5
2

Âm tính
2
111

7
113

Tổng số

7

113

120

Tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 96,7%
Tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe: 89,0%
K = 0,697
Bảng 3.38. Độ tương đồng so với bộ sinh phẩm của Norgen
Kết quả kit
Bộ sinh phẩm Norgen
Tổng số
nested – PCR
Dương tính
Âm tính
Dương tính
7
0
7
Âm tính
0
113
113

Tổng số
7
110
120
Độ nhạy Se = 100%; Độ đặc hiệu Sp = 100%; Giá trị tiên đoán dương:
100%; Giá trị tiên đoán âm: 100%; K = 1
So sánh kết quả xét nghiệm giữa bộ sinh phẩm nested-PCR với
bộ sinh phẩm Norgen hệ số tương đồng giữa 2 phương pháp xét nghiệm
là 1-hoàn toàn tương đồng.
3.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm định chất lượng bộ sinh
phẩm chế tạo ra
Bảng 3.39. Tóm tắt tiêu chuẩn cơ sở
TT Chỉ tiêu đánh giá
Tiêu chuẩn cơ sở
1 Nhận dạng
Phản ứng PCR2 cho bang kích thước 135
bp đặc trưng cho nấm C.neoformans


- 16 -

2 Độ nhạy
≥ 95%
3 Độ đặc hiệu
≥ 99%
4 Ngưỡng phát hiện
≥ 10pg/µl
5 Thời gian phát hiện
Không quá 48 giờ
6 Độ ổn định

≥ 12 tháng
7 Bảo quản
- 20oC
3.2.3.2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR
tại Viện kiểm định quốc gia về vắc xin và sinh phẩm y tế
Viện kiểm định quốc gia về vắc xin và sinh phẩm y tế có giấy
chứng nhận kết quả kiểm định số 00515/SPCD-NC kết luận bộ sinh
phẩm chẩn đoán nested-PCR phát hiện nấm C. neoformans loạt số
#A011-02 do Học viện quân y sản xuất có độ nhạy đạt 99,11%; độ đặc
hiệu 100%; ngưỡng phát hiện 0,4pg/µl khi thực hiện trên bộ mẫu chuẩn
của nhà sản xuất.
Chương 4. BÀN LUẬN
4.1. Về kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm
nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn được cặp mồi cho PCR1 là
ITS1, ITS4, các cặp mồi của vòng 2 là CN4, CN5 cho nấm C.
neoformans. Cặp mồi CN4, CN5 nhân đoạn gen nằm trong đoạn khuếch
đại bởi cặp mồi ITS1, ITS4. Đây là cặp mồi được nhiều tác giả sử dụng
trong nghiên cứu về các loài nấm C. neoformans và một số vi nấm gây
bệnh khác.
Cặp mồi CN4, CN5 đã được Mitchell TG và cs (1994) nghiên
cứu phát hiện nấm C. neoformans từ năm 1994 [46]. Nghiên cứu của
Martins MA. và CS (2015) cho thấy, bằng cặp mồi CN4, CN5, 100%
các mẫu DNA của nấm C. neoformans cho kết quả dương tính và trên
bệnh phẩm dịch não tủy nhiễm C. neoformans tỷ lệ dương tính là 94,8%
[102]. Cidiane GM và CS (2016) sử dụng cặp mồi CN4, CN5 trong phản


- 17 -

ứng realtime PCR phát hiện nhiễm C. neoformans[14]. … Cặp mồi này
được sử dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu về nấm C. neoformans
cho thấy, vị trí của sợi ADN nấm C. neoformans là các vị trí ít có sự
biến đổi. Trình tự các mồi CN4, CN5 lại đặc hiệu cho C. neoformans.
Điều này cũng chỉ ra rằng, lựa chọn cặp mồi này để nhân gen nấm C.
neoformans là rất phù hợp.
4.1.2.2. Về kết quả xác định các điều kiện của kỹ thuật nested PCR
phát hiện C. neoformans gây VMN
Từ kết quả lựa chọn các cặp mồi, chúng tôi đã xác định được các
điều kiện cho phản ứng PCR để khuếch đại ADN của các vi nấm. Theo
đó, phản ứng PCR với các cặp mồi ITS1, ITS4 có kết quả tốt khi Mg2+ =
2,0mM, mồi 0,1µM, nồng độ ADN đưa vào phản ứng PCR từ 10pg đến
10ng, nhiệt độ gắn mồi 56oC. So với các nghiên cứu trên thế giới, các
điều kiện có nhiều điểm phù hợp và không phù hợp [105], [106]. Tuy
nhiên, ở hầu hết các nghiên cứu, 2 điều kiện quan trọng nhất là nồng độ
Mg2+ đều từ 1,5 đến 2,0mM và nhiệt độ gắn mồi của cả 2 cặp mồi 55oC
đến 56oC. Kế t quả xác định ngưỡng phát hiện cho thấ y, nested - PCR cho
phép nhìn rõ và kết quả ổn định khi lượng ADN nấm đưa vào 25μl phản
ứng PCR1 > 1pg. Một số tác giả đã phát triển kỹ thuật nested-PCR để phát
hiện nấm riêng lẻ các C. neoformans, C. albicans như Paola Rappelli và
cs (1998) [52], Jahromi S. B và cs (2006) [27], Victor A. Makene và cs
(2013) [107] cho kết quả ngưỡng phát hiện nhạy hơn nghiên cứu này (có
thể phát hiện khi nồng độ ADN nấm thấp hơn 1pg). Guizhen Luo và cs
(2002) sử dụng kỹ nested multiplex-PCR để phát hiện C. albicans, C.
glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. neoformans và A. fumigatus
[108]; Taira CL và cs (2014) [64] sử dụng kỹ thuật Nested Multiplex-PCR
để phát hiện 7 căn nguyên Candida gây nhiễm nấm máu ở trẻ sơ sinh
cũng cho kết quả ngưỡng phát hiện thấp hơn nghiên cứu của chúng tôi.
Điều này có thể do số chu kỳ trong các phản ứng khác nhau. Các tác giả
thường chạy PCR1 với số chu kỳ là 35, PCR2 với 20 chu kỳ. Trong khi

- 18 -

đó, số chu kỳ ở cả 2 vòng trong nghiên cứu này đều là 25... Do đó, cần
phải tiếp tục tìm hiểu, đánh giá để hạ thấp ngưỡng phát hiện và nâng cao
hiệu quả chẩn đoán. Mặc dù vậy, đây là những kết quả cho thấy tiềm năng
ứng dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán nhiễm C. neoformans ở Việt Nam.
4.2. Bàn luận về độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR
chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans trong dịch não tủy.
Để đánh giá được độ nhạy, độ đặc hiệu của một sinh phẩm chẩn đoán
cần so sánh kết quả xét nghiệm bằng bộ sinh phẩm muốn đánh giá với
chuẩn vàng trên các nền mẫu khác nhau. Đồng thời so sánh với các bộ
sinh phẩm, các phương pháp xét nghiệm đã được đánh giá và thương
mại hóa trên thị trường.
Trước hết đánh giá bộ sinh phẩm trên các mẫu chuẩn, đây cũng là cơ sở để
xác định được ngưỡng phát hiện, mẫu chuẩn bao gồm chuẩn dương, chuẩn
âm, chuẩn trắng. Bước tiếp theo đánh giá bộ sinh phẩm trên các mẫu nhiễm
giả định trên nền mẫu mà chúng ta tiến hành phân tích đối với các mẫu xét
nghiệm thông thường. Cuối cùng là đánh giá trên các mẫu dịch não tủy thu
từ các bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng viêm màng não.
Các bước đánh giá trên mẫu chuẩn và giả định thường được các nhà sản xuất
tiến hành trong quá trình xây dựng cũng như thử nghiệm lại trên bộ sinh phẩm.
Cũng như hầu hết các nghiên cứu, độ nhạy độ đặc hiệu của bộ
sinh phẩm chẩn đoán trên các mẫu chuẩn sẽ phản ánh độ nhạy, độ đặc
hiệu của phương pháp tạo nên bộ sinh phẩm. Đối với các bộ sinh phẩm
dựa trên kỹ thuật PCR độ nhạy, độ đặc hiệu trên mẫu chuẩn phản ánh độ
nhạy, độ đặc hiệu của các cặp mồi và quy trình thực hiện phản ứng PCR.
Ở hầu hết các trường hợp, nếu không có sự nhiễm chéo thì độ nhạy và
độ đặc hiệu đều đạt 100%.

4.2.2.2. Bàn luận về kết quả đánh giá độ tương đồng của bộ sinh phẩm
tạo ra trên mẫu DNT bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng VMN
Hầu hết các công bố về độ nhạy, độ đặc hiệu của các kỹ thuật hoặc bộ
sinh phẩm được đánh giá trên các mẫu lâm sàng. Đây cũng là cơ sở để


- 19 -

đánh giá chất lượng của các bộ sinh phẩm.
Sử dụng 120 mẫu dịch não tủy thu thập từ các bệnh nhân có các biểu
hiện lâm sàng viêm màng não từ Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch và Bệnh
viện Quân Y để thử nghiệm chẩn đoán bằng bộ sinh phẩm nested-PCR
rồi so sánh với các phương pháp xét nghiệm truyền thống bao gồm: soi
tươi nhuộm mực tàu, nuôi cấy và 01 bộ sinh phẩm đã được thương mại
hóa trên thị trường là bộ sinh phẩm Cryptococcus neoformans PCR Kit
EP-42720 của hãng Norgen.
Kết quả ở bảng 3.35 cho thấy trong 120 mẫu nghiên cứu đã xác định có
6/120 mẫu dương tính với nấm C.neoformans bằng phương pháp soi tươi
nhuộm mực tàu; 8/120 mẫu dương tính bằng phương pháp nuôi cấy; tỷ
lệ này ở bộ sinh phẩm nested PCR là 7/120 và bộ sinh phẩm Norgen là
7/120. Tỉ lệ nhiễm C. neoformans trong dịch não tủy là 6,67% với
phương pháp nuôi cấy.
3.36 cho thấy kết quả so sánh giữa bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02
với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu cho giá trị tiên đoán dương là
71,4% và giá trị tiên đoán âm là 98,2%. Hệ số tương đồng giữa 2
phương pháp xét nghiệm là 0,697.
Bảng 3.37 cho thấy kết quả so sánh giữa bộ sinh phẩm nested-PCR
#A011 - 02 với phương pháp nuôi cấy có độ nhạy là 87,5% ; độ đặc hiệu
100% ; giá trị tiên đoán dương là 100%và giá trị tiên đoán âm là 98,2%.
Hệ số tương đồng giữa 2 phương pháp xét nghiệm là 0,929 mức tương

đồng cao.
Bảng 3.38 cho thấy hệ số tương đồng giữa 2 bộ sinh phẩm PCR là 1 ở
ngưỡng tương đồng rất cao; độ nhạy đạt = 100%; độ đặc hiệu 100%. Giá
trị tiên đoán dương là 100%và giá trị tiên đoán âm là 100%.
Kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu của Hetal và cs (2011)
khi đánh giá tính khả năng áp dụng của que thử nhanh để chẩn đoán
viêm màng não tủy do nấm C. neoformans trên 63 mẫu dịch não tủy đã
xác định tỷ lệ nhiễm nấm là 14,28% bằng phương pháp latex; 11,11%


- 20 -

bằng phương pháp nhuộm mực tàu; 9,5% bằng phương pháp nuôi cấy
[84]. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp nhuộm mực tàu là 83,3%
và 96,49%. Trong khi đó các giá trị này ở phương pháp Latex là 100%
và 94,7% so với phương pháp nuôi cấy [84]. Tuy nhiên trong nghiên cứu
của Hetal thì khả năng phát hiện của phương pháp nhuộm mực tàu cao
hơn phương pháp nuôi cấy. Trong khi nghiên cứu của chúng tôi thì
ngược lại, phương pháp nuôi cấy cho tỷ lệ kết quả xét nghiệm dương
tính cao nhất, sau đó lần lượt là các phương pháp xét nghiệm bằng kỹ
thuật PCR, phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu cho kết quả thấp nhất.
quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ mẫu dịch não tủy dương
tính với nấm được phát biện bằng bộ sinh phẩm nested-PCR #A011-02
cao hơn kỹ thuật soi tươi nhuộm mực tàu nhưng thấp hơn kỹ thuật nuôi
cấy và tương đương với bộ sinh phẩm của hãng Norgen (Canada).
Chúng tôi cũng nhận định rằng, nếu lượng dịch não tủy quá ít có thể ảnh
hưởng tới kết quả phân tích vì mật độ nấm trong dịch não tủy thường rất
thấp [30]. Khi phân tích bằng kỹ thuật truyền thống đối với soi tươi và
nuôi cấy, chúng tôi thường phải ly tâm, loại bỏ dịch nổi để tập trung nấm
thông thường khoảng 3-5 lần sau đó mới tiến hành kỹ thuật. Hơn nữa,

trong thực tế các mẫu dịch não tủy thường được ưu tiên thực hiện chẩn
đoán bằng các kỹ thuật truyền thống trước sau đó phần còn lại mới tiến
hành thử nghiệm bằng kỹ thuật sinh học phân tử nên lượng bệnh phẩm
còn lại có khi rất ít. Đây có thể cũng là một nguyên nhân dẫn đến sự
khác biệt giữa kết quả của kỹ thuật nested-PCR thấp hơn so với nuôi cấy.
chỉ số giá trị tiên đoán dương tính, giá trị tiên đoán âm tính và chỉ số
phù hợp chẩn đoán K appa đã được sử dụng để đánh giá hiệu quả
của các bộ sinh phẩm.
bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02, so với kỹ thuật nuôi cấy ở
bảng 3.37 trong chẩn đoán nhiễm C.neoformans kỹ thuật này cho giá
trị tiên đoán dương 100%, giá trị tiên đoán âm 99,1% và chỉ số phù
hợp chẩn đoán là 0,929. Các kết quả này chỉ ra rằng, phương pháp


- 21 -

nested PCR cho giá trị tiên đoán dương và mức độ phù hợp cao so với
nuôi cấy. Điều này có nghĩa là 100% những trường hợp chẩn đoán
dương tính bằng kỹ thuật nested PCR có thể nghĩ tới nhiễm nấm
C.neoformans thực sự và 99,1% không nghĩ tới nhiễm C.neoformans
khi kỹ thuật nested PCR cho kết quả âm tính. Nếu coi nuôi cấy là
phương pháp chuẩn vàng để so sánh thì trong chẩn đoán C.
neoformans ở dịch não tủy, bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 có
độ nhạy Se=87,5%, độ đặc hiệu Sp=100%. K ết quả này chỉ ra bộ
sinh phẩm có tỷ lệ chẩn đoán dương tính ở những bệnh nhân thực sự
nhiễm C.neformans ở dịch não tủy là 100% và tỷ lệ chẩn đoán đúng
là âm tính với C.neformans ở dịch não tủy của bộ sinh phẩm là
99,1%.

- 22 -

KẾT LUẬN
1. Xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR
chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans
Đã xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán
nhiễm nấm C.neoformans tóm tắt như sau:
Bước 1. Lựa chọn 2 cặp mồi cho 02 phản ứng PCR với trình tự như sau
+ Phản ứng PCR1: ITS1 F: 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’;
ITS4 R:5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’
+ Phản ứng PCR2: CN4 F: 3’-ATC ACC TTC CCA CTA ACA CAT T5’; CN5 R: 3’-GAA GGG CAT GCC TGT TTG AGA G-5’
Bước 2. Xây dựng các điều kiện cơ bản cho kỹ thuật nested-PCR phát
hiện C. neoformans trong dịch não tủy
+ Điều kiện cho phản ứng PCR1:
Thành phần phản ứng: Nồng độ dNTPs 200µM, mồi 0,02µM, Mg2+
2,0 mM, nồng độ Taq DNA polymerase là 0,5U trong 25 µl thể tích
phản ứng. Chu trình nhiệt là: 1 chu kỳ 94oC/5 phút; 25 chu kỳ, mỗi chu
kỳ 94oC/40 giây, 56oC/40 giây, 72oC/40 giây; 1 chu kỳ 72oC/7 phút.
+ Điều kiện cho phản ứng PCR2:
Thành phần phản ứng: Nồng độ dNTPs 200µM, mồi 0,02µM, Mg2+ 2,0
mM, nồng độ Taq DNA polymerase là 0,5U trong 25 µl thể tích phản
ứng.
Chu trình nhiệt như PCR1 nhưng ở nhiệt độ gắn mồi là 57oC.
Bước 3. Xác định ngưỡng phát hiê ̣n của kỹ thuật nested-PCR: ≥ 102
CFU/ml trong dịch treo nấm;
Bước 4. Xây dựng chứng dương cho phản ứng PCR: Chứng dương là
ADN được tách chiết, từ chủng chuẩn ATCC® 90113 Chứng dương
được đo nồng độ ADN và được điều chỉnh đến nồng độ 0,5 ng/µl.