Sắc ký lớp mỏng dược liệu chứa saponin

GVHD: Ths. Đỗ Văn Mãi

1


I. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG
- Sắc kí lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật
sắc kí được dùng để tách các chất trong hỗn hợp.
- Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm:
•Pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel,
aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất
trơ.
•Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong
một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc kí bởi mao dẫn, tách
dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong
dung dịch.
2


QUAN
KÝ
LỚP
MỎNG
HệI.sốTỔNG
di chuyển
Rf làVỀ
đạiSẮC
lượng
đặc
trưng
quan trọng về mức độ

tách. Hệ số di chuyển Rf được tính theo công thức:

Trong đó:
- a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử,
tính bằng cm.
- b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo
trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm.
- Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l.
3


I. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG
Khi Rf = 0 thì chất tan hoàn toàn không di chuyển, còn khi Rf = 1
thì chất tan di chuyển bằng tốc độ của dung môi. Có nhiều yếu tố
ảnh hưởng đến Rf nhưng quan trọng là:
 Chất lượng và hoạt tính chất hấp thụ.
 Bề dày của lớp mỏng.
 Chất lượng và độ tinh khiết của pha động.

4


I. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG

- Một số cải tiến có thể kết hợp phương pháp truyền thống để
tự động hóa một vài bước, làm tăng độ dung giải của sắc kí
lớp mỏng và cho số liệu chính xác hơn.
 Phương pháp này được gọi là sắc kí lớp mỏng hiệu năng
cao (high performance TLC - HPTLC).

5


II. Các bước chuẩn bị sắc ký lớp mỏng

- Chọn chất hấp phụ: cũng tương tự như sắc ký cột có thể
dùng các chất hấp phụ là silicagel, nhôm oxit, bột cellulose,
tinh bột, sephadex...
- Để cho chất hấp phụ bám chắc vào phiến kính, người ta cho
thêm chất dính vào chất hấp phụ. Chất dính thường là CaSO4
với tỷ lệ khoảng 10%.
6


II. Các bước chuẩn bị sắc ký lớp mỏng
- Chuẩn bị phiến kính và lớp mỏng chất hấp phụ trên kính:
•Các phiến kính thường có cỡ 20x5 cm, 20x20 cm, 7,5x2,6 cm. Rửa
sạch, sấy khô trước khi rải.
• Cân 5g bột silicagel cho vào cối nghiền đều với 10ml nước cất,
lượng này có thể rải trên 2 phiến kính cỡ 20x5cm.
Sau đó rải ngay lên phiến kính bằng tay hoặc bằng máy.
• Để khô ở nhiệt độ phòng sau đó sấy ở 1000C từ 30 - 120 phút tuỳ
theo yêu cầu. Độ dày chuẩn của lớp mỏng là 0,25 - 0,30 mm.
7


II. Các bước chuẩn bị sắc ký lớp mỏng

- Chuẩn bị mẫu thử: cũng giống như sắc ký giấy, các mẫu thử
cần có cách chuẩn bị riêng để loại bỏ tạp chất và cô đặc

mẫu.
- Dùng ống vi quản chấm mẫu cách bờ dưới phiến kính
khoảng 1-2 cm. Vết chấm phải nhỏ, đường kính 2 - 5 mm
cách xa nhau ít nhất 1 cm.
8


Một số dụng cụ cho SKML
 Bình triển khai

9


Một số dụng cụ cho SKML
 Bảng mỏng tráng sẳn

10


Một số dụng cụ cho SKML

Uv lamps cabinet 365, 254nm
Mao quản

Máy sấy bảng mỏng
11


III. Một vài hệ dung môi dùng để khai triển trên các bản

silicagel-G:
1. mỏng
Saponin
triterpenoid:
a) Chloroform – methanol – nước (65:35:10)

b) Ethyl acetat – acid acetic – nước (8:2:1)
c) n-butanol – ethanol
12


III. Một vài hệ dung môi dùng để khai triển trên các bản

silicagel-G:
2.mỏng
Saponin
nhóm spirostan:
a)Chloroform – methanol – nước (65:35:10)

b) Chloroform – methanol (8:2)
c) n-butanol bão hòa nước
13


III. Một vài hệ dung môi dùng để khai triển trên các bản

silicagel-G:
3.mỏng
Saponin
kiềm:

a) Chloroform – ethanol – dung dịch amoniac 1%
trong nước (2:2:1)

b) Ethanol – pyridin – nước (3:1:3)

14


 Dung môi phải là loại tinh khiết, thường dùng hỗn
hợp 2-3 các dung môi.
Các dung môi xếp theo thứ tự mạnh dần (sức đẩy,
phản hấp phụ): hexan, heptan, cyclohexan, carbon
tetraclorid, benzen, cloroform, butyl acetat, ether, ethyl
acetat, pyridin, aceton, ethanol, methanol, nước.
15


IV. Tiến hành SKLM
 Chiết xuất và tinh chế sơ bộ Saponin.
 Chấm dung dịch trên bản mỏng.
 Triển khai SKLM.
 Cách phát hiện.

16


17


Chấm mẫu thử

 Kẻ một vạch thẳng nằm ngang bằng bút chì, cách mép dưới của bản mỏng 1cm làm vạch xuất phát.
 Dùng mao quản hay micropipet chấm các vết dung dịch thử và dung dịch chuẩn lên đó. Các vết phải cách nhau và cách mép bản
mỏng ít nhất 1 cm.

18


Triển khai SKLM
 Quá trình cho pha động chạy, kéo mẫu phân tích di chuyển trên pha tĩnh.
 Đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hoà hơi dung môi của pha động, mép phía chấm mẫu được nhúng vào dung môi động nhưng không
được cho điểm đã chấm mẫu chạm trực tiếp vào dung môi động.
 Sau khi dung môi chạy được nửa hay 2/3 bản mỏng ta lấy ra để khô hay sấy khô.

19


Cách phát hiện
 Dựa vào tính phá huyết bằng cách tráng một lớp gelatin – máu (hòa tan 5 g gelatin trong 100 ml dung dịch NaCl 9% ở 60 0C.Khi
nguội đến 400C thì thêm máu bò đã loại fibrin) hoặc phun dung dịch treo máu 2% đã loại fibrin trên bản mỏng.
 Các vết saponin sẽ cho vết mầu nhạt trên nền hồng đỏ.

20


Cách phát hiện
 Các thuốc thử dưới đây dùng cho loại saponin và sapogenin nên sau khi phun cần phải sấy 10 phút ở 1100C rồi quan sát mầu ở ánh
sáng thường hoặc ánh sáng tử ngoại (365nm):

 Thuốc thử Carr – Price (dung dịch SbCl3 bão hòa trong chloroform).
 Thuốc thử Liebermann – Burchard.

 Thuốc thử Salkowski, acid phosphomolibic 10% trong ethanol, acid
phosphotungstic 20% trong ethanol, dung dịch acid phosphoric 50%
trong nước, dung dịch vanillin – sulfuric.
 Các vết saponin sẽ cho các mầu khác nhau, tùy loại thuốc thử saponin.

21


Cách phát hiện
 Saponin nhóm spirostan có thể hiện màu bằng thuốc thử Sannié (dung dịch A: vanillin 1% trong cồn, dung dịch B: anhydrid acetic +
H2SO4 12:1).
 Phun dung dịch rồi sấy 1200 trong 3 phút sau đó phun dung dịch B, vết saponin có mầu vàng.
 Đối với nhóm spirostan và nhóm steroid alcaloid có thể dùng thuốc thử Carr – Price để phân biệt các dẫn chất có nối đôi và không
có nối đôi ở vị trí C-5. Các dẫn chất C5 có mầu đỏ ở 200C và tím đỏ sau khi sấy 1050C.

22


Cách phát hiện
 Cũng có thể phân biệt 2 loại dẫn chất trên bằng thuốc thử Marquis (0,2 ml dung dịch formaldehyd 37% trong nước + 10 ml H 2SO4),
chỉ có loại dẫn chất của C5 cho phản ứng.
 Các saponin nhóm spirosolan và solanidan có thể phát hiện bằng thuốc thử Dragendorff.

23


V. Ứng dụng và công dụng của SKLM
 Ứng dụng:








24

Định tính.
Định lượng (phải có chất chuẩn).
Phát hiện thành phần trong hỗn hợp, định tính điểm chỉ.
Theo dõi thành phần các chất.
Phân lập các chất.


V. Ứng dụng và công dụng của SKLM
 Công dụng:







25

Xét nghiệm độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dược khoa.
Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật.
Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn.
Nhận biết những hóa chất trong một chất cho sẵn.
Giám sát các phản ứng hữu cơ.