Báo cáo thực hành môn hóa dược

BÀI 2:
ĐỊNH TÍNH CÁC KHÁNG SINH PENICILLIN VÀ KIỂM ĐỊNH
KHÁNG SINH CLORAMPHENICOL
Dụng cụ và hoá chất:

*Dụng cụ
- Ống nghiệm và mặt kính đồng hồ
- Bình định mức 50; 100; 250; 500 mL.
- Cốc thủy tinh dung tích 50; 100; 250; 500 mL.
- Ống đong dung tích 10; 25; 50; 100 mL
- Phễu lọc thủy tinh dung tích 250 mL
- Giấy lọc, giấy quỳ tím
- Đũa khuấy bằng thủy tinh, bếp điện hoặc bể điều nhiệt
- Bể siêu âm
*Hóa chất
- Các chế phẩm penicillin G, penicillin V, amoxicillin, cloramphenicol
- Acid sulfuric đậm đặc
- Acid nitric 2%
- Hydroxylamin hydroclorid 1 N
- Formaldehyd
- Thuốc thử Fehling (gồm Fehling A và Fehling B)
- Natri hydroxid 10%
- Bạc nitrat 2%

1


Nội dung thực hành
I. ĐỊNH TÍNH CÁC KHÁNG SINH PENICILLIN

Tên penicillin

………………………………………………………

Penicillin G

Penicillin V

Amoxicillin

1. Định tính chung: làm cùng lúc 3 chế phẩm ( Penicillin G, Penicillin V,
Amoxicillin).

2


- Lấy vài tinh thể chế phẩm cho lên mặt kính đồng hồ.

- Pha dung dịch gồm 1ml hydroxylamin hydroclorid 1N và 0,3ml dung dịch NaOH
1N, thêm 2 giọt dung dịch mới pha vào mỗi phần chế phẩm, trộn đều từng phần chế
phẩm.

3


- Sau 3 phút, cho thêm 1 giọt dung dịch acid acetic 1N vào mỗi phần chế phẩm, trộn.
Thêm 1 giọt CuSO4.

Quan sát hiện tượng: tủa màu xanh ngọc thạch.

2. Định tính phân biệt:
2.1 Phản ứng màu với H2SO4 đậm đặc: cho một ít chế phẩm ( cỡ hạt gạo) lên mặt

kính đồng hồ khô. Nhỏ 1 giọt H2SO4 đậm đặc vào quan sát ngay:
4


 Penicillin G: màu vàng nhạt.
 Penicillin V: màu vàng rất nhạt.
 Amoxicillin: màu vàng.

2.3 Phản ứng với thuốc thử Fehling: cho vài tinh thể chế phẩm vào ống nghiệm,
thêm 1ml nước cất, lắc đều. Pha thuốc thử Fehling ( 1ml Fehling A + 1ml Fehling B +
6ml nước cất, trộn đều), cho 2ml hỗn hợp thuốc thử Fehling vào ống nghiệm, quan sát:
 Penicillin G: sau 5 phút chuyển qua màu xanh thẫm.
 Penicillin V: cho màu xanh.
 Amoxicillin: màu đỏ tím.

5


II. Định tính Cloramphenicol:

6


1. Định tính:
- Cho một ít Cloramphenicol vào ống nghiệm, thêm 2ml dung dịch NaOH 10%. Đun
cách thuỷ xuất hiện màu vàng, đun tiếp chuyển sang màu da cam.

- Đun đến sôi: NH3 bay lên, có tủa đỏ gạch xuất hiện.

- Để nguội, acid hoá bằng HNO3 loãng (khoảng 3ml), lọc bỏ tủa. Thêm vào dịch lọc

vài giọt AgNO3 2%, xuất hiện tủa trắng.

7


III. Câu hỏi thảo luận:
Câu 1.Tại sao có tên vòng -lactam?
Lactam là amid nội vòng. Vòng -lactam = azetidin – 2 – on, vòng lactam đóng
ở vị trí ở phản ứng trùng ngưng.
Câu 2.Cơ chế của Penicillin? Vi khuẩn gram nào dễ bị tấn công hơn? Giải thích?
Penicillin tấn công vào các enzym kiến tạo thành tế bào của vi khuẩn. Thành tế
bào là một mạng lưới bao quanh và tạo cho vi khuẩn hình dạng cũng như sự toàn vẹn.
Một khi thành này bị thủng, vi khuẩn sẽ chết.
Beta-lactam gắn lên và làm bất hoạt transpeptidase (Penicillin Binding Protein) của vi
khuẩn, enzyme này có vai trò gắn các chuỗi peptidoglycan (chủ yếu tạo thành bởi Nacetyl glucosamine và N-acetyl muranic acid) lại với nhau. Như vậy, vi khuẩn sẽ
không gắn kết các chuỗi peptidoglycan lại để tạo thành vách được, vi khuẩn sẽ chết.
Vách tế bào vi khuẩn Gram- và Gram+ nhau và khác nhau ở những điểm cơ bản
nào? Giống nhau ở chỗ vách của hai loại này đều có sự góp mặt của peptidoglycan
nhưng khác nhau ở chỗ vi khuẩn Gram+ có lớp peptidoglycan dày hơn vi khuẩn
Gram-. Ở Gram-, có thêm lớp outer membrane, lớp này là lipopolysaccharide và
protein.
Do cả Gram- và Gram+ đều có cấu tạo vách bằng peptidoglycan nên Penicillin
có thể tác động đến quá trình hình thành vách làm vi khuẩn chết đi. Tuy nhiên, do ở vi
khuẩn Gram- có thêm lớp outer membrane xem như lớp bảo vệ nên tác dụng của
penicillin lên Gram- thì ít hơn lên Gram+.
Câu 3.Tại sao Penicillin G dùng đường tiêm, Pencillin V dùng đường uống?
8


Penicillin G không uống được do điện tử tập trung nhiều ở amid nội vòng có

xu hướng phá vỡ vòng để giải phóng điện tử, khi H + (trong dịch vị) đi qua điện tử sẽ
được cho H+ và vòng amid vỡ  kháng sinh mất tác dụng.
Penicillin V nhóm phenoxy hình thành tâm hút điện tử rất lớn  hút điện tử 
giữ nguyên vòng amid  bền trong acid dịch vị. .
Câu 4.Tại sao Amoxcillin uống được?
Amoxcillin uống được do cấu trúc tương tự phenicillin V, có nhóm amino hút
điện tử nên vòng amid không bị phá vỡ trong môi trường H+ dạ dày.
Câu 5.Fehling A, Fehling B là chất gì? Tại sao không trộn sẵn thuốc thử Fehling
trước?
Thuốc thử Fehling có 2 loại là Fehling A có công thức CuSO 4 và Fehling B là
hỗn hợp của NaOH với muối tartrate của Na và K có công thức NaOOC-CHOHCHOH-COOK (trong đó -OOC-CHOH-CHOH-COO- là gốc tartrate)
Khi trộn Fehling A và Fehling B với nhau thì lúc đầu sẽ xảy ra phản ứng tạo
kết tủa Cu(OH)2, sau đó Cu(OH)2 phản ứng tiếp với muối tartrate tạo phức đồng
tartrate màu xanh
2Na+ + 2C4H4O62- + 2K+ + Cu2+ + 2OH- = Cu(C4H4O6)24- + 2Na+ + 2K+
Hiện tượng hóa học : khi cho andehit vào dung dịch thuốc thử Fehling (A và B) thấy
xuất hiện kết tủa đỏ gạch. Dùng Fehling để cho phản ứng xảy ra dễ,đẹp, hiện tương rõ
ràng hơn là dùng Cu(OH)2 được điều chế từ NaOH và CuSO4, vì có thể nó bị phân hủy
tạo ra chất màu đen.
Nguyên nhân là để lâu thì phức đồng tartarate không bền để lâu phân giải ra
2+

Cu

Cu2+ +2 NaOH  Cu(OH)2 + 2Na+
Khi đó Cu(OH)2 kết tủa làm Fehling không thể làm thuốc thử được nữa.

Câu 6.Cơ chế tác động của Cloramphenicol?
Gắn vào tiểu phần 50S của ribosome nên ngăn cản ARNm gắn vào
ribomsome, đồng thời ức chế transferase nên acid amin được mã hoá không gắn được

vào polypeptid.

9


BÀI 3: TỔNG HỢP KHÁNG SINH SULFACETAMID
I. Dụng cụ và hoá chất:
1. Dụng cụ:
-Ống nghiệm và mặt kính đồng hồ.
-Bình định mức 50 ; 100 ; 250 ; 500 mL.
-Cốc thủy tinh, bình tam giác dung tích 50 ; 100 ; 250 ; 500 mL.
-Ống đong dung tích 10 ; 25 ; 50 ; 100 mL.
-Phễu lọc thủy tinh dung tích 250 mL.
-Giấy lọc, giấy đo pH.
-Than hoạt tẩy màu.
-Đũa khuấy bằng thủy tinh.
-Bể điều nhiệt.
-Hệ thống lọc dưới áp suất giảm.
-Tủ sấy.
2. Hoá chất:
-Sulfanilamid
-Anhydrid acetic (acid acetic băng).
-Kẽm clorid 50% trong acid acetic băng.
-Hydroxylamin hydroclorid 1 N .
-Dung dịch NH3 đậm đặc.
-Acid clohydric 10%.
-Natri hydroxid 30% và 10%.

10

NỘI DUNG THỰC HÀNH
1. Cơ chế tác dụng của Sulfacetamid.
PABA (para amino benzoic acid) là nguồn nguyên liệu cần thiết cho vi khuẩn
tổng hợp acid folic để phát triển. Do có cấu trúc hóa học gần giống với PABA
nên sulfacetamid đã tranh chấp với PABA ngăn cản quá trình tổng hợp acid folic
của vi khuẩn.
Ngoài ra, sulfacetamid còn ức chế Dihydropteroat syntase , một enzym tham gia
tổng hợp acid folic.
Pteridin + PABA
Dihydropteroat syntase

SUNFAMID

Dihydropteroic acid
Glutamat

Dihydrofolic acid
NADPH

NADP
Tetrahydrofolic acid

Metylen tetrahydrofolat
Thymidilat, base purin, pyrimidin

DNA
11

12


2. Nguyên tắc
Sulfacetamid được điều chế từ sulfanilamid bằng phản ứng acetyl hóa và thủy phân
không hoàn toàn.
3.Cơ chế phản ứng.

13


4. Tiến hành thí nghiệm
1. Chuẩn bị nồi cách thuỷ ở 700C – 800C.
2. Cho 5g Sulfanilamid vào erlen 100ml đặt vào cách thuỷ ở 700C – 800C .Thêm vào
9ml anhydrid acetic và 2 - 3ml dung dịch ZnCl2 50% trong acid acetic băng. Khuấy
đều và giữ ở 750C trong 20 phút.

Kiểm tra phản ứng kết thúc bằng cách:
Cho một lượng hỗn hợp phản ứng bằng hạt bắp vào ống nghiệm chứa 10ml dung dịch
amoniac đậm đặc, hỗn hợp phải tan hoàn toàn.
Tại sao? Vì sản phẩm giai đoạn 1 có tính acid nên tan trong dung dịch và không tan
trong acid. Gốc SO2NCOOCH3 có tính acid.
Cho một lượng hỗn hợp phản tứng tương tự vào ống nghiệm chứa 10ml HCl 10%, hỗn
hợp không tan.
Thêm 50ml nước cất vào erlen, khuấy đều. Lọc thu tủa, rửa tủa bằng nước cất.
3. Chuyển tủa vào becher 100ml, thêm 40ml dung dịch NaOH 10%, khuấy cho tan hết.
Chuyển hỗn hợp vào erlen 250ml để thực hiện phản ứng
4. Chỉnh nhiệt độ nồi cách thuỷ xuống 450C
5. Đặt erlen vào trong bếp cách thủy ở 450C 60 phút. Kiểm tra phản ứng kết thúc bằng
cách: cho một lượng hỗn hợp phản ứng bằng nửa hạt bắp vào ống nghiệm chứa 10ml

HCl 10%, hỗn hợp tan hoàn toàn.
Tại sao? Vì sản phẩm giai đoạn 2 lưỡng tính (NH2 có tính base, SO2NHCOOCH3 có
tính acid) nên tan trong cả acid và base
6.Trung hoà sản phẩm bằng 40ml HCl 10% đến khi xuất hiện tủa (làm lạnh hỗn hợp
phản ứng). Để yên 3 phút cho kết tủa hoàn toàn, thêm HCl 10% đến khi pH = 1. Dùng
giấy vạn năng
7. Lọc áp suất giảm, rửa tủa sulfacetamid bằng nước cất khoảng 20ml sấy khô ở 60 oC.
14


Tính hiệu suất.

Dựa vào phương trình phản ứng ta có:

nsulfanilamid = nsulfacetamid =
vậy mlt = 0,029 . 214 = 6,206g
Sản phẩm thực hành.

msp =5,708 – 0,706 = 5,002g
Hiệu suất phản ứng:
H=

= = 80,59%

15


BÀI 4:
KIỂM ĐỊNH THUỐC KHÁNG LAO RIMIFON
I. Dụng cụ và hoá chất:

1.
Dụng cụ
• Ống nghiệm và mặt kính đồng hồ.
• Bình định mức 50, 100, 250, 500 ml.
• Buret 25 ml, Pipet 5ml, 1ml.
• Chậu thủy tinh.
• Cốc thủy tinh, Bình tam giác nút mài 50, 100, 250, 500 ml.
• Ống đong 10, 25, 50, 100 ml.
• Phễu thủy tinh 250 ml và đũa thủy tinh.
2.
Hóa chất
• Chế phẩm Rimifon.
• Natri nitroprussiat 5%.
• Natri hydroxid 10%.
• Acid clohydric 10%.
• Acid acetic loãng.
• Acid Clohydric đậm đặc.
• Dd CuSO4 5%.
• Dd Vanilin.
• Ethanol 70%
• Iod 0.1N
• Natri hydrocacbonat (rắn).
• Natri thiosulfate 0.1N
• Hồ tinh bột.
II. Tính chất của Rimifon:
1. Tên đầy đủ của Rimifon: Isonicotinoyl hydrazid.
2. Tính chất:
Bột kết tinh trắng hay tinh thể không màu, không
mùi. Dễ tan trong nước, hơi tan trong ethanol 96%, khó tan
trong cloroform, rất khó tan trong ether. Điểm nóng chảy

170oC – 174 oC.
III. Kiểm định Rimifon:
1. Định tính:
a. Phản ứng tạo phức với natri nitroprussiat:
 Hoà tan 0,01g chế phẩm vào 10ml nước, thêm vào 1ml dung dịch
này 3 giọt dung dịch natri nitroprussiat 5%, 3 giọt dung dịch NaOH 10%, 2 giọt acid
acetic loãng. Xuất hiện màu đỏ da cam.
 Thêm 3 giọt HCl đậm đặc, chuyển sang màu nâu đỏ. Thêm HCl,
chuyển sang màu vàng.
b. Phản ứng tạo tủa với CuSO4:
 Hoà tan 0,1g chế phẩm vào 5ml nước, thêm 5 giọt dung dịch
CuSO4 xuất hiện màu xanh lam, có kết tủa.
16


 Đun nóng, màu xanh lam chuyển sang xanh ngọc thạch, có bọt

khí bay lên.
2. Định lượng:
a. Cân chính xác 0,1g chế phẩm cho vào erlen nút mài 250ml, hoà tan trong
100ml nước cất, thêm 2g NaHCO3, 50ml dung dịch Iod 0,1N.
b. Để yên trong tối 30 phút, sau đó để 10 phút trong đá và trong tối.
c. Thêm từ từ 20ml HCl 10%.
d. Vẫn làm lạnh, định lượng bằng Na2S2O3 0,1N với chỉ thị hồ tinh bột (cho
vào dung dịch màu vàng nhạt).
e. Tiến hành một mẫu trắng cùng điều kiện.
IV. Câu hỏi thảo luận:
1. Tại sao có bọt khí bay lên ở phản ứng với CuSO4?
Khi cho CuSO4 vào sẽ có màu xanh và tủa, đun nóng lên xanh rồi đến xanh
ngọc của Cu2+{6N-[C(O)]=NNH2}2 sẽ có bọt khí bay lên của N 2 và tủa đỏ của Cu2O

xuất hiện.
2. Viết phương trình phản ứng với Anillin tạo tủa?

3. Đọc quy trình định lượng, tìm: chất cần phân tích, chất chuẩn, chỉ thị, môi

trường, hiện tượng để kết thúc phản ứng, phương pháp chuẩn độ, kỹ thuật chuẩn độ.
a. Chất cần phân tích: Rimifon (isoniazid).
b. Chất chuẩn: Na2S2O3
c. Chỉ thị: hồ tinh bột
d. Môi trường: kiềm nhẹ
e. Hiện tượng kết thúc chuẩn độ: màu xanh của tinh bột và iod biến mất,
dung dịch trong suốt.
f. Phương pháp chuẩn độ: oxy hoá khử
g. Kỹ thuật chuẩn độ: chuẩn độ thế
4. Tại sao thêm NaHCO3, tại sao để trong tối, tại sao thêm đá, tại sao thêm
HCl?
a. Thêm NaHCO3 để tạo môi trường kiềm nhẹ
b. Để trong tối nhằm hạn chế sự thăng hoa của iod
c. Thêm đá hạn chế sự thăng hoa của iod, tăng độ nhạy của chỉ thị hồ tinh
bột.
d. Thêm HCl tạo môi trường acid yếu cho phản ứng của iod và natri
thiosulfat
5. Mẫu trắng là gì? Tại sao dùng mẫu trắng?
a. Mẫu trắng là mẫu có đầy đủ thuốc thử và thao tác giống như mẫu thử,
nhưng không có chất cần phân tích.
b. Dùng mẫu trắng để tìm thể tích iod thực đã phản ứng (thông qua chuẩn
độ trực tiếp bằng chất chuẩn Na2S2O3). Thể tích thực của iod này áp dụng vào tính toán
hàm lượng.
6. Viết phương trình phản ứng định lượng?
I2 + 2 Na2S2O3  2 NaI + Na2S4O6

17


7. Cơ chế tác dụng : Mặc dù isoniazid đã được sử dụng điều trị lao vài thập kỷ

và đến nay vẫn được coi là thuốc số một trong điều trị tất cả các thể lao nhưng cơ chế
tác dụng của thuốc vẫn còn chưa được giải thích đầy đủ.
• Theo Takayama và cộng sự
(1975), acid mycolic là một
thành phần quan trọng
trong cấu trúc
màng của trực khuẩn lao.
Giai
đoạn đầu của quá trình
tổng hợp
mycolic là sự kéo dài
mạch của acid nhờ
desaturase. Với nồng độ
rất
thấp của INH, enzym này
bị ức chế làm ngăn cản sự
kéo dài mạch của acid
mycolic dần dần giảm số
lượng lipid của màng vi khuẩn, vi
khuẩn không phát triển được.
• Ngoài ra, một số tác giả còn cho rằng, INH
tạo chelat với Cu2+ và ức chế cạnh tranh với
nicotinamid và pyridoxin làm rối loạn chuyển
hóa
của trực khuẩn lao.

8. Tính hàm lượng?
INH
0,36125

→

NH2NH2
0,36125

NH2NH2 + 2I2 → N2
0,36125

+

4HI

0,7225

I2 thừa + 2Na2S2O3

→

2Na + Na2S4O6

V1 Na2S2O3 = 38,2 ml
V1 Na2S2O3 = 38,75 ml
V1 Na2S2O3 = 37,5 ml

Vtb = 38,15ml

V mẫu trắng = 52,6 ml

C Na2S2O3 . V Na2S2O3 = C Iod . V Iod ( C Na2S2O3 = C Iod )
V Iod = V trắng - Vtb = 52,6 – 38,15 = 14,45 ml
CM I2 = CN/n = 0,1/2 = 0,05M
Số mol I2 phản ứng n= CM . V = 0,05. 14,45= 0,7225 (mmol)
Số mol Rimifon n= n I2 / 2= 0,36125 (mmol)
Khối lượng Rimofon m=n.M= 0,36125. 137= 49,49mg
18


Ta có:
0,1g chế phẩm → 49,49 mg Rimifon
m viên: 0,2971g

→147,03mg Rimofon

Hàm lượng thực tế trong chế phẩm
( 147,03/150) . 100 = 98,02%
Vậy hàm lượng thực tế là 98,02% Rimifon

19


BÀI 5: ĐIỀU CHẾ VÀ ĐỊNH TÍNH BẠC SULFADIAZIN
 DỤNG CỤ VÀ HOÁ CHẤT
*Dụng cụ
- Ống nghiệm và mặt kính đồng hồ
- Cốc thủy tinh bình tam giác dung tích 50; 100; 250; 500ml
- Ống đông dung tích 10; 25; 50; 100mL

- Chậu thủy tinh
- Giấy lọc, giấy đo pH
- Đũa khuấy bằng thủy tinh
- Máy khuấy từ
- Hệ thống lọc dưới áp suất giảm
- Tủ sấy
*Hoá chất
- Natri sulfadiazin và sulfadiazin
- Anhydrid acetic ( acid acetic băng )
- Acid clohydric 10%
- Natri hydroxid 1N và 0,4%
- Dung dịch bạc nitrat 0,5N
- Dung dịch Natri clorid
- Thuốc thử β-naphtol
- Dung dịch natri nitrit 1%
- Dung dịch đồng sulfat

20


NỘI DUNG THỰC HÀNH
I. ĐIỀU CHẾ BẠC SULFADIAZIN
1.Nguyên tắc
Trong môi trường kiềm, sulfadiazin chuyển về dạng natri sulfadiazin. Sau đó, chất này
sẽ kết hợp với AgNO3 để tạo tủa bạc sulfadiazin.

Tính chất
Bột trắng, sẫm màu khi tiếp xúc với không khí. Không tan trong cồn, ether, cloroform
Công dụng
Bạc sulfadiazin được sử dụng dưới dạng kem 1% để ngăn ngừa và điều trị nhiễm trùng

trong trường hợp bỏng nặng.

21


2.Thực hành.
2.1 Phương pháp 1 : Từ nguyên liệu sulfadiazin
-Hòa tan 1g sulfadiazin trong 3mL NaOH 1N. Điều chỉnh pH của dung dịch đến 9
bằng acid HNO3 loãng.

-Cho từ từ 12mL dung dịch AgNO3 0,5N ( vừa cho vừa khuấy đều ), kết tủa trắng xuất
hiện.

Tiếp tục khuấy trong 10 phút. Lọc lấy kết tủa trên phễu Buchner

22


Sấy sản phẩm ở 90 độ C trong tủ sấy chân không.( điểm nóng chảy khoảng 2550C,
kèm thủy phân)

II.ĐỊNH TÍNH BẠC SULFADIAZIN
Kết tủa bạc sulfadiazin sau khi được điều chế tiến hành định tính theo chuyên luận bạc
được quy định trong Dược điển Việt Nam IV
1.Phản ứng đặc trưng của nhóm amin thơm bận nhất (phản ứng diazo hoá)
Phản ứng diazao hoá:
Giai đoạn 1: Phản ứng bắt đầu là sự proton hoá acid nitro, rồi nitrozo hoá amin theo
quá trình chậm tại thành muối diazoni

Giai đoạn 2: Phản ứng β-naphtol với NaOH tạo muối khó tan trong nước, sau đó

muối này phản ứng với dd muối diazoni thu được ở giai đoạn 1 thực hiện phản ứng
ghép đôi azo và phản ứng này xảy ra theo cơ chế ái điện tử, không kèm theo sự giải
phóng N2

23


Hòa tan 0,1g chế phẩm (khoảng bằng hạt bắp) vào 2mL dung dịch HCl 10% và làm
lạnh trong nước đá. Thêm vào dung dịch trên 5mL dung dịch NaNO2 1%. Lấy 1 mL

dung dịch này cho vào 5mL dung dịch β-naphtol trong kiềm (pha ngay khi dùng), sẽ
sức hiện màu đỏ thẫm.

2.Phản ứng với CuSO4
Hoà tan 0,1g chế phẩm trong 3mL nước và 6 giọt NaOH 10%, lắc đều và lọc.

24


Thêm vào dịch lọc vài giọt CuSO4, xuất hiện kết tủa màu xanh hơi vàng và chuyển
sang màu tím khi để yên một thời gian.

*Tính hiệu xuất
-Số mol Sulfadiazin

=0,004 (mol)
-Số mol NaOH

CM =
n=CM .V = 1.0,003= 0,003 (mol)

-Số mol AgNO3

n AgNO3= CM.V= 0,5.12.10-3
CM=
Khối lượng Bạc Sulfadiazin là 357
Sản phẩm sấy là 1,885g, giấy lọc là 0,906
1,885 – 0,906 = 0,979g

H=
Câu hỏi thảo luận
25