Khảo sát khả năng ức chế escherichia coli và salmonella của vi khuẩn acid lactic phân lập từ các sản phẩm sữa có trên thị trường

TÓM TẮT NỘI DUNG
Vi khuẩn lactic có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống. Chúng sinh ra
nhiều chất kháng khuẩn để kháng các vi sinh v ật gây b ệnh. Do đó, vi ệc tìm ra
những chất kháng khuẩn sinh ra từ vi khuẩn lactic nhằm b ổ sung cho nh ững
nghiên cứu về chất kháng khuẩn và ứng dụng chất kháng khuẩn vào trong cu ộc
sống cũng như ứng dụng trong Dược học. Với đề tài “ Khảo sát khả năng ức chế
Escherichia coli và Salmonella của vi khuẩn acid lactic phân lập t ừ các s ản
phẩm sữa có trên thị trường” sử dụng môi trường MRS để phân lập và tuyển
chọn vi khuẩn lactic, sử dụng phương pháp nhuộm Gram, Catalase, Oxydase, kh ả
năng sinh hơi để định danh sơ bộ, sử dụng phương pháp khuếch tán gi ếng th ạch
và phương pháp nhỏ giọt để kiểm tra sự kháng lại vi khuẩn E.coli và Salmonella .
Kết quả cho thấy có tổng số 6 dòng vi khuẩn lactic được phân lập từ 16 mẫu s ữa
chua (được mua tại các siêu thị, tiệm tạp hóa, các cửa hàng bách hóa tại thành
phố Cần Thơ) cho vòng kháng khuẩn đối với dòng chỉ th ị. Đường kính vòng
kháng khuẩn từ 4,6 – 10,3mm. Như vậy, có thể sử dụng vi khuẩn lactic từ các sản
phẩm sữa chua trên thị trường để kháng lại vi khuẩn E.coli và Salmonella.

1


MỤC LỤC

2


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
E.Coli Escherichia coli
LAB Lactic acid bacteria
MRS Lactobacillus MRS Broth
TSA Lactobacillus MRS Broth
TSB Tryptic Soyabean Broth

SCA Simmon Citrate Agar

3


DANH SÁCH HÌNH
Hình 4. 1 Thử độ phân giải CaCO3 cuả LAB
Hình 4. 2 Kết quả nhuộm Gram
Hình 4. 3 Kết quả hoạt tính Catalase âm tính của 6 mẫu sữa chua
Hình 4. 4 Kết quả hoạt tính Oxydase âm tính
Hình 4. 5 Kết quả âm tính thử nghiệm citrate âm tính của 6 mẫu sữa
Hình 4. 6 LAB kháng E.coli và Salmonella bằng phương pháp khuếch tán trên
giếng thạch.
Hình 4. 7 LAB sinh kháng khuẩn với E.coli bằng phương pháp nhỏ giọt

4


DANH SÁCH BẢNG

5


CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
Ngay từ xa xưa, với kinh nghiệm của mình con người đã bi ết phát tri ển các
kỹ thuật chế biến thực phẩm để sử dụng lâu dài và các kinh nghi ệm đó đ ến nay
vẫn đang được sử dụng, trong đó các nhóm thực phẩm lên men đã được phát
triển ra từ trước khi loài người có kiến thức về vi sinh vật. Trong quá trình lên
men Lactic, acid lactic tạo thành làm thức ăn có v ị chua, làm h ạ th ấp PH môi
trường dẫn đến ức chế vi sinh vật gây hại và ổn định hệ vi sinh vật trong sản

phẩm nên kéo dài thời gian bảo quản và làm cho s ản phẩm an toàn đ ối v ới con
người .(Lê Văn Nhương và csv., 2009)
Ứng dụng về việc acid lactic làm cho thức ăn có vị chua d ễ ch ịu cũng nh ư gây ức
chế các dòng vi khuẩn có hại cho đường ruột mà người ta đã dùng nó đ ể ch ế
biến thực phẩm, như là một chất gia vị đối với các đồ uống nh ẹ nh ư : Sữa chua,
siro, dịch quả…(Lê Văn Nhương và csv., 2009). Trong đó, sữa chua hay còn g ọi là
yaourt là một sản phẩm rất nổi tiếng thế giới từ rất lâu và được tiêu thụ ph ổ
biến cho đến nay với nhiều loại sữa chua khác nhau trên th ị tr ường th ế gi ới nói
chung cũng như thị trường Việt nam nói riêng.
Ngày nay,với sự tiến bộ nhanh chóng của công nghệ sản xuất mà các công
ty trong và ngoài nước đã nghiên cứu và sản xuất nhi ều sản ph ẩm s ữa chứa l ợi
khuẩn với nhiều dạng bào chế khác nhau và được gọi chung là nh ững ch ế ph ẩm
probiotic

. Có nhiều chủng lợi khuẩn đường ruột được bi ết đến nh ư:

Lactobacillus, Bacillus, Bifidobacterium,… trong đó các vi khuẩn thuộc chi
Lactobacillus được ưa chuộng làm probiotic để nhằm gây ức chế và kháng lại các
vi khuẩn gây hại cho đường ruột trong đó có Escherichiacoli và Salmonella.
Ở Việt Nam tỉ lệ người mắc bệnh đường ruột khá cao đặc bi ệt là tr ẻ em,
do môi trường sống cũng như ăn uống không hợp vệ sinh, nên số lượng nhi ểm
khuẩn đường ruột xảy ra khá nhiều, việc dùng kháng sinh trong quá trình tr ị
liệu những khi nhiễm khuẩn là không thể tránh khỏi. Nhưng s ử d ụng dài lâu sẽ
gây hại đến sức khỏe người lớn lẫn trẻ em mà đó là những tác hại bên trong mà
chúng ta không hề hay biết được .Một trong những mặt trái của việc l ạm dụng
thuốc kháng sinh dài lâu là gây hại cho khuẩn có l ợi. Th ực t ế, kháng sinh có ph ổ
rộng tiêu diệt cả vi khuẩn xấu và tốt. Vì vậy nếu dùng không đúng h ướng d ẫn,
lạm dụng sẽ tiêu diệt cả khuẩn có lợi có trong đường ruột, làm mất cân b ằng
mang tính tự nhiên của cơ thể. Một khi bị mất cân bằng, khu ẩn xấu hoành hành,
dễ phát sinh nhiều bệnh như rối loạn dạ dày, làm cho các chứng bệnh nghiêm

trọng hơn và làm giảm hiệu quả của thuốc kháng sinh.

6


Biết rằng vi khuẩn lactic có khả năng tạo các sản phẩm có th ể ức ch ế m ột s ố vi
sinh vật có hại . Đây là một thế mạnh của vi khuẩn lactic và nó đang thu hút s ự
quan tâm của nhiều nhà khoa học. Các sản phẩm sau khi lên men nh ư acid h ữu
cơ, diacetyl, hydro peroxyt và đặc biệt là bacteriocin có khả năng ức ch ế s ự phát
triển của các vi sinh vật.Vậy để giảm việc dùng kháng sinh quá nhiều, có thể bổ
sung hoặc thay thế bằng các chế phẩm lên men có ch ứa vi khuẩn lactic đ ể kháng
lại các vi khuẩn gây bệnh đường ruột như Escherichiacoli, Salmonella,…
Nhằm tiếp nối cho việc nghiên cứu khảo sát dòng vi khuẩn lactic có khả
năng sinh chất kháng khuẩn với các vi khuẩn gây bệnh hiện nay, đề tài “ Khảo
sát khả năng kháng khuẩn Escherichia coli và Salmonella của vi khuẩn acid
lactic phân lập từ các sản phẩm sữa ” được thực hiện.
Mục tiêu
Nhằm tìm ra một số dòng vi khuẩn lactic có khả năng sinh ch ất kháng
khuẩn từ các sản phẩm sữa lên men.
Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập
2.Định Danh Sơ Bộ
3. Khả năng ức chế Vi Khuẩn

7


CHƯƠNG 2 : TỔNG QUANG TÀI LIỆU
1. VI KHUẨN LACTIC
1.1 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn axit lactic (LAB) là các vi sinh vật phổ bi ến r ộng rãi, có th ể tìm
thấy trong bất kỳ môi trường giàu carbohydrate, như thực vật, thực phẩm lên
men và niêm mạc bề mặt của con người, động vật trên cạn và biển. Trong cơ thể
người và động vật, LAB là một phần của vi sinh vật bình thường hoặc vi sinh v ật
hệ sinh thái tự nhiên sống trong đường tiêu hóa .(Florou-Paneri et al., 2013)
Vi khuẩn acid lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Các sản
phẩm lên men axit lactic truyền thống đã được sử dụng lâu đời như lên men rau
hoa quả, lên men thịt, lên men cá. Nhưng mãi đến năm 1878, Lister m ới phân l ập
được LAB , ông gọi vi khuẩn này là Bacterium lactic (hiện nay gọi là Trestococcus
lactic). Từ đó đến nay, nhiều loại LAB được phát hiện và ứng dụng có ích c ủa
chúng ngày càng đựợc mở rộng ra nhiều lĩnh vực, đặc biệt là th ực ph ẩm và th ực
phẩm chức năng. Công nghiệp lên men để sản xuất axit lactic có th ể nói đ ược
hình thành từ năm 1881 (Nguyễn Lân Dũng và csv, 1997).Vi khuẩn lactic tuy có
hình dạng khác nhau nhưng chúng điều có một đặc đi ểm chung sau: chúng là
những vi khuẩn Gram dương, không có khả năng sinh bào tử, catalase âm tính,
oxydase âm tính, khử nitrat âm tính và hâu hết không chuy ển đ ộng. (Lê Văn
Nhương và csv, 2009)
1.2 Phân loại
Orla Jensen mô tả bảy chi trong năm 1919, nhưng chỉ có tên c ủa m ột
trong số chủng, Streptococcus , vẫn còn hiệu lực ngày nay. Nhóm LAB hiện nay
bao gồm 16 chi (J.A. Narvhus, et al.,2003).Các vi khuẩn lên men acid lactic rất đa
dạng bao gồm nhiều giống khác nhau. Theo nghiêng cứu, vi khuẩn lactic được
xác định là một số loài (species) thuộc các gi ống (genus) sau : Aerococus,
Alloiococcus,
Lactobacillus,

Atopobium,
Lactococcus,

Bifidobacterium,

Leuconostoc,

Carnobacterium,
Pediococcus,

Enterococcus,

Tetragenococcus,

Streptococcus, Vagococcus, Weissella. (Lê Văn Nhương và csv, 2009).
Một số vi khuẩn lactic thường gặp là:
Lactobacillus : Giống Lactobacillus là bao gồm 52 loài trực khuẩn phổ
biến nhất, hình dạng tế bào của chúng có thể thay đổi từ hình b ầu dục đ ến hình
que dài. (Lê Văn Nhương và csv, 2009).Ví dụ:

nhóm Lactobacillus Casei –

Pediococcus, nhóm Leuconostoc và nhóm Lactobacillus acidophilus. Lactobacillus
acidophilus Các chủng đã được phân lập từ phân của trẻ sơ sinh hơn một trăm
năm trước đây, và được sử dụng thương mại như một tác nhân probiotic trong
8


thực phẩm. Nó là một chất lên men đồng đẳng bắt buộc và là một trong s ố ít
lactobacilli chịu được oxy nhất ( Marcus J. Claesson et al.,2007), Loài
Lactobacillus plantarum tế bào hình que kích thước ( 0,7-1) x (3-8)µm x ếp thành
chuỗi hoặc đứng riêng lẻ, trong khi Lactobacillus bulgaricus lại có dạng que dài,
mảnh có kích thước (0,7-0,9) x (5-20)µm đứng riêng l ẻ cặp đôi hay tạo thành
chuỗi ngắn.(Lê Văn Nhương và csv, 2009).Mặc dù nó có một hệ thống phân giải
protein phức tạp để phân hủy peptit, nó cũng có khả năng tổng h ợp hầu h ết các

axit amin . Lactobacillus plantarum được tìm thấy trong nhiều môi trường sống
giàu dinh dưỡng, chẳng hạn như các sản phẩm từ sữa, thịt, rau và th ực v ật ( Cai
Y et al.,1999 )
Streptococcus: là loại có hình dạng của tế bào hình tròn hoặc hình ovan,
đường kính 0,5 - 1µm. Tế bào thường tạo chuỗi dài hoặc xếp đôi, ít khi đứng đơn
lẻ, có khả năng lên men các loại đường như glucose, fructose, galatose, lactose…
Chúng thường có nhiều trong sữa và sữa chua. Chúng có khả năng tích tụ 0,8 –
1% acid lactic.(Lê Văn Nhương và csv, 2009).
Leuconostoc : lại có hình hơi dài hoặc hình ovan, đường kính khoảng (0,5 –
0,8)µm và chiều dài khoảng 1,6µm. Nhưng đôi khi chúng lại có dạng h ơi tròn,
sắp xếp thành chuỗi và không tạo thành một đám.
Pediococcus có dạng hình cầu, có thể đứng riêng lẻ, kết đôi hay k ết chu ỗi
hoặc tạo đám tỷ cầu hay bát cầu khuẩn.(Lê Văn Nhương và csv, 2009)
1.3 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lên men axit lactic có hai dạng hình chính là hình cầu và hình que.
Tuy nhiên, khi nuôi cấy trong điều kiện môi trường hay các điều kiện ngoại cảnh
khác nhau thì có hình dạng khác nhau nhưng chúng đều có m ột s ố đ ặc đi ểm sau:
chúng là những vi khuẩn Gram dương, không có khả năng sinh bào tử, catalase
âm tính, oxydase âm tính, khử natri âm tính và hầu hết đều không chuy ển đ ộng,
chúng không có khả năng tổng hợp nhân hem của các polyphyrine, chúng không
có chứa xitocrom. Chúng có thể sinh trưởng được khi 17 có mặt oxy, là lo ại c ơ
thể duy nhất có khả năng lên men hiếu khí cũng như yếm khí (Lê Văn Nhương và
csv , 2009).
1.4 Cơ chế của quá trình lên men lactic
Trong quá trình lên men axit lactic, cơ chất đầu tiên tham gia vào quá trình
lên men là đường glucose hoặc fructose. Khi sử dụng ngu ồn nguyên li ệu là các
đường đôi hay các chất chứa gốc đường thì trước khi tham gia vào quá trình lên
men chúng phải được thủy phân thành glucose hay fructose nh ờ các enzyme
tương ứng. Lên men axit lactic là quá trình chuy ển hoá y ếm khí đường thành axit
9

lactic (Lê Văn Nhương và csv, 2009). Có 2 ki ểu len men lactic. Trong lên men
lactic đồng hình thực tế chỉ xuất hiện axit lactic, còn trong lên men d ị hình các
sản phẩm cuối cùng khá đa dạng: axit lactic, etanol, axit acetic và CO2. Ch ỉ có lên
men lactic đồng hình là có ý nghĩa về mặc công nghi ệp (Nguy ễn Lân Dũng và csv,
1997).
Tầm quan trọng của vi khuẩn axit lactic trong thực phẩm và đồ uống từ
sữa lên men đã được xem xét trước đó vào đầu những năm 1990 trong tổng quan
về vai trò của vi khuẩn axit lactic trong kimchi , sản phẩm cá lên men và sữa chua
thực vật (Sook Jong Rhee et al,.2003)Vai trò của vi khuẩn axit lactic trong quá
trình lên men rượu gạo / bia cũng đã được báo cáo (Rhee SJ et al.,2003). Bánh mì
hấp như idli từ Ấn Độ và puto từ Philippines, được làm bằng gạo, được lên men
bởi Leuconostoc . Hàn Quốc sikhae và Philippine burong ISDA / dalag , mà được
thực hiện bằng cách trộn cá muối và các loại ngũ cốc, cũng đ ược lên men trong
giai đoạn đầu bởi Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc mesenteroides bắt đầu
tăng trưởng tương đối nhanh chóng trong các vật liệu thực vật khác nhau (rau và
ngũ cốc) trên một phạm vi rộng của nhiệt độ và n ồng đ ộ mu ối so v ới các vi
khuẩn axit lactic khác. Trong quá trình phát triển, Leuconostoc mesenteroides tạo
ra carbon dioxide và axit, dẫn đến sự thay đổi môi trường cũng như các đi ều
kiện có lợi cho sự tăng trưởng của các vi khuẩn axit lactic khác. Tương tự, các
quá trình lên men khác nhau được khởi xướng bởi Leuconostoc mesenteroides bao
gồm

vai

trò

nổi

bật

cho

các

vi

khuẩn

axit

lactic

khác

thu ộc

chi Lactobacillus và Pediococcus ở giai đoạn sau.
2. SỰ ỨC CHẾ VI KHUẨN BỆNH CỦA ACID LACTIC
2.1 Tạo ra các sản phẩm acid hữu cơ trong quá trình lên men
Trong quá trình lên men vi khuẩn lactic sinh ra các acid h ữu c ơ. Các acid
này là chất kháng khuẩn trực tiếp của vi khuẩn lactic. Chúng bao gồm acid lactic,
acid acetic, acid probionic, acid butyric, trong đó acid lactic và acid acetic là s ản
phẩm chính. Chúng tạo ra môi trường không thích hợp cho sự phát tri ển các vi
sinh vật gây bệnh, gây hỏng. Theo Mariae và Thomas, một số vi sinh vật gây bệnh
(Samonella, Listeria sp.) và một số vi sinh vật sinh độc tố ( Staphylococcus aureus,
Bacillus cereus, Clostridium hotulinum) bị ức chế thậm chí bị tiêu diệt khi pH môi
trường

giảm nhanh. Sự phát triển của E.coli

bị ức chế ở pH=5,1 còn

Staphylococcus thì bị ức chế ở pH < 5,3, trong khi các vi khuẩn lactic có th ể ch ịu
tới pH=3. Các acid hữu cơ, đặc biệt là acid acetic có kh ả năng ức ch ế m ạnh đ ối
với nhiều loài vi sinh vật sinh độc tố, vi khuẩn sinh bào tử, n ấm m ốc, n ấm men
10


trong thực phẩm. Acid acetic có tác động rất l ớn lên tổng s ố vi sinh v ật hi ếu khí,
sau đó là Enterobacteriaceae và với E. Coli thì ảnh hưởng ít hơn. (Lê Văn Nhương
và csv, 2009)
Acid lactic và acetic được tạo ra để ức chế các vi khu ẩn gây h ại. Chúng tác
động lên màng tế bào chất của vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức năng bảo v ệ và
chức năng dinh dưỡng của màng tế bào, Acid lactic dễ dàng thấm qua màng tế
bào, làm giảm pH nội bào. làm giảm pH nội bào hoặc tự oxy hóa, làm đúng quá
trình trao đổi chất, gây chết những tế bào nhạy cảm v ới nó. Kh ả năng ức ch ế
của acid lactic sẽ tăng đáng kể khi trong môi trường có mặt acid acetic.
2.2 Tác dụng kháng khuẩn của bacteriocin
Trong các sản phẩm chuyển hóa có khả năng ức chế vi sinh vật c ủa vi
khuẩn lactic thì bacterocin được các nhà khoa học và các nhà công nghi ệp th ực
phẩm đặc biệt chú ý đến. Bacteriocin của vi khuẩn lactic b ắt đ ầu đ ược nghiên
cứu từ những năm 1940. Từ đó đến nay đã có rất nhiều bacteriocin khác nhau
được phát hiện trong số đó đã được ứng dụng vào chế biến và bảo quản thực
phẩm. Đặc biệt là nisin đã được sử dụng ở trên 50 nước khác nhau trên thế gi ới.
Đã có nhiều định nghĩa về bacteriocin theo tài liệu gần đây nhất thì bacteriocin
được định nghĩa như sau : “ Bacteriocin là các polypeptit có tính kháng khu ẩn
chống lại một phổ hẹp các loài vi khuẩn họ hàng gần gũi”. Tùy thu ộc vào b ản
chất protein mà bacteriocin có thể bị vô hoạt bởi các protease trong đ ường ru ột.

Người ta đã chứng minh chắc chắn rằng nhiều loại vi khuẩn lactic s ản sinh ra
bacteriocin. (Lê Văn Nhương và csv, 2009)
Bacteriocin bao gồm một lượng lớn các peptide tổng h ợp ribosomally có
hoạt tính kháng khuẩn đối với các chủng liên quan chặt chẽ, m ặc dù có m ột s ố
lượng lớn các vi khuẩn được báo cáo có hoạt tính kháng khuẩn r ộng. Trong thập
kỷ qua, sự quan tâm đến nghiên cứu bacteriocin, đặc bi ệt là từ vi khu ẩn axit
lactic, đã đạt được động lượng lớn nhờ khả năng bảo quản thực ph ẩm tự nhiên
và kháng sinh trị liệu.Vi khuẩn có một số thu ộc tính tích cực đã khi ến chúng đ ặc
biệt hấp dẫn đối với các ứng dụng khác nhau. LAB bacteriocins vốn đã được biết
đến với hoạt động của chúng trên một phạm vi pH r ộng. Các peptide kháng
khuẩn này cũng không màu, không mùi và không vị, giúp tăng cường tính hữu
dụng tiềm năng của chúng. Mặc dù lịch sử lâu dài của việc sử dụng bacteriocin,
không có báo cáo về sự phát triển của vi khuẩn kháng thu ốc. Một lý do có thể là
do bacteriocin có cơ chế tác động nhanh, tạo thành l ỗ chân lông trong màng c ủa
vi khuẩn, ngay cả ở nồng độ cực thấp. Chúng cũng dễ bị phân hủy bởi các
enzyme phân giải protein do tính chất protein của chúng. Do đó, các mảnh vi
11


khuẩn không sống lâu trong cơ thể con người hoặc trong môi tr ường, giúp giảm
thiểu cơ hội của các chủng để tương tác với các kháng sinh bị suy thoái. Đây là
điểm khởi đầu phổ biến trong sự phát triển kháng kháng sinh. Có lẽ, lợi thế đáng
kể nhất của bacteriocin trên kháng sinh thông thường là ch ất chuy ển hóa chính
của chúng vì chúng có cơ chế sinh tổng hợp tương đối đơn gi ản so v ới các kháng
sinh thông thường, là các chất chuyển hóa thứ cấp. Sự khác biệt chính giữa
bacteriocin và kháng sinh thông thường được tóm tắt trong bảng lợi thế đáng kể
nhất của bacteriocin trên kháng sinh thông thường là chất chuy ển hóa chính c ủa
chúng vì chúng có cơ chế sinh tổng hợp tương đối đơn giản so v ới các kháng sinh
thông thường. Thực tế này làm cho chúng dễ dàng tuân theo thông qua công
nghệ sinh học để tăng hoạt động hoặc tính đặc hiệu của chúng đ ối v ới các vi

sinh vật mục tiêu. Sự khác biệt chính giữa bacteriocin và kháng sinh thông
thường được tóm tắt trong bảng 2.4 . Đối với các ứng dụng thực phẩm, các vi
khuẩn lactic có lợi thế vốn có so với các kháng sinh thông th ường, các vi khu ẩn
LAB thường được coi là cấp thực phẩm, do sự kết hợp của LAB đối v ới quá trình
lên men thực phẩm có từ thời cổ đại. Thực tế, Cơ quan Quản lý Thực phẩm và
Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã phân loại LAB và các sản phẩm ph ụ của nó nh ư
thường được coi là an toàn (GRAS) như một thành phần thực phẩm của con
người. Trong khi các ứng dụng lâm sàng, bacteriocin được xem là một gi ải pháp
khả thi đối với kháng sinh do tính đặc hiệu cao của một s ố vi khu ẩn ch ống l ại
các mầm bệnh lâm sàng, bao gồm các chủng kháng đa kháng sinh (MDR).
( RodNey H Perez et al.,2014)
Bảng 2. 1 Sự khác biệt giữa Bacteriocin và kháng sinh thông th ường (RodNey H
Perez et al.,2014)
Đặc trưng

Bacteriocin

Thuốc kháng sinh

Ứng dụng

Thực phẩm/lâm sàng

Lâm Sàng

Tổng hợp

Ribosome

Phổ sinh học

Hầu như hẹp

Chất chuyển hóa thứ
cấp
Chủ yếu là rộng

Cường độ hoạt tính
sinh học

Hoạt động ở phạm vi
mol-to-micro

Khả năng phân hủy
enzyme phân giải
protein
Ổn định nhiệt

Cao
Cao

Thấp

Phạm vi PH hoạt động

Rộng

Hẹp
12

Hoạt động ở dãi
phân tử micro-tomilli
Trung bình đến
không


Màu sắc/ Hương Vị/ Không
Mùi
Không có khả năng sinh Có
học
Cơ chế có thể có của
kháng sinh
Phương thức hành
động
Độc tính đối với các tế
bào nhân chuẩn

Có
Không

Thích ứng thông qua các
thay đổi trong thành
phần tế bào

Yếu tố quyết định
chuyển gen có thể
làm bất hoạt hợp
chất hoạt tính
Hình thành lỗ rỗng, ức
Màng tế bào hoặc

chế sinh tổng hợp vách tế các mục tiêu tế bào
bào
Tương đối không
Có

Về mặt hóa học bacteriocin được xếp vào nhóm các chất dị gen nhưng
trong phân tử luôn có thành phần protein hoạt tính. M ột s ố bacteriocin là phân
tử protein hoạt tính. Một số bacteriocin là phân tử protein thuần khi ết, trong khi
một số khác lại có phân tử cấu tạo phức hợp gồm nhi ều thành ph ần: lipid,
carbonhydrat và protein. Người ta đã phát hiện được m ột s ố gen mã hóa sinh
tổng hợp Bacteriocin tồn tại độc lập trong tế bào vi khu ẩn, chúng n ằm trên các
plasmid. Hiện nay, bacteriocin của vi khuẩn lactic được chia thành 4 nhóm sau:
Nhóm I: là nhóm lantibiotic, là loại polypeptit có kh ối l ượng phân tử nh ỏ
(< 5KDa) , chứa amino acid lanthionine, β-methyllanthionine. Ví dụ: nisin, lacticin
481, carnocin U149, lactocin S.(Lê Văn Nhương và csv, 2009)
Nhóm II: Gồm các bacteriocin không phải là lantibiotic, kh ối l ượng phân
tử nhỏ (< 10KDa). Cấu trúc gấp nếp β, bền nhiệt, có thể chịu được nhiệt độ
trong khoảng 100-121℃. Các bacteriocin trong nhóm này lại được chia thành 3
nhóm nhỏ sau:
 Bacteriocin có chứa N-terminal là –Tyr-Gly-Ans-Val-Xaa-Cys-. Các

bacteriocin tiêu biểu nhóm này là: sakacin A, sakacin P, leucocin A,
curvacin A.
 Bacteriocin có chứa nhóm Thiol
Nhóm III: Các bacteriocin có khối lượng phân tử lớn (> 30KDa), khả năng
bền nhiệt cao .
Nhóm IV: Đây là bacteriocin phức tạp.

13

Cơ chế tác động của bacteriocin của vi khuẩn lactic : Bacteriocin dù thu ộc
nhóm này hay nhóm khác điều có cơ chế tác động chung. Chúng tấn công vào
màng tế bào nhạy cảm, gây tổn thương màng không khắc ph ục được. T ế bào sẽ
chết do nội chất bị thoát ra ngoài. Sỡ dĩ bacteriocin có th ể tấn công vì nó ở d ạng
hòa tan, dễ dàng xâm nhập vào tế bào, làm mất l ực đ ẩy proton (PMF), làm gi ảm
thế năng của màng nguyên sinh chất và thay đổi pH n ội bào, từ đó t ế bào không
thể tổng hợp được màng tế bào và tế bào bị chết.
3. CHẾ PHẨM SỮA CHUA CHỨA VI KHUẨN LACTIC
3.1 Giới thiệu về sữa chua
Sữ a chua là m ột s ản ph ẩm s ữa đông t ụ, k ết qu ả t ừ quá trình lên
men axit

lactic trong

s ữ a,

b ởi

vi

khu ẩn

(LAB) Lactobacillus

bulgaricus và Strepetococcus thermophilus. Nó đ ượ c s ản xu ấ t theo cách
truy ền th ống b ằng cách tăng c ườ ng s ữa ho ặc s ữa g ầy b ằng cách làm bay
h ơi, ho ặc thêm s ữa b ột g ầy, đun nóng đ ến 85-95 o C trong 10-30 phút và
tiêm v ới vi khu ẩn (LAB) và sau đó ủ ở 42-45 o C. (Ayman Suliman Mazahreh,
Omer Turki Mamdo Ershidat, 2009).

3.2 Ứng dụng lactic trong sản xuất sữa chua
Lên men acid lactic được ứng dụng nhiều trong ngành sữa đ ể tạo ra các
sản phẩm như: sữa chua, phomat và các loại sữa lên men lactic .
Sản xuất sữa chua quá trình lên men lactic là do vi khu ẩn lactic phát tri ển
và tích tụ một lượng acid lactic gây đông tụ casein của sữa và tạo hương v ị đ ặc
trưng cho sản phẩm. Nguyên liệu dùng để sản xuất sữa chua là s ữa t ươi, s ữa
bột hay sữa đặc. Sữa sau thanh trùng sơ bộ, được cấy b ổ sung vi khu ẩn lên men
lactic điển hình ( Phối hợp nhiều loài để làm tăng giá trị cho s ản ph ẩm ), th ường
sử dụng các loài : Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus. Tiến hành
lên men ở nhiệt độ duy trì 40 - 50℃. Vi khuẩn lên men tích tụ acid lactic, làm
giảm pH, kết quả gây đông tụ casein. Để đảm bảo khẩu vị cho sữa chua , th ường
chỉ để quá trình lên men đến độ nhất định rồi phân phối vào các bao bì phù
hợp và đưa đi bảo quản lạnh. Sản phẩm có màu trắng ngà , h ơi chua, ng ọt nh ẹ,
có mùi thơm đặc trưng, sữa đông kết và đồng nhất.(Lê Văn Nhương và csv, 2009)
Ho ạ t tính sinh h ọc c ủa vi khu ẩn (LAB) đ ượ c s ử d ụng trong s ản xu ất
s ản phẩ m , cho đ ến nay, nhi ều nghiên c ứu t ập trung vào vai trò c ủa
probiotic bao g ồm (LAB) vi khu ẩn trong s ữa chua đ ể tăng c ường ch ức năng
tiêu hóa thông qua tăng h ấp thu khoáng ch ất, gi ảm không dung n ạp lactose
(thi ếu lactase) và thông qua vi ệc tiêu th ụ s ữa chua nuôi c ấy Lactobaccilus
acidophilus. Vi khuẩn LAB cho phép ức ch ế s ự lây nhi ễm m ầm b ệnh thông
14


qua s ản xu ất axit axetic, axit lactic và bacteriocin cũng nh ư ổn đ ịnh h ệ vi
sinh đườ ng ru ột , Ứ c ch ế các ch ất gây ung th ư có h ại liên quan đ ến ung th ư
đại tràng và tăng mi ễn d ịch b ằng cách s ản xu ất globulin mi ễn d ịch. Đi ều tr ị
táo bón, gi ảm cholesterol huy ết thanh và ki ểm soát tiêu ch ảy thông qua
vi ệc tiêu th ụ s ữa chua. (Ayman Suliman Mazahreh, Omer Turki Mamdo
Ershidat, 2009).
4 VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI VÀ SALMONELLA

4.1 Vi khuẩn Escherichia coli
Escherichia coli do Theodore Escherich ( 1857 – 1911), một nhà vi khuẩn
học người Áo, phát hiện lần đầu tiên năm 1985. Chi Escherichia thu ộc h ọ khu ẩn
đường ruột. Trong các loài thuộc chi này, E.Coli được chọn làm điển hình và có vai
trò quan trọng nhất trong y học. E. Coli là một trong những thành viên chính của
hệ vi khuẩn bình thường ở ruột nhưng cũng là căn nguyên của nhi ều b ệnh
nhiễm trùng, trong đó có những bệnh nó là căn nguyên đứng đầu. ( Lê Văn Phủng
và csv, 2009)
4.1.1 Đặc tính sinh học
E.coli là dạng vi khuẩn hình que, kích thước tế bào khoảng 2-3µm x
0,5µm,vi khuẩn Gram âm, có lông, di động, không sinh nha bào, k ỵ khí tùy ti ện,
khuẩn lạc dạng S, tròn, mô, bóng, bìa nguyên, không màu, hoặc trắng xám.
E.coli rất dễ phát triển trên các môi trường nuôi cấy thông thường, th ời
gian phát triển khoảng 4-5 giờ có thể làm đục môi tr ường l ỏng, có kh ả năng lên
men đường lactose, khuẩn lạc có màu vàng trên môi trường Istrati, màu đ ỏ trên
môi trường SS. Vi khuẩn E.coli

có khả năng lên men đường sinh hơi như:

glucose, malnitol, lactose, dương tính với indol, không sinh H 2S, không có men
urease. Vi khuẩn bị bất tiêu diệt ở nhiệt độ 55 ℃ sau 1 giờ, 60℃ sau 30 phút,
nhạy với các thuốc sát khuẩn thông thường. (Nguyễn Văn Bá, 2016 )
4.1.2 Phân loại
Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E.Coli được chia thành các type huyết
thanh. Với sự tổ hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ có r ất nhi ều type
huyết thanh khác nhau. Mỗi type huyết thanh được ký hiệu bằng kháng nguyên
O và K ví dụ O86B7 ( yếu tố kháng nguyên O số 86, yếu t ố kháng nguyên K s ố 7
loại B).Dựa vào vị trí gây bệnh các E. Coli có khả năng gây bệnh ở người được
chia thành 2 nhóm: thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC- intestinal
pathogenic Ecoli) hay E. coli gây tiêu chảy (DEC-Diarrheagenic E. Coli ), thứ hai là

nhóm gây bệnh ngoài đường ruột (ExPEC- extraintestinal pathogenic E. Coli ) ( Lê
Văn Phủng và csv, 2009)
15


Các loại E.Coli gây bệnh đường ruột ( IPEC ) đã được biết đến gồm:
•
•
•
•
•
•

EPEC (Enteropathogenic E.Coli ): E.Coli gây bệnh đường ruột
ETEC (Enterotoxigenic E.Coli ): E.Coli sinh độc tố ruột
EIEC (Enteroinvasive E.Coli ): E.Coli xâm nhập ruột
EAEC (Enteroaggregative E.Coli ): E.Coli ngưng tập ruột
DAEC (Diffusely adherent E.Coli ) : E.Coli bám dính phân tán
EHEC (Enterohaemorrhagic E.Coli ): E.Coli gây xuất huyết ruột

Hai loại E.Coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là:
•
•

MAEC (Meningitidis-associated E.Coli ): E.Coli gây viêm màng não
UPEC ( Uropathogenic E.Coli ): E.Coli gây nhiễm khuẩn đường tiết
niệu.

4.1.3 Khả năng gây bệnh
E.Coli là thành viên thuộc vi hệ bình thường của đường tiêu hóa, chi ếm tỷ

lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí ( khoảng 80%). Tuy nhiên, E. Coli cũng
là một vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong các vi khu ẩn gây tiêu
chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn
nguyên gây nhiễm khuẩn huyết. E.Coli còn là căn nguyên thường gặp trong viêm
màng não, viêm phổi ở trẻ mới sinh. E. Coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại
khoa, nhiễm trùng trong bỏng. (Lê Văn Phủng và csv, 2009)
4.2 Vi khuẩn Salmonella
Salmolella là một trong những chi quan trọng nhất thuộc họ vi khu ẩn
đường ruột. Đến nay hơn 2500 type huyết thanh Salmolella đã được xác định.
Những

Salmolellagây bệnh ở người thường được xếp thành 2 loại: các

Salmolella gây bệnh thương hàn và các Salmolella gây bệnh khác (quan trọng
nhất là gây nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn).(Lê Văn Phủng và csv, 2009).
4.2.1 Đặc tính sinh học
Salmolella được đặt theo tên của nhà bệnh học Salmon, người đầu tiên
phân lập Salmolella choleraesuis từ ruột heo. Salmolella là vi khuẩn hình que,
Gram âm, không sinh bào tử, không sinh nha bào, không có v ỏ bao, di đ ộng nh ờ
chiên mao, ký sinh trong đường ruột của nhiều động vật máu nóng và máu l ạnh,
đường kính tế bào khoảng 0,7- 0,5µm, dài 2-5µm. Nhóm vi khu ẩn này d ễ nuôi
cấy, có khả năng tồn tại trong nước với một thời gian dài và có thể chóng l ại m ột
số hóa chất nhú xanh brillant, sodium tetrathionat, sodium deoxycholat, đây là
những hóa chất có khả năng ức chế sự phát triển của các trực khuẩn đường ruột
khác. (Nguyễn Văn Bá, 2016 )
4.2.2 Phân loại
Lúc đầu, các loài Salmolella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng mà
chúng gây ra như Salmonella

typhi và các Salmonella

16

paratyphi A, B, C


( typhphoid = bệnh thương hàn, para = “ phó”), hoặc theo vật chủ nh ư S.
typhimurium gây bệnh ở chuột (murine = chuột ). Về sau, người ta th ấy r ằng,
một loài Salmolella có thể gây ra một số hội chứng và có thể phân lập được ở
nhiều loài động vật khác nhau.
Salmolella đã từng được chia thành các chi phụ ( subgenus) và nhi ều loài
(species). Mỗi loài lại có thể được chia thành các loài ph ụ ( subspecies). M ỗi loài
lại có thể được chia thành các loài phụ ( subspecies). Ví d ụ loài Samonella
enterica được chia thành sáu loài phụ gồm Salmonella enterica, Salmonella
salamae, Salmonella arizonae, Salmonella diarizonae, Salmonella houtenae và
Salmonella indica. Với cách phân loại này, S. enteritidis ( tên v ẫn được gọi t ắt) có
tên đầy đủ là Salmolella enterica loài phụ enterica type huyết thanh enteritidis
PT4 (phage type). Để giảm bớt sự phức tạp , trong các phần còn lại của mục
Salmolella chúng tôi gọi một vi khuẩn được viết bằng hai chữ bắt đ ầu b ằng ch ữ
Salmonella là một loại Salmolella – nó có thể là loài, loài phụ hay m ột type huy ết
thanh. (Lê Văn Phủng và csv, 2009)
4.2.3 Khả năng gây bệnh
Tùy theo từng loại, Salmonella có thể chỉ gây bệnh cho người ( như
Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, Salmonella sendai…), chỉ gây bệnh cho
động vật (như Salmonella abortusovis, Salmonella typhisuis, Salmonella
gallinarum…), nhưng cũng có thể vừa gây bệnh cho người vừa gây bệnh cho
động vật (như Salmonella

enteritidis, Salmonella

typhimurium, Salmonella

choleraesuis…). Theo công bố của WHO (1998), hằng năm trên th ế gi ới có
khoảng 17 triệu người mắc bệnh thương hàn với khoảng 600.000 người chết.
Nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn do Salmonella là bệnh thường gặp, ngay cả ở
các nước phát triển - ở Anh tới thập niên cuối của thế kỷ vừa qua, hàng năm v ẫn
có hàng vạn người mắc bệnh. (Lê Văn Phủng và csv, 2009)
5. NHỮNG NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
5.1 Những nghiên cứu trong nước
Ngày nay, ở nước ta việc nghiên cứu về chất kháng khuẩn do LAB sinh
tổng hợp đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Tuy nhiên, các nghiên
cứu về ứng dụng của chất kháng khuẩn còn ít và chưa thu được những k ết qu ả
khả quan. Một số nghiên cứu tiêu biểu về LAB và chất kháng khu ẩn là:
• Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh ch ất kháng

khuẩn (Ngô Thị Phương Dung et al.,2011).
• Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nem chua v ới kh ả năng kháng
vi sinh vật và đặc điểm của bacteriocin ( Nguyen Thi Lam Doan et
al.,2016)
17


• Phân lập và tuyển chọn dòng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khu ẩn

từ dưa lê non (cucumis melo l.) Muối chua (Huỳnh Ngọc Tâm et
al.,2016)
• Xác định tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic v ới vi khu ẩn
(streptococcus agalactiae) phân lập từ cá rô phi (oreochromis
niloticus) bệnh phù mắt và xuất huyết (Ngô Thị Ngọc Trân et al.,2016)
5.2 Những nghiên cứu ngoài nước
Hiện nay việc nghiên cứu, ứng dụng chất kháng khuẩn do LAB sinh tổng

hợp nên đang là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm.
Cũng đã có những công trình nghiên cứu và ứng dụng thành công, góp ph ần vào
việc nâng cao chất lượng cuộc sống của nhân loại. Chất kháng khu ẩn là m ột
chất có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh, nhờ khả năng này mà vi ệc
ứng dụng của LAB được đa dạng và phong phú hơn. Chất kháng khu ẩn đã đ ược
các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu từ rất lâu và đạt nhiều thành tựu.
• Theo Kekessy et al., (1970) đã nghiên cứu m ột ph ương pháp m ới trong

việc phát hiện chất kháng khuẩn. Chủng vi sinh vật đối kháng được
nuôi ủ trên đĩa môi trường thạch dinh dưỡng, sau đó tạo gi ếng có
đường kính 0.5 mm bằng cách đục bỏ agar trên đĩa. Cho một l ượng vi
khuẩn có khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn vào gi ếng, sau
thời gian nuôi ủ vòng kháng khuẩn sẽ xuất hiện, thể hiển bởi một
vòng sáng rõ quanh giếng.
• Năm 1976 tại Minnesota, Tagg et al., đã nghiên cứu v ề nh ững lo ại ch ất
kháng khuẩn của vi khuẩn gram dương và cho ra nhiều kết qu ả có giá
trị. Nghiên cứu đã cho biết được tính đối kháng của chất kháng khuẩn,
cách đặt tên và phân loại chất kháng khuẩn, chiết tách và tinh s ạch
chất kháng khuẩn, phân tích hoạt tính chất kháng khuẩn, các loại hoạt
động của chất kháng khuẩn và ứng dụng của chất kháng khuẩn.
• Năm 1992 tại Laramie, Yang et al., đã nghiên cứu m ột ph ương pháp
mới để chiết tách một lượng lớn chất kháng khuẩn từ LAB. Phương
pháp này dùng môi trường pediocin AcH, nisin, sakacin A, leuconocin
Lcm1 làm tăng hiệu quả chiết tách và thu được một lượng ch ất kháng
•

khuẩn nhiều hơn quá trình phân lập.
Năm 1999 tại Bỉ, Raf Callewaert và Luc De Vuyst đã nghiên c ứu vi ệc
sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của Lactobacillus amylovorus DCE
471 và có ứng dụng cải tiến và làm ổn định các sản phẩm lên men.

Việc sinh tổng hợp thu nhận chất kháng khuẩn bị ức ch ế b ởi n ồng đ ộ
của nguồn nitrogen.
18


• Năm 1999 tại Pakistan, Khalid et al., đã nghiên cứu tìm ra một lo ại ch ất

kháng khuẩn mới có tên lactocin LC-09. Lactocin LC-09 được phân l ập
từ chủng vi khuẩn lactobacillus có trong một mẫu bệnh.
• Năm 2002 Soore và ctv đã nghiên cứu vi ệc tạo ra m ột ch ất kháng đ ặc
biệt của LAB gọi là chất kháng khuẩn. Chất kháng khu ẩn được s ử
dụng như một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên có khả năng thay
thế các loại hoá chất bảo quản

• khác. Chất kháng khuẩn có bản chất là protein nên r ất an toàn đ ối v ới
•

sức khoẻ con người. 24
Năm 2002 tại Thái Lan, Pongtep Wilaipun et al. đã tìm th ấy khă năng
sinh chất kháng khuẩn của Enterococcus faecium được phân lập từ các

sản phẩm thủy sản lên men của Thái.
• Năm 2004, Todorov, S.D., Van Reenen, C.A. và Dicks K.M. (Nam Phi) đã
nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng
Lactobacillus plantarum ST13BR , một chủng được phân lập từ bia
Barley.
• Năm 2006, 50 chủng LAB được tìm thấy từ sản ph ẩm lên men truy ền
thống suan-tsai của Đài Loan. Với các chủng sau khi phân l ập ti ếp tục
nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và khả năng sinh
tổng hợp chất kháng khuẩn.

• Năm 2006, Stefan Marcinowski cho biết kẹo cao su có ch ứa các ch ủng
vi khuẩn có lợi lactobacillus do công ty hoá chất BASF của Đức phát
triển. Đây là sản phẩm giúp người dùng loại trừ các bệnh về răng
miệng.
• Tháng 3/2007, Todorov, S.D. và Leon M.T. Dicks K.M. (Nam Phi) đã
nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng
Lactobacillus pentosus ST712BZ được phân lập từ boza.

19


CHƯƠNG 3 : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. THỜI GIAN ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
1.1. Địa điểm
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thực hành Vi Sinh của Khoa dược Điều dưỡng, trường đại học Tây Đô.
Địa chỉ: Số 68, Trần Chiên, phường Lê Bình, quận Cái Răng, TP Cần Thơ.
1.2. Thời gian thực hiện
Từ 26/2 năm 2018 đến 4/6 năm 2018
2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
Sữa Chua mua ở các siêu thị, cửa hàng bách hóa, tiệm tạp hóa ở Cần Th ơ.
2.2. Dụng cụ thiết bị
Dụng cụ:
- Đĩa Petri

- Giấy cân

- Que cấy

- Đầu co

- Đèn cồn

- Ống nghiệm

- Bình thủy tinh

- Khăn sạch

- Muỗng

- Duham

•

Thiết bị: Sử dụng các thiết bị hiện có tại Phòng thự hành Vi Sinh

khoa Dược - Điều dưỡng, trường Đại học Tây Đô.

•

•

- Tủ cấy vô trùng

•

- Tủ lạnh

•

- Tủ ấm.

•

- Nồi hấp tiệt trùng

•

- Bếp điện

•

- Lò vi sóng

2.3. Hóa chất và môi trường
•

Hóa chất:
• Nước Cất
20


• CaCO3
• MRS (MRS broth Lactobacillus broth acc. To DEMAN. ROGOSA and

SHARPE for microbiolody) Peptone from casein 10.0, Meat extract 8.0,…
• TSA (Tryptone 15g; Soya peptone 5g; Sodium chloride 5g; Agar 15g)
• TSB (Tryptone 17g; Papaic digest soybean meal 3.0g; Glucose 2.5g;

Dipotassium phosphate 2.5 g; Sodium chloride 5.0 g)
• Bột Rau câu
• Nước cất
• Cồn 70º và cồn 96º

Hoá chất nhuộm Gram.

•
•
•
•

Hoá chất thử catalase.

•
•
•

Crystal violet
Lugol
Safranin
H2O2
Môi trường nuôi và phân lập LAB: MRS lỏng, MRS đặc , TSA lỏng ,

TSA đặc, TSB .
•

3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNG CỨU

•

3.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu
•

Mẫu sữa chua được mua tại các siêu thị, tiệm tạp hóa, cửa hàng

bách hóa tại Tp. Cần Thơ. Mẫu được giữ riêng bi ệt từng lo ại trong h ộp nh ựa
nhỏ đặt tại phòng thí nghiệm với nhiệt độ phòng
3.2. Phân lập vi khuẩn lactic và thử nghiệm CaCO3

•

Phân lập vi khuẩn là quá trình tách riêng vi khu ẩn từ quần th ể ban

•

đầu để nhận được những giống thuần khiết.
•

Các mẫu sữa chua , lấy mỗi mẫu một ít đem hòa tan vào môi tr ường MRS

lỏng. Sau đó đem vào tủ ủ với nhiệt độ 37 ℃ trong 24 giờ. Sau khi ủ dung dịch có
màu đục, lắc đều lên đem cấy vào môi trường MRS đặc (ch ứa agar). Quá trình
cấy này được diễn ra đến khi đạt được độ thuần.
21


•

Quy trình phân lập

•
•

22


•

Mẫu sữa chua

•
•
•

Hoạt hóa trong môi trường MRS lỏng
Ủ ở nhiệt độ 37℃, trong 16 giờ - 24 giờ

•

Dùng que cấy lấy dung dịch cấy vạch 3 chiều vào MRS đặc
•
•

Ủ ở nhiệt độ 37℃, trong 48 giờ

•
•

Phân lập đến khi được khuẩn lạc thuần

•

Lấy• khuẩn lạc thuần đem tăng sinh trong môi trường MRS lỏng
•

Ủ ở nhiệt độ 37℃, trong 24 giờ
•
•
•

Trữ ở tủ đông -40℃
Hình 3. 1 Quy trình phân lập LAB

•
•
•
•
•
•

23


•
•
•
•

Kiểm tra hình thái khuẩn lạc đặc trưng và được chấp nhận khi:

•
•

+ Hình dạng khuẩn lạc trắng đục

•

+ Không màu

•

+ Bờ láng, lồi, bìa nguyên hoặc chia thùy

•

Khuẩn lạc nằm trên đường cấy riêng lẽ không lẫn với những khuẩn lạc

•

Sau khi thuần, những dòng phân lập sẽ được định danh sơ bộ với các

khác.
phương pháp nhuộm Gram, thử catalase, thử oxydase, kiểm tra khả năng phân giải
CaCO3.
•

3.2. Phương pháp định danh vi khuẩn

•

Nhuộm Gram
•

Là phương pháp phân chia vi khuẩn thành từng nhóm Gram dương

và Gram âm dựa vào đặc tính vật lý và hóa học của vách tế bào.
•

Bước làm:

•

Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng l ấy một ít vi khu ẩn từ môi

trường đặc sau khi cấy 24 giờ, hòa vào 1 giọt nước cất ở giữa lam để khô tự
nhiên trong không khí, hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
•

Nhuộm:
• Nhỏ dung dịch Crystal violet để yên trong 1 phút, rửa nước.
• Nhỏ dung dịch Lugol để yên trong 1 phút, rửa nước.
• Nhỏ cồn 95º giữ khoảng 30 giây hoặc cho c ồn chảy qua vết bôi vi

khuẩn liên tục đến khi xuất hiện giọt đầu tiên không còn màu, ngừng
lại và rửa nước.
• Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin đ ể yên trong 1 phút, r ửa
nước, để khô trong không khí.
• Soi kính: dùng vật dầu 100X để quan sát
•

Đọc kết quả:
• Màu sắc: tế bào vi khuẩn bắt màu tím: Gram (+); màu đỏ: Gram (-).
• Hình dạng tế bào vi khuẩn: que, cầu , phẩy, xoắn.
• Cách sắp xếp: đơn, đôi, chùm, chuỗi, đám.
24


•

Xét nghiệm Oxydase
•

Dụng cụ hóa chất:
• Que cấy, đèn cồn, lam
• Hóa chất: dung dịch Tetramethyl-p-phenylen diamin dihydrochlorid

1% trong nước, bảo quản trong lọ màu tối ở 4℃, sử dụng trong 2
tuần.
• Mẫu Vật: Vi khuẩn đã phân lập ra riêng lẽ
• Bước làm :
• Đặt một miếng giấy lọc trên lam sạch , nhỏ dung dịch Tetramethyl-pphenylen diamin dihydrochlorid 1% lên trên miếng giấy lọc sao cho
vừa đủ ẩm.

• Dùng que cấy , lấy một ít vi khuẩn bôi lên miếng l ọc.
• Quan sát kết quả
•

Đọc kết quả sau 10 giây:
• Oxydase dương tính: mẫu thử có màu tím xanh

• Không chuyển màu hoặc sau 60 giây chuy ển sang màu âm tính (Âm

tính nếu là vi khuẩn lactic)
•

Xét nghiệm Catalase
•

Enzim catalase có tác dụng xúc tác phản ứng hydrgen peroxide

(H2O2) thành nước và khí oxygen.
•

Dụng cụ và hóa chất :
• Que cấy, lam kính
• Hóa chất: dung dịch H2O2 3-10%
• Vật liệu: Vi khuẩn đã phân lập riêng lẽ
•

Bước làm:
• Lấy dung dịch H2O2 nồng độ 3-10% nhỏ một giọt lên lam kính hoặc

nhỏ trực tiếp lên khuẩn lạc trên đĩa thạch.
• Dùng đầu que cấy lấy một ít vi khuẩn được nuôi trong 24 gi ờ tr ộn vào
giọt H2O2 trên phiến kính.
•

Đọc kết quả:
• Dương tính: sủi bọt
• Âm tính : không sủi bọt (Âm tính nếu là vi khuẩn lactic)

•

Thử nghiệm citrate
•

Sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO 2 làm kiềm hóa

môi trường. Mặc khác thì mọi vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm ngu ồn
cacbon duy nhất đều có khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm duy
nhất. Sự phân giải muối ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ
25