ĐÁNH GIÁ hàm LƯỢNG SAPONINS và KHẢ NĂNG ức CHẾ các ENZYME TRONG BỆNH GOUT của PHÂN đoạn CAO CHIẾT rễ ĐẢNG sâm (codonopsis javanica)

1

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG SAPONINS
VÀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ CÁC
ENZYME TRONG BỆNH GOUT CỦA
PHÂN ĐOẠN CAO CHIẾT
RỄ ĐẢNG SÂM (Codonopsis javanica)

Người hướng dẫn: TS. TRƯƠNG THỊ DIỆU HIỀN
Người thực hiện: HUỲNH TẤN ĐẠT
Lớp

: 14060301

Niên khóa: 2014 – 2019


2

LỜI CẢM ƠN
Con đường dẫn đến thành công nào mà không phải trải qua gian khổ, kết quả
nào mà không bắt đầu từ lòng quyết tâm và khó khăn nào không thể vượt qua mà
không có sự đồng lòng hỗ trợ từ người thân xung quanh. Chính vì vậy, để có thể
hoàn thành khoá luận này, đến nay em đã luôn nhận được thật nhiều lời động viên
và sự trợ giúp của quý thầy cô, gia đình và bạn bè.

Em muốn gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Tôn Đức Thắng
đã tạo ra một môi trường học tập thuận lợi với trang thiết bị tân tiến để em có thể
hoà nhập với nền tri thức nhân loại. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý Thầy, Cô
khoa Khoa học ứng dụng đã đang và sẽ luôn từng ngày dạy dỗ, nâng niu, tạo nên
những nền tảng kiến thức vững chắc để chúng em có thể đi tới những chân trời khoa
học mới. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất em xin kính gửi cô Trương Thị Diệu Hiền,
với niềm đam mê khoa học cháy bỏng, cô luôn luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em,
để em có thể hoàn thành được khoá luận một cách hoàn thiện như ngày hôm nay.
Và không thể nào quên được công ơn nuôi lớn của cha mẹ, sự giúp đỡ từ bạn
bè thân thương trong suốt quá trình thực hiện đề tài. “Công cha nghĩa mẹ ơn thầy –
Sau này khôn lớn ơn dày biển sâu” viết sao cho hết những công lao, những dạy dỗ,

THÀNH PHỐ những lời động viên mà mọi người đã dành cho em. Từ đáy lòng
mình em xin cảm ơn tất cả sự giúp đỡ chân tình và quý báu ấy một lần nữa.

TÓM TẮT
Theo y học cổ truyền, các vị thuốc từ Đảng sâm (Codonopsis javanica) là
thập toàn đại bổ, tứ quân tử thang, có tác dụng ích khí, sinh tân, dưỡng huyết. Còn
theo các nghiên cứu của y học hiện đại Đảng sâm có tác dụng tường cường sức đề
kháng, hỗ trợ tiêu hoá, tim mạch, chống lão hoá. Trong nghiên cứu này các thí
nghiệm khảo sát ảnh hưởng của dung môi, nhiệt độ, tốc độ khuấy đến hàm lượng


3

saponins và khả năng ức chế enzyme trong bệnh Gout của các cao phân đoạn rễ
Đảng sâm (C. javanica) được thực hiện với mục tiêu giúp đưa thêm nhiều luận cứ
khoa học, từ đó nâng cao giá trị sử dụng của của Đảng sâm.
Trong thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi tách chiết ( methanol,
ethanol, dichloromethane, butanol 50% và nước), nhiệt độ tách chiết ( 20, 40, 60,

80, 100oC) và tốc độ khuấy mẫu (0, 100, 150,200, 500 rpm) đến hàm lượng
saponins cao cao chiết Đảng sâm, kết quả chỉ ra rằng điều kiện tối ưu để thu được
hàm lượng saponins cao nhất là trích ly dung môi methanol 50% (8,887  0,085a %
w/w), ở nhiệt độ 60oC (10,082  0,013a % w/w) và tốc độ khuấy mẫu là 500 rpm
(31,076  0,265a w/w). Thành phân hoá học trong các cao phân đoạn từ dịch chiết rễ
Đảng sâm cũng đã được xác định bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và quang phổ
Ultraviolet-Visible. Kết quả cho thấy trong cao tổng và các cao phân đoạn có xuất
hiện nhiều vệt (spot) chất khác nhau trên bản mỏng silicagel khi soi dưới đèn UV
bước sóng 254 và 365 nm, cũng như khi sử dụng thuốc thử p-anisalderhyde. Thêm
vào đó, có sự tương đồng giữa giá trị Rf = 0,43 và độ hấp thu quang phổ ở bước
sóng 212 nm của các cao phân Đoạn rễ Đảng sâm với các kết quả nghiên cứu về
hợp chất β-sitosterol.
Khả năng ức chế các enzyme α-glucosidase, lipoxygenase và xanthine
oxidase của các cao phân đoạn cũng đã được chứng minh là có sự thay đổi co ý
nghĩa (p<0,05). Cụ thể, trong thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế enzyme αglucosidase, cao phân đoạn F1 cho kết quả kháng tốt nhất với giá trị ức chế 50%
(IC50) bằng 2200,84  14,29 g/mL, ngược lại cao tổng cho kết quả thấp nhất với
IC50 bằng 8108,47  43,71 g/mL. Tiếp đến trong thí nghiệm đánh giá khả năng ức
chế enzyme lipoxygenase, giá trị IC50 tối ưu nhất là của cao phân đoạn F1 (103,04 
17,93 g/mL), trong khi đó cao tổng vẫn cho giá trị IC 50 thấp nhất (9121,29 
442,14 g/mL). Ở thí nghiệm ức chế enzyme xanthine oxidase, cao phân đoạn F1
tiếp tục cho thấy khả năng kháng tốt nhất với giá trị IC50 = 615,04  20,66 µg/mL.


4

Tóm lại, nghiên cứu này cho thấy: Điều kiện tách chiết có ảnh hưởng đến
hàm lượng saponins trong cao chiết Đảng sâm (C. javanica). Với việc sử dụng dung
môi là methanol 50%, nhiệt độ ngâm 60oC và tốc độ khuấy 500 rpm cho hàm lượng
saponins cao nhất. Cùng với đó, khả năng ức chế các enzyme trong bệnh Gout của
các phân đoạn cao chiết cũng được chứng minh. Kết quả này góp phần bổ sung

thêm những dữ liệu giá trị trong việc xác định thành phần hoá học và hoạt tính sinh
học của rễ cây Đảng sâm.


5

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN

...................................................................................................ii

TÓM TẮT

..................................................................................................iii

MỤC LỤC

...................................................................................................v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT..................................................................viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH.............................................................................ix
DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................................x
CHƯƠNG 1.

MỞ ĐẦU...................................................................................1

CHƯƠNG 2.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................3

2.1.

Tổng quan về saponins............................................................................3

2.1.1.

Saponins trong thực vật....................................................................3

2.1.2.

Saponins trong chi Codonopsis và loài C. javanica.........................4

2.2.

Ứng dụng của saponins...........................................................................5

2.2.1.

Ứng dụng của saponins từ thực vật.................................................5

2.2.2.

Ứng dụng của saponins từ chi Codonopsis và loài C.javanica.......6

2.3.

Bệnh Gout và các enzyme liên quan.......................................................8

2.3.1.

Enzyme xanthine oxidase.................................................................8

2.3.2.

Enzyme lipoxygenase........................................................................8

2.3.3.

Enzyme α-glucosidase......................................................................9

2.4.

Ứng dụng của dược liệu trong điều trị bệnh Gout................................9

CHƯƠNG 3.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP..........................................11

3.1.

Địa điểm và thời gian thực hiện............................................................11

3.2.

Thiết bị, dụng cụ và hóa chất................................................................11


6

3.2.1.

Thiết bị, dụng cụ.............................................................................11

3.2.2.

Hóa chất, dung môi........................................................................11

3.3.

Đối tượng nghiên cứu.............................................................................11

3.4.

Phương pháp nghiên cứu......................................................................12

3.4.1.

Quy trình thu nhận dịch chiết rễ Đảng sâm (C. javanica)............12

3.4.2.

Phương pháp xác định thành phần hoá thực vật..........................13

3.4.3.

Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố tách chiết đến hàm lượng

saponins trong cao chiết rễ Đảng sâm (C. javanica).....................................14

3.4.4.

Đánh giá khả năng kháng một số enzyme liên quan đến bệnh Gout

của các phân đoạn cao chiết rễ Đảng sâm....................................................15
3.4.5.
CHƯƠNG 4.
4.1.

Xử lý số liệu thống kê.....................................................................19
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN..................................................20

Khảo sát ảnh hưởng của kiều kiện tách chiết đến hàm lượng saponins

trong cao chiết rễ Đảng sâm (C. javanica)........................................................20
4.1.1.

Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hàm lượng saponins trong

cao chiết rễ Đảng sâm (C. javanica)..............................................................20
4.1.2.

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng saponins trong

cao chiết rễ Đảng sâm (C. javanica)..............................................................22
4.1.3.

Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến hàm lượng saponins

trong cao chiết rễ Đảng sâm (C. javanica)....................................................23

4.2.

Phương pháp xác định thành phần hoá thực vật................................24

4.2.1.

Sắc ký lớp mỏng..............................................................................24

4.2.2.

Quang phổ UV – Vis.......................................................................26

4.3.

Khảo sát ảnh hưởng của các phân đoạn cao chiết Đảng sâm đến khả

năng kháng một số enzyme...............................................................................27
4.3.1.

Khả năng kháng oxi hoá................................................................27

4.3.2.

Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase........................................29

4.3.3.

Khả năng ức chế enzyme lipoxygenase..........................................31

4.3.4.

Khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase...................................33


7

CHƯƠNG 5.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...............................................36

5.1.

Kết luận..................................................................................................36

5.2.

Kiến nghị................................................................................................37

TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................39

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Abs
CH2Cl2
CHCl3
cs
DMSO
EtOH
H2O
HPLC
IC50

BuOH
MeOH
NMR
OD
Rf
TLC
UV-Vis

: Khả năng hấp thu bức xạ (Absorbance)
: Dichloromethane
: Chloroform
: cộng sự
: Dimethyl sulfoxide
: Ethanol
: Nước cất
: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)
: Nồng độ ức chế 50% (Half maximal inhibitory concentration)
: Butanol
: Methanol
: Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance)
: Optical density
: Hệ số lưu giữ (Retention factor)
: Sắc ký bảng mỏng (Thin layer chromatography)
: Quang phổ (Ultraviolet – visible)

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Trang
Hình 3.1 Quy trình thu nhận cao chiết rễ Đảng sâm (C. javanica)...............12
Hình 3.2 Bản chấm sắc ký...........................................................................13

Hình 3.3 Quy trình thu nhận phân đoạn cao chiết Đảng sâm (C. javanica)..16
Hình 4.1 Phương trình đường chuẩn acid oleanolic.....................................20


8

Hình 4.2 Sắc ký lớp mỏng của cao chiết của rễ Đảng sâm (C. javanica) soi ở
bước sóng 365 nm (a), 254 nm (b) và sau khi phun (p-anisalderhyde:acid acetic
glacial:acid sulfuric:ethanol) với hệ dung môi chloroform:methanol (16:4)............25
Hình 4.3 Phổ hấp phụ của cao tổng và các cao phân đoạn F1, F2, F3 ,F4 từ
rễ Đảng sâm (C. javanica) (bước sóng từ 205 – 300 nm)........................................26
Hình 4.4 Phương trình đường chuẩn Acid ascorbic......................................27
Hình 4.5 Giá trị quang phổ của các cao phân đoạn rễ Đảng sâm (C. javanica)
trong khả năng kháng oxi hoá..................................................................................28
Hình 4.6 Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của các cao phân đoạn rễ
Đảng sâm (C. javanica)...........................................................................................30
Hình 4.7 Khả năng ức chế enzyme lipoxygenase của các cao phân đoạn rễ
Đảng sâm (C. javanica)...........................................................................................32
Hình 4.8 Khả năng ức chế enzyme oxidase của các cao phân đoạn rễ Đảng
sâm (C. javanica).....................................................................................................34

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Quy trình xác định hàm lượng saponins từ dịch chiết rễ Đảng sâm
................................................................................................................................. 15
Bảng 3.2 Quy trình xác định khà năng kháng oxi hoá theo phương pháp
FRAP....................................................................................................................... 17
Bảng 4.1 Hàm lượng saponins trong cao chiết rễ Đảng sâm (C. javanica) ở
các loại dung môi khác nhau...................................................................................21
Bảng 4.2 Hàm lượng saponins trong cao chiết rễ Đảng sâm (C. javanica) ở

các khoảng nhiệt độ khác nhau................................................................................22
Bảng 4.3 Hàm lượng saponins trong cao chiết rễ Đảng sâm (C. javanica) ở
những tốc độ phá mẫu khác nhau............................................................................23


9

Bảng 4.4 Khả năng kháng oxi hoá của các cao phân đoạn rễ Đảng sâm (C.
javanica)..................................................................................................................29
Bảng 4.5 Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của các cao phân đoạn rễ
Đảng sâm (C. javanica)...........................................................................................31
Bảng 4.6 Khả năng ức chế enzyme lipoxygenase của các cao phân đoạn rễ
Đảng sâm (C. javanica)...........................................................................................33
Bảng 4.7 Khả năng ức chế enzyme oxidase của các cao phân đoạn rễ Đảng
sâm (C. javanica).....................................................................................................35


1

CHƯƠNG 1.

MỞ ĐẦU

Từ xa xưa nhân sâm luôn là loài thảo dược ví như thuốc cải lão hoàn đồng,
hồi sinh mệnh, chỉ có vua chúa và các quan lại triều đình mới có thể sử dụng nhân
sâm. Ngày nay, với nền y học tiên tiến nhân sâm vẫn được sử dụng như một loại
thực phẩm giúp bổ dung khí huyết, tăng cường thể trạng. Các loại nhâm sâm với
hoạt tính sinh học cao nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học như sâm
Bắc Mỹ (Panax quinquefolius), sâm Cao Ly (Panax ginseng) và gần đây nhất là
sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis). Bên cạnh đó vẫn có một số loại sâm chưa

được nghiên cứu và xác định thành phần hoá học cũng như hoạt tính sinh học rõ
ràng. Tiêu biểu trong đó có loài Codonopsis javanica, hay với tên gọi Đảng sâm. Ở
Việt Nam, các nghiên cứu chỉ ra rằng β-sitosterol , 2′-hydroxy-N-((E,2R)-1,3,4trihydroxyoctadec-8-en-2-yl)

hexacosanamid

và

α-spinasterol

3-O-β-D-

glucopyranosid có mặt trong thành phần hoá thực vật của Đảng sâm [1]. Tác dụng
của Đảng sâm cũng đã được Võ Văn Chi và cs [2] nhắc đến trong Từ điển cây thuốc
Việt Nam như chữa ho, viêm thượng thận, viêm loát dạ dày… Cũng theo các nghiên
cứu khoa học khác Đảng sâm còn có tác dụng tăng cường hệ thống miễn dịch, hạ
đường huyết, cải thiện sự thèm ăn, khắc phục tình trạng tiêu hoá kém [3, 4, 8, 74].
Nhìn chung có thể thấy Đảng sâm là một loại dược liệu quý, có nhiều tiềm năng
trong y học. Do vậy việc xác định chính xác thành phân hoá học cũng như nghiên
cứu về hoạt tính sinh học của loài cây này là điều cần thiết.
Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Đánh giá hàm lượng saponins và
khả năng ức chế các enzyme trong bệnh Gout của phân đoạn cao chiết rễ Đảng
sâm (Codonopsis javanica)” với mục tiêu xác định rõ thành phần hóa học, đặc biệt
là nhóm saponins, và hoạt tính kháng các enzyme trong bệnh Gout, nhằm góp phần
cung cấp luận cứ khoa học, nâng cao giá trị sử dụng và khai thác hiệu quả nguồn
hoạt chất quý từ loài thuốc dân gian này.


2

Đề tài được thực hiện nhằm đạt được các mục tiêu chính sau:
-

Đánh giá ảnh hưởng của dung môi chiết (), nhiệt độ ngâm mẫu (), và
tốc độ khuấy mẫu () đến hàm lượng saponins trong cao chiết Đảng
sâm(C. javanica)

-

So sánh khả năng kháng enzyme α-glucosidase của cao tổng và các
cao phân đoạn.

-

So sánh khả năng kháng enzyme lipoxygenase của cao tổng và các
cao phân đoạn.

-

So sánh khả năng kháng enzyme xanthine oxidase của cao tổng và các
cao phân đoạn.

CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về saponins
1.1.1. Saponins trong thực vật
Saponins thuộc nhóm glycoside được tìm thấy nhiều ở trong thực vật, bao
gồm các hợp chất được đặc trưng bởi cấu trúc aglycone liên kết với một hay nhiều

phân tử đường. Saponins được chia thành triterpenoid saponins hay steroid saponins
tuỳ thuộc vào nhóm aglycone. Một số tính chất đặc trưng cho hợp chất saponins
như có vị đắng, làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt, khả năng làm tan huyết, gây độc
với cá…[9].
Saponins được tìm thấy trong hơn 100 loài thực vật và một số nguồn hải sản
như sao biển, hải sâm [10]. Các steroid saponins chủ yếu được tìm thấy trong các
loài thực vật một lá mầm như Agavaceae, Dioscoreaceae và Liliaceae, còn
triterpenoid saponins được tìm thấy chủ yếu ở những loài thực vật hai lá mầm như
Leguminosae, Araliaceae, Caryophyllaceae [11]. Saponins cũng hiện trong một số
loài thực vật như Quillaja saponaria, Trigonella foenum-graceum, Medicago sativa,
Aesculus hippocastanum, Saponaria officinalis [12].


3

Các loài thực vật khác nhau có chứa những loại saponins đặc trưng khác
nhau. Ví dụ, saponins đặc trưng của cây đậu nành (Glycine max) gồm ba nhóm chất
soyasapogenol A, B và E. Trong nhân sâm, saponins đóng vai trò hoạt tính chính
của nhóm cây này. Khoảng 40 loại saponins đã được xác định từ nhân sâm, mỗi loại
có thể có tác dụng dược lý khác nhau. Trong đó Rb1, Rg1, Rg3, Re, Rd và Rh1
được nghiên cứu nhiều nhất. Asian ginseng (Panax ginseng C. A. Meyer) và
American ginseng (Panax quinquefolium L.) là hai loại sâm được sử dụng phổ biến
nhất. Theo đó Panax quinquefolium L. chứa hàm lượng saponins cao hơn các loại
sâm khác [13].

1.1.2. Saponins trong chi Codonopsis và loài C. javanica.
Codonopsis thuộc họ Campanulaceae, là một chi gồm 42 loài cây thân thảo
lâu năm, chủ yếu được tìm thấy ở Trung, Đông và Nam Á. Một số loài Codonopsis
được xem là có nhiều dược tính và được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền.
Dựa trên nhiều nghiên cứu, thành phân hoá thực vật của Codonopsis bao gồm

alkaloids, phytosteroids, phenylpropanoids, polysaccharides, flavones, saponinss,
polyacetylenes, triterpenoids, acid hữu cơ… Trong đó, alkaloids, polysaccharides,
saponins, triterpenoids là nhóm chất đóng vai trò quan trọng trong việc quy định
hoạt tính sinh học của Codonopsis [8].
Năm 2006, nhờ vào nghiên cứu của Yuan Zang và cs [14] một hợp chất
triterpenoid saponins mới được tìm thấy trong rễ C. lanceolata là codonolaside V.
Năm 2008, Makoto Ichikawa và cs [15] đã tìm ra 7 nhóm chất 3,28-bidesmosidic
triterpenoid saponins là lancemaside A, lancemaside B, lancemaside C, lancemaside
E, lancemaside G, foetidissimoside A, và aster saponins Hb trong phân đoạn cao
chiết MeOH 50% bằng phương pháp LC-MS. Qi Huan-yang và cs [16] năm 2011,
đã phát hiện ra α-Spinasterol-β-D-glucoside, β-sitosterol, β-daucosterol trong cao
chiết rễ C.pilosula.


4

Codonopsis javanica tên thường dùng là Đảng sâm, được tìm thấy chủ yếu ở
Trung Quốc, Lào, Ấn Độ, Myanma, Thái Lan, và ở Việt Nam chúng phân bố chủ
yếu ở vùng miền núi phía Bắc và các cao nguyên phía Nam. Theo nghiên cứu của
Chung và cs [5] năm 2002, đã chỉ ra thành phần hoá học của C.javanica bao gồm
amino acid, đường khử, chất béo và saponins. Cũng theo nghiên cứu này, C.
javanica chứa nhiều saponins triterpenoid, hàm lượng saponins trong rễ là 3,12 ±
0,08%. Đến năm 2014, Hà và cs [1] bằng phương pháp phổ MS và MNR đã phát
hiện ba hợp chất là β-sitosterol (1); 2′-hydroxy-N-(E,2R)-1,3,4-trihydroxyoctadec8-en-2-yl) hexacosanamid (2) và α-spinasterol 3-O-β-D glucopyranosid (3) trong
cao chiết EtOH từ rễ Đảng sâm. Trên thế giới có một số báo cáo công nhận thành
phần hoá học của Đảng sâm chứa polysaccharides, saponins,alkaloids và
phytosteroids [17, 74]. Tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học
của C. javanica.
1.2. Ứng dụng của saponins
1.2.1. Ứng dụng của saponins từ thực vật

Saponins được xem là thành phần chính và có tác dụng dược lý quan trọng
trong một số loại thuốc thảo dược [18]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng saponins có
tác dụng làm giảm cholesterol máu, kích thích miễn dịch và chống ung thư. Ngoài
ra, chúng còn giảm nguy cơ mắc bệnh tim đối với những người thường xuyên sử
dụng thực phẩm giàu saponins [19]. Saponins đã được áp dụng làm tá dược cho vắc
xin phòng ngừa virus( ví dụ: Quillaja saponaria-21) và vi khuẩn ( ví dụ: Quillaja
saponins) [20]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng saponins có khả năng hạn chế sự
lây nhiễm và gây suy giảm miễm dịch của virus ở người [21, 22].
Saponins được xem là một chất chống oxi hoá tự nhiên vì nó có khả năng
liên kết với cholesterol và ngăn ngừa quá trình oxi hoá cholesterol ở đại tràng . Ở tế
bào, các gốc oxi hoá tự đo sẽ tấn công vào các chất béo không no, thúc đẩy quá
trình peroxid hoá, dẫn đến tổn thương tế bào [23]. Các saponins có liên kết với 2,3dihydro2,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one (DDMP) được tìm thấy nhiều
trong cây họ Đậu, có tác dụng ngăn ngừa sự peroxid hoá và bảo vệ protein khỏi các


5

gốc oxi hoá tự do [24, 25]. Ahumada-Santos và cs [26] (2013) đã nghiên cứu hoạt
tính chống oxi hoá của sáu loài Agave sống ở Mexico. Agave rzedowskiana cho
thấy khả năng chống oxi hoá cao nhất (27.41 mM Trolox/gram mẫu khô) trong thí
nghiệm DPPH. Trong một vài nghiên cứu gần đây, saponins được chứng minh có
khả năng chống lại các gốc tự do và tăng cường hoạt động của các enzyme chống
oxi hoá nội bào [27].
Các nghiên cứu gần đây cho thấy saponins co hoạt tính chống viêm. Nhiều
saponins ly trích từ thực vật có hiệu quả ức chế viêm trong thử nghiệm phù nề
chuột. Trong một nghiên cứu của Just và cs năm 2008 [28], Fruticesaponins B một
loại saponins bidesmosidic được phân lập từ Bupleurum fruticescens L., đã được
chứng minh là có hoạt động chống viêm cao nhất trong các loại saponins thử
nghiệm phù nề trên chuột. Aescin là một hỗn hợp triterpenoid saponins, thu nhận từ
cây Aesculus hippocastanum, cũng được phát hiện là có khả năng chống viêm trong

nghiên cứu của Sitori năm 2011 [29]. Các triterpenoid saponins loniceroside C được
ly trích từ cây Lonicera japonica Thunb. (Caprifoliaceae) cho thấy khả năng chống
viêm cao nhất khi thử nghiệm trên chuột, với nồng độ 50-200 mg/kg loniceroside C
cho khả năng ức chế 15-31% [30]. Kim và cs [31] đã chứng minh rằng hợp chất
saponins trong Panax ginseng cũng có hoạt tính kháng viêm.
Khả năng ngăn ngừa và hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư của
saponins được nói đến trong nhiều nghiên cứu khoa học. Nhiều steroidal saponins
đươc thu nhận từ thực vật cho thấy có tiềm năng trong việc gây độc với dòng tế bào
ung thư bạch cầu người HL-60 [32, 41]. Tran và cs [33] đã thử nghiệm các hợp chất
spirostanol và furostanol - loại saponins được thu nhận từ cây Dracaena
angustifolia về khả năng chống ung thu đại tràng dòng 25-L5, HT-1080
fibrosarcoma và u ác tính B-16 BL6. Kết quả cho thấy ba trong số các hợp chất
được nghiên cứu là namonin A, namonin B và một steroidal saponin có tiềm năng
trong việc chống lại tế bào HT-1080 fibrosarcoma (giá trị IC 50 là 0,2 to 0,6µM).


6

Saponins từ Panax ginseng đã được chứng minh là có khả năng ngăn chặn quá trình
tăng sinh của dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt [34].
1.2.2. Ứng dụng của saponins từ chi Codonopsis và loài C.javanica
Dựa trên nhiều tài liệu y học thì chi Codonopsis có những tác dụng dược lý
như cải thiện sức khoẻ, chống lão hoá, phòng chống béo phì, hạ đường huyết, phòng
chống ung thư, bệnh đái tháo đường, và kháng viêm.
Phòng chống bệnh đái tháo đường
Năm 2008, Fu và cs [35] đã tìm ra rằng với 3 nồng độ khác nhau của
polysaccharide (100, 200 và 300 mg/kg/ngày) từ rễ C. pilosula có khả năng hạ
đường huyết, giảm nồng độ insulin, tăng cường hoạt động của enzyme superoxide
dismutase (SOD) và giảm hàm lượng malondialdehyde (MDA) trong huyết thanh
của chuột. Đến năm 2011, ông cùng cùng các cộng sự đã nghiên cứu và phát hiện

khả năng làm chậm tiến triển bệnh tiểu đường của chuột sau 3 ngày sử dụng cao
chiết C. pilosula ( kết quả 4,5 g nguyên liệu thô/kg/ngày) [36].
Phòng chống tế bào ung thư
Wang và cs [37] năm 2011, đã cho thấy ở các nồng độ 50, 100, 150 và 200
μg/mL của phân đoạn n-butanol từ rễ C. lanceolata có khả năng ức chế sự phát triển
của tế bào ung thư đại tràng người HT-29. Hơn nữa các nhóm saponins từ
C.lanceolata (100, 150 và 200 μg/mL) cũng đã được Yu và cs [38] phát hiện có
hoạt tính trong việc ức chế sự phát triển của tế bào HepG2 thông qua việc tác dụng
lên caspases-8 và caspases-9 và kích hoạt caspases-3.
Khả năng kháng viêm
Theo nghiên cứu của Xu và cs [14] năm 2008, hai hợp chất codonolaside II
và codonolaside III trong cao chiết methanol từ rễ C. lanceolata cho kết quả kháng
viêm tốt ( 62,46% và 59,97% ức chế) trong thí nghiệm phù nề tai chuột. Trước đó
vào năm 2007 Lee và cs [39], đã phát hiện ra rằng cao chiết MeOH từ C.lanceolata
với nồng độ 100 mg/mL ngăn chặn rõ ràng việc sản xuất INF-α và nitric oxide.
Chống lão hoá


7

Xu và cs [40] năm đã cho thấy rằng chuột sau khi được xử lý với dịch chiết
C. pilosula trong 8 tuần thì hoạt động của superoxide dismutase (SOD) trong huyết
thanh và gan, cũng như glutathione peroxidase và nitric oxide synthase trong thận
tăng. Trong khi đó, các chỉ số của malondialdehyde (MDA) trong huyết thanh, gan
và lipofuscin trong não giảm một cách đáng kể. Sự kiềm hãm này có thể liên quan
đến khả năng nâng cao hệ miễn dịch, loại bỏ các gốc tự do…
Bảo vệ niêm mạc dạ dày
Liu và cs [42, 50] đã chứng minh hoạt tính của dịch chiết C.pilosula có khả
năng bảo vệ niêm mạc dạ dày trước tác hại của rượu, axít (HCl 0,6N) và bazơ
(NaOH 0,2N). Hoạt tính này có thể do sự tổng hợp prostaglandins. Năm 2008, Song

và cs [43] nghiên cứu và chỉ ra rằng lobetyolin có ảnh hưởng đáng kể việc giảm
mức độ loét và bào vệ niêm mạc dạ dày trước tổn thương.
Theo nghiên cứu của Do 2003 [3], Dinh 2010 [4], Chen và cs [74] năm 2013
và He và cs [8] năm 2015 thì Codonopsis javanica cũng có khả năng cải thiện sự
thèm ăn, khắc phục tình trạng tiêu hoá kém, tăng cường hệ thống miễn dịch, hạ
đường huyết.
1.3. Bệnh Gout và các enzyme liên quan
Gout là căn bệnh gây ra do sự lắng đọng tinh thể monosodium urate trên các
khớp và dây chằng. Các tinh thể urate sẽ bám chặt vào các sụn khớp dẫn đến nên
tình trạng viêm khớp – khớp đỏ, mềm, nóng, sưng, đau nhức [80]. Việc hình thành
tinh thể muối urate có liên quan mật thiết đến nồng độ acid uric cao trong cơ thể.
Acid uric là sản phẩm cuối trong quá trình phân giải purine [44]. Thông thường acid
uric sẽ được cơ thể đào thải qua nước tiểu, sự rối loạn hoạt động của thận hay bất kỳ
enzyme nào trên con đường phân giải purine cũng có thể làm tăng nồng độ acid uric
trong cơ thể.
Ngoài ra các yếu tố nhóm máu, tuổi tác, yếu tố di truyền, chế độ ăn uống và
các bệnh như tăng huyết áp, béo phì, tiểu đường, thận mãn tính cũng đã được đề cập
là có liên quan đến tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh Gout [45].


8

1.3.1. Enzyme xanthine oxidase
Xanthine oxidase (XO) là một enzyme xúc tác cho quá trình oxy hoá
hypoxanthine thành xanthine và xanthine thành acid uric trên con đường phân giải
purine. Hơn nữa, các gốc oxi hoá tự đo được tạo ra từ phản ứng do xanthine oxidase
xúc tác, cũng góp phần gây nên các vấn đề về viêm, rối loạn chuyển hoá, lão hoá tế
bào, ung thư… Vì vậy, việc hạn chế hoạt động của enzyme xanthine oxidase không
chỉ góp phần giảm nồng độ acid uric trong máu, mà còn hạn chế được nhiều bệnh
khác.

1.3.2. Enzyme lipoxygenase
Đối với các bệnh nhân bị Gout, sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể trước các
tinh thể độc (muối urate) dẫn đến việc hình thành phản ứng viêm các mô, khớp làm
sưng, đỏ và đau. Cơ chế gây viêm được tạo thành bởi nhiều yếu tố, trong đó các
nhóm chất trung gian đóng vai trò quan trọng.
Leukotriene là một nhóm chất trung gian gây viêm được sản xuất trong bạch
cầu do quá trình oxi hoá acid arachidonic và acid eicosapentaenoic [46]. Histamin
và prostaglandin là hai chất trung gian gây viêm cũng được giải phóng trong quá
trình này. Ba enzyme xúc tác đặc hiệu cho phản ứng phân giải acid arachidonic là 5lipoxygenase, 12-lipoxygenase và 15-lipoxygenase [47]. Vì vậy việc ức chế hoạt
động của lipoxygenase, được cho là có thể giảm sự hình thành viêm, giảm sưng,
giảm đau nhức ở người bị Gout.
1.3.3. Enzyme α-glucosidase
Bệnh đái tháo đường type 2 xảy ra khi cơ thể xảy ra sự kháng insulin và
đường sẽ nằm trong máu với nồng độ cao gây ra các biến chứng của bệnh. Một vài
nghiên cứu cho rằng điều này có thể ảnh hưởng đến sự phát triển bệnh Gout và tăng
acid uric máu.
Enzyme α-glucosidase đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hoá
carbonhydrate thành glucose. Bằng cách ức chế enzyme này, nồng độ glucose trong
máu có thể được trả lại trong giới hạn bình thường [48].


9

1.4. Ứng dụng của dược liệu trong điều trị bệnh Gout.
Acid uric là yếu tố cơ bản dẫn đến bệnh Gout, do vậy hướng chữa trị bệnh
này chủ yếu xoay quanh việc giảm nồng độ acid uric trong máu và đào thải nó khỏi
cơ thể. Allopurinol là loại thuốc đang được sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh Gout.
Tuy có khả năng giảm và giữ ổn định nồng độ acid uric luôn ổn định trong máu,
nhưng allopurinol cũng có những hạn chế như dị ứng, viêm gan nhiễm độc, xáo trộn
chức năng gan và chống chỉ định cho người suy thận, sỏi thận [49]. Hơn nữa

allopurinol cũng chỉ có tác dụng đơn lẻ trong việc ngăn chặn hình thành acid uric,
hoàn toàn không có hiệu quả trong việc giảm hiện tượng viêm sưng tấy hay loại bỏ
tinh thể muối urate – nguyên nhân chính gây nên cơn đau bệnh Gout. Chính vì vậy
mà hiện nay xu hướng sử dụng kết hợp các loại thảo dược trong điều trị bệnh Gout
được ưu tiên hơn cả.
Cây nở ngày đất (Gomphrena celosiodes Mart.) có tiềm năng trong việc
phòng ngừa bệnh Gout và đái tháo đường. Các nhà khoa học đã tìm thấy các hợp
chất phenolic, flavonoid, saponins, sterol, terpen, tannin và coumarins trong thành
phần hóa học của cây nở ngày đất. Theo kết quả nghiên cứu của Thu và cs [6] vào
năm 2002 cho thấy rằng phân đoạn cao chiết butanol và ethyl acetate của cây nở
ngày đất có tách dụng chống oxi hoá và ức chế enzyme xanthine oxidase cao nhất.
Mặc dù chưa có công bố chính thức nào về việc dây gắm có khả năng điều trị
bệnh Gout, nhưng vẫn có một số bài thuốc y học cổ truyền, thực phẩm chức năng đề
cập đến việc dây gắm có hiệu quả trong việc giảm nồng độ acid uric, giảm viêm.
Trong một số nghiên cứu khác về dây gắm (Gnetum montanum), người ta đã phân
lập ra được các hợp chất như resveratrol, gnetol, 4′,5,7-trihydroxy-3′methoxyflavone, β-sitosterol, daucosterol, ursolic acid, và tetracosanoic acid [51].
Theo nghiên cứu với 96 loài cây khác nhau ở Việt Nam về khả năng ức chế
enzyme xanthine oxidase có thể thấy cao chiết methanol (MeOH) của cây Artemisia
vulgaris, Caesalpinia sappan, Blumea balsamifera, Chrysanthemum sinense và cao


10

chiết methanol-nước của cây Tetracera scandens cho kết quả tối ưu với IC50 dưới 20
μg/mL [52].


11

CHƯƠNG 2.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện
Đề tài khóa luận bắt đầu từ ngày tháng năm 2018 và kết thúc vào ngày
tháng năm 2019 tại phòng thí nghiệm chuyên đề, khoa Khoa học Ứng dụng,
Trường đại học Tôn Đức Thắng.
2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ

-

Tủ sấy Trung Quốc.

-

Tủ lạnh.

-

Máy khuấy từ gia nhiệt Velp Scientifica (Italy).

-

Cân phân tích.

-

Ống nghiệm, erlen, bercher, pipette, pipetpasteur, micropipet, …

-

Máy đo UV – Vis Jasco V-730.

-

Máy ủ nhiệt khô
2.2.2. Hóa chất, dung môi
Dung môi và hóa chất sử dụng như:

-

Ethanol (EtOH), Methanol (MeOH), Chloroform (CHCl3), Dichloromethane
(CH2Cl2), n-Buthanol (BuOH), Dimethyl sulfoxide (DMSO) …

-

HCl, NaOH, FeCl3…

2.3. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là rễ Đảng sâm (Codonopsis javanica) được lấy từ
tỉnh Kon Tum sau đó được đóng gói trong các túi chuyên dụng, giữ lạnh bằng đá
khô trong suốt quá trình vận chuyển về phòng thí nghiệm. Phần rễ được làm sạch


12

loại bỏ bùn đất và tạp sau đó đem sấy khô ở nhiệt độ 55 – 60 oC, nghiền thành bột,
bảo quản ở 50 oC đến khi phân tích.
2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Quy trình thu nhận dịch chiết rễ Đảng sâm (C. javanica)

Bột mẫu nguyên liệu
Dung môi chiết
(1:20)
Ngâm mẫu

Đồng nhất mẫu trong
6 giờ, 60 oC
Lọc
Dịch chiết
Cô cạn
Cao chiết thô

Hình 3.1 Quy trình thu nhận cao chiết rễ Đảng sâm (C. javanica)
Giải thích quy trình: Bột Đảng sâm được chiết xuất với các loại dung môi
khác nhau bao gồm: nước cất (H2O), ethanol 50% (EtOH 50%), methanol 50%
(MeOH 50%), buthanol 50% (BuOH 50%) và dichloromethane (CH 2Cl2 50%) với
tỷ lệ 1:20. Hỗn hợp được ủ ở các nhiệt độ 20 oC, 40 oC, 60 oC, 80 oC và 100 oC trong
các khoảng thời gian 0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ. Sau đó hỗn hợp được đem


13

đi đồng nhất ở 60 oC trong 6 giờ và cuối cùng được lọc thu dịch chiết tổng. Dịch
chiết tổng được cô cạn thành cao tổng Đảng sâm.
2.4.2. Phương pháp xác định thành phần hoá thực vật
2.4.2.1. Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography – TLC ) [53, 54]
Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật đơn giản thường được ứng dụng để xác
định sự hiện diện của một hay nhiều nhóm chất trong hỗn hợp. Phương pháp sắc ký

lớp mỏng dựa trên sự phân tách của các chất khi cho pha tĩnh đi qua pha động. Pha
tĩnh trong này thường là một lớp mỏng với chất hấp phụ là silicagel, aluminium
oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động sử dụng để
phân tách các chất được sử dụng các dung môi hay hỗn hợp các dung môi có độ
phân cực khác nhau.
Hệ số tồn lưu (Retention factor – Rf) là giá trị thể hiện sự di chuyển của các
hợp chất trong mẫu phân tích. Với cùng một hệ dung môi giải ly các chất giống
nhau sẽ có giá trị Rf tương tự nhau
 hoặc 
Trong đó l là khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tâm vệt sắc ký, l 0 là khoảng
cách từ tuyến xuất phát tới tuyến dung môi, v là tốc độ di chuyển của chất tan và v 0
là tốc độ của dung môi. Như vậy giá trị Rf luôn nằm trong khoảng từ 0 đến 1.
1cm

Tiền tuyến dung môi

10 cm

Mẫu
Vạch xuất phát
1cm

Hình 3.2 Bản chấm sắc ký


14

Để xác định sự hiện diện của hợp chất saponins (đặc biệt là β-sitosterol)
trong cao chiết rễ Đảng sâm (C. javanica), phương pháp sắc ký lớp mỏng được áp
dụng với pha tĩnh là bản mỏng silicagel 60 F254, pha động là hỗn hợp dung môi

chloroform : methanol tỷ lệ 16 : 4. Thể tích mỗi điểm chấm là 50 µL, được đưa lên
bản mỏng bằng ống mao quản sao cho điểm chấm phải nhỏ đường kính không quá 5
mm. Vạch xuất phát và đường tiến tuyến phải cách mép dưới và mép trên của bản
mỏng silicagel tối thiểu 1 cm. Khi triển khai sắc ký, bản mỏng phải được đặt thằng
đứng và ổn định trong bình triển khai, thể tích dung môi dùng để triển khai không
được vượt quá vạch xuất phát. Khi dung môi chạm đường tiền tuyến, có thể lấy bản
mỏng ra, sấy đuổi dung môi ở 105oC trong 5 phút. Sự hiện diện của các nhóm chất
được ghi nhận dưới ánh sáng tia cực tím 254 nm và 365 nm, cũng như dưới tác
dụng của thuốc thử (p-anisalderhyde:acid acetic glacial:acid sulfuric:ethanol).
2.4.2.2. Quang phổ Ultraviolet – visible (UV–Vis) [55]
Quang phổ Ultraviolet – visible là kỹ thuật thường được dùng trong phân
tích hoá dược. Nguyên tắc của kỹ thuật là đo cường độ tia ló khi cho chùm tia sáng
song song đơn sắc đi qua một hỗn hợp có khả năng hấp thụ tia sáng. Cường độ hấp
thu phụ thuộc vào nồng độ các chất hấp thu và độ đài đoạn đường mà tia sáng đi
qua. Giá trị quang phổ hấp thu của cao tổng và các cao phân đoạn từ rễ Đảng sâm
(C. javanica) được xác định bằng máy UV-Vis Jasco V-730. Các mẫu cao được hoà
tan bằng methanol nguyên chất để đạt nồng độ 100 µg/mL.
2.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố tách chiết đến hàm lượng saponins
trong cao chiết rễ Đảng sâm (C. javanica)
Hàm lượng saponins trong cao chiết rễ Đảng sâm được xác định dựa theo
phương pháp của Han và cs [56]. Đường chuẩn acid oleanic được xây dựng với hàm
lượng từ 5-30 μg


15

Bảng 3.1 Quy trình xác định hàm lượng saponins từ dịch chiết rễ Đảng sâm
(C. javanica)
Nhóm chất
Thể tích (mL)

Mẫu thử / Chất chuẩn
0,1
Cô cạn
Vanillin 5%
0,2
Lắc đều
HClO4
0,8
o
Ủ ở 60 C, trong 15 phút
Acid acetic
5,0
Lắc đều và đo độ hấp phụ ở bước sóng 548 nm
Hàm lượng saponins được tính theo công thức:
S(%, w/w) =
Trong đó : S: hàm lượng saponins tổng (%, w/w)
AOE (Acid oleanic equivalent) là hàm lượng acid oleanic trong 1
mL mẫu phân tích (μg/mL)
v: tổng thể thích mẫu phân tích (mL).
m: khối lượng mẫu phân tích (g).


16

2.4.4. Đánh giá khả năng kháng một số enzyme liên quan đến bệnh Gout của
các phân đoạn cao chiết rễ Đảng sâm.
2.4.4.1. Thu nhận phân đoạn cao chiết Đảng sâm.
Cao chiết tổng
Nước cất (1:20)
Dịch chiết

Petroleum ether
(1:1)

Thu phân lớp dưới

Phân lớp trên

n-Buthanol
(1:1)

Thu phân lớp trên

Phân lớp dưới

Sắc ký cột
Pha động
Thu các phân đoạn sắc ký
Hình 3.3 Quy trình thu nhận phân đoạn cao chiết Đảng sâm (C. javanica)
Giải thích quy trình: Cao tổng Đảng sâm sau khi được hoà tan lại bằng nước
cất sẽ được đem chiết lỏng-lỏng với petroleum ether tỷ lệ 1:1 để loại béo. Phân lớp
dưới tiếp tục được chiết lỏng-lỏng với n-buthanol tỷ lệ 1:1, đến khi phân lớp trên
không màu. Thu phân lớp trên, cô cạn và hoà tan với methanol. Dịch chiết n-