NGHIÊN cứu ẢNH HƯỞNG của các CHẤT điều hòa SINH TRƯỞNG và hợp CHẤT hữu cơ đến QUÁ TRÌNH NUÔI cấy IN VITRO LAN GIẢ hạc hòn hèo dendrobium anosmum lindl

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
-----o0o-----

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT
ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG VÀ HỢP CHẤT
HỮU CƠ ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY
IN VITRO LAN GIẢ HẠC HÒN HÈO
Dendrobium anosmum Lindl
Người hướng dẫn: TS. TRẦN THỊ DUNG
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN CÔNG TOẢN
Lớp: 14060302
Khóa: 18
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019


TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
-----o0o-----

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT
ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG VÀ HỢP CHẤT
HỮU CƠ ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY
IN VITRO LAN GIẢ HẠC HÒN HÈO
Dendrobium anosmum Lindl

Người hướng dẫn: TS. TRẦN THỊ DUNG
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN CÔNG TOẢN
Lớp: 14060302
Khóa: 18
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019


1

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám đốc Công Ty
TNHH Nông Vinh đã tạo mọi điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận này.
Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn đến cô Trần Thị Dung, người đã dẫn dắt, hướng
dẫn và giải đáp những thắc mắc để em có thể làm tốt và hoàn thành khóa luận này
một cách thuận lợi.
Bên cạnh đó em cũng xin được gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại
học Tôn Đức Thắng, Ban chủ nhiệm khoa Khoa Học Ứng Dụng cùng các thầy cô và
cán bộ công nhân viên trong trường đã tạo điều kiện thuận lợi và truyền đạt những
kiến thức quý báu trong suốt quảng thời gian em học tập tại trường. Từ những kiến
thức đó đã tạo nền tảng, cơ sở để em có thể hoàn thành được khóa luận này.
Cuối cùng em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, bạn bè và những
người thân, mọi người đã luôn ở bên cạnh em là nguồn động lực về cả vật chất và
tinh thần giúp em vượt qua những khó khăn vất vả trong học tập và cuộc sống để
em có được thành công như hôm nay.
Em xin chân thành cảm ơn!
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2019
NGUYỄN CÔNG TOẢN


2

LỜI CAM ĐOAN
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH
TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự
hướng dẫn khoa học của TS. TRẦN THỊ DUNG Các nội dung nghiên cứu, kết quả
trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây.
Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá
được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu
tham khảo.
Ngoài ra, trong khóa luận còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số
liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn
gốc.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách
nhiệm về nội dung khóa luận của mình. Trường đại học Tôn Đức Thắng không
liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình
thực hiện (nếu có).
TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm
Tác giả
(ký tên và ghi rõ họ tên)


3

TÓM TẮT
NGUYỄN CÔNG TOẢN, Đại học Tôn Đức Thắng, tháng 01/2019.
“NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH
TRƯỞNG VÀ HỢP CHẤT HỮU CƠ ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY IN
VITRO LAN GIẢ HẠC HÒN HÈO (Dendrobium anosmum Lindl.)”
Giảng viên hướng dẫn TS. TRẦN THỊ DUNG.

Đề tài được thực hiện tại công ty TNHH Nông Vinh TP HCM.
Nội dung nghiên cứu gồm 5 thí nghiệm về ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa
sinh trường BA, NAA, chất hữu cơ và giá thể trồng đến quy trình nuôi cấy in vitro
lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl).
Các kết quả đạt được:
Môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L NAA + 2 mg/L là tốt nhất cho sự tạo chồi từ
lớp mỏng lan Giả hạc Hòn Hèo với kết quả tỷ lệ tạo chồi đạt 43,31% và trung bình
11,49 chồi/mẫu sau 60 ngày nuôi cấy.
Nhân chồi lan đạt hiệu quả cao nhất trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L BA với
kết quả 22,44 chồi/mẫu cấy, 4,07 lá/chồi, chiều cao chồi 1,55 cm sau 60 ngày nuôi
cấy.
Chất hữu cơ thích hợp nhất cho sự phát triển của lan Giả hạc Hòn Hèo là khoai
tây ở nồng độ 20 g/L với chiều cao đạt 1,87 cm, số lá 5,87 lá/chồi sau 60 ngày nuôi
cấy.
Nồng độ NAA tối ưu cho sự hình thành rễ lan là 1,5 mg/L, kết quả số rễ hình
thành 8,04 rễ/chồi, chiều dài rễ đạt 0,98 cm sau 60 ngày nuôi cấy.
Giá thể thích hợp nhất cho việc trồng cây con in vitro Giả hạc Hòn Hèo ngoài
vườn ươm là giá thể dớn với tỷ lệ cây sống đạt 95,56% và cây con phát triển với
6,15 lá/cây, chiều cao cây đạt 3,39 cm sau 60 ngày trồng ngoài vườn ươm.


4

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN...........................................................................................................i
LỜI CAM ĐOAN....................................................................................................ii
TÓM TẮT...............................................................................................................iii
MỤC LỤC............................................................................................................... iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................viii
DANH MỤC BẢNG...............................................................................................ix

DANH MỤC BIỂU ĐỒ..........................................................................................xi
DANH MỤC HÌNH...............................................................................................xii
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU...........................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề......................................................................................................1
1.2 Mục tiêu........................................................................................................2
1.3 Ý nghĩa..........................................................................................................2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................3
2.1 Tổng quan về lan Dendrobium......................................................................3
2.1.1 Nguồn gốc và phân bố............................................................................3
2.1.2 Phân loại.................................................................................................3
2.1.3 Đặc điểm hình thái.................................................................................4
2.1.4 Đặc điểm thực vật học............................................................................5
2.2 Tổng quan về lan Giả hạc (Dendrobium anosmum).......................................5
2.2.1 Nguồn gốc và phân bố............................................................................6
2.2.2 Phân loại.................................................................................................6
2.2.3 Đặc điểm hình thái.................................................................................6


5

2.2.4 Điều kiện sinh trưởng của lan Giả hạc (Dendrobium anosmum)............7
2.2.5 Giá thể trồng lan.....................................................................................8
2.3 Tổng quan về nuôi cấy mô thực vật...............................................................9
2.3.1 Khái niệm...............................................................................................9
2.3.2 Lịch sử hình thành và phát triển của công nghệ nuôi cấy in vitro...........9
2.3.3 Một số phương pháp nuôi cấy mô........................................................11
2.3.4 Các giai đoạn trong nuôi cấy in vitro....................................................13
2.4 Các chất hữu cơ tự nhiên bổ sung vào trong quá trình nuôi cấy..................14
2.4.1 Chuối....................................................................................................14
2.4.2 Nước dừa..............................................................................................15

2.4.3 Khoai tây..............................................................................................15
2.5 Các chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung ..............................................15
2.5.1 Cytokinin..............................................................................................15
2.5.2 Auxin....................................................................................................16
2.5.3 Sự kết hợp giữa Auxin và cytokinin.....................................................16
2.6 Tình hình nghiên cứu về lan Giả hạc (Dendrobium anosmum)....................17
2.6.1 Tình hình nghiên cứu trên Thế giới......................................................17
2.6.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam......................................................17
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM........................19
3.1 Địa điểm-thời gian thực hiện.......................................................................19
3.2 Nội dung nghiên cứu...................................................................................19
3.3 Vật liệu thí nghiệm......................................................................................19
3.3.1 Nguyên liệu nuôi cấy............................................................................19


6

3.3.2 Trang thiết bị và dụng cụ......................................................................19
3.3.3 Môi trường nuôi cấy.............................................................................20
3.3.4 Điều kiện nuôi cấy................................................................................20
3.4 Phương pháp thí nghiệm..............................................................................20
3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự hình thành
chồi từ lớp mỏng lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl)..............20
3.4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân
chồi của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl)..........................21
3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng hợp chất hữu cơ bổ
sung trong môi trường đến sự sinh trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo
(Dendrobium anosmum Lindl)............................................................................22
3.4.4 hí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của
chồi in vitro Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl).....................23

3.4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến giai đoạn vườn ươm
của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl)..................................24
3.5 Xử lý số liệu................................................................................................24
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................25
4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự hình thành chồi
từ lớp mỏng lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl)..........................25
4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi
của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl).......................................31
4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng hợp chất hữu cơ bổ sung
trong môi trường đến sự sinh trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium
anosmum Lindl).......................................................................................................36
4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi


7

in vitro Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl).................................41
4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát giá thể trồng cây in vitro Lan Giả hạc Hòn Hèo
(Dendrobium anosmum Lindl).................................................................................45
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................48
5.1 Kết luận.......................................................................................................48
5.2 Kiến nghị.....................................................................................................48
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................50
PHỤ LỤC 1............................................................................................................52
PHỤ LỤC 2............................................................................................................53


8

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D

:

2,4-dichlorophenoxyacetic acid

BA

:

6-benzyladenin

ĐC

:

Đối chứng

IBA

:

3-indolebutyric acid

IAA

:

3-indole acetic acid

MS

:

Murashige and Skoog medium

NAA

:

α-naphtalene acetic acid

TCL

:

Thin Cell Layer


9

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự hình thành
chồi từ lớp mỏng giả hành lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl)....20
Bảng 3.2: Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân
chồi của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl)...............................21
Bảng 3.3: Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng hợp chất hữu cơ bổ
sung trong môi trường đến sự sinh trưởng trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo
(Dendrobium anosmum Lindl).................................................................................22

Bảng 3.4: Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của
chồi in vitro Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl).........................23
Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm Khảo sát giá thể trồng cây invitro Lan Giả hạc...........24
Bảng 4.1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự hình thành chồi từ
lớp mỏng lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 30 ngày nuôi cấy
................................................................................................................................. 25
Bảng 4.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự hình thành chồi từ
lớp mỏng lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày nuôi cấy
................................................................................................................................. 28
Bảng 4.3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi của
Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 30 ngày nuôi cấy...........31
Bảng 4.4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi của
Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày nuôi cấy...........33
Bảng 4.5: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng hợp chất hữu cơ bổ sung
trong môi trường đến sự sinh trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium
anosmum Lindl) sau 30 ngày nuôi cấy.....................................................................36
Bảng 4.6: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng hợp chất hữu cơ bổ sung
trong môi trường đến sự sinh trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium
anosmum Lindl) sau 60 ngày nuôi cấy.....................................................................38


10

Bảng 4.7: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi in
vitro Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 30 ngày nuôi cấy. .41
Bảng 4.8: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi in
vitro Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày nuôi cấy. .43
Bảng 4.9: Kết quả khảo sát giá thể trồng cây in vitro Lan Giả hạc Hòn Hèo
(Dendrobium anosmum Lindl).................................................................................45

11

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến tỷ lệ tạo chồi từ lớp mỏng lan Giả hạc
Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 30 ngày nuôi cấy...............................26
Biểu đồ 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự tăng sinh chồi từ lớp mỏng lan Giả
hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 30 ngày nuôi cấy.........................26
Biểu đồ 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến tỷ lệ tạo chồi từ lớp mỏng lan Giả hạc
Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày nuôi cấy...............................28
Biểu đồ 4.4: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự tăng sinh chồi từ lớp mỏng lan Giả
hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày nuôi cấy.........................29
Biểu đồ 4.5: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi của Lan Giả hạc
Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 30 ngày nuôi cấy...............................32
Biểu đồ 4.6: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi của Lan Giả hạc
Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày nuôi cấy...............................33
Biểu đồ 4.7: Ảnh hưởng của hàm hợp chất hữu cơ bổ sung trong môi trường đến
khả năng sinh trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau
30 ngày nuôi cấy......................................................................................................37
Biểu đồ 4.8: Ảnh hưởng của hàm lượng hợp chất hữu cơ bổ sung trong môi trường
đến khả năng sinh trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl)
sau 60 ngày nuôi cấy...............................................................................................38
Biểu đồ 4.9: Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi in vitro Lan Giả
hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 30 ngày nuôi cấy.........................42
Biểu đồ 4.10: Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi in vitro Lan Giả
hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày nuôi cấy.........................43
Biểu đồ 4.11: Ảnh hưởng của giá thể trồng đến tỷ lệ sống cây con lan Giả hạc Hòn
Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày trồng............................................45
Biểu đồ 4.12: Ảnh hưởng của giá thể trồng đến sự phát triển số lá và chiều cao của
cây con lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày trồng....46

12

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Một số giống lan Dendrobium (A: Dendrobium Antennatum; B:
Dendrobium Parishii; C: Dendrobium anosmum; D: Dendrobium Wardianum; E:
Dendrobium chrysotoxum; F: Dendrobium Farmeri; G: Dendrobium Atroviolaceum;
H: Dendrobium Spectabile; I: Dendrobium Draconis; J: Dendrobium Formosum; K:
Dendrobium bellatulum; L: Dendrobium lindleyi)....................................................4
Hình 2.2: Hình hoa Giả hạc Hòn Hèo-Nha Trang.....................................................6
Hình 4.1: Sự phát triển của mẫu lát mỏng sau 15 ngày (trái) và 30 ngày (phải).....27
Hình 4.2: Các nghiệm thức ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự hình thành chồi từ
lớp mỏng lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày nuôi cấy
................................................................................................................................. 30
Hình 4.3: Các nghiệm thức ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi của
Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày nuôi cấy...........35
Hình 4.4: Các nghiệm thức ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây, chuối và nước dừa
bổ sung trong môi trường đến sự sinh trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo
(Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày nuôi cấy...............................................40
Hình 4.5: Các nghiệm thức ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi in
vitro lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày nuôi cấy....44
Hình 4.6: Các nghiệm thức khảo sát giá thể trồng cây in vitro Lan Giả hạc Hòn Hèo
(Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày trồng...................................................47


1

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề

Hoa lan là loài hoa đẹp và mang nhiều giá trị về mặt thẩm mỹ và tinh thần.
Là loài hoa có giá trị kinh tế cao được ưa chuộng rộng rãi trong nước và ngoài
nước. Do đó, ngành sản xuất lan là ngành mang lại nhiều lợi ích to lớn về mặt kinh
tế.
Tuy nhiên, vấn đề gặp phải là làm thế nào để cung ứng được nguồn giống đa
dạng về cả chất lượng và chủng loại để phục vụ cho nhu cầu thị trường. Vì hàng
năm, chúng ta vẫn phải nhập các giống lan từ các nước Thái Lan, Đài Loan, Trung
Quốc,…Vậy nên, việc nghiên cứu phương pháp nhân giống nhằm cung cấp một số
lượng lớn giống cho thị trường là yêu cầu cần thiết. Hiện nay, các phương pháp
nhân giống truyền thống được áp dụng đối với lan là tách, chiết, giâm cành nhưng
cho hệ số nhân giống thấp và cây dễ bị thoái hóa. Trong những năm gần đây
phương pháp nhân giống in vitro được nghiên cứu và áp dụng thành công trong sản
xuất nhiều loại cây trồng khác nhau đặc biệt là đối với nhân giống lan.
Lan Giả hạc (Dendrobium anosmum Lindl.) là một loài lan thuộc chi Hoàng
thảo (Dendrobium) phân bố khá rộng rãi và có nhiều màu sắc hoa khác nhau. Ở Việt
Nam có nhiều loài lan Giả hạc đặc hữu có màu sắc hoa và hình thái đặc trưng được
đặt tên theo nơi tìm thấy như: Giả hạc Daklay, Giả hạc Di Linh, Giả hạc Hòa Bình,
Giả hạc Hòn Hèo…
Giả hạc Hòn Hèo một loại lan Giả hạc được tìm thấy ở Hòn Hèo thuộc Nha
Trang, đây là loài lan đặc hữu và hiện đã bị khai thác cạn kiệt ở ngoài tự nhiên. Vì
vậy việc nhân giống in vitro có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn loài lan này để
phục vụ những mục đích nghiên cứu, lai tạo giống.
Từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa
sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến qáu trình nuôi cấy in vitro lan Giả hạc Hòn
Hèo” được thực hiện.


2

1.2 Mục tiêu

Xác định được nồng độ chất điều hòa sinh trưởng và chất hữu cơ thích hợp
cho sự tái sinh và tăng trưởng chồi trong quá trình nuôi cấy in vitro lan Giả hạc Hòn
Hèo (Dendrobium anosmum Lindl), đồng thời xác định được giá thể trồng phù hợp
cho cây con in vitro ở giai đoạn vườn ươm.
1.3 Ý nghĩa
Đề tài giúp tìm hiểu quy trình nuôi cấy in vitro phù hợp nhằm giúp nhân
nhanh lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) và đồng thời tạo ra
nguồn cây giống lớn phục vụ cho nhu cầu thị trường và bảo tồn loài lan đặc hữu.


3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về lan Dendrobium
2.1.1 Nguồn gốc và phân bố
Giống Dendrobium có khoảng 1600 loài và được lai tạo thêm nhiều loài mới.
tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Hy Lạp: “Dendro” có nghĩa là gỗ, “bios” có
nghĩa là sống. Dendrobium hầu hết là thực vật biểu sinh, sống bám trên vỏ cây. Ở
Việt Nam, người ta còn gọi là Hoàng Thảo, Hoàng Lan hay Đăng Lan. [3]
Dendrobium thuộc loại đa thân, rất phong phú về dạng cây, dạng hoa. Điều kiện
sinh thái cũng đa dạng, có nhiều loài chỉ mọc và ra hoa ở vùng lạnh, có loài ở vùng
nóng, có loài trung gian và cũng có loài thích nghi với mọi điều kiện khí hậu. [5]
2.1.2 Phân loại
Giới (regnum):

Plantae

Ngành (phylum):

Angiosperms

Lớp (class):

Monocots

Bộ (order):

Asparagales

Họ (family):

Orchidaceae

Phân họ (subfamiliy):

Epidendroideae

Tông (tribe):

Dendrobieae

Phân tông (subtribe):

Dendrobiinae

Chi (genus):

Dendrobium

Dendrobium được Clof Swart đặt tên vào năm 1799, là chi lớn thứ nhì của họ

lan. Dendrobium có khoảng 1600 giống nguyên thủy được chia làm 40 nhóm, trong
đó có 8 nhóm phổ biến nhất là: Phalaenanthe, Ceratobium, Callista, Eugenanthe,
Nigrohirsute, Pedilonum, Crumenata, Latourea.


4

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

K

L

Hình 2.1: Một số giống lan Dendrobium (A: Dendrobium Antennatum; B:
Dendrobium Parishii; C: Dendrobium anosmum; D: Dendrobium Wardianum; E:
Dendrobium chrysotoxum; F: Dendrobium Farmeri; G: Dendrobium Atroviolaceum;


5

H: Dendrobium Spectabile; I: Dendrobium Draconis; J: Dendrobium Formosum; K:
Dendrobium bellatulum; L: Dendrobium lindleyi). [23]
2.1.3 Đặc điểm hình thái
Dendrobium là loài đa thân và nhiều giả hành, các giả hành thường mang một
thân với nhiều lá mọc xen kẽ, trên thân có rất nhiều mắt ngủ. Hoa có thể mọc từ
thân thành từng chùm hay từng hoa cô độc. Hoa lớn, cánh môi phẳng. Cụm hoa ít
hoa, phát triển toàn bộ chiều dài giả hành. [11]
Dendrobium được chia ra làm 2 nhóm theo dạng thân của chúng: Dạng thòng
hay Nobile là dạng thân mềm thường sống ở vùng hơi lạnh như Đà Lạt; dạng đứng
hay Phalaenopsis là dạng thân cứng thường sống ở vùng có khí hậu nóng hơn. [11]
2.1.4 Đặc điểm thực vật học
Thân: Dendrobium là loại đa thân, giả hành gồm một hay nhiều lóng. Giả hành
thường mang một thân với nhiều lá mọc xen kẽ - một bộ phận cần thiết cho sự phát
triển và sinh trưởng của lan. Kiểu thân Dendrobium được chia thành 2 nhóm: kiểu
thân mềm (thường có ở vùng lạnh như Đà Lạt) và kiểu thân cứng (thường có ở vùng
nóng hơn). [1]
Lá: lá lan thường hình kim hay hình trụ có rãnh hoặc phiến mỏng. Dạng là mềm
mại, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt phụ thuộc vào môi trường sống của cây.
Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hoặc chỉ gấp lại theo
gân giữa như hình chữ V. [6]
Rễ: lan Dendrobium có hệ rễ khí sinh, có một lớp tế bào chết chứa đầy không
khí rễ sẽ ánh lên màu xanh bạc. Rễ hút được nước mưa chảy dọc trên vỏ cây gỗ hay

nước lơ lửng trong không khí, hơi sương và hơi nước, chức năng đó giúp cây hút
dinh dưỡng, chất khoáng, mặt khác giúp cây bám chặt vào giá thể, không bị gió
cuốn. [8]
Hoa: hoa Dendrobium có 6 cánh với 3 đài (sepal) xen kẽ 3 cánh (petal), trong đó
có 1 cánh khác hẳn với các cánh khác, biến thành môi (lip) và quyết định giá trị
thẩm mỹ của lan. [10]
Quả và hạt: sau khi thụ phấn, các cánh hoa héo, cuống hoa hình thành quả. Quả


6

chứa 10.000-100.000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt với kích thước nhỏ nên phôi hạt
chưa phân hóa. Sau 3-5 tháng hạt chín và phát tán nhờ gió. [6]
2.2 Tổng quan về lan Giả hạc (Dendrobium anosmum)
Lan Giả hạc (Dendrobium anosmum) là một giống lan thường mọc ở các quốc
gia thuộc vùng Đông Nam Á Châu nhưng nay phổ biến trên khắp thế giới bởi vì khá
dễ trồng, nhiều hoa và hương thơm dịu nhẹ. [18]
2.2.1 Nguồn gốc và phân bố
Lan Giả hạc (Dendrobium anosmum) là một loài lan trong chi Lan hoàng thảo
(Dendrobium).
Người Việt chúng ta thường gọi là Dã Hạc, Giã Hạc, Lưỡng Điểm Hạc, Phi
Điệp... Lan thường mọc trên các cành cây ở cao độ khoảng 1000-1300 m tại các
rừng cây thuộc Đô Lương, Vinh, Krong Pha, Đà Lạt, Bảo Lộc, Đắk Lắk, Sông Bé,
Lộc Ninh ...[18]
2.2.2 Phân loại
Giới (regnum):

Plantae

Ngành (phylum):

Angiosperms

Lớp (class):

Monocots

Bộ (order):

Asparagales

Họ (family):

Orchidaceae

Chi (genus):

Dendrobium

Loài (species):

Dendrobium anosmum Lindl.


7

Hình 2.2: Hình hoa Giả hạc Hòn Hèo-Nha Trang [19]
2.2.3 Đặc điểm hình thái [20]
Thân có thể dài tới 3 m, lá mọc đối cách, hoa nở to khoảng 7 cm ra hoa ở các
đốt đã rụng lá, Giả Hạc ra hoa vào mùa xuân và hoa có mùi rất thơm, lan Giả Hạc

nở hoa kéo dài trong 3-4 tuần lễ là tàn.. Về màu sắc Giả Hạc có các màu chính như:
tím hồng và trắng. Ngoài ra còn có hồng nhạt hồng thẫm hoặc cánh trắng lưỡi tím,
nhưng rất dễ nhầm lẫn với lan Trầm tím, Trầm tím thì thân ngắn hơn chỉ dài chừng
30-40 cm và hoa tím sẫm hơn nhiều và cũng thơm hơn Giả Hạc.
2.2.4 Điều kiện sinh trưởng của lan Giả hạc (Dendrobium anosmum) [20]
Ánh sáng: Lan Giả hạc cần nhiều ánh sáng gần như có thể để ở ngoài trời,
nhưng cần phải có lưới che phòng khi lá non bị cháy nắng. Khi thấy cây quặt quẹo,
đó là dấu hiệu thiếu nắng. Hãy đưa cây ra chỗ có nhiều nắng hơn. Nhất là vào mùa
đông, nếu thiếu nắng cây khó lòng ra hoa.
Nhiệt Độ: Giả Hạc chịu nóng và chịu lạnh rất tốt, vào mùa nóng cây có thể chịu
được nhiệt độ lên đến 38oC, còn vào mùa lạnh cây có thể chịu được nhiệt độ xuống
thấp đến mức 3,3oC. Vào mùa lạnh nếu nhiệt độ 15-16oC không kéo dài trong
khoảng 4-6 tuần lễ thì Giả Hạc khó lòng ra nụ.
Độ ẩm: Ẩm độ tốt từ 60-70% cây phát triển tốt đặc biệt là cây con và trong thời
gian ra nụ, nếu độ ẩm trong vườn trồng không đủ cây con sẽ teo dần và chết, còn


8

hoa thì đến mùa hoa ra rất ít.
Vật liệu trồng: cũng như nhiều loài phong lan khác có thể trồng được bằng sơ
dừa, bó vào dớn, vào các khúc gỗ. Có thể trồng trong chậu nhưng phải để chậu nằm
và đặc biệt chậu phải thoát nước tốt. Đặc biệt Giả Hạc ưa sống trong các chậu nhỏ,
có diện tích chật chội.
Tưới nước: vào mùa hè thì tưới 2-4 lần 1 tuần, vào mùa thu quan sát thấy cây
tăng trưởng chậm thì tưới nước ít lại, giảm mức độ tưới xuỗng còn khoảng 1 lần/1
tuần để cây không thiếu nước và tẹo lại. Đến mùa đông cây chuẩn bị nụ và ra bông
nếu ẩm độ thấp nên kết hợp với tưới phun sương 2 lần/tháng để cây bung nụ.
Phân bón: Lan Giả Hạc không ưa phân bón có nhiễu chất Nitrogen cho nên bón
với phân 15-15-15 từ tháng 2 đến tháng 9, bón phân theo hàm lượng 10-30-10 từ

tháng 9-11. Đến mùa đông tháng 12 thì chúng ta ngưng hẳn việc bón phân lại. Nếu
tiếp tục bón hoặc phân bón có nhiều chất Nitrogen quá, cây sẽ ra cây con (keiki)
thay vì ra nụ.
2.2.5 Giá thể trồng lan[8]
2.2.5.1 Xơ dừa
Xơ dừa có khuyết điểm dễ mọc rêu, không thoáng, dễ mục, nhưng do số lượng
nhiều và rất rẻ nên xơ dừa được trồng thành băng trên vạt tre. Nếu dùng xơ dừa
trồng chậu phải hạn chế tưới nước. Tốt nhất là tạo điều kiện ẩm độ bên ngoài hơn là
trong chậu. Đối với chất trồng này phải phun thuốc ngừa sâu bệnh thường xuyên.
Tuy nhiên xơ dừa lại là môi trường rất tốt cho đa số các loại lan thuộc giống
Dendrobium.
2.2.5.2 Dớn
Đây là dạng sợi của thân và rễ cây dương xỉ. Sở dĩ dớn được chọn vì không bao
giờ đóng rêu nhưng hút ẩm tốt. Tuy nhiên, nếu chất trồng toàn dớn thì không có độ
thoáng.
Có 2 loại dớn:
Dớn sợi: là loại dớn già, hóa mộc. Có dạng từng sợi được ưa chuộng để trồng
lan ở thành phố.


9

Dớn vụn: là phần còn lại của cây dớn sau khi đã lấy loại dớn sợi. Loại dớn vụn
là phần non của thân cây dớn, loại này sử dụng trồng lan rất tốt ở vùng lạnh vì độ
hút ẩm cao, thiếu thoáng khí nên nhiệt độ trong chậu cao hơn bên ngoài, do đó dớn
tạo một độ ẩm nhất định thuận lợi cho sự phát triển của rễ. Trái lại do điều kiện sinh
thái ở thành phố có khác nên các nhà vườn trồng lan tuyệt đối không nên dùng loại
dớn vụn vì nhiệt độ cao và ẩm độ thấp, nên phải tưới nước nhiều, dớn vụn bị bít dễ
làm thối rễ lan. Ngoài ra, điều kiện nóng ẩm rất thuận lợi cho một số loại côn trùng
và nấm bệnh chọn dớn làm mục tiêu cắn phá.

2.2.5.3 Than gỗ
Được dùng với mục đích giữ ẩm. Than là một chất trồng tốt nhất vì không có
nấm bệnh, không bị mục và có khả năng giữ nước, vì thế than sẽ hấp thụ dinh
dưỡng qua quá trình bón phân và thải ra dần qua sức hút rất mạnh của rễ lan.
Than được dùng ở đây là loại than gỗ rừng được nung thật chín. Tránh tuyệt đối
dùng các loại than gỗ rừng sác (đước) vì hàm lượng NaCl trong than cao dễ làm
chết lan.
2.3 Tổng quan về nuôi cấy mô thực vật
2.3.1 Khái niệm
“Nuôi cấy mô - tế bào thực vật” là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại
nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các loại vi sinh vật, trên môi trường
dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. [2]
Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in
vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật.
Nhân giống in vitro được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi
cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật
có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc
trong các loại bình nuôi cấy khác.
Phương pháp nhân giống in vitro thực chất là một tiến bộ vượt bậc của các
phương pháp nhân giống vô tính cổ điển như giâm cành, chiết, ghép,… Ở đây giá


10

trị thực tiễn của các tiến bộ khoa học kỹ thuật là đã biến những phương thức cổ điển
đó thành những phương thức hoàn toàn mới về chất, cho phép giải quyết những khó
khăn mà phương pháp cổ điển không thể vượt qua. [2]
2.3.2 Lịch sử hình thành và phát triển của công nghệ nuôi cấy in vitro [7]
Năm 1838, Schleiden và Schwann hai nhà sinh vật học người Đức đã chứng
minh thành công học thuyết tế bào: “Mọi cơ thể sinh vật dù phức tạp đến đâu cũng

đều được tạo nên bởi sự kết hợp của rất nhiều đơn vị rất nhỏ, đó là các tế bào”.
Năm 1902, Haberlandt trở thành người đầu tiên thực hiện việc nuôi cấy tế bào
thực vật và nhận thấy có sự ảnh hưởng của các khoáng chất và điều kiện môi trường
trên sự chuyển hóa của các tế bào cô lập trên môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, ông
đã gặp thất bại trong khi nuôi cấy các tế bào đã chuyển hóa được tách ra từ lá một
số cây một lá mầm.
Năm 1922, Kotte và Robins làm lại thí nghiệm của Haberlandt trên vật liệu là
đỉnh sinh trưởng của rễ cây hòa thảo.
Năm 1934, White đã nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum
esculentum) trên môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và dịch chiết nấm
men trong thời gian dài. Trong khoảng thời gian này, Went và Thimann tìm ra chất
điều hòa sinh trưởng đầu tiên ở thực vật: acid β-indolacetic (IAA).
Năm 1941, Overbeck chứng tỏ khả năng kích thích sự sinh trưởng phôi ở cây
thuộc họ cà (Datura) của nước dừa trong quá trình nuôi cấy.
Năm 1948, Steward xác định tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trên
mô sẹo cà rốt. Cũng trong thời gian này, người ta nghiên cứu và tổng hợp thành
công các chất điều hòa sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin như αnaphthylacetic (NAA) và 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D).
Năm 1955, Skoog tìm ra kinetin có tác dụng kích thích sự phân bào.
Năm 1957, Skoog và Miller ghi nhận thành công sự hình thành cơ quan


11

từ mô sẹo thuốc lá chịu sự ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi
cấy.
Từ năm 1954-1959 bắt đầu tiến hành các kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn.
Năm 1960, Cooking công bố có thể dùng enzyme cellulase để phân hủy vách
cellulose của tế bào thực vật và thu được kết quả là các tế bào không có vách mà có
mang nguyên sinh chất bao quanh, gọi là tế bào trần.
Năm 1962, Murashige và Skoog cải tiến thành công môi trường nuôi cấy (môi

trường MS).
Năm 1966, bắt đầu chú ý đến nuôi cấy túi phấn.
Từ năm 1980-1992, hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen
thực vật được công bố: chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium, kỹ thuật sử dụng
điện, vi tiêm, siêu âm, súng bắn gen đã và đang được các phòng thí nghiệm trên thế
giới áp dụng và đạt hiệu quả cao.
2.3.3 Một số phương pháp nuôi cấy mô[2]
2.3.3.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Phương thức này sử dụng các bộ phận nhỏ nhất của đỉnh chồi hay đỉnh sinh
trưởng làm mẫu vật nuôi cấy. Nó bao gồm mô phân sinh đỉnh và các phần lá non.
Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo một hay nhiều chồi và
mỗi chồi sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh. Xét về nguồn gốc của các cây đó,
có các khả năng:
- Cây phát triển từ chồi đỉnh.
- Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ.
- Cây phát triển từ chồi mới phát sinh.
- Phát triển cây trực tiếp: chủ yếu ở các đối tượng hai lá mầm như khoai tây,
thuốc lá, cam chanh: mầm (đỉnh sinh trưởng)  chồi nách  cây.
- Phát triển thông qua giai đoạn protocorm: chủ yếu gặp ở các đối tượng một lá