Nghiên cứu bán tổng hợp một số dẫn xuất flouroatkyl ether của dihyroartemisinin

BỘ GIÁO DỰC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TÊ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI

DS. NGUYỄN VĂN HÂN

NGHIÊN CỨu BÁN TỔNG HỢP
MỘT S ố DẪN XUẤT FLUOROALKYL ETHER
CỦA DIHYDROARTEMISININ
LUẬN VĂN THẠC SỸ D ư ợ c HỌC

Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm
và bào chế
Mã số: 60.73.01
Người hướng dẫn: PGS. TS. Đỗ Hữu Nghị


LÒI CẢM ON

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS. Đỗ Hữu
N ghị đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. X in chân thành cảm ơn
GS.TS. Trần M ạnh Bình đả quan tâm giúp đỡ tôi hoàn thành luận
văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn DSCKIỈ. Nguyễn Thị Tuyết, ThS. Vũ
Thị Thuận, ThS. Nguyễn H uy Văn và tập th ể cán bộ Công ty cổ
phần TRAPHACO đã quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi đ ể tôi được
tiếp tục học tập.
X in trân trọng cảm ơn PGS.TS. Từ M inh Koóng, các thầy cô

trong Ban Giám hiệu nhà trường, cảm ơn Phòng Đào tạo Sau đại
học, Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện tốt cho tôi trong
thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên
khích lệ, giúp đỡ tôi tận tình.

Nguyễn Văn Hân


KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

DHA

dihydroartemisinin

HPLC

sắc ký lỏng hiệu năng cao

IR

phổ hồng ngoại

MS

phổ khối

NMR

phổ cộng hưởng từ hạt nhân

PF-DHA

p-dihydroartemisinin pentafluoropropyl ether

TF-DHA

P-dihydroartemisinin triíìuoroethyl

ether


MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ

5

Chương 1 -TỔNG QUAN

6

1.1. Vài nét về sự phát triển của các thuốc chống sốt rét

6

1.2. Nguồn gốc, tính chất của artemisinin

7

1.2.1. Nguồn gốc và cấu tạo hoá học của artemisinin

7

1.2.2. Các phản ứng hoá học của artemisinin

7

1.3. Bán tổng hợp dihydroartemisinin và các dẫn xuất của nó

10

1.3.1. Bán tổng hợp DHA

10

1.3.2. Bán tổng hợp các dẫn xuất ether của DHA

11

1.3.3. Bán tổng hợp các dẫn xuất ester của DHA

12

1.3.4. Bán tổng hợp các dẫn xuất carbonat của DHA

13

1.4. Các dẫn xuất khác của artemisinin

13

1.5. Tác dụng của artemisinin và các dản xuất

15

1.5.1. Hoạt tính chống sốt rét của artemisinin và các dẫn xuất

15

1.5.2. Cơ chế tác dụng của artemisinin

15

1.5.3. Độc tính

16

1.5.4. Liên quan cấu trúc - tác dụng

16

1.6. Các phương pháp định tính, định lượng artemisinin và dẫn xuất

17

1.6.1. Các phương pháp hoá học

17

1.6.2. Các phương pháp quang

17

1.6.3. Các phương pháp sắc ký

18

1.7. Các dẫn xuất fluoroalkyl ether của artemisinin

19

1.7.1. Tống hợp các dẫn xuất fluoroalkyl ether của artemisinin

21

1.7.2. Hoạt tính chống sốt rét của các dẫn xuất fluoroalkyl ether

22

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU, THIế t BỊ VÀ PHUƠNG PHÁP NGHIÊN c ứu 24


2.1. Nguyên liệu

24

2.2. Thiết bị

24

2.3. Phương pháp và nội dung nghiên cứu

25

Chương 3 - THựC NGHIỆM VÀ KẾT

26

quả

3.1. Bán tổng hợp P-dihydrơartemisinin trifluoroethyl ether

26

3.1.1. Lựa chọn dung môi cho phản ứng bán tổng hợp

26

3.1.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ xúc tác và nhiệt độ tới phảnứng ether hoá 30
3.1.3. Khảo sát tỉ lệ alcol / DHA trong phản ứng bán tổng hợp

32

3.2. Bán tổng hợp p-dihydroarteniisinin pentaíluoroprơpyl ether

34

3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các loại xúc tác khác nhau

36

Chương 4 —BÀN LUẬN

41

4.1. Các yếu tô ảnh hưởng đến phản ứng bán tổng hợp

41

4.1.1. Ảnh hưởng của các dung môi khác nhau

41

4.1.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ xúc tác, tỉ lệ alcol và nhiệt độ

42

4.2. Một sô đặc điểm của phản ứng ether hoá

43

4.2.1. Mức độ triệt để của phản ứng

43

4.2.3. Khả năng tổng hợp lựa chọn lập thể

44

4.3. Ánh hưởng của các xúc tác khác nhau đối với phản ứng ether hoá45
KẾT LUẬN

47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

48

PHỤ LỤC

51


ĐẶT VÂN ĐỂ
Artemisinin là thuốc sốt rét có hiệu quả đối với p. falciparum đa kháng
thuốc. Nhưng do độ tan thấp cả trong nước và trong dầu mà việc sử dụng rộng
rãi artemisinin trong điều trị còn hạn chế. Trong quá trình nghiên cứu làm
tăng độ tan và sinh khả dụng, một số dẫn xuất của artemisinin đã được tổng
hợp như artesunat, artemether, arteether. Các dẫn xuất này có ưu điểm hơn so
với artemisinin về độ tan và hoạt tính, nhưng chúng vẫn còn nhược điểm là
thời gian bán thải ngắn, hậu quả là tỉ lệ sốt rét tái phát cao.
Thời gian gần đây, các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu điều chế các dẫn
xuất mới có thể hạn chế được nhược điếm trên. Hướng nghiên cứu tổng hợp
các dẫn xuất chứa fluor của dihydroartemisinin có những kết quả thử nghiệm
bước đầu rất khả quan. Trong số đó, hai dẫn xuất [3-dihydroartemisinin
trifluoroethyl ether và P-dihydroartemisinin pentafluoropropyl ether có hoạt
tính in vivo rất đáng quan tâm. Đặc biệt khi thử nghiệm trên chuột không thấy
ký sinh trùng sốt rét sau 42 ngày kể từ khi bắt đầu đợt điều trị kéo dài 4 ngày.
Kết quả này tốt hơn hắn so với dùng artemisinin và artemether.

Để điều chế các dẫn xuất này, một số phương pháp đã được sử dụng, nhưng
hiệu suất chưa cao và qui trình còn khá phức tạp. Việc nghiên cứu khảo sát
các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng bán tổng hợp, tìm ra các điều kiện phù
hợp để điều chế chúng ở nước ta là việc làm cần thiết. Trên cơ sở đó, chúng tôi
tiến hành đề tài này với mục tiêu như sau:
1. Bán tổng hợp hai dẫn xuất fluoroalkyl ether của dihydroartemisinin:
P-dihydroartemisinin trifluoroethyl ether và P-dihydroartemisinin
pentafluoropropyl ether.
2. Khảo sát một sô yếu tô ảnh hưởng đến phản ứng bán tổng họp, tù đó
tìm ra các điều kiện phản ứng thích hợp đê có hiệu suất cao.


Chương 1

TỔNG QUAN
1.1.

VÀI NÉT VỂ SỤ PHÁT TRIỂN CỦA CÁC THUỐC C H ấN G SỐT RÉT

Các vị thuốc chữa sốt rét như cây qinghao, cây cinchona đã được sử dụng
từ lâu đời. Nhưng mãi đến đầu thế kỷ XIX, những nghiên cứu về hoá học các
thuốc sốt rét mới thực sự bắt đầu. Năm 1834, quinin được người châu Âu phân
lập và sử dụng. Đây là thuốc dùng trị sốt rét sớm nhất dưới dạng hoạt chất. Nó
chỉ có tác dụng với thể phân liệt, ít tác dụng với thể giao bào và khá độc.
Đến năm 1926, primaquin được tổng hợp ra ở Đức. Dẫn xuất nhóm 8 aminoquinolin này có tác dụng diệt thê giao bào và thê ngủ trong gan, dùng
cắt đường lan truyền của ký sinh trùng và điều trị tiệt căn đối với p. vivax.
Cloroquin, dẫn xuất thuộc nhóm 4-aminoquinolin được tổng hợp năm
1944. Cloroquin là thuốc chống sốt rét lý tưởng trong nhiều năm, vì vừa có tác
dụng đối với p. falciparum và p. vivax, vừa có thể dùng dự phòng, lại ít độc
hơn các thuốc chống sốt rét khác thời đó.

Năm 1948, nhóm thuốc kháng folic ra đời, trong đó proguanil và
cloproguanil có tác dụng tốt và ít độc hơn quinin. Do dễ bị kháng mà
proguanil không được dùng từ 1965. Nhưng nay được dùng lại vào điều trị dự
phòng. Đến năm 1951, pyrimethamin được tổng hợp, nó có cùng cơ chế kháng
folic như proguanil, nhưng ít độc hơn. Tuy nhiên hiện nay cũng ít dùng vì bị
kháng cao. Năm 1972, mefloquin được đem vào sử dụng rộng rãi ở nhiều
nước, với ưu điểm diệt thể phân liệt mạnh và thải trừ chậm [1 i].
Cũng vào năm 1972, artemisinin được phân lập bới các nhà khoa học
Trung Quốc từ cây qinghao, một cây thuốc đã sử dụng từ lâu đời. Artemisinin
có tác dụng rất mạnh trên ký sinh trùng sốt rét, tác dụng cả với các chủng
kháng đa thuốc. Artemisinin được dùng làm thuốc chữa sốt rét hoặc làm
nguyên liệu bán tống hợp các dẫn chất khác, tạo ra một nhóm thuốc điều trị
sốt rét có triển vọng [36][37].


1.2.

NGUỔN GỐC, TÍNH CHAT CỦA ARTEMISININ

1.2.1. Nguồn gốc và cấu tạo hoá học của artemisinin
Artemisinin là một hoạt chất có tác dụng chống sốt rét được chiết xuất từ
cây thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L. Asteraceae). Cây mọc hoang và
9

được trồng nhiều ở Trung Quốc, Việt Nam, còn có ở nhiều nơi khác như An
Độ, Châu Âu, Bắc và Nam Mỹ. Hàm lượng Artemisinin trong lá khô có từ
0,01 đến 1,0% và phụ thuộc vào nguồn gốc địa lý, thời điểm thu hái [23].
Artemisinin là một sesquiterpenlacton có cầu

CH3

nối peroxyd nội đặc trưng. Công thức phân tử
C 15H 220 5. Tên khoa học là [3R-(3a, 5ap, ỏp, 8 ocp,
9ot,12ị3,

12aR*)]-Octahydro-3,6,9-trimethyl-3,12-

epoxy-12H-pyrano[4,3-j]-1,2-benzodioxepin-

0
Artem isinin

10(3H)-on.
Artemisinin là chất kết tinh không màu hoặc bột kết tinh trắng, không
mùi, vị đắng. Rất ít tan trong nước và trong dầu, ít tan trong ete, ete dầu hoả,
tan được trong ethanol, aceton, rất dễ tan trong chloroform và ethyl acetal.
Nhiệt độ nóng

chảy

151-153°c, năng suất quay cực [a]D: 66,3°

(C=l,64/cloroform) [26],
1.2.2. Các phản ứng hoá học của artemisinin
Do trong phân tử có cầu peroxyd là liên kết dễ bị phân huý, artemisinin bị
biến đổi trong các điều kiện khác nhau thành những hợp chất mà đa số không
giữ được khung cơ bản ban đầu. Trong môi trường trung tính artemisinin khá
bền vững. Trong môi trường kiềm mạnh hay acid mạnh artemisinin bị mất
hoạt tính do cầu peroxyd bị phá huỷ.
♦

Phàn ứng với kiềm
Artemisinin dễ bị phân huỷ bởi kiềm thành các sản phẩm khác nhau. Khi

cho artemisinin tác dụng với kali carbonat trong methanol ở nhiệt độ phòng sẽ


tạo ra este (2), epoxy lacton (3) và một cetoacid (4). Nếu cho tác dụng với
kiềm trong nước sẽ tạo thành pyran (5). Còn khi tác dụng với kiềm kéo dài sau
đó acid hoá sẽ thu được lacton (6 ) [36]. Trong dung dịch kiềm loãng tạo ra
hợp chất (7) còn gọi là Q 292 có cực đại hấp thụ ở 292nm. Phản ứng này được
áp dụng trong phép định lượng bằng quang phố tử ngoại như đo mật độ quang
sau khi thuỷ phân bằng NaOH loãng, hoặc làm phản ứng trước hay sau cột
trong định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao [35].

h 3c

7 (Q292)

♦ Phản ứng với acid
Phản ứng của artemisinin với acid sẽ tạo ra một hỗn hợp phức tạp các sản
phẩm thuỷ phân và sắp xếp lại phân tử. Artemisinin tác dụng với acid trong
ethanol tạo thành ba hợp chất (8 ), (9), (10) [36].

HCVC2 H5OH


♦

Phản ứng khử hoá

Phản ứng khử hoá là một trong những phản ứng có ý nghĩa của

artemisinin, vì nó tạo ra nhiều dẫn xuất quan trọng. Với các điều kiện khử hoá
khác nhau, phân tử artemisinin bị khử ở các nhóm khác nhau, tạo ra nhiều sản
phẩm khác nhau. Khử hoá bằng tác nhân LiAlH4 tạo ra hợp chất (11) và (12)
[32]:

LiAlH 4

----- ►

Khi khử hoá artemisinin bằng hydro với xúc tác Pd/CaCCK, thì nhóm
peroxid bị khử thành oxid, tạo thành deoxyartemisinin (13), một chất không
còn hoạt tính chống sốt rét:

h2

P d/C aC O ,

1

13

Khử hoá artemisinin bằng natriborohydrid (NaBH4) trong melhanol ở
nhiệt độ lạnh sẽ tạo ra dihydroartemisinin (14) mà rất ít ảnh hưởng đến nhóm
peroxid [19]. Dihydroartemisinin là hợp chất trung gian quan trọng để tổng
hợp ra nhiều dẫn chất khác:

N aB H ị/m ethanol

------------ ►
0 - 5°c


Nếu dùng tác nhân khử là hỗn hợp natriborohydrid và boron trifluorid,
nhóm carbonyl bị khử thành nhóm methylen, tạo ra deoxoartemisinin (15).
Hoạt tính chống sốt rét của hợp chất này gấp tám lần so với artemisinin [36]:
ch

T

H

ch

3

H

T

3

1.3. BÁN TỔNG HỢP DIHYDROARTEM ISININ VÀ CÁC DAN x u ấ t c ủ a n ỏ

Mặc dù hoạt tính chống sốt rét của artemisinin có nhiều ưu việt so với các
thuốc chống sốt rét kinh điển nhưng việc sử dụng còn nhiều hạn chế do khả
năng hoà tan kém cả trong nước lẫn trong dầu. Do đó các nhà khoa học đã
nghiên cứu bán tổng hợp từ nó các dẫn xuất dễ hoà tan hơn và có hoạt tính
mạnh hơn. Một trong những dẫn chất được tổng hợp đầu tiên là

dihydroartemisinin (DHA).
1.3.1. Bán tổng hợp DHA
Cho đến nay phương pháp hiệu quả nhất để khử hoá chọn lọc nhóm c o
lacton của artemisinin thành OH bán acetal trong DHA, là dùng tác nhân khử
NaBH4 trong methanol ở nhiệt độ thấp [19].
H

?h3

T

u

ch3

ì

Trên cơ sở phương pháp này, A. Brossi đã điều chế DHA bằng cách cho 1
phần artemisinin vào 50 phần methanol ở 0 - 5°c, rồi cho dần 1 phần chất khử
NaBH4 vào. Sau khi tinh chế thu được DHA với hiệu suất 79% [17]. Đỗ Hữu


Nghị thực hiện phản ứng theo nguyên tắc trên nhưng giảm 6 lần lượng chất
khử và dung môi, cải tiến phương pháp tinh chế thu được DHA với hiệu suất
trên 90% [12].
1.3.2. Bán tổng hợp các dẫn xuất ether của DHA
Phương pháp thông thường để tổng hợp các dẫn xuất ether (16) là cho
DHA (14) tác dụng với alcol tương ứng có mặt xúc tác boron trifluorid etherat
[2][13][18][19]:

ROH

------------ »
b f 3 0 (C 2h 5)2

R: a lk y Ị alkenyl, a ry l...

Các dẫn xuất loại này đều tồn tại dưới hai dạng đồng phân a và Ị3. Với các
alcol có mạch carbon thẳng và ngắn, đồng phân p chiếm ưu thế. Các đồng
phân p thường tồn tại dưới dạng tinh thể, có thể tinh chế bằng phương pháp
kết tinh phân đoạn. Còn các đổng phân a thường là dạng dầu (trừ a-DHA
methyl ether), chủ yếu được tách ra nhờ sắc ký cột. Có thể tổng hợp chọn lọc
đồng phân a-arteether bằng cách cho DHA tác dụng với ethyl iodid có mặt
xúc tác Ag20 [30].
Ngoài xúc tác thông dụng boron tl'ifluorid etherat, một số xúc tác khác
cũng có thể sử dụng cho phản ứng ether hoá như acid clohydric, boron
tribromid, trimethylsilyl clorid, hoặc hỗn hợp triphenylphosphin và diethylazo
dicarboxylat. Đỗ Hữu Nghị đưa ra một phương pháp bán tổng hợp artemether
và arteether dùng xúc tác là acid clohydric trong dung môi hữu cơ phân cực.
Phương pháp cải tiến này vừa đơn giản, vừa thu được đồng phân p với hiệu
suất cao [ 12].


So với artemisinin, các dẫn xuất ether có hoạt tính cao hơn và tan được
trong dầu, do vậy có thể dùng đường tiêm. Trong số các dẫn xuất nhóm này đã
có hai ether được đưa vào sử dụng là P-DHA methyl ether (artemether) và P"
DHA ethyl ether (arteether).
Acid artelinic là một dẫn xuất ether tan được trong nước. Điều chế hợp
chất này bằng phản ứng ngưng tụ DHA với methyl p-(hydroxymethyl) benzoat
để thu được hợp chất ester-ether. Sau đó thuỷ phân hợp chất ester-ether trong

kiềm sẽ được muối artelinat (17) [25].

HOCH 2C 6H4COOCH 3
BF3 Et20

ester-eth er

Phan Đình Châu và cộng sự đưa ra phương pháp cải tiến để tổng hợp
artelinat bằng phản ứng ether hoá trực tiếp DHA với acid p-hydroxymethyl
benzoic mà không cần khoá nhóm acid. Phương pháp này đơn giản hơn và cho
hiệu suất cao hơn [16].
1.3.3. Bán tổng hợp các dẫn xuất ester của DHA
Các dẫn xuất ester (18) được tổng hợp theo nguyên tắc cho DHA tác dụng
với tác nhân acyl hoá tương ứng có mặt xúc tác thích hợp. Tác nhân acyl hoá
có thể là acyl clorid, anhydrid acid hoặc acid carboxylic. Xúc tác cho phản
ứng acyl hoá thường là các amin bậc ba như pyridin, triethylamin, 4đimethylamino pyridin hoặc hỗn hợp các xúc tác này [19] [24].
CH
t1

0

'

ĩ

í

X

ẳ

1""III
1
11

T

R - c t

xúc tác

\

Ò " .J
O -X /
H Ì
Ổ

ÓH

ỎCOR

14

IX

X: -Cl, -O H . acyloxy

R: aryl, alkyl.

Phương pháp cổ điển sử dụng tác nhân acyl hoá là acyl clorid hoặc
anhydrid acid trong môi trường pyridin (có hoặc không có chất ngưng tụ
dicyclohexyl carbodiimid) chi thu được kết quả với một số ít ester. Năm 1982,
Li Y. sử dụng 4-dimethylamino pyridin làm xúc tác cho phản ứng acyl hoá.
Đây được coi là phương pháp cải tiến, hiệu quả thu được rất khả quan nhưng
cũng có nhược điểm là phản ứng tạo ra sản phẩm phụ gây khó khăn cho việc
tinh chế [24].
Các dẫn xuất ester của DHA cũng có hai dạng đồng phân a và Ị3. Nói
chung phản ứng alkyl hoá DHA trong môi trường acid sẽ thu được sản phẩm
là đồng phân p chiếm ưu thế, trong khi acyl hoá trong môi trường kiềm chủ
yếu tạo ra đổng phân ot [36],
Hoạt tính chống sốt rét của các dẫn xuất ester thường cao hơn artemisinin.
Trong đó bán ester của acid succinic với DHA là artesunat đã trở thành một
trong những thuốc sốt rét rất thông dụng hiện nay.
1.3.4. Bán tổng hợp các dẫn xuất carbonat của DHA
Dẫn xuất carbonat (19) của DHA được điều chế bằng cách cho DHA tác
dụng với alkyl cloroformat với sự có mặt của xúc tác triethylamin hoặc 4dimethylamino pyridin. Phần lớn sản phẩm tạo thành là đồng phân a [24].
_ o—c'/0
R—

C1

xúc tác

H3
ỖCOOR

19

1.4. CÁC DẪN XUẤT KHÁC CỦA ARTEMISININ

Nhằm tăng tính bền vững của phân tử, nhiều dẫn xuất được điều chế theo
kiểu thay thế oxy trong vòng lacton bằng nitơ để tạo ra dẫn xuất có chứa vòng
lactam (dẫn xuất 1l-azaartemisinin) (20). Quá trình điều chế các dẫn xuất


kiểu này thường được tiến hành qua hai bước: mở vòng lacton bằng các amin
tương ứng rồi đóng vòng trở lại đê tạo ra lactam:
ch3
h 3c

Trong số các dẫn xuất kiểu này, hợp chất với R= -CHr CHO có hoạt tính
gấp 4 lần so với artemisinin [28].
Một dẫn xuất chứa fluor của artemisinin có tác dụng chống tái phát tốt
hơn artemether là lOa-trifluoromethylhydroartemisinin (21). Điều chế hợp
chất

này

bằng

cách

cho

artemisinin

tác

dụng

với

trimethylsilyl

trifluoromethan trong tetrahydro furan với xúc tác tetrabuthylamoni fiuorid
trihydrat [36].
9 H3

CH,

Khác với deoxyartemisinin (dẫn xuất mất một nguyên tử oxy trong cầu
peroxid) không có hoạt tính thì dẫn xuất deoxoartemisinin (15) lại có hoạt tính
gấp 8 lần artemisinin. Deoxoartemisinin là sản phẩm khử hoá artemisinin với
hỗn hợp xúc tác natriborohydrid và boron trifluorid.
CH 3

N aBH 4, B F 3Et20


Hoạt tính chống sốt rét cao của deoxoartemisinin đã gợi ý các nhà nghiên
cứu điều chế ra các chất tương tự. Nhiều dẫn xuất nhóm này đã được tổng hợp
ra. Qua sàng lọc thấy các dẫn xuất 10-alkyldeoxoartemisinin và 10allyldeoxoartemisinin là có hoạt tính cao nhất [36].
1.5. TÁC DỤNG CỦA ARTEM ISININ VÀ CÁC DAN XUÂT

1.5.1. Hoạt tính chông sốt rét của artemisinin và các dản xuất
Artemisinin và các dẫn xuất có tác dụng trực tiếp và nhanh chóng trên in
vitro cũng như in vivo đối với các chủng Plasmodium, kể cả các chủng đã
kháng lại các thuốc chống sốt rét khác [10][20]. Thuốc có tác dụng mạnh trên

thể phân liệt của ký sinh trùng sốt rét ở giai đoạn trong hồng cầu. Thời gian
làm sạch ký sinh trùng trong máu khoảng 24 giờ, nhanh hơn so với các thuốc
điều trị sốt rét khác. Thuốc không có tác dụng diệt thể giao bào, nghĩa là
không có tác dụng dự phòng [11 ][21].
Nhiều dẫn xuất bán tổng hợp từ artemisinin có hoạt tính cao hơn chất ban
đầu. Trong đó các dẫn xuất carbonat có hoạt tính cao hơn cả. Các ester
carboxylic có hoạt tính cao hơn các ether trong khi ether lại có hoạt tính cao
hơn DHA [36], Các thí nghiệm in vivo với p. berghei ở chuột nhắt trắng và p.
cynomolgi ở khỉ cho thấy hoạt tính chống sốt rét của artemether và arteether
mạnh hơn artemisinin từ 2 - 4 lần [20]. Natri artesunat có hiệu lực cao hơn
artemisinin 5 lần khi dùng đường tiêm tĩnh mạch [14]. DHA cũng có hoại
tính cao gấp 2 lần so với artemisinin [23].
Hiện tượng ký sinh trùng kháng artemisinin và dẫn xuất đã được quan sát
trên in vitro và trên súc vật thực nghiệm. Tuy nhiên trên thực tế lâm sàng, đến
nay chưa thấy p . falciparum kháng lại artemisinin và các dẫn xuất [ 11].
1.5.2. Cơ chế tác dụng của artemisinin
Có nhiều quan điểm khác nhau khi giải thích cơ chế tác dụng của
artemisinin và các dẫn chất của nó. Các nhà nghiên cứu Trung Quốc cho rằng
artemisinin tấn công chủ yếu vào màng tế bào ký sinh trùng, làm thay đổi cấu


trúc vi mô của màng. Một số nghiên cứu khác cho rằng cơ chế tác dụng của
artemisinin và các dẫn xuất là do các gốc tự do. Các gốc tự do được tạo ra do
cầu peroxyd bị bẻ gãy, chúng tấn cồng vào những thành phần cốt yếu của tế
bào, làm chết ký sinh trùng [23].
1.5.3. Độc tính
Những nghiên cứu về độc tính cấp và bán cấp của artemisinin cho thấy
độc tính của artemisinin đối với động vật thực nghiệm là tương đối thấp. Với
liều điều trị artemisinin hầu như không độc, không có tác dụng phụ. Bệnh
nhân sốt rét được điều trị bằng artemisinin hoặc artemether không thấy có các

phản ứng độc hại rõ ràng nào trên tim, gan và thận. So với các thuốc sốt rét
khác như cloroquin thì artemisinin và các dẫn xuất ít độc hơn nhiều
[8][11][23].
1.5.4. Liên quan cấu trúc - tác dụng.
Artemisinin tác dụng với acid hoặc kiềm đều tạo thành các sán phẩm
không có hoạt tính chống sốt rét. Các chất chuyến hoá không có nhóm
peroxid như desoxyartemisinin và các sequiterpen khác được chiết từ

Artemisia annua đều không có tác dụng. Như vậy nhổm peroxid vòng ỉà
không thể thiếu cho tác dụng chống sốt rét. Nhưng một mình nhóm peroxid là
chưa đủ bởi chất a-santonin. một peroxid vòng được tống hợp bởi Tani và
cộng sự lại không có tác dụng này.
Trên cơ sở artemisinin và các dẫn xuất là những chất kiềm yếu, như những
chất amin có khả năng tập trung chọn lọc vào không bào tiêu hoá của ký sinh
trùng sốt rét, Vennerstrom đã điều chế ra một loạt các amin peroxid. Những
hợp chất này cũng có chút hoạt tính trên in vitro, nhưng không có hoạt tính
trên in vivo. Những nghiên cứu sâu hơn về hệ vòng của phân tử còn đưa ra kết
luận rằng sự nguyên vẹn của cấu trúc lập thể là bắt buộc cho hoạt tính chống
sốt rét [23].


1.6.

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG
ARTEM ISININ VÀ DAN XUÂT

1.6.1. Các phương pháp hoá học
♦

Phương pháp acid-base

Trong môi trường kiềm, vòng lacton và peroxid của artemisinin và các dẫn

chất bị phá vỡ tạo ra polyoxocarboxylic. Căn cứ lượng kiềm tiêu thụ đê tính ra
lượng chất thử cần định lượng. Phương pháp này khá đơn giản, có thể dùng
xác định hàm lượng artemisinin trong cây và trong các chế phẩm [5][7].
♦

Phương pháp chuẩn độ iod
Nguyên tắc của phương pháp này là dùng kali iodua để khử cầu peroxid

của artemisinin, chuyển nó thành deoxyartemisinin và giải phóng ra iod. Xác
định lượng iod giải phóng để tính ra lượng artemisinin [34].
1.6.2. Các phương pháp quang
Phân tử artemisinin và đa số các dẫn chất không hấp thụ mạnh ỏ' vùng tử
ngoại gần, do vậy không thể định lượng bằng cách đo mật độ quang trực tiếp.
Thông thường để định lượng bằng phương pháp quang, người ta phải tiến hành
tạo ra các hợp chất trung gian có khả năng hấp thụ ánh sáng khả kiến hay tử
ngoại. Xác định các hợp chất trung gian qua khả năng hấp thụ ánh sáng rồi
suy ra lượng chất thử ban đầu.
♦

Phương pháp đo độ hấp thụ trong vùng tử ngoại
Dưới tác dụng của kiềm loãng, artemisinin bị phân huỷ tạo ra hợp chất

Q292 có cực đại hấp thụ ở 292nm, artesunat bị phân huỷ thành hợp chất có cực
đại hấp thụ ở 289nm, còn DHA thì chuyến thành hợp chất có cực đại hấp thụ ở
bước sóng 238nm. Artemether dưới tác dụng của acid clohydric trong ethanol
cũng tạo ra hợp chất có cực đại hấp thụ ở 254nm. Nguyên tắc này được nhiều
tác giả sử dụng để định lượng artemisinin và các dẫn xuất cùa nó bằng cách đo
mật độ quang ở bước sóng thích hợp [35]. Các phản ứng này còn được sử dụng

trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, tạo ra các dẫn chất trước hay sau cột, nhầm
tăng độ nhạy của detector u v .
Phương pháp tử ngoại được sử dụng để định lượng nhanh artemisinin
trong các mẫu cây [1]. Phương pháp này cũng được Dược điển Việt Nam áp
dụng để định lượng artemisinin và artesunat [3].
♦

Phương pháp đo độ hấp thụ vùng khả kiến
Dưới tác dụng của các thuốc thử đặc hiệu, artemisinin và một số dẫn xuất

có thể tạo ra các hợp chất trung gian có màu. Tiến hành xác định đậm độ màu
bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng vùng khả kiến và suy ra lượng chất cần định
lượng. Ví dụ artemisinin sau khi thuỷ phân bằng kiềm sẽ tạo ra các sản phẩm
có thể tạo màu với dung dịch sắt III clorid. Để định lượng artemether, người ta
cho phản ứng với dung dịch vanilin 2 % trong acid sulfuric, rồi phân tích ở
bước sóng 500nm [27]. Nguyên tắc này đã được áp dụng để định lượng
artemisinin dạng nguyên liệu hay trong các chế phẩm [6][15].
♦

Phương pháp đo phổ hồng ngoại
Việc phân tích phổ hồng ngoại của Artemisinin và dẫn xuất rất hữu ích

trong việc xác định sự có mặt của nhóm ỗ-lacton với pic ở 1745cm"1. Còn pic
ở 722, 831, 881 và 1115cm'1là đặc trưng của nhóm peroxyd [36]. Phép đo phổ
hồng ngoại có sử dụng chất đối chiếu hay phổ chuẩn được Dược điển Việt
Nam cũng như Dược điển Quốc tê chọn làm phương pháp chủ yếu để định
tính artemisinin và các dẫn xuất [3][31].
1.6.3. Các phương pháp sắc ký

<

Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Phương pháp sử dụng lớp mỏng để tách các hỗn hợp thành các vết riêng rẽ

bằng các hệ dung môi khai triển phù hợp, rồi hiện màu bằng các thuốc thử đặc
hiệu. Sau đó quan sát màu sắc và so sánh R( của vết thử với vết đối chiếu.
Để định lượng artemisinin và các dẫn xuất bằng phương pháp sắc ký lớp
mỏng, sau khi triển khai sắc ký, người ta dùng densitomet để đo mật độ vết.


Nếu dùng thuốc thử hiện màu là p-dimethylaminobenzaldehyđ thì đo mật độ
vết ở bước sóng 600nm, còn thuốc thử hiện màu là dung dịch vanilin trong
acid sulfuric thì đặt bước sóng ở 560nm. Phương pháp sắc ký lớp mỏng đã
được sử dụng để định lượng artemisinin trong cây và định lượng artemether
trong huyết tương [4][9][33].
♦

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Các nghiên cứu ứng dụng HPLC trong định lượng artemisinin và các dẫn

xuất ngày một nhiều, đặc biệt là đối với các mẫu có nồng độ thấp và nhiều tạp
chất. Thuận lợi của HPLC là có khả năng tách cao, lại có thể định lượng sản
phẩm tách được bằng các detector thích hợp.
Cột được dùng trong HPLC chủ yếu là cột pha đảo. Detector thường dùng
là detector u v đo trực tiếp hay dẫn chất hoá sau cột để tăng độ nhạy [22][35].
Ngoài ra có thể dùng detector điện hoá để nghiên cứu dược động học và định
lượng hoạt chất trong cây [36],

1.7. CÁC DẪN XUẤT FLUOROALKYL ETHER CỦA DIHYDROARTEMISININ [29 ]

Artemisinin là thuốc sốt rét có hiệu quả đối với p. falciparum đa kháng
thuốc. Nhưng do độ tan thấp cả trong nước và trong dầu mà việc sử dụng rộng
rãi artemisinin trong điều trị bị hạn chế. Trong quá trình nghiên cứu cải thiện
hoạt tính và độ tan của thuốc, artesunat và một số dẫn xuất ether của DHA
như artemether đã được tổng hợp. So với artemisinin, độ tan của các dẫn xuất
này đã được cải thiện, nhưng sinh khả dụng vẫn còn thấp do chúng bị chuyển
hoá rất nhanh trong cơ thể. Sự tái xuất hiện ký sinh trùng trong máu thường
quan sát thấy ở các thuốc sốt rét có thời gian bán thải ngắn. Vì vậy việc
nghiên cứu tạo ra các dẫn xuất mới có sinh khả dụng và chỉ số điều trị cao là
mục tiêu quan trọng của nhiều phòng thí nghiệm trên khắp thế giới. Trong đó
nhóm dẫn xuất ether của DHA nhận được sự quan tâm đặc biệt.


Trên in vivo, con đường chuyển hoá chính của các dẫn xuất ether là chúng
nhanh chóng bị oxy hoá - dealkyl hoá dưới tác động của men cytocrom P450,
tạo thành DHA có hoạt tính:

Gliicuronid

COOH

Như vậy, thời gian bán thải của các dẫn xuất ether phụ thuộc vào tốc độ
của quá trình oxy hoá-dealkyl hoá tạo DHA. Bản thân DHA cũng có thời gian
bán thải rất ngắn. Hậu quả là tỉ lệ tái xuất hiện ký sinh trùng trong máu cao và
tỉ lệ điều trị tiệt căn thấp nếu đợt điều trị không đủ dài.
Theo sơ đồ trên ta thấy một phương pháp khả thi đê kéo dài thời gian bán
thải của các dẫn xuất ether là biến đổi cấu trúc phân tử để chúng trở thành
những cơ chất nghèo đối với men cytocrom ^450- Nghĩa là tạo ra các dẫn xuất
ether mới, bền vững hơn đối với quá trình oxy hóa-dealkyl hoá dưới tác động

của loại men này:

Cytocrom P450 oxy hoá

quá irình oxy hoa


Dựa trên cơ sở đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu tổng hợp ra các dẫn
xuất fluoroalkyl ether của DHA. Việc gắn thêm nhóm riuoroalkyl vào vị trí
chuyển hoá chính của phân tử thuốc đã cải thiện đáng kể hoạt tính chống sốt
rét trên in vivo.
1.7.1. Tổng hợp các dẫn xuất fluoroalkyl ether của DHA
Tổng hợp các dẫn xuất fluoroalkyl ether (22) của DHA cũng theo nguyên
tắc chung như tổng hợp các dẫn xuất ether thông thường, là cho DHA tác
dụng với các alcol tương ứng trong dung môi và xúc tác thích hợp.

R r: nhóm fluoroalkyl

Đến nay có ba phương pháp tổng hợp có thể được tóm tắt như sau:
♦

Phương pháp A: sử d ụ n g xúc tác boron trifluorid etherat
Cho boron trifluorid etherat vào dung dịch DHA và fluoroalkyl alcol trong

ether ethylic. Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
Trung hoà hỗn hợp phản ứng, làm khan và bốc hơi dung môi thu được sản
phẩm thô. Sau đó tinh chế sản phẩm thô bằng sắc ký cột.
♦

Phương pháp B: sử d ụ n g xúc tác trimethylsilyl chlorid

Cho trimethylsilyl chlorid vào dung dịch DHA và fluoroalkyl alcol trong

dicloromethan. Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 2 - 4
giờ. Trung hoà hỗn hợp phản ứng, làm khan rồi bốc hơi dung môi được sản
phấm thô. Tinh chế sản phẩm thô bằng sắc ký cột.
♦

Phương pháp C: sử dụng phản ứng Mitsunobu
Cho triphenylphosphin và diethylazo dicarboxylat vào dung dịch DHA và

fluoroalkyl alcol trong dung môi toluen. Khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ phòng


trong 2 giờ. Bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm thu được sản phẩm thô. Sau
đó tinh chế sản phẩm thô bằng sắc ký cột.
Trong các phương pháp trên, phương pháp A có sự lựa chọn lập thể tốt
nhưng hiệu suất không cao. Phương pháp B có sự lựa chọn lập thể kém và tạo
ra nhiều sản phẩm phụ. Còn phương pháp c được coi là phương pháp ưu việt
hơn cả, cho hiệu suất cao và khả năng tổng hợp lựa chọn lập thể tốt.
1.7.2. Hoạt tính chóng sốt rét của các dẫn xuất fluoroalkyl ether
Trên in vitro, hoạt tính chống sốt rét của các dẫn xuất fluoroalkyl ether
của DHA thấp hơn so với artemether. Nồng độ ức chế 50% (IC50) đối với
chủng P. falciparum W-2 kháng cloroquin trong khoảng 27 - 72 nmol, trong
khi IC5() của artemether là 5,4 nmol (Bảng 1.1). Hơn nữa, kết quả còn cho thấy
cấu trúc của mạch carbon có chứa fluor ảnh hưởng khônu nhiều đến hoạt tính
chống sốt rét trên in vitro.
Bảng 1.1. Hoạt tính chống sốt rét in vitro (IC50) với chủng p. falciparum W-2
R

Hợp chất

IC 50

R

Hợp chất

ICso

(nmol)

(nmol)
1

Artemether

ch 3-

5,4

22e

C F 3-C H -C H 3

22a

C F3-C H 2-

31

22f

c f :, - c h

27

22g

C F 3-C H -C F 3
CF3-C H -C O O C 2H 5

22b

cf

3-

cf

2-

ch

2-

22c

C F 3-C F 2 -C F 2 -C H 2 -

36

22h

22d

c 6f 5-

72

22i

1

-

c 6h 5

1

1

cf

,-

1

c

1

-

cf3

35
66

34
61

38

c 6h 5

Hoạt tính chống sốt rét in vivo được đánh giá trên chuột nhiễm p. berghei.
Một ngày sau khi gây nhiễm bệnh, cho chuột dùng thuốc với liều
35,5|imol/kg/ngày qua đường tiêm màng bụng và kéo dài trong 4 ngày.
Đến ngày thứ 4, là ngày cuối của đọt điều trị, ở nhóm điều trị bằng
artemisinin và nhóm chứng không dùng thuốc, ký sinh trùng trong máu còn
20 - 25%. Nhóm điều trị bằng artemether, đến ngày thứ 4 ký sinh trùng trong


máu là 1% và tăng lên 25% ở ngày thứ 16. Trong khi đó nhóm chuột dùng
fluoroalkyl ether, ký sinh trùng trong máu còn 0,6 - 2% ở ngày thứ 4, đến
ngày thứ 11 thì hoàn toàn không còn ký sinh trùng trong máu. Tất cả số chuột
đều sống đến ngày thứ 42 (Hình 1.1).

0

4

7

9

11

16

42

—0— % chuột sống —o — KST trong máu

100 o——— 0
%
80 /o
60

00o o'O

40

o - - ...... o

■c

0-----------0---------- o

22g

22b

ngày_
0----- 0------o----- o------ o— H-io

0

4

7
% chuột sống

9

11

16

—o — KST trong máu

42

4

7

—o — % chuột sông

9

11

16

42

—o— KST trong máu

Hình 1.1. Hoạt tính in vivo của các dẫn xuất fluoroaikyl alcoì của DHA.
Ký sinh trùng trong máu từ 1 - 2% ở ngày cuối của đợt điều trị, giảm dần
đến 0 % ở những ngày tiếp theo, như vậy thuốc vẫn còn phát huy tác dụng sau
khi ngừng điều trị. Chứng tỏ các nhóm thế fluoroalkyl đã có tác dụng làm
chậm quá trình chuyển hoá oxy hoá thành DHA.
Tóm lại các dẫn xuất fluoroalkyl ether có hoạt tính chống sốt rét trên in

vitro không cao, nhưng hoạt tính chống sốt rét trên in vivo thì tốt hơn hẳn so
với artemisinin và artemether.


Chương2
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1. Nguyên liệu
-

Dihydroartemisinin đạt tiêu chuẩn Dược Điển Quốc tế (Bộ môn Công
nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội).

-

2,2,2-trifluoroethanol (Merck-Schuchardt).

-

2,2,3,3,3 pentafluoro 1-propanol (Aldrich Chem).

-

Diethyl azodicarboxylat (Pfaltz & Bauer).

-

Boron trifluorid etherat (Basf AG).

-

Các hoá chất: triphenyl phosphin, natri bicarbonat, p-dimethylamino
benzaldehyd, acid acetic, acid phosphoric loại tinh khiết phân tích.

-

Dung môi: aceton, ethanol tuyệt đối, ether ethylic, n-hexan, ethyl acetat,
dicloromethan, toluen loại tinh khiết phân tích.

-

Hạt silicagel 70 - 200 mesh dùng cho sắc ký cột (Nhật Bản).

-

Bản mỏng sắc ký silicagel đế thuỷ tinh (Merck) kích thước 2,5 X 7,5 cm.

2.2. Thiết bị
-

Cân điện tử (Sartorius)

-

Máy khuấy từ (Heidolph MR3001)

-

Thiết bị cất quay (Bucchi)

-

Tủ sấy điện

-

Máy đo năng suất quay cực (Metller)

-

Máy đo độ chảy (Metller)

-

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (Shimadzu)

-

Phổ hổng ngoại đo trên máy Perkin Elmer, Phòng Thí nghiệm Trung tâm,
Trường Đại học Dược Hà Nội.