Nghiên cứu tinh chế và thiết lập chất chuẩn charantin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM VĂN KIỀN

NGHIÊN CỨU TINH CHẾ
VÀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN CHARANTIN
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM VĂN KIỀN

NGHIÊN CỨU TINH CHẾ
VÀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN CHARANTIN
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH : KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ : 60 73 15

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Trịnh Văn Lẩu

TS. Trịnh Thị Điệp

HÀ NỘI 2012


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:
- PGS.TS. Trịnh Văn Lẩu, Chủ tịch Hội đồng Dược điển Việt Nam,
nguyên Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Bộ Y tế.
- TS. Trịnh Thị Điệp, Viện Dược liệu, Bộ Y tế.
Những người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và
hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường và các thầy cô giáo trường Đại
học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường, cũng như trong
quá trình hoàn thiện luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể thực hiện và hoàn thành luận văn tốt
nghiệp này.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến phòng Kế hoạch tổng hợp, khoa Thiết lập chất
chuẩn – Chất chiếu, Khoa Kiểm nghiệm Các dạng Bào chế, Khoa Kiểm nghiệm
Đông dược – Dược liệu, Khoa Vật lý – Đo lường, là những khoa đã tạo điều kiện
cho tôi tiến hành thực nghiệm trong quá trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, quan tâm, chia sẻ
và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này.

Hà Nội, ngày 14 tháng 11 năm 2012
DS. Phạm Văn Kiền


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................................. 3
1.1. MƯỚP ĐẮNG..................................................................................................... 3
1.1.1. Thành phần hóa học ........................................................................................ 3
1.1.2. Tác dụng ........................................................................................................... 4
1.1.3. Một số chế phẩm có nguồn gốc từ mướp đắng ................................................ 4
1.2. CHARANTIN ..................................................................................................... 5
1.2.1. Tính chất........................................................................................................... 5
1.2.2. Tác dụng ........................................................................................................... 6
1.3. SỰ CẦN THIẾT PHẢI THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN TỪ DƯỢC LIỆU ......... 7
1.4. PHƯƠNG PHÁP TINH CHẾ CÁC CHẤT TỪ DƯỢC LIỆU VÀ NHẬN
DẠNG HỢP CHẤT SAU KHI TINH CHẾ............................................................... 8
1.4.1. Phương pháp tinh chế các chất từ dược liệu .................................................... 8
1.4.2. Nhận dạng hợp chất sau khi tinh chế ............................................................... 9
1.5. PHƯƠNG PHÁP THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN .............................................. 10
1.5.1. Tổng quan về nghiên cứu thiết lập chất chuẩn trên thế giới .......................... 10
1.5.2. Thiết lập, bảo quản chất chuẩn theo hướng dẫn của WHO và ASEAN ........ 12
1.5.3. Yêu cầu nội dung của quy trình phân tích theo quy định của Asean ............. 15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................... 17
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .......................................................................... 17
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ...................................................................... 17
2.2.1. Trang thiết bị .................................................................................................. 17
2.2.2. Hoá chất, chất chuẩn và thuốc thử ................................................................. 17
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................... 18
2.3.1. Lựa chọn phương pháp phân tích ................................................................... 18
2.3.2. Thẩm định phương pháp HPLC ..................................................................... 21
2.3.3. Kiểm tra nguyên liệu Charantin trước khi tinh chế........................................ 22
2.3.4. Nghiên cứu và thiết lập quy trình tinh chế Charantin .................................... 22
2.3.5. Xác định cấu trúc, nhận dạng nguyên liệu Charantin sau khi tinh chế .......... 23
2.3.6. Thiết lập chất chuẩn Charantin ...................................................................... 24

2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................. 25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................................ 27
3.1. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG VÀ
XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT LIÊN QUAN ................................................................... 27


3.1.1. Độ thích hợp của hệ thống sắc ký .................................................................. 27
3.1.2. Tính đặc hiệu .................................................................................................. 27
3.1.3. Độ tuyến tính .................................................................................................. 28
3.1.4. Khoảng xác định ............................................................................................ 29
3.1.5. Độ lặp lại ........................................................................................................ 30
3.1.6. Độ chính xác trung gian ................................................................................. 31
3.1.7. Độ đúng .......................................................................................................... 32
3.1.8. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng ........................................................ 32
3.2. KIỂM TRA SƠ BỘ NGUYÊN LIỆU CHARANTIN TRƯỚC KHI TINH CHẾ
.................................................................................................................................. 33
3.2.1. Định lượng Charantin..................................................................................... 33
3.2.2. Mất khối lượng do làm khô ............................................................................ 34
3.2.3. Tạp chất liên quan .......................................................................................... 34
3.3. NGHIÊN CỨU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH TINH CHẾ .......................... 35
3.3.1. Khảo sát các dung môi dùng để kết tinh lại Charantin .................................. 35
3.3.2. Xây dựng quy trình tinh chế Charantin bằng phương pháp kết tinh lại......... 36
3.4. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC, NHẬN DẠNG NGUYÊN LIỆU SAU KHI TINH
CHẾ .......................................................................................................................... 41
3.4.1. Phổ NMR........................................................................................................ 41
3.4.2. Phổ khối lượng (MS)...................................................................................... 42
3.4.3. Đo điểm chảy ................................................................................................. 43
3.5. THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN CHARANTIN. .................................................. 43
3.5.1. Kiểm tra chất lượng nguyên liệu theo quy trình thiết lập chất chuẩn Charantin
.................................................................................................................................. 43

3.5.2. Đóng lọ chất chuẩn Charantin ........................................................................ 45
3.5.3. Đánh giá đồng nhất quá trình đóng gói .......................................................... 46
4.3.3. Đánh giá liên phòng ....................................................................................... 47
4.3.4. Xử lý kết quả phân tích theo phương pháp thống kê ..................................... 48
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .................................................................................................. 52
4.1. TÍNH MỚI VÀ HIỆU QUẢ CỦA ĐỀ TÀI ...................................................... 52
4.1.1. Về tính mới..................................................................................................... 52
4.1.2. Về hiệu quả kinh tế, xã hội............................................................................. 52
4.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................. 53
4.2.1. Về quy trình tinh chế ...................................................................................... 53
4.2.2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất ............................................................. 53


4.2.3. Thiết lập chất chuẩn, xây dựng TCCL ........................................................... 53
4.3.1. Tinh chế và xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng .................................................. 54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................ 57
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 57
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC .....................................................................................................................
Phụ lục 1: Quy trình tinh chế Charantin ......................................................................
Phụ lục 2: Giải phổ NMR nguyên liệu Charantin sau tinh chế ....................................
Phụ lục 3: Quy trình thiết lập chất chuẩn Charantin ....................................................
Phụ lục 4: Phổ MS và Sắc ký đồ ..................................................................................


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ANOVA

: Analysis of variance

Phân tích phương sai

DAD

: Diode array detector

DĐVN IV

: Dược điển Việt Nam IV

DMFM

: Dung môi pha mẫu

EtOH
HPLC

: Ethanol
: High Performance Liquid Chromatoghraphy
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IR

: Infra-red
Hồng ngoại

LOD

: Limit of detection
Giới hạn phát hiện

LOQ

: Limit of quantitation
Giới hạn định lượng

MeOH
MS

: Methanol
: Mass spectrometry
Phổ khối

NMR

: Nuclear Magnetic Resonance
Cộng hưởng từ hạt nhân

1

: Hydrogen - 1 Nuclear Magnetic Resonance
Phổ cộng hưởng proton.

H-NMR

13

C-NMR

: Carbon - 13 Nuclear Magnetic Resonance

Phổ cộng hưởng carbon.

PTN
RSD

: Phòng thử nghiệm
: Relative standard deviation
Độ lệch chuẩn tương đối.

SKĐ

: Sắc ký đồ

TCCL
UV-VIS

: Tiêu chuẩn chất lượng
: Ultraviolet-Visible
Tử ngoại – khả kiến


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Tên bảng, biểu

Trang

Bảng 2.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký cho định lượng, tạp chất liên quan ...... 18
Bảng 2.2. Điều kiện sắc ký cho định lượng ......................................................... 19
Bảng 2.3. Chương trình gia nhiệt ......................................................................... 20
Bảng 2.4. Điều kiện sắc ký cho tạp chất liên quan .............................................. 20

Bảng 3.5. Độ thích hợp của hệ thống sắc ký. ....................................................... 27
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ tuyến tính ............................................................ 29
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát khoảng xác định ....................................................... 30
Bảng 3.8. Kết quả đánh giá độ lặp lại. ................................................................. 30
Bảng 3.9. Kết quả xác định độ chính xác trung gian ........................................... 31
Bảng 3.10. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp ..................................... 32
Bảng 3.11. Kết quả xác định giới hạn phát hiện .................................................. 33
Bảng 3.12. Kết quả định lượng Charantin trong nguyên liệu trước tinh chế ....... 33
Bảng 3.13. Kết quả mất khối lượng do làm khô .................................................. 34
Bảng 3.14. Kết quả tạp chất liên quan trước tinh chế .......................................... 35
Bảng 3.15. Độ hòa tan của nguyên liệu Charantin trong các dung môi ở nhiệt độ
thường và nhiệt độ sôi .......................................................................................... 36
Bảng 3.16. Kết quả định lượng Charantin trong nguyên liệu sau tinh chế. ......... 39
Bảng 3.17. Kết quả mất khối lượng do làm khô. ................................................. 39
Bảng 3.18. Kết quả tạp chất liên quan của nguyên liêu Charantin sau tinh chế. . 40
Bảng 3.19. Kết quả so sánh nguyên liệu Charantin trước tinh chế và sau tinh chế.
.............................................................................................................................. 40
Bảng 3.20. Kết quả đo điểm chảy nguyên liệu Charantin ................................... 43
Bảng 3.21. Kết quả đo điểm chảy nguyên liệu Charantin ................................... 44
Bảng 3.22. Kết quả mất khối lượng do làm khô. ................................................. 44
Bảng 3.23. Kết quả tạp chất liên quan ................................................................. 45
Bảng 3.24. Kết quả định lượng nguyên liệu Charantin........................................ 45
Bảng 3.25. Kết quả đánh giá độ đồng nhất về mất khối lượng do làm khô ......... 47
Bảng 3.26. Kết quả đánh giá độ đồng nhất về hàm lượng ................................... 47
Bảng 3.27. Kết quả định lượng Charantin. .......................................................... 47
Bảng 3.28. Kết quả đánh giá thành phẩm ............................................................ 48
Bảng 3.29. Kết quả đánh giá theo Anova ............................................................ 48
Bảng 3.30. Xác định giá trị ấn định ..................................................................... 50
Bảng 3.31. Kết quả tính giá trị Z.......................................................................... 51
Bảng 4.32. Số liệu thẩm định phương pháp HPLC.............................................. 54

Bảng 4.33. Các chỉ tiêu đã đánh giá ..................................................................... 55


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình vẽ, đồ thị

Trang

Hình 1.1. Một số chế phẩm có nguồn gốc từ mướp đắng ...................................... 5
Hình 1.2: Sơ đồ các giai đoạn thiết lập chất chuẩn .............................................. 16
Hình 3.3. Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu của phương pháp ............................... 28
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và tổng diện tích 2 pic ... 29
Hình 3.5: Sắc ký đồ của chuẩn và nguyên liệu Charantin trước tinh chế ............ 34
Hình 3.6. Sắc ký đồ tạp chất liên quan nguyên liệu Charantin trước khi tinh chế
.............................................................................................................................. 35
Hình 3.7. Sơ đồ quy trình tinh chế Charantin ...................................................... 38
Hình 3.8. Sắc ký đồ của chuẩn và nguyên liệu Charantin sau tinh chế ............... 39
Hình 3.9. Sắc ký đồ tạp chất liên quan nguyên liệu Charantin sau tinh chế ........ 40
Hình 3.10. Sắc ký đồ tạp chất liên quan nguyên liệu Charantin trước và sau tinh
chế ........................................................................................................................ 41
Hình 3.11. Phổ khối lượng của chuẩn và nguyên liệu Charantin ........................ 42
Hình 3.12. Đồ thị mất khối lượng do làm khô ..................................................... 44
Hình 3.13. Sắc ký đồ tạp chất liên quan ............................................................... 45


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, cùng với sự phát triển kinh tế - xã hội và khoa học kỹ thuật, rất
nhiều loại thuốc cũng như các liệu pháp hiện đại đã được nghiên cứu và áp dụng,
đáp ứng nhu cầu ngày càng cao về chăm sóc và bảo vệ sức khỏe con người.
Cùng với đó, xu hướng quay trở lại sử dụng dược liệu và các sản phẩm có nguồn

gốc tự nhiên để phòng và điều trị bệnh cũng đang trở nên thịnh hành ở Việt Nam
cũng như rất nhiều nước trên thế giới. Vì vậy, để phù hợp với xu hướng phát
triển, nền y học cổ truyền nước ta đang dần được hiện đại hóa để có thể phát
triển hài hòa với y học hiện đại: như tìm ra thuốc mới dựa trên kinh nghiệm dân
gian, chiết tách và đánh giá tác dụng chữa bệnh của các hợp chất từ tự nhiên, tiêu
chuẩn hóa dược liệu và thuốc đông dược,…
Mướp đắng – tên khoa học Momordica charantia L. họ Bầu bí
(Cucurbitaceae), là loại cây rất quen thuộc ở nước ta vừa được sử dụng làm thực
phẩm, vừa được sử dụng để làm thuốc chữa bệnh. Những nghiên cứu gần đây đã
chứng minh mướp đắng có tác dụng trong phòng - điều trị bệnh tiểu đường và
nhiều bệnh khác [3,7,20,22]. Hợp chất chính gây ra tác dụng hạ đường huyết
trong quả mướp đắng là Charantin - một hỗn hợp của hai sterol glucosid:
sitosteryl glucosid và stigmasteryl glucosid.
Hiện nay, trên thị trường đã xuất hiện nhiều chế phẩm có chứa Charantin
(chiết xuất từ quả mướp đắng), nhưng chưa có chuyên luận vị thuốc mướp đắng
trong Dược điển Việt Nam IV [2]. Để đánh giá được chất lượng của dược liệu
mướp đắng, chế phẩm đông dược, thực phẩm chức năng chứa vị dược liệu này
cần có Charantin với độ tinh khiết phù hợp làm chất chuẩn để đánh giá phân tích.
Hơn thế, hiện chưa có một đơn vị nào trong nước cung cấp chuẩn Charantin. Do
đó, để chủ động nguồn chất chuẩn phục vụ công tác giám sát đảm bảo chất lượng
thuốc và chuẩn hóa dược liệu mướp đắng, chúng tôi thực hiện đề tài:

1


“Nghiên cứu tinh chế và thiết lập chất chuẩn Charantin.”
với mục tiêu:
- Tinh chế nguyên liệu Charantin đạt độ tinh khiết ≥ 95%.
- Xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng Charantin.
- Thiết lập được 50 lọ (20 mg/lọ) chất chuẩn Charantin.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. MƯỚP ĐẮNG
1.1.1. Thành phần hóa học
Các nghiên cứu gần đây cho thấy thành phần hóa học chính của cây mướp
đắng gồm có các steroid, triterpen thuộc nhóm cucurbitan, nhóm olean và các
glycosid của chúng (saponin); các alkaloid; chất béo; tinh dầu; protein; các
vitamin và khoáng chất [24,28].
Thành phần hóa học của mướp đắng được thống kê như sau:
* Các hợp chất thuộc nhóm saponin:
- Charantin: sitosterrol – D - glucosid và 5,25-stigmastadien – D - glucosid.
- Momordicosid A, B, C, D, E, F1, F2, I, G, K, L.
- Các cucurbitan triterpenoid I, II, III.
- Momordicin I, II, III.
- Nuominosid (calceolariosid E)
- Các goyasaponin I, II, III.
* Các polypeptid – lectin:
- MAP – 30
- MCI
+ MCTI: I, II, III
+ α,β – Momorcharin I, II.
+ Momorcharin I, II.
+ P – insulin.
* Các hợp chất khác: chất dẫn dụ côn trùng, chất màu: lycopen, β - caroten;
các amin; các chất khoáng như Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, P, N, I, F…; các alcol,
aldehyd, acid béo…

3


1.1.2. Tác dụng
Mướp đắng không chỉ là nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao mà còn
là nguồn dược liệu quí. Với nhiều tác dụng sinh học có giá trị đã được các nhà
khoa học trên thế giới chứng minh, khẳng định. Trong đó, dịch chiết của quả
mướp đắng và các hoạt chất của nó đã được chứng minh có rất nhiều tác dụng
sinh học: Kháng khuẩn [27], kháng virus [17], kháng viêm giảm đau [18], chống
ung thư [20], và hạ đường huyết [23].
Các nghiên cứu trong nước về cây mướp đắng
Nhóm tác giả Phạm Thị Diệu Hạnh và cộng sự chứng minh tác dụng hạ
đường huyết, kiểm soát sự tăng đường huyết ở bệnh nhân tiểu đường tuýp II nhờ
tác dụng ức chế enzym  - glucosidase - một enzym tham gia quá trình thủy
phân polysaccharid thành glucose [4].
Nhóm tác giả Phạm Văn Thanh, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn
Thượng Dong, Vũ Kim Thu đã nghiên cứu thành phần hóa học của cây mướp
đắng và đã chứng minh được rằng tác dụng hạ đường huyết của cây mướp đắng
trên thỏ gây đái tháo đường là do sự hiện diện của triterpen saponin [10].
Về mặt lâm sàng, các nghiên cứu của Bùi Chí Hiếu và Nguyễn Kim Phi
Loan đã chứng minh viên khổ qua bào chế từ quả mướp đắng có tác dụng hạ
đường huyết trên bệnh nhân đái tháo đường tuýp 2 [6]. Nghiên cứu của Đỗ Thị
Minh Thìn cũng cho kết quả tương tự. Với 33,33% bệnh nhân đái tháo đường
tuýp 2 sau khi được điều trị bằng cách sử dụng bột quả mướp đắng khô và cao
lỏng chiết từ quả mướp đắng đã có chỉ số đường huyết trở về bình thường và
32,0% số bệnh nhân có kết quả trung bình [11]. Ngoài ra, tác dụng trong điều trị
của vị thuốc này cũng được khẳng định trong các nghiên cứu của tác giả Lê Thị
Ngoan [8] và của nhóm tác giả Lê Lương Đống, Đặng Vũ Thu Hằng và Mai
Xuân Trường [3].
1.1.3. Một số chế phẩm có nguồn gốc từ mướp đắng

- Trà mướp đắng (Công ty TNHH Lâm Hương, Hà Nội)
- Viên nén Glukokine (China hongkong vinco soundproof material co., Ltd )
chứa cao đặc mướp đắng (10% Charantin).

4


- Bitter Melon Extract, 1 - 10% Charantin (Hangzhou World-wide Biology
Tech Co.Ltd)
- Bitter Melon Extract 10% Charantin (uv-vis) (Changsha Sunfull Bio-tech
Co., Ltd).

Trà mướp đắng

Viên nén Glukokine

Hình 1.1. Một số chế phẩm có nguồn gốc từ mướp đắng
1.2. CHARANTIN
1.2.1. Tính chất
Charantin là hỗn hợp của 2 sterol glycosid được Lotlikar và Rao cô lập lần
đầu tiên vào năm 1962 [22]. Đến năm 1965, Sucrow đã xác định được đây là
một hỗn hợp 2 sterol glycosid gồm chất A: Stigmasta - 5,25 – dien - 3β – O glucosid và chất B: β-sitosterol – 3 – β – O - glucosid [24].

Stigmasta - 5,25 – diene - 3β – O - glucosid
Tên khoa học:

Công thức cấu tạo:

17-(5-Ethyl-6-methylheptan-2-yl)10,13-dimethyl2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17dodecahydro -1 H-cyclopenta [a]
phenanthren-3-glucopyranosid

Công thức phân tử: C35H60O6.
Khối lượng phân tử: 574,8.

5


β-sitosterol-3-β-O-glucosid
Tên khoa học:

Công thức cấu tạo:

(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17[(E,2R,5S)-5-ethyl-6-methylhept-3-en2-yl]-10,13-dimethyl2,3,4,7,8,9,11,12,
14,15,16,17dodecahydro-1H-cyclopenta
[a]
phenanthren-3-glucopyranosid
Công thức phân tử: C35H58O6
Khối lượng phân tử: 576,8.
Charantin là chất ở dạng tinh thể, màu trắng, không vị, ít tan trong nước và
các dung môi không phân cực như n-hexan. Nhiệt độ nóng chảy 266oC - 268oC.
1.2.2. Tác dụng
Trong nhiều tài liệu đã công bố, Charantin được xem là một trong những hoạt
chất chính trong quả mướp đắng có tác dụng hạ đường huyết ở bệnh nhân đái
tháo đường.
Theo kết quả nghiên cứu của Lotlikar và Rao, khi được sử dụng ở cùng liều
điều trị thì Charantin có hoạt tính giảm đường huyết cao hơn Tolbutamide – một
loại thuốc thông thường được dùng để điều trị bệnh đái tháo đường dựa trên cơ
chế kích thích tuyến tụy sinh insulin.
Năm 2006 - 2007, nhóm nghiên cứu của TS. Nguyễn Ngọc Hạnh đã xây dựng
được qui trình phân lập Charantin ở qui mô phòng thí nghiệm. Chất Charantin
thu được theo qui trình này được tiến hành khảo sát hoạt tính ức chế men α glucose (in vitro) có IC50 là 27,4 µg/ml so với đối chứng acarbose là 35,1 µg/ml.

Thực nghiệm in vivo trên chuột gây đái tháo đường cho thấy, khi cho chuột uống
Charantin với liều 200mg/kg B.W trước 15 phút tương đương với Acabose ở liều
10 mg/kg B.W [5].

6


1.3. SỰ CẦN THIẾT PHẢI THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN TỪ DƯỢC LIỆU
Hoạt động nghiên cứu thiết lập và sản xuất các chất chuẩn giúp cho công tác
kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc và nguyên liệu làm thuốc. Mỗi khi chiết
xuất, tinh chế được 1 hoạt chất nào đó từ dược liệu để làm thuốc thì đồng thời
phải nghiên cứu thiết lập chất chuẩn từ chính chất đó.
Hiện nay, trên thế giới đã có một số chất chuẩn là những dược chất đặc trưng
của dược liệu được sản xuất đạt mức độ tinh khiết nhất định. Trong số đó, chỉ có
một số ít chất chuẩn có thể tiếp cận mua được, nhưng thường có giá rất đắt
(thường là đắt hơn khoảng 10 lần so với dược chất tương ứng). Chất chuẩn có độ
tinh khiết càng cao thì giá càng đắt.
Từ những lý do trên, nhiệm vụ cần thiết và cấp bách hiện nay là phải nghiên
cứu tinh chế và thiết lập các chất chuẩn có nguồn gốc từ dược liệu, từng bước
chủ động nguồn chất chuẩn phục vụ công tác kiểm tra, giám sát chất lượng dược
liệu và thuốc có nguồn gốc dược liệu đang rất đa dạng trên thị trường hiện nay.
Chất chuẩn có vai trò rất quan trọng trong công tác kiểm tra chất lượng thuốc
từ khâu nghiên cứu, sản xuất đến lưu hành trên thị trường. Hiện nay, nguồn chất
chuẩn ở Việt Nam đã có hơn 500 chất chuẩn bao gồm chuẩn quốc tế, chuẩn khu
vực, chuẩn Dược điển Việt Nam, chuẩn phòng thí nghiệm, chuẩn chính. Tuy
nhiên chủ yếu trong số đó là chất chuẩn hóa học, rất ít chất chuẩn có nguồn gốc
từ dược liệu. Sự thiếu hụt này đã gây nên rất nhiều khó khăn cho ngành Dược
như:
- Không kiểm nghiệm được chất lượng dược liệu một cách đầy đủ và toàn
diện;

- Không kiểm tra, giám sát chất lượng các dạng bào chế có nguồn gốc từ dược
liệu đang lưu hành trên thị trường một cách đầy đủ;
- Không tiêu chuẩn hoá được các thuốc sản xuất trong nước bào chế từ dược
liệu hoặc chiết xuất từ dược liệu về mặt hàm lượng dược chất, do đó, không giúp
được ngành Dược bào chế ra các thuốc có chất lượng cao phục vụ nhu cầu phòng
bệnh và chữa bệnh.

7


Như vậy, vấn đề nghiên cứu thiết lập chất chuẩn từ các chất chiết ra từ dược
liệu là đòi hỏi thực tiễn khách quan và là nhiệm vụ nghiên cứu khoa học công
nghệ cấp thiết.
1.4. PHƯƠNG PHÁP TINH CHẾ CÁC CHẤT TỪ DƯỢC LIỆU VÀ NHẬN
DẠNG HỢP CHẤT SAU KHI TINH CHẾ
1.4.1. Phương pháp tinh chế các chất từ dược liệu
Thông thường sau khi phân lập, độ tinh khiết của chất thường đạt trên 80%.
Quá trình tinh chế làm sạch nhằm tăng độ tinh khiết, loại tiếp các vết tạp hoặc
phần chất phân lập kèm theo, chưa thể hoặc không thể loại hết trong điều kiện
phân lập. Các phương pháp tinh chế có thể thực hiện [1]:
- Kết tinh trong các dung môi thích hợp: Với ưu điểm kỹ thuật tiến hành đơn
giản, dễ tiến hành đối với các chất có khả năng kết tinh. Kỹ thuật này cũng là kỹ
thuật cơ bản và thường được áp dụng
- Tinh chế trên cột sắc ký: Sử dụng sắc ký lỏng điều chế hiệu năng cao, với
các cột phân tách khác nhau như Octadecyl silica gel, rây phân tử (Sephadex,
divinylpolystyrene), cột tách đồng phân quang học ... Sắc ký điều chế / bán điều
chế thường được sử dụng ở nước ngoài trong phân lập và tinh chế. Khác với sắc
ký phân tích, sắc ký điều chế được sử dụng để tách một lượng chất nhất định ra
khỏi hỗn hợp. Sự khác nhau cơ bản giữa hai kỹ thuật là hỗn hợp không được xác
định hay phân tích hoàn toàn mà dung dịch chứa chất cần lấy được tách riêng và

thu hồi lại để sử dụng về sau.
Tinh chế Charantin:
Hiện nay, trên thế giới cũng như tại Việt nam, chưa có một nguồn thông tin
chính thống nào đề cập đến việc tinh chế Charantin đạt hàm lượng trên 95,0%.
Tại Việt Nam và một số nước trên thế giới, đã xuất hiện các chế phẩm chứa
Charantin, nhưng mới chỉ dừng lại ở việc chiết xuất, phân lập Charantin có hàm
lượng tương đối thấp (≤ 10%).

8


1.4.2. Nhận dạng hợp chất sau khi tinh chế
Cấu trúc các chất sau khi tinh chế được xác định bằng sự kết hợp của nhiều
phương pháp khác nhau. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người
ta sử dụng các phương pháp khác nhau. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối
hợp các phương pháp càng cao. Dưới đây là một số phương pháp chúng tôi dùng
để xác định cấu trúc của chất tinh chế được.
- Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): Phổ cộng hưởng 1H-NMR và 13C-NMR
thường được sử dụng để xác định cấu trúc của phân thử hợp chất hữu cơ hoàn
toàn chưa biết. Phổ cộng hưởng proton 1H-NMR và phổ cộng hưởng carbon 13CNMR cho biết số nguyên tử hydro và số nguyên tử carbon (carbon bậc 1, bậc 2,
bậc 3 và bậc 4)... Từ các thông tin cộng hưởng từ, phân tích bằng nhiều kỹ thuật,
kết hợp với các phương pháp mô phỏng (phần mềm), có thể dựng lại cấu trúc
khung phân tử hữu cơ một cách chính xác [9].
- Phổ khối lượng (MS): Mỗi hợp chất hữu cơ có phân tử lượng xác định, khi
dùng năng lượng bẻ gẫy phân tử sẽ cho phổ khối là tập hợp nhiều mảnh có tỷ số
khối m/z xác định đặc trưng cho các hợp chất hữu cơ. Vì vậy, phổ khối là một
trong những kỹ thuật phân tích cấu trúc và sử dụng để định tính mang tính khẳng
định: có thể so sánh phổ khối của hợp chất hữu cơ với phổ chuẩn trong thư viện
hoặc đo song song với 1 mẫu chuẩn. Phổ khối phân giải cao (HR EI-MS) sử
dụng kỹ thuật ion hóa và bẻ gãy phân tử bằng va chạm điện tử (Electron Impact)

hoặc bằng phun điện tử (Electron Spray Ionisation ESI) kết hợp đo thời gian bay
qua tứ cực Quadrupole/Time of Flight (Q/TOF) [1].
- Điểm chảy: Đối với chất rắn kết tinh, điểm chảy là một tiêu chuẩn lý học rất
quan trọng. Thông thường phân tích đầu tiên sau khi thu được một sản phẩm kết
tinh là việc xác định điểm chảy. Điểm chảy là tiêu chuẩn kiểm tra mức độ tinh
khiết của hợp chất mà chỉ cần lượng mẫu thử rất ít. Nếu điểm chảy của hai loại
tinh thể thu được qua 2 lần kết tinh chỉ chênh lệch nhau không quá 0,5 oC thì có
thể xem là sản phẩm kết tinh tinh khiết. Khi điểm chảy xác định được, đối chiếu
với tài liệu tham khảo có thể kết luận sơ bộ về hợp chất đang nghiên cứu [1,13].

9


1.5. PHƯƠNG PHÁP THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN
1.5.1. Tổng quan về nghiên cứu thiết lập chất chuẩn trên thế giới
Bất cứ quốc gia nào cũng đều phải thiết lập và sản xuất các chất chuẩn đối
chiếu hóa học cho công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc và nguyên liệu
làm thuốc. Mỗi hoạt chất sau khi được chiết xuất, phân lập, tinh chế hoặc bán
tổng hợp, tổng hợp toàn phần đều được nghiên cứu phát triển tiềm năng thành
thuốc mới. Song song với việc nghiên cứu phát triển nguồn nguyên liệu hóa
dược phục vụ cho công nghiệp bào chế thuốc, việc nghiên cứu thiết lập chất
chuẩn đối chiếu hóa học (gọi tắt là chất chuẩn) từ chính chất đó phục vụ công tác
đánh giá chất lượng sản phẩm công nghiệp hóa dược cũng như các dạng bào chế
vô cùng quan trọng.
Trong những năm gần đây, danh mục thuốc mới được nghiên cứu, phát triển
ngày càng nhiều từ nguồn tổng hợp hóa dược, hoặc các chất chiết từ sản phẩm tự
nhiên (dược liệu) góp phần không nhỏ trong việc bảo vệ, chăm sóc và điều trị
bệnh, đặc biệt một số bệnh hiểm nghèo như ung thư, tim mạnh, tiểu đường….
Đồng nghĩa với danh mục dạng thuốc mới ngày càng nhiều là danh mục các hoạt
chất mới cũng càng nhiều cả về hoạt chất hóa dược và các chất đặc trưng từ dược

liệu (Có hơn 2400 hoạt chất được chuẩn hóa thành chất chuẩn) [26]. Do đó, việc
tinh chế và chuẩn hóa các hoạt chất này để có độ tinh khiết thích hợp thành chất
chuẩn hóa học để đánh giá chất lượng nguyên liệu và sản phẩm thuốc là rất cần
thiết.
Các chất chuẩn theo Dược điển Mỹ (USPRS), Dược điển Châu Âu (EPRS),
Dược điển Quốc tế (ICRS) và chất chuẩn khu vực ASEAN (ARS) được thiết lập
với sự hợp tác của nhiều phòng thí nghiệm độc lập trên thế giới và được sản xuất
tại các trung tâm sau:
 Hội đồng chất đối chiếu Dược điển Mỹ (USP Reference Standard
Committee);

10


 Ban thư ký Kỹ thuật thuộc Hội đồng Dược điển Châu Âu (Technical
Secretariat of the European Pharmacopoeia Commission);
 Trung tâm hợp tác về các chất chuẩn hoá học của Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO Collaborating Centre for Chemical Reference Substances).
Chất chuẩn khu vực ASEAN (ARS) được thiết lập với sự đánh giá hợp tác của
các nước trong khối ASEAN theo chương trình Hợp tác kỹ thuật giữa các nước
ASEAN về lĩnh vực Dược phẩm; và Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương – Bộ
Y tế là thành viên chính thức đánh giá, thiết lập chất chuẩn ASEAN.
Mục đích và cách sử dụng của các chất chuẩn nước ngoài cũng khác nhau phụ
thuộc vào tiêu chuẩn trong Dược điển của từng nước.
- Chất chuẩn quốc tế:
 Cách sử dụng và mục đích sử dụng theo chứng chỉ phân tích
- Chất chuẩn Châu Âu:
 Cách sử dụng: Theo kết quả ghi trong Catalogue tính theo nguyên trạng
 Mục đích sử dụng: Có 14 mục đích sử dụng khác nhau, phụ thuộc vào
từng chuyên luận cụ thể trong Dược điển.

- Chất chuẩn theo Dược điển Mỹ: Một số chất phải xác định lại độ ẩm trước
khi sử dụng.
- Chất chuẩn ASEAN : Cách sử dụng và mục đích sử dụng theo chứng chỉ
phân tích.
Để thiết lập được chất chuẩn, các trung tâm nêu trên thường tiến hành các
bước sau:
- Các chất chuẩn hóa dược
 Xây dựng quy trình phân tích dựa theo phương pháp phân tích nêu trong
Dược điển có độ chính xác và độ lặp lại cao, ổn định nhằm đánh giá
đúng chất lượng nguyên liệu dự kiến thiết lập chất chuẩn và phù hợp với
mục đích sử dụng.
 Lựa chọn nguyên liệu thiết lập chất chuẩn dựa theo nguyên tắc:

11


 Độ tinh khiết của nguyên liệu dự kiến thiết lập chất chuẩn phụ thuộc
vào mục đích sử dụng. Một chất chuẩn dự kiến sử dụng cho phép thử
định tính bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại hay phương pháp
TLC không yêu cầu có độ tinh khiết quá cao, trong khi đó các nguyên
liệu được sử dụng thiết lập chuẩn để dùng trong định lượng nên có độ
tinh khiết ít nhất 99% hoặc cao hơn nữa.
 Để đáp ứng cho yêu cầu của một chất đối chiếu, điều cần xem xét quan
trọng nhất là ảnh hưởng của tạp chất đến phép đo trong khi định lượng.
 Việc phân tích chất lượng nguyên liệu, nhất là nguyên liệu dùng để thiết
lập chất chuẩn thường phức tạp, tốn kém, đòi hỏi những trang thiết bị
hiện đại, những hoá chất, chất chuẩn đặc biệt, người làm phân tích phải
có trình độ và kinh nghiệm, do đó tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu phải
luôn đề cập đến các chỉ tiêu nhằm chứng minh tính xác thực về hoá học
và độ tinh khiết của nó.

 Xác định chất lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn được tiến hành bởi
chương trình đánh giá hợp tác giữa các phòng thí nghiệm độc lập dựa
theo quy trình phân tích đã được xây dựng.
- Các chất chuẩn dược liệu
 Xác định hoạt chất chính có tác dụng dược lý trong dược liệu
 Xây dựng qui trình chiết xuất, phân lập và tinh chế hoạt chất chính có tác
dụng dược lý
 Sau đó tiến hành các bước thiết lập như chất chuẩn hóa dược.

1.5.2. Thiết lập, bảo quản chất chuẩn theo hướng dẫn của WHO và ASEAN
1.5.2.1. Lựa chọn nguyên liệu
Nguyên liệu làm chất chuẩn phải đồng nhất và ổn định [21]. Độ tinh khiết đối
với chất chuẩn phụ thuộc vào loại nguyên liệu làm chất chuẩn. Đối với hợp chất

12


là hoá chất tổng hợp, yêu cầu độ tinh khiết không dưới 99,0%. Đối với các hợp
chất chiết từ dược liệu, yêu cầu độ tinh khiết không dưới 95,0%.
1.5.2.2. Xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng nguyên liệu
Các phương pháp hoá lý được sử dụng để đánh giá chất lượng nguyên liệu
thiết lập chất chuẩn phải phản ánh được đúng tính chất của chất đó, có độ chính
xác và độ lặp lại.
- Các phương pháp phân tích được sử dụng để định tính: Đó là các phương pháp
có khả năng chứng minh được các tính chất đặc trưng của mẫu là đúng. Đáp ứng
mục đích này thường đo phổ IR, ngoài ra có thể áp dụng phương pháp khác như
đo điểm chảy, HPLC ...[13].
- Phương pháp xác định hàm ẩm: Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng:
Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng (Thermogravimetry – TG hay
Thermogravimetry analysis - TGA) là phương pháp theo dõi sự thay đổi khối

lượng theo thời gian hoặc nhiệt độ khi mẫu được đặt trong một môi trường nhất
định và được truyền nhiệt theo chương trình. Phương pháp này được dùng để
nghiên cứu sự thay đổi của khối lượng mẫu trong quá trình gia nhiệt như quá
trình phân huỷ, dehydrat hoá, oxy hoá – khử,… Chương trình nhiệt có thể bao
gồm: đốt nóng hoặc làm lạnh với một tốc độ nhất định hoặc giữ nhiệt độ mẫu là
hằng số hoặc một số kiểu gia nhiệt khác phức tạp hơn [25,26].
- Các phương pháp xác định độ tinh khiết:
+ Sắc ký: Các phương pháp này dựa trên sự chia tách sắc ký, rất phù hợp cho
việc phát hiện và xác định các tạp chất có trong nguyên liệu. Trong đó, phương
pháp HPLC (có detector UV-VIS và DAD) rất thuận lợi cho mục đích xác định
tạp chất liên quan [1,13].
+ Điểm chảy: Điểm chảy càng gọn càng gần với giá trị thực [1,13].
Dù bất cứ phương pháp nào được sử dụng để đánh giá các nguyên liệu thiết
lập chất chuẩn thì điều cơ bản nhất là hàm lượng của các tạp chất phải được xác
định.
- Các phương pháp phân tích được sử dụng để định lượng: Phương pháp HPLC
với detector UV-VIS là phương pháp thường được dùng trong định lượng hoạt

13


chất. Hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử được tính toán dựa vào diện tích píc
của mẫu thử (dung dịch thử), diện tích píc mẫu chuẩn (dung dịch chuẩn) đã biết
trước nồng độ trong cùng điều kiện phân tích [1,13].
1.5.2.3. Đóng gói
Để đảm bảo chất lượng của chất chuẩn trong suốt thời gian sử dụng thì việc
tiến hành đóng gói và cách bảo quản cũng góp phần quan trọng.
- Lọ đựng chất chuẩn phải đảm bảo tránh được ẩm, ánh sáng, thuận tiện sử dụng,
thống nhất về kiểu dáng và kích thước, đánh số thứ tự lên từng lọ.
- Đóng gói trong glove-box kiểm soát được độ ẩm và nhiệt độ.

- Các bước trong quá trình đóng gói phải kiểm soát chặt chẽ tránh nhiễm chéo,
tạp, sai nhãn…
- Lượng chất chuẩn đóng trong một lọ phải đủ cho 1 lần kiểm tra và chỉ sử dụng
một lần.
1.5.2.4. Bảo quản
Điều kiện bảo quản ở nhiệt độ thông thường khoảng 2oC – 8oC với đồ bao gói
ngăn được sự hấp phụ ẩm, tránh ánh sáng là phù hợp cho các chất đối chiếu hoá
học. Các lọ chất chuẩn không được mở cho đến khi cân bằng về nhiệt độ phòng
thí nghiệm để ngăn quá trình hấp phụ ẩm.
1.5.2.5. Hồ sơ chất chuẩn
Các thông tin cung cấp kèm theo chất chuẩn:
- Thông tin trên nhãn: Tên chất chuẩn, phân loại chất chuẩn, khối lượng đóng
(mg)/lọ, tên đơn vị thiết lập, số kiểm soát, điều kiện bảo quản.
- Thông tin trên chứng chỉ phân tích: Tên chất chuẩn, phân loại chất chuẩn, mục
đích sử dụng, số kiểm soát, mô tả, các kết quả phân tích, hướng dẫn sử dụng,
điều kiện bảo quản, đơn vị thiết lập chuẩn, thời gian thiết lập, thời hạn kiểm tra
định kỳ.
- Các dữ liệu phân tích được ghi trong chứng chỉ nên ngắn gọn, rõ ràng và cần
thiết cho mục đích sử dụng trong các phép thử định tính và định lượng.

14


1.5.3. Yêu cầu nội dung của quy trình phân tích theo quy định của Asean
Để đảm bảo sự thống nhất, việc xây dựng quy trình phân tích phải đảm bảo
các yêu cầu khoa học sau [16]:
- Đưa ra phương pháp đánh giá phù hợp với mục đích sử dụng
- Phù hợp với các điều kiện thiết bị, dung môi hóa chất, chất đối chiếu của đơn vị
kiểm nghiệm
- Quy trình phải ổn định, đảm bảo độ tái lặp giữa các phòng thí nghiệm và độ lặp

lại giữa các lần kiểm tra định kỳ
- Quy trình phân tích phải đảm bảo đánh giá được đúng chất lượng của nguyên
liệu dự kiến thiết lập chất đối chiếu, thể hiện qua các tiêu chuẩn: Định tính, xác
định độ tinh khiết, nước/hàm ẩm, và định lượng.

15


Chuẩn bị nguyên liệu và chất chuẩn gốc

Đánh giá sơ bộ nguyên liệu, xây dựng quy trình thiết lập chất
chuẩn

Kiểm tra chất lượng nguyên liệu

Đóng lọ

Đánh giá độ đồng nhất

Đánh giá liên phòng thử nghiệm

Xử lý số liệu và hoàn thành hồ sơ

Họp đánh giá và thông qua chứng chỉ

Dãn nhãn, sử dụng và kiểm tra định kỳ

Hình 1.2: Sơ đồ các giai đoạn thiết lập chất chuẩn

16