Nghiên cứu mô hình tối ưu hóa thống kế đánh giá độ ổn định của nguyên liệu artesunat

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TlỊíèrỉ® ®ẠI HỌC DƯỢC HÀ MỘI

DƯỢC SỸ NGUYỄN THỊ THANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU MÔ HÌNH
TỐI ƯU HOÁ THỐNG KÊ
ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH
■

■

CỦ A NGUYÊN LIỆU ARTESUINIAT
■

Chuyên ngành Kiểm nghiệm dược và độc chất học
Mã sô : 3.02.05

ẬM VẰN THẠC
SỸ DƯỢC
HỌC
*
*
*

,*

Người hướng dẫn khoa học

P G S - T S TRẨN TỬ AN
TS TRỊNH VĂN LAU

Hà nội, 2000


Ỉ.UÃI I A i I

Z(

MỤC LỤC
Mục lục,..................................................................................................................1
Lòi cảm ơ n ............................................................................................................ 3
Phần 1 : Đặt vấn đề............................................................................................. 4
Phần 2 : Tổng quan
................................................................................6
2.1 Tổng quan về ARTESUNAT...................................................................... 6
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.1.4
2.1.5
2.1.6

Công thức:..................................................................................................................6
Tính chất:.................................................................................................................... 6
Phương pháp điều c h ế :............................................................................................. 6
Cơ chế tác dụng :....................................................................................................... 8
Các phương pháp định lượng:...................................................................................8
Tạp chất và cách xác định:..................................................................................... 13

2.2 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu độ ổnđịnh của thuốc.............. 16
2.2.1 Khái niệm về độ ổn định của thuốc :....................................................................16
2.2.2 Các yếu tố ảnh hương đến độ ổn định của thuốc :............................................. 16
2.2.3 Vài nét về đặc điểm khí hậu Việt nam và sự ảnh hưởng của khí hậu đến độ ổn
định của thuốc : ................................................................................................................. 17
2.2.4 Động học của phản ứng phân huỷ thuốc và việc đánh giá độ ổn định của
18
thuốc:
.7........................................
2.2.5 Đánh giá độ ổn định của thuốc:............................................................................. 19

2.3 Đánh giá độ ổn định của thuốc bằng mô hình tối ưu hoá thông kê:.....28
2.3.1. Nguyên tắc chung:..................................................................................................28
2.3.2. Mô hình hoá thực nghiệm đa nhân tố:................................................................. 29
2.3.3. Mô hình hoá thực nghiệm bậc hai đánh giá độ ổn định của nguvén liệu
Artesunat...................................................................................
39

Phần 3 : Đối tượng - Phương tiện phương pháp nghiên cứu.................... 41
3.1. Đối tượng................................................................................................... 41
3.2. Phương tiện, dụng cụ, thuốc thử, điều kiện............................................ 41
3.2.1. Phương tiện, dụng cụ............................................................................................. 41
3.2.2. Thuốc thử, chất chuẩn và dung môi hoá chất:....................................................41
3.2.3 Điều kiện tiến hành................................................................................................ 42

3.3. Phương pháp nghiên cứu:........................................................................ 43
3.3.1. Đánh giả độ ổn định của nguyên liệu Artesunat bằng mô hình tối ưu hoá
thống kê:.............................................................................................................................43
3.3.2 Các chỉ tiêu đánh giá:............................................................................................. 45

3.3.3 Tính toán xử lý thống kê kết quả thực nghiệm....................................................48

Phần 4 : Kết quả thực nghiệm & bàn luận...................................................50
4.1 Xảy dựng phương pháp định lượng nguyên liệu Artesunat khi mẫu đã
có sự phân huỷ.................................................................................................. 50
4.1.1 Khảo sát độ lặp lại của phương pháp:................................................................... 50
4.1.2. So sánh với phương pháp HPLC..........................................................................51
4.1.3. Xác đinh độ đúng của phương pháp:................................................................... 52

,

4.2. Kết quả đánh giá mẫu ban đầu............................................................ 52
4.2.1. Thử tạp chất liên quan..........................................................................................52
4.2.2 Xác định hàm lượng:..........................................
54

4.3 Đánh giá độ ổn định bàng mô hình tối ưu hoá thống kê........................ 56
4.3.1 Đánh giá mẫu A |................................................................................................... 56
Trang I


LLr»\i I AM J| *A c J Í

4.3.2 Đánh giá mẫu A2.................................................................................................. 60

4.4 Đánh giá nguyên liệu Artesunat ở điều kiện bảo quản bình thường... 65
4.4.1 Tạp chất liên quan.................................................................................................. 65
4.4.2 Xác định hàm lượng............................................................................................... 66

4.5 So sánh kết quả ở điều kiện bảo quản thường & kết quả tính toán từ

phương trình hồi qui........................................................................................ 66
4.6 Dự đoán sự suy giảm hàm lượng của nguyên liệu Artesunat ở các điều
kiện bảo quản................................................................................................... 68
Phần 5 : Bàn luận và Kết luận........................................................................73
Tài liệu tham khảo
.........................................................
76

Trang 2


LUẦII All i.;-y:

LÒI CẢM ƠN
Tôỉ xỉn được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS - TS
Trần tử An - người hướng dẫn tận tình, chu đáo, chỉ đạo
sâu sát về mặt khoa học việc thực hiện đề tài này.
Để hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự giúp đỡ
nhiều mặt của tập thể Trung tâm KNDP - Sở Y tế Hà nội
Tôi cũng đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của TS Trịnh
văn Lẩu, Thạc sỹ Nguyễn kim Thanh và các cán bộ phòng
thuốc chuẩn Viện Kiểm nghiệm Trung ương.
Nhận dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành với
tất cả sự giúp đỡ quý báu nói trên.
Xin chân thành cảm ơn thư viện Viện Kiểm nghiệm, thư
viện trường Đại học Dược Hà nội đã cung cấp những thông
tin cần thiết giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này.

Trang 3

PHẦN 1 : ĐẶT VẤN ĐỂ
:

Trong những năm gần đây, ngành Dược nước ta rất chú ý đến vấn đề
nâng cao chất lượng thuốc nhằm phục vụ ngày càng tốt hơn công tác
phòng và chữa bệnh , chăm sóc sức khoẻ cộng đồng.

Chính sách quốc gia về thuốc của Việt nam đến năm 2000 đã đề ra
việc nghiên cứu , sản xuất và cung ứng đầy đủ thuốc đảm bảo chất lượng
để phục vụ cho công tác phòng và chữa bệnh , có thể tiến tới đưa nhiều
sản phẩm của ngành dược Việt nam lưu hành trên thị trường quốc tế. Đó
là một nhiệm vụ cấp bách và nặng nề.

Nguyên liệu làm thuốc có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc
hình thành chất lượng dược phẩm. Hiện nay trong cơ chế thị trường có sự
cạnh tranh quyết liệt về giá cả. Do đó nhiều cơ sở sản xuất đã nhập về một
số nguyên liệu làm thuốc với giá rẻ có chất lượng tuy đạt tiêu chuẩn
nhưng nằm ở gần giới hạn tối thiểu cho phép. Mặt khác các hãng sản xuất
nguyên liệu khác nhau có những công nghệ sản xuất và kỹ thuật tinh chế
khác nhau dẫn đến chất lượng và giá cả cũng khác nhau vì vậy có hiện
tượng “Một số nguyên liệu sản xuất ở Trung quốc nhưng nhãn trên bao bì
làm người ta hiểu nhầm là sản xuất tại các nước Châu Âu. Việc kiểm tra
chất lượng nguyên liệu trong sản xuất thuốc là vấn đề cần được quan tâm
không chỉ ở nước ta mà là chung cho tất cả các nước trên thế giới.

Việc nghiên cứu đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng thuốc từ nguyên
liệu đến thành phẩm bào chế đạt yêu cầu chung của dược điển các nước
tiên tiến sẽ góp phần thúc đẩy trình độ sản xuất thuốc trong nước, tiếp cận
với khoa học kỹ thuật hiện đại, hoà nhập vào cộng đồng y tế thế giới.

Trang 4


L'J-Ul A»I l»!AC jf

Hiện nay , số lượng thuốc của các Công ty nước ngoài nhập vào Việt
nam cũng như thuốc của các cơ sở sản xuất trong nước không ngừng gia
tăng. Một trong các tiêu chuẩn để được Cục Quản lý dược Việt nam xét
duyệt cấp số đăng ký là phải có hồ sơ theo dõi đánh giá độ ổn định của
thuốc (nguyên liệu hay thành phẩm bào chế) [1]

Trong các hồ sơ xin đăng ký lưu hành thuốc , trên nhãn bao bì và
trong các hợp đồng kinh tế về thuốc người dược sỹ luôn quan tâm, đến
hạn dùng (expiration date) hoặc tuổi thọ (shelf life) của thuốc. Số liệu tin
cậy về hạn dùng hoặc tuổi thọ của thuốc phải được xem xét tính toán từ
những tư liệu nghiên cứu , theo dõi và lập thành hồ sơ của thuốc.

Việt nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa - nóng - ẩm và có
mưa nhiều vì vậy việc nghiên cứu đánh giá tuổi thọ của thuốc gắn với điều
kiện khí hậu của nước ta là việc làm cần thiết.

Để góp phần làm phong phú thêm các phương pháp đánh giá độ ổn
định của thuốc chúng tôi xây dựng một “mô hình tối ưu hoá thống kê đánh
giá độ ổn định của nguyên liệu Artesunat “ nhằm hai mục tiêu sau :
- Đánh giá khả năng sử dụng mô hình 2k tâm trực giao trong việc
đánh giá độ ổn định nguyên liệu thông qua ví dụ nguyên liệu
Artesunat.
- Thông qua mô hình tối ưu hoá thống kê đánh giá ảnh hưởng của
các yếu tố : nhiệt độ và độ ẩm đến sự suy giảm hàm lượng hoạt

chất để xem xét cách đánh giá tuổi thọ của thuốc

Trang 5


r-ỈẬII All MẠC jf

PHẦN 2 : TỔNG QUAN
2.1 TỔNG QUAN VỂ ARTESUNAT
2.1.1 Công thức:

o

- c o - c h 2— c h 2— c o o h

Công thức phân tử : c 19 H28 Og
Trọng lượng phân tử: 384,4
Tên khoa học : Decahydro -3,6,9 - trimetyl - 3,12 epoxy -12 H - pyranol
[ 1,33-6] benzodioxepin - 10 -ol, hydrogen succinate.(*}

2.1.2 Tính chất:
Bột kết tinh trắng, ít tan trong nước, dễ tan trong các dung môi
Dicloromethan, Aceton, Cloroform và các dung dịch kiềm. Artesunat
không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng vì vậy được qui
định bảo quản trong bao gói kín tránh ánh sáng và để ở nơi mát [23].
Nhiệt độ nóng chảy : 132-135°c
Năng suất quay cực: [a]20D= 10-14°

2.1.3 Phương vháv điều c h ế :
Artesunat được bán tổng hợp từ artemisinin qua hai giai đoạn [11]

Trang 6


Ỉ.I/AI I /«l ỉ J* t»\C t» (

Giai đoạn 1 : Artemisinin được khử hoá nhóm Lacton thành Dihydro
artemisinin (DHA ) bed Natriborohydrid (NaBH4 ) trong môi trường
Methanol khan ở nhiệt độ CM-5° c
Sơ đồ phản ứng:

o
Artemisinin

Dihydro artemisinin
(DHA)

DHA thu được ở hai dạng đồng phân (X&p.
Giai đoạn 2: DHA được este hoá thành Artesunat khi cho phản ứng với
anhydrid succinic dùng dimethylaminopiridin (DMAP) làm xúc tác
hoặc khi cho phản ứng vơí acid succinic và dùng dicyclo-hexyl
carbodimid (DCC) làm xúc tác :
Sơ đồ phản ứng :
.0

o
V-

DMAP

0

COOH
CH,
I
ch2
COOH

DMAP
DDC

O—CO- ch2- ch2- cooh

Trang 7


L'J.'MI Ai I J . ; . y .

~A

Ngày nay từ DHA người ta còn có thể bán tổng hợp ra nhiều chất khác
có hoạt lực tương tự như Artesunat đó là Arteether (AE) và Artemether
(AM), các chất này bền vững hơn Artesunat.

2.1.4 Cơ chế tác duns i
Qua nhiều nghiên cứu người ta thấy rằng tác dụng điều trị sốt rét của
Artesunat mạnh gấp 5 lần artemisinin và có tác dụng trên ký sinh trùng
đã kháng Cloroquin, Mefloquin, Fansidar [7].
Cơ chế tác dụng bắt nguồn từ cấu tạo phân tử của Artesunat có mang cầu
nối peroxyd do đó từ các phân tử Artesunat luôn sinh ra các dạng Oxy

hoạt động, các gốc tự do của Oxy tác động vào tế bào của ký sinh trùng
sốt rét và tiêu diêt nó. Vì vậy khi cầu nối peroxyd bị phá huỷ thì thuốc
không còn tác dụng.
Artesunat ức chế hoạt tính của cytochrom- oxydaza và hệ vận chuyển
glutamin trong hồng cầu. Ở pH cao Artesunat tạo tức thì các dạng oxy
hoạt động .

2.1.5 Các vhươns vháv đinh Ỉươri2:
2.1.5.1 Phươns pháp quang p h ổ :
bản thán Artesunat chỉ hấp thụ ở vùng u v có bước sóng ngắn. Sau khi
đun nóng ở môi trường kiềm Artesunat chuyển thành Q289 là sản phẩm
có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 289 nm± l nm - Nếu acid hoá Q289 sẽ
trở thành dẫn chất Q260. Các chất này người ta đã phân lập được dưới
dạng kết tinh [17][12]

60°C; NaOH

H+

30'

OH

►

OH
h3C^

Q 289

'COOH

Q260

Trang 8


tvẬti All I.uy: ‘ù

Nhìn chung ở nước ta Artesunat và các chế phẩm thường qui định định
lượng bằng phương pháp đo quang ở X =289 nm sau khi thuỷ phân
Artesunat ở môi trường NaOH 0,1 N và nhiệt độ : 60 0 c trong thời gian
30 phút và so sánh với hàm lượng chất chuẩn .
Phương pháp này chỉ cho kết quả chính xác nếu như cả chuẩn và thử
được tiến hành trong cùng một điều kiện , nhiệt độ ổn định trong suốt
thời gian thuỷ phân và chỉ dùng đối với những nguyên liêu đạt qui định
về độ ẩm và đạt yêu cầu về tạp chất phân huỷ.

2.1.5.2 Phươns pháp sắc ký lỏns hiêu n ă m cao : nhìn chuns đươc tiến
hành theo các hướns i
•

Hướng trực tiếp:

Artesunat được làm giàu trên cột. Sau khi tách ra khỏi cột tách được phát
hiện bằng các detector thích hợp. Tử ngoại, điện hoá, hoặc khúc xạ kế
[33] [23] [15]
•

Hướng gián tiếp :

- Phản ứng trước cột tách : Artesunat sau khi thuỷ phân bằng kiềm
hoặc phản ứng với thuốc thử đặc hiệu tạo ra sản phẩm có hấp thụ tử
ngoại hoặc khả kiến, sản phẩm này được tách trên cột và được phát hiện
bằng detector tử ngoại hoặc khả kiến.
- Phản ứng sau cột tách : Dịch chiết Artesunat và tạp chất sau khi
chiết tách qua cột được phản ứng với thuốc thử đặc trưng tạo thành dẫn
chất có thể phát hiện bằng detector thích hợp
Phương pháp này cũng dựa trên nguyên tắc Artesunat được thuỷ phân
trong môi trường kiềm nhưng đặc diểm khác là quá trình thuỷ phân xảy
ra sau khi,hoạt chất được tách ra khỏi cột cùng với pha động là
Acetonitril và hệ đệm acetat do bơm thứ nhất được đi qua ống hình chữ
T chứa thuốc thử (KOH IM trong Methanol) và dẫn chất được bơm vào
bơm thứ hai - Toàn bộ được đặt trong bể ổn nhiệt ở 70 0 c. Sau đó được
Trang 9


! U - \ Ỉ I /-*1 ỉ J i %tN

phát hiện bằng detector u v

^(

ồ bước sóng 289 nm

hoặc 292nm

Một số qui trình định lượng Artesunat bằng HPLC đã được khảo s á t :
Đinh lương trưc tiếp - detector tử ngoai (*} Ă = 235nm [15]
- Pha tĩnh : Cột lichrosorb RP 18 ( 200 x4,6mm X 10 |nm)

- Pha động : A cetonitriỉ: đệm acetat pH 5,1 (1:1)
- Tốc độ dòng : 1,3 ml/ p h ú t. Nồng độ l mg/l ml
- Thể tích tiêm : 20 |J.1
- Dung môi hoà tan mẫu : acetonitril
•

Cách pha dung dịch đệm acetat pH 5,1 : Cân 1,64 g Natriacetat
hoà tan trong 1000 ml nước, điều chỉnh bằng acid acetic đặc đến
pH =5,1 và lọc qua phễu G4

•

Phương pháp này có độ tuyến tính và

độ lặp lại cao thể hiện

phương trình hồi q u i:
Y= 564,5 X +0,57

Y : diện tích pic;

X : nồng độ mg/ml

R= 0,999
Độ lệch chuẩn s = 0,23
Sai số tương đối RSD = 0,1 %
Phương pháp này kiểm tra đúng bằng phương pháp thêm chuẩn, kiểm
chứng bằng test T với mức ý nghĩa p= 0,95.
Đinh lương Artesưnat trưc tiếp - detertor khúc xa kế (WHO) dư thảo
dươc điển quốc tế lần 3

- Pha tĩnh : Cột RP 18 ( 12,5cm X 3m m ) cỡ hạt 5|j.m

- Pha động : Acetolnitril đệm pH 3 (1:1) 12,5 cm X 3 mm X 5|IIĨ1
- Tốc độ dòng : 0,6 ml/ p h ú t.
- Nồng độ 0,4mg/l ml
- Thể tích tiêm : 20 Ịil
- Dung môi hoà tan mẫu : acetonitril

Trang 10


L U Ặ II A l l I . I Ạ C Z (

Phương pháp detector điện hoá [337
Dựa trên nguyên tắc cầu nối peroxyd trong phân tử Artesunat nên đã
tham gia vào qui trình khử trên bề mặt điện cực đặc hiệu. Quá trình đó
có thể tóm tắt theo sơ đồ sau:

Dựa vào nguyên tắc này Acton đã triển khai phương pháp HPLC để định
lượng artemisinin và Artesunat ở nồng độ nanogam
2.1.5.3 Phươns pháp đo thể tích
al Phương pháp chuẩn đo trong môi trường nước Tiêu chuẩn dự thảo
của Cty DLTW1.
Trong phân tử của Artesunat còn một nhóm chức acid tự do nên người ta
có thể định lượng nhóm chức này bằng dung dịch chuẩn độ NaOH 0,5 N
(dung dịch chuẩn) với chỉ thị là Phenolphtalein

bỉ Phương pháp định lượng trong môi trường khan : Để tăng độ tin cậy
người ta thay nước bằng dung môi khan [33]
Hoà tan khoảng 0,19 g chế phẩm trong 30 ml Ethanol tuyệt đối, chuẩn

độ bằng dung dịch chuẩn tetrabutylamonium hydroxide 0,1 N trong 2 propanol. Điểm kết thúc của phép định lượng được phát hiện bằng chỉ
thị tím tinh thể trong acid acetic khan hoặc bằng kỹ thuật chuẩn độ đến
điểm dừng (dead stop titration).
Trang 11


I Ái i iI ;-\C

J (

Phương pháp này cho độ chính xác cao.

2.1.5 4 Các vhương pháp đinh lươns khác :
Cầu nối peroxyd nội phân tử của Artesunat thể hiện sự đáp ứng cao trên
máy cực phổ.
Hãng Metrohm đã cho ra trang WEB trên mạng Internet phương pháp
định lượng Artesunat như sau: [ www.metrohm.com]

Metrohm Application Note
Voltammetry and Polarography [ V-53 ]
Artemisin and Artesunat in Standard
Summary:

Determination of Artemisin and Artesunat in
standard

Sample:

Standard 99%

Sample
Dilution in methanol 75%
Preparation:
Artesunat
Electrolyte:

Ammoniumsulfate and methanol

AE:

Pt....................................................

RÈ:

Ag/AgCl/LiQ sat. in ethanol

Parameters

DPPOL (-50 mV), DME
Ustart = +200 mV
u end= -500 mV
Ep (Artesunat) = +20 mV

Trang 12


LUÀÌI A lt I . i- y : z i

Determination of Artesunat
METRDHM €93 v« PROCESSOR (5.693.0021) ===========

Method
Mode
Run
Curve

a r t e a is i

DPHODE
3'
smoothed

User
i B.Reifler
Deter*!.
04181642

Date : 9+-0+-18
Ti»e ! 10:4 2 :15

Segment : art

V R

* 0

I/nft

0

-5 8

-1 0 0

-1 5 8

2.1.6 Tap chất và cách xác đinh:
Do Artesunat được bán tổng hợp từ Antemisinin qua sản phẩm trung
sian là DHA nên tạp chất liên quan thường là DHA do đó TCN của nước
ta và một số TCCS thường lấy DHA làm chất chuẩn để xác định tạp chất
trong Artesunat ( nguyên liệu và thành phần chứa Artesunat)
Mặt khác Artesunat trong bảo quản có thể bị thuỷ phân tạo ra tạp chất và
lượng tạp đến một giới hạn nhất định có thể phát hiện được bằng sắc ký
lớp mỏng hoặc HPLC
2.1.6.1 Theo dư thảo dươc điển guốc tế lần 3 ợui đinh cách xác đinh tap
chất như sau :
al Phương pháp sắc kỷ lớp mỏng :
• Pha tĩnh : Bảng Silicagel G
• Pha động Cloroform : Methanol (8:2)
• Dung dịch chấm sắc ký :
Hoà tan 40 mg nguyên liệu Artesunat trong 10 ml
cloroform (dung dịch A).

Trang 13


V -ỈẬ II A l l

Zi

1 ml dung dịch A hoà tan trong 100 ml cloroform (dung

dịch B).
Triển khai sắc ký, quan sát sắc ký đồ thu được và biện luận kết quả. Bất
cứ vết nào xuất hiện ngoài vết chính của dung dịch A không được thẫm
hơn và lớn hơn vết của dung dịch B
b/Phương pháp HPLC:
•

Pha tĩnh : Cột RP 18 5 Jim (12,5 cm x3,5 mm)

•

Pha động: acetonitrile - đệm pH3 (1:1)

•

Dung môi hoà tan mẫu : acetonitril

• Tốc độ dòng ; 0,6 ml/phút:
•

Dung dịch A : 4mg nguyên liệu Artesunat trong lm l cloroform

•

Dung dịch B : 0,04 mg nguyên liệu artersunate trong lm l cloroform.

Thời gian lưu của hai dung dịch không được lệch nhau 0,1 phút
Tổng điện tích pic ngoài pic chính của dung dịch A ( Loại trừ pic của
dung m ô i) không lớn hơn điện tích pic của dung dịch B tưc là tạp chất
không quá 1 %.

Tổng diện tích pic ngoài pic chính của dung dịch A không lớn hơn 2 lần
diện tích pic của dung dịch B tức là tạp chất không quá 2 %
2.1.6.2 Tiêu chuẩn ngành qui đinh xác đinh tay chất bằng sắc ký lớv
mỏng.
Pha tĩnh:

Bản mỏng silieagel - hoạt hoá ở 100° trong 1 giờ

Pha động:

Cloroform: Methanol (8:2)

Dung dịch chấm sắc ký:
Dung dịch (1):

0 ,lg Artesunat hoà trong 10ml cloroform

Dung dịch (2):

0,lg Artesunat chuẩn hoà trong 10ml cloroform

Dung dịch (3): Dung dịch đối chiếu DHA 0,01% trong clorform

Trang 14


I

VJAt I Ai I J* ỈAC

Chấm riêng biệt 10

jllI

rj (

dung dịch l,2,31ên bản mỏng. Triển khai sắc ký.

Lấy bản mỏng ra và để khô ở nhiệt độ phòng sau đó phun thuốc thử
vanilin 2% trong acid sulfuric. Sấy khô ở 105° trong 15'.
Đánh giá kết quả: Vết DHA (vết thứ hai) trên sắc ký đồ thu được của
dung dịch (1) không được thẫm hơn vết DHA của dung dịch (3) đối
chiếu. Ngoài vết chính và vết tương ứng với DHA trên sắc ký đồ của
dung dịch (1) có thể có thêm một vết phụ nữa, vết này không được sẫm
màu hơn vết thứ 3 của dung dịch (2) đối chiếu.
2.1.6.2 Dư thảo DĐVN quy đinh tap chất bans SKLM.
Pha tĩnh : Bản mỏng Silicagel G
Pha động : Ethylacetat: Toluen (1:1)
Dung dịch chấm sắc ký :
Dung dịch thử : lOmg chế phẩm trong lm l cloroform
Dung dịch DHA chuẩn (1) : 0,1 mg DHA chuẩn trong lm l
cloroform
Dung dịch DHA chuẩn (2) : 0,05 mg DHA chuẩn trong lml
cloroform
Dung dịch Artesunat chuẩn : lOmg Artersunate chuẩn trong lm l
cloroform
Chấm 10ml mỗi dung dịch lên bản mỏng, triển khai sắc ký bản mỏng ra
và để khô ở nhiệt độ phòng sau đó phun thuốc thử vanilin 2% trong acid
sulfuric. Sấy khô ở 105°c trong 15 phút. Vết trong sắc ký đồ của dung
dịch thử tương ứng với vết DHA không được đậm mầu hơn vết trên sắc

ký đồ của dung dịch DHA chuẩn (1). Ngoài vết chính và vết tương ứng
với DHA trên sắc ký đồ của dung dịch thử không được có vết mầu đậm
hơn mầu của vết trong sắc ký đồ của dung dịch DHA chuẩn (2).

Trang 15


”Ạ|| All I.;-\r.‘i'<

2.2 TỔNG QUAN VỂ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ĐỘ
ỔN ĐỊNH CỦA THUỐC
2.2.1 Khái niêm về đô ổn đinh của thuốc :
Độ ổn định của thuốc là khả năng của thuốc được bảo quản trong đồ bao
gói chuyên dụng, bảo quản trong điều kiện xác định vẫn giữ nguyên
được đặc tính vốn có về vật lý, hoá học vi sinh, đặc tính trị liệu và độc
dược trong một khoảng thời gian nhất định [4].

2.2.2 Các yếu tố ảnh hươns đến đô ổn đinh của thuốc :
Độ ổn định của thuốc chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố trong đó hai yếu
tố chủ yếu là :
•

Yếu tố nội tại ( ngay trong chế phẩm )

•

Yếu tố ngoại cảnh

Yếu tố nội tại bao gồm :
- Cấu trúc phân tử của nguyên liệu

- Nông độ hoạt chất của thuốc
- Sản phẩm phân huỷ và tạp chất trong nguyên liệu ( độ tinh khiết của
nguyên liệu )
- Nước kết tinh: Trong quá trình sản x u ấ t, bảo quản một phần nước kết
tinh bị mất đi làm suy yếu mạng tinh thể nên làm giảm tính bền vững
của dược c h ấ t.
Yếu tố ngoại cảnh : ( điều kiện bảo quản )
- Nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng gây phân huỷ thuốc.
- Ánh sáng : một số chất bị phân huỷ dưới tác động của ánh sáng,
thường là làm tăng tốc độ oxi hoá - khử hoặc chuyển dạng đồng phân
- Độ ẩm : Độ ẩm cao thúc đẩy nhanh sự phân huỷ do phản ứng thuỷ
phân và làm thay đổi tính chất lý học của thuốc ,
- Không khí : Oxy và Carbondioxyd

Trang 16


liẠii All I.ÌẠ'; zi

- ĐỒ bao g ó i: Chất lượng nguyên liệu có thể bị ảnh hưởng bởi độ kiềm
của thuỷ tinh, đồ bao gói kim lo ạ i, các nhựa polyme và các nút cao su

2.2.3 Vài nét về đăc điểm khí hâu Viêt nam và sư ảnh hưởng của
khí hâu đến đô ổn đinh của thuốc :
Lãnh thổ Việt nam nằm hoàn toàn trong vùng nội chí tuyến - Vùng nhiệt
đới bắc bán cầu do đó khí hậu Việt nam là khí hậu nhiệt đới gió mùa có
thuộc tính cơ bản là : Nóng ẩm . Tổng bức xạ mặt trời vào khoảng 125135 Kcal/cm3 . Đề cương của chương trình thử ổn định cần quan tâm đến
thị trường dự kiến và điều kiện khí hậu của vùng mà trong đó sản phẩm
thuốc sẽ được lưu hành. Bốn vùng khí hậu đựơc phân chia cho mục đích
thử độ ổn định trên thế giới như sau [31] :

Vùng Đặc điểm

Số liệu ngoài Số liệu trong
trời
t°TB

Số liệu tính toán

kho bình quân

% RH

°c

% RH

°c

%

Cmkt

RH

năm °c

I

On hoà

n

Cận nhiệt đới

m
IV

10.9

75

18.7

45

20

20

42

17

70

21.1

52

21.6

22

52

Nóng & khô

24.4

39

26

54

26.4

27.9

35

Nóng & ẩm

26.5

77

28.4

70

26.7

27.4

76

Việt nam thuộc vùng khí hậu số IV với nhiệt độ trung bình năm vào
khoảng 27 0 c và độ ẩm khoảng 75 % do đó uu
có ia.1
rất nhiều
I1IUCU trở
II u ngại
Iigại trong
u u iig
công tác bảo quản thuốc. Vì vậy mà đối với từng
ìmg loại thuốc phải có quy
định bảo quản trong điều kiện và bao gói nhcất^đinh7càC vkho thuốc và
•p '

\

\

kho nguyên liệu làm thuốc phải có qui địn ;đậc biệt khác ì^ẳn với bảo
quản những hàng hoá khác .

.
‘ÍTHƯ-VlỆS-ị

:\ r U T a

Theo số liệu của Tổng cục thuỷ văn, số liệu về

và độ ẩm trung

bình cho từng tháng ở Hà nội năm 1995 như sau [20]:
Trang 17


Nhiệt độ trung bình

°c & độ ẩm RH % năm 1995

1

2

3

4

5

6

7

Nhiệt độ °c

17,5

16,4

19,4

24,2

27,3

29,8

29,3

28,1

độ ẩm RH %

80

80

83

87

79

79

81

85

Tháng

8

10

11

12

28,0

26,7

20,8

17,9

70

72

73

71

9

Có thể chấp nhận nhiệt độ trung bình năm ở Hà nội là 23,9°c , độ ẩm
trung bình năm là 80,5%.

2.2.4 Đ ôns hoc của phản ứng phân huỷ thuốc và viêc đánh giá
đô ổn đinh của thuốc: Í41 ỉ101
Trong quá trình bảo quản dưới tác động của nhiều yếu tố trong thuốc sẽ
xảy ra các thay đổi về mặt hoá học, lý học và sinh học làm giảm chất
lượng của thuốc.
Biến đổi hoá học là nguyên nhân quan trọng nhất. Các phản ứng hoá học
gây ra phân huỷ thuốc làm giảm hàm lượng và xuất hiện các sản phẩm
phân huỷ gây độc hại.
Nghiên cứu sự phân huỷ thuốc chủ yếu là nghiên cứu về hoá học, ở đây
chỉ đề cập đến tốc độ phản ứng .
Tốc độ phản ứng là sự biến đổi nồng độ của các chất tham gia phản ứng
theo thời gian.
Ta có phương trình phản ứng :

----------- ►

nA + mB
Gọi

V là

tốc

độ

phản ứng ta

có

n’A ’ +m’B’

:

y _ dC A _ dCB _ dCA _ dCH

dt

dt

dt

dt

Tốc độ phản ứng tỷ lệ với nồng độ các chất trong phản ứng:

Trang 18


L U Ặ II A l l i . ; ạ c z i

v = -kC;CB
n = - k (m+n)[ A Ỵ [ B r

[A ], [B] : nồng độ chất A và B
k: hằng số tốc độ

Phản ứng trên được gọi là phản ứng bậc m+n, như vậy bậc của phản
ứng phụ thuộc vào tốc độ phản ứng và nồng độ các chất tại thời điểm
nghiên cứu.

2.2.5 Đánh eiá đô ổn đinh của thuốc:

1

2.2.5.1. Khái niêm :
Nghiên cứu độ ổn định của thuốc là việc đánh giá những kết quả thí
nghiệm về lý hoá, sinh học của thuốc khi được bảo quản ở những điều
kiện nhất định, trong những khoảng thời gian xác định.
Kết quả của việc nghiên cứu độ ổn định được sử dụng để thiết lập tuổi
thọ của thuốc trong thị trường mà thuốc được lưu hành và đưa ra điều
kiện bảo quản thích hợp
Việc nghiên cứu độ ổn định của thuốc là do các nhà máy, xí nghiệp
sản xuất hay các cơ sở nghiên cứu ra sản phẩm thực hiện.
Việc làm này là cả một quá trình từ giai đoạn phát triển sản xuất
(nghiên cứu sản phẩm ) làm hồ sơ để đăng ký thuốc tại cơ quan quản lý
và cả giai đoạn sau đăng ký.
Nhà sản xuất phải tiến hành nghiên cứu độ ổn định của thuốc ở điều
kiện cấp tốc và điều kiện bình thường để chứng minh hạn dùng và điều
kiộn bảo quản đã được dự kiến trước. Hồ sơ về độ ổn định phải được độ
trình theo yêu cầu của Bộ Y tế ở bất kỳ thòi gian nào nếu cần.
Thông thường trước khi đưa một sản phẩm mới ra thị trường thì sản
phẩm đó phải được nghiên cứu sự ảnh hưởng của điều kiện bảo quản, khi
lưu hành trên thị trường ( nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm ...) đối với mức độ
biến đổi chất lượng.
Việc đánh giá chất lượng của mẫu nghiên cứu dựa trên các chỉ tiêu chất
lượng của dược điển các nước , của TCKT hay TCCS.

Trang 19


Đánh giá độ ổn định của thuốc thường sử dụng một số chỉ tiêu có ý
nghĩa n h ư :
- Định lượng hoạt chất và tạp chất phân huỷ
- Quan sát sự biến đổi lý học, độ bền vững của dạng thuốc .
- Độ hoà tan.
- Thử độc tính cấp
- Nếu có thể thử tác dụng điều trị
Tất cả các phương pháp phân tích sử dụng để đánh giá độ ổn định phải
có độ chính xác, độ nhạy và độ chọn lọc cao, thông thường là áp dụng
phương pháp phân tích đã qui định trong dược điển hoặc tiêu chuẩn chất
lượng, song tuỳ theo từng trường hợp cụ thể mà người nghiên cứu phải
chọn phương pháp đánh giá cho thích hợp.
Từ việc nghiên cứu độ ổn định của thuốc rút ra kết luận từ các vấn đề
sau nhằm nâng cao hạn dùng của thuốc
- Công thức bào chế thích hợp
- Bao bì đóng gói thích hợp
- Điều kiện bảo quản thích hợp
Thông thường nghiên cứu độ ổn định thường sử dụng các phương pháp:
-

Phép thử dài hạn (long term stability testing)

-

Phép thử cấp tốc (accelerated stability testing)

2.2.5.2 Nehiên cứu đô Ổn đinh của thuốc ở điều kiên bình thường (phép

thử dài han )
a/ Theo khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới WHO thì thuốc phải được
xác định tuổi thọ trong điều kiện bảo quản thực nghiệm gần với điều
kiện bảo quản thực tế trong hệ thống phân phối thuốc. Điều đó có nghĩa
là khi xây dựng đề cương nghiên cứu cần quan tâm đến tính ổn định của
hoạt chất có trong mẫu nghiên cứu và vùng khí hậu mà dự kiến thuốc sẽ
lưu hành.
Trang 20


I Ai I li ÍẠC ù ỉ

Theo qui định chung thì đối với các dạng thuốc bình thường khi tiến
hành nghiên cứu độ ổn định ở điều kiện bình thường được bảo quản ở
điều kiện như sau :
- Nhiệt độ 25 ±2 °c
- Độ ẩm tương đối 70 ± 5 %
- Thời gian kiểm định 3 tháng một lần
Thời gian tối thiểu 1 năm với mục tiêu phục vụ lập hồ sơ đăng ký. Sau
khi đăng ký nhà sản xuất phải tiếp tục nghiên cứu tuổi thọ của sản phẩm
và đệ trình toàn bộ hồ sơ này cho cơ quan quản lý dược nếu có yêu cầu.
Các nhà sản xuất được khuyên nên áp dụng điều kiện khí hậu vùng II
khi dự định thị trường thuốc lưu hành có khí hậu ôn hoà. Đối với những
nước mà ở đó chắc chăn thuộc vùng khí hậu II hoặc III và có ý định dự
kiến thị trường toàn cầu thì chương trình thử ổn định được nêu ra phải
trên cơ sở điều kiện phù hợp với vùng điều kiện IV.

bỉ Đánh giá tuổi thọ : bất cứ một chỉ tiêu nào trong tiêu chuẩn chất
lượng tại thời điểm kiểm tra không đạt yêu cầu thì phép thử được kết
thúc, kết luận hạn dùng của thuốc là khoảng thời điểm kể từ khi bắt đầu

sản xuất đén thời gian kiểm tra lần cuối cùng mà lô thuốc khi kiểm tra
vẫn đạt yêu cầu
Phương pháp này được nhiều cơ sở sản xuất và nghiên cứu áp dụng để
thử tuổi thọ của thuốc.
Ưu điểm của nó là không đòi hỏi điều kiện bảo quản nghiêm ngặt, kết
luận về hạn dùng là tương đối chính xác, song đòi hỏi thời gian theo dõi
khá d à i.
2.2.53 Phươns pháp thử ổn đinh cấy tốc ( lão hoá cấy tốc ì
Phương pháp này đượcWHO thừa nhận để thử độ ổn định của thuốc
aỉ Nguyên tắc chung của phương pháp :

Trang 21


LUẶII Á i l lilẠC

Phương pháp “ lão hoá cấp tốc “ là phương pháp nghiên cứu độ ổn định
cuả thuốc trong điều kiện khắc nghiệt thúc đẩy nhanh sự phân huỷ của
thuốc, Mẫu thử được bảo quản trong điều kiện thực nghiệm có tăng
cường các tác nhân kích thích sự phân huỷ. Sau những khoảng thời gian
xác định mẫu thử được đem phân tích chất lượng - Căn cứ vào kết quả
phân tích ở các điều kiện bảo quản khác nhau tính toán được gần đúng
tuổi thọ của thuốc.

bỉ Mục tiêu của phương pháp :
•

Phát hiện nhanh mức độ phân huỷ của thuốc có trong những

công thức bào chế khác nhau nhằm lựa chọn công thức bào chế

thích hợp < trên quan điểm về độ ổn định>
Công thức 1
Tạp phân
huỷ
(Sự giảm
hàm lượng)

Công thức 2

Công thức 3
— ►

Thời gian

Trang 22


L'J-'.II A ll h ; - \ c Z (

•

Dự đoán thời gian hữu hiệu của thuốc đó là thời gian mà chế

phẩm vẫn giữ được chất lượng bảo quản ở điều kiện khác nhau

Tạp phân huỷ
(Sự suy giảm hàm

• Lựa chọn điều kiện bảo quản để có thời gian hữu hiệu cuả thuốc
theo mons muốn.

Tạp phân huỷ

Trang 23


LUẠIÌ A l l

i .; ạ c

-a

cì Cấc tác nhân lão hoá bao gồm:
* Nhiệt độ thúc đẩy tốc độ phản ứng phân huỷ thuốc, tuy nhiên đối
với mỗi loại thuốc cần xác định nhiệt độ bảo quản giới hạn tránh làm
thay đổi trạng thái của dạng thuốc và gây ra những phản ứng không xảy
ra ở điều kiện thường. Khi nhiệt độ bảo quản ở điều kiện cao hơn, các
phản ứng phân huỷ thuốc diễn ra nhanh hơn do đó làm giảm thời gian
cần thiết nghiên cứu độ ổn định của thuốc . Với kết quả thu được có thể
giải quyết vấn đề ngược lại nghĩa là xác định nhiệt độ bảo quản tối ưu
đảm bảo hạn dùng của thuốc đề ra.
Tuổi thọ H ở nhiệt độ bảo quản bình thường (t0) liên quan với tuổi thọ
thực nghiệm Htn ở nhiệt độ nâng cao ttn theo phương trình:

H= K. Htn

k: hê số tương quan =

(1)

-ft?- -Qàí
A 10 = A 10

A : hệ số nhiệt độ của tốc độ phản ứng hoá học khi nhiệt độ tăng thêm
10 ° c .
Phương trình trên dựa trên nguyên lý Vant-hoff (tốc độ phản ứng hoá
học tăng 2-3 lần khi nhiệt độ tăng lên 10°C)
Theo một số tài liệu A=2, hệ số A có thể đượcxác

địnhbằng

thực

nghiệm hoặc đuợc dự đoán trên cơ sở phương trình Arrhenius cho độ
chính xác cao hơn như sau :
log K = log ,4------ —--2,303RT

Trong đó E : Năng lượng hoạt hoá (kcalo/mol)

R : Hằng số khí ( 1,987 calo / 0 c mol)
T° : nhiệt độ tuyệt đ ố i0 K ( t° c + 273 0 C)

Trang 24