Nghiên cứu định lượng riboflavin natri phosphat natrazolin nitrat clorpheniramin maleat pyridoxin hydroclorid và dexphanthenol trong thuốc nhỏ mắt naphacollyre b complex bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁ O DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC

BỘ Y TÊ

Dược HÀ NỘI

PHAN T H Ị THÙY CH I

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG RIBOFLAVIN NATRI
PHOSPHAT, NAPHAZOLIN NITRAT, CLORPHENIRAMIN
MALEAT, PYRIDOXIN HYDROCLORID VÀ
DEXPANTHENOL TRONG THUỐC NHỎ MẮT
NAPHACOLLYRE B-COMPLEX Bằ NG SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC s ĩ

Dược HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM n g h iệ m THUỐC - ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60 73 15

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Thái Phan Quỳnh Như
CH

HÀ N Ộ I-2 0 0 5


LỜ I CẢM Ơ N
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Thái Phan

Quỳnh Như đ ã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Viện Kiểm nghiệm,
tập th ể cán bộ phòng H óa lý 1 - Viện Kiểm nghiệm đ ã quan tâm, tạo
điều kiện thuận lợi đ ể tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập và nghiên
cứu trong thời gian qua.
]ũn trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, cảm ơn các
thầy cô trong Phòng Đ ào tạo sau đại học, Bộ môn Phân tích cùng
các Bộ môn khác của Trường Đ ại học Dược H à nội đ ã tạo điều kiện
tốt cho tôi trong thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng xin cảm ơn gia đình và bạn bè đ ã luôn động viên,
khích lệ và giúp đỡ tôi tận tình.

Phan Thị Thùy Chỉ


MỤC LỤC
Trang
NHỮNG CHỮ V IẾ T TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VÂN ĐỂ

1

Phần 1. TỔNG QUAN

3

1.1. Vài nét về riboflavin natri phosphat, naphazolin nừrat,

3

clorpheniramin maleat, pyridoxin hydrodorid và dexpanthenol.
1.2. Một s ố phương pháp được áp dụng đ ể định lượng riboflavin

8

natrỉ phosphat, naphazolin nitrat, clorphenỉramin maleat,
pyridoxin hydroclorid và dexpanthenoỉ.
Phần 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

22

NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu

22

2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

22

2.2.1. Lựa chọn dung môi để pha mẫu

22

2.2.2. Xây dựng phương pháp HPLC để phân tích định tính và

23

định lượng B2, NP, CM, B5 và B6 trong thuốc nhỏ mắt
Naphacollyre B-complex.
2.2.3. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả

25


Phần 3. THỰC N G H IỆM , K ÊT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

27

3.1. Lựa chọn dung mồi đ ể pha mẫu
3.2. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng B2, NP,
CM, B5 và B6 trong thuốc nhỏ mắt Naphacollyre B-complex
bằng phương pháp HPLC.
3.2.1. Dụng cụ - Hoá chất - Mẫu thử
3.2.2. Khảo sát chọn điều kiện sắc ký
3.2.3. Xây dựng và đánh giá phưcfng pháp định tính, định lượng

27
29
33

B2, NP, CM, B5 và B6 trong thuốc nhỏ mắt Naphacollyre
B-complex.

49

3 3 . Bàn luận.

3.4. Áp dụng phương pháp đã xây dựng đ ể định lượng B2, NP,

2

ị

CM, B5 và B6 trong một s ố lô thuốc nhỏ mắt Naphacollyre
B-complex.

KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT

53

TÀI LIỆU TH AM KH ẢO

55

PHU LUC


NHŨNG CHỮ V IẾT TẮT

BP

: Dược điển Anh.

B2

: Riboflavin natri phosphat.

B5

: Dexpanthenol.

B6

: Pyridoxin hydroclorid.

DĐVNIII

: Dược điển Việt Nam, lần xuất bản thứ 3 - 2002.

CM

: Clorpheniramin maleat

HPLC

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao.

JP

: Dược điển Nhật

NP

: Naphazolin nitrat.

SKS

: Số kiểm soát.

USP

: Dược điển Mỹ.


DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Ký hiệu

Nội dung

T rang

1

Bảng 3.1

Hệ số match so sánh giữa phổ chuẩn và thử.

34

2

Bảng 3.2

Kết quả khảo sát tính thích hựp của hệ thống.

39

3

Bảng 3.3

Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của B2,
NP, CM, B5 và B6.

40

4

Bảng 3.4

Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp
định lượng B2, NP, CM.

45

5

Bảng 3.5

Kết quả khảo sát độ lặp lại của phucfng pháp
định lượng B5 và B6.

46

6

Bảng 3.6

Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
định lượng B5 và B6.

47

7

Bảng 3.7

Kết quả khảo sát độ đúng của phưcmg pháp
định lượng B2, NP, CM.

48

8

Bảng 3.8

Một số kết quả khảo sát áp dụng phương pháp

52

định lượng B2, NP, CM, B5 và B6.


DANH MỤC CÁC HÌNH

STT

Ký hiệu

Nội dung

T rang

1

Hình 1.1

Giản đồ sắc ký hai chất 1 và 2.

12

2

Hình 3.1

Phổ hấp thụ UV-VIS trong pha động của B2.

30

3

Hình 3.2

Phổ hấp thụ UV-VIS trong pha động của NP.

30

4

Hình 3.3

Phổ hấp thụ UV-VIS trong pha động của CM.

31

5

Hình 3.4

Phổ hấp thụ UV-VIS trong pha động của B6.

31

6

Hình 3.5

Phổ hấp thụ UV-VIS trong pha động của B5.

31

7

Hình 3.6

Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn B2, NP và CM.

35

8

Hình 3.7

Sắc ký đồ của dung dịch thử B2, NP và CM.

35

9

Hình 3.8

Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn B6 và B5.

36

10

Hình 3.9

Sắc ký đồ của dung dịch thử B6 và B5.

36

11

Hình 3.10

So sánh phổ UV-VIS của B2 trong mẫu chuẩn
và thử.

37

12

Hình 3.11

So sánh phổ UV-VIS của CM trong mẫu
chuẩn và thử.

37

13

Hình 3.12

So sánh phổ UV-VIS của NP trong mẫu chuẩn
và th ử .

37

14

Hình 3.13

So sánh phổ UV-VIS của B6 trong mẫu chuẩn

và thử.

38

15

Hình 3.14

So sánh phổ UV-VIS của B5 trong mẫu chuẩn
và th ử .

38

16

Hình 3.15

Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của
vitamin B2.

41


17

Hình 3.16

Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của
naphazolin nitrat.

41

18

Hình 3.17

Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của
clorpheniramin maleat.

42

19

Hình 3.18

Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của
vitamin B5.

42

20

Hình 3.19

Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của
vitamin B6.

43

ĐẶT VÂN ĐỂ

Trong những năm gần đây do môi trường sống ngày càng bị ô nhiễm
nên các bệnh về mắt ngày càng gia tăng. Các loại thuốc nhỏ mắt đơn thành
phần không còn đáp ứng được nhu cầu điều trị trong chuyên khoa mắt. Các
nhà bào chế dược phẩm đã cho ra đời rất nhiều các chế phẩm thuốc nhỏ mắt
kết hợp nhiều dược chất khác nhau để đáp ứng nhu

cầu phòng vàchữa các

bệnh khác nhau về mắt. Các biệt dược thuốc nhỏ mắt

đa thành phần được sản

xuất, lưu hành và sử dụng rất nhiều ở nước ta như: Virondo của Xí nghiệp dược
phẩm trung ưcfng II; Pinkle của Hanil Pharmaceutical Corporation; Tobirob
của Ahn Gook Pharmaceutical Corporation; Kodomo và V.Rohto của Rohto
Pharmaceutical Corporation v.v. Tuỳ theo mục đích điều trị mà các nhà sản
xuất đã phối hợp các thành phần hoạt chất khá đa dạng trong công thức bào
chế.
Công ty cổ phần dược phẩm Nam Hà nghiên cứu sản xuất chế phẩm
thuốc nhỏ mắt Naphacollyre B-complex với công thức bào chế như sau:
Naphazolin nitrat (NP)

25mg

Clorpheniramin maleat (CM)

20mg

Riboflavin (dạng natri phosphat) (B2)

lOmg

Pyridoxin hydroclorid (B6)

50mg

Dexpanthenol (B5)

lOOmg

Nước cất và tá dược vừa đủ

lOOml

Biệt dược này là sản phẩm dựa trên sự phối hợp tác dụng dược lý của các
chất co mạch, giảm viêm, chống dị ứng, giảm ngứa, lành vết loét, bảo vệ niêm
mạc mắt. Thuốc được chỉ định khi nhức mỏi mắt, mờ mắt, xung huyết kết mạc,


ngứa mắt, được dùng để dưỡng mắt, phòng các bệnh về mắt khi bơi lội hoặc do
bụi, mồ hôi lọt vào mắt.
Thuốc đa thành phần này là sản phẩm mới, không có trong các Dược
điển hiện hành nên chưa có phương pháp để kiểm nghiệm đánh giá chất lượng.
Để giúp cho cơ sở tiêu chuẩn hoá sản phẩm, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu
định tính và định lượng riboflavin natri phosphat, naphazolin nitrat,
clorpheniramin maỉeat, pyridoxin hydroclorid và dexpanthenol trong thuốc
nhỏ mắt Naphacollyre B-complex bằng phương pháp HPLC ” nhằm đánh giá
chất lượng của thuốc trong sản xuất và lưu thông phân phối.

- Mục tiêu của công trình là:
Xây dựng phương pháp định tính và định lượng B2, NP, CM, B6 và B5
trong thuốc nhỏ mắt Naphacollyre B-complex đủ tin cậy, nhanh chóng, thuận
tiện nhằm góp phần nâng cao khả năng kiểm tra chất lượng thuốc trong quá
trình sản xuất và lưu hành.
- Công trình thực hiện các nội dung sau:
+ Xây dựng chương trình sắc ký thích hợp cho phép tách và định lượng
năm thành phần này.
+ Đánh giá phưofng pháp đã xây dựng.
+Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng một số lô sản phẩm.


TỔNG QUAN

PHẦN 1.
1.1.

Vài

nét

về

riboflavin

natri

phosphat,

naphazolin

nitrat,

clorpheniramin maleat, pyridoxin hydroclorid và dexpanthenol
1.1.1. Naphazolin nitrat
Tên khoa học : 2-(l-naphthylmetyl )-2-imidazolin nitrat.
Công thức phân tử : C14H14N2.HNO3.
Phân tử lượng : 273,3.
Công thức cấu tạo :

HNO,

Tính chất:
Naphazolin nitrat có dạng bột kết tinh trắng hay gần như trắng. Hơi tan
trong nước, tan trong ethanol 96%, thực tế không tan trong ether.
Đặc tính p h ổ hấp thụ tử ngoại:
Trong môi trường acid hydrocloric 0,0 IM naphazolin nitrat có 4 cực đại
hấp thụ ở 270nm (E l% ,lcm = 215), 280nm (E l% ,lcm = 250), 287nm
(E l% ,lcm = 175) và 291nm (E l% ,lcm = 170) [1], [17].
Đặc tính p h ổ hấp thụ hồng ngoại:
Phổ hấp thụ hồng ngoại của naphazolin có các đỉnh chính đặc trưng ở
các số sóng sau:1615, 780, 1499, 791, 1211, 800 [18].


Tác dụng và công dụng :
Naphazolin có tác dụng chống xung huyết và được dùng phối hợp điều
trị viêm kết mạc [3].
1.1.2. Clorpheniramin maleat
Tên khoa học: (RS)-3-(4-clorophenyl)-3-(2-pyridyl) propyl- dimethylamin
hydrogen maleat.

Công thức phân tử : CjgHigClNj. C4 H 4 O4 .
Phân tử lượng : 390,9.
Công thức cấu tạo :
'NM62

N H/,

^COOH

^Cl

^COOH

Tính chất:
Clorpheniramin maleat có dạng bột kết tinh trắng, không mùi, vị đắng.
Dễ tan trong nước, tan trong cloroform, ethanol 96%, khó tan trong ether.
Đặc tính p h ổ hấp thụ tử ngoại:
Trong môi trường acid hydrocloric 0,1M có cực đại hấp thụ ở 265nm
(E l% ,lcm = 200 -220) [1], [17], [21].
Đặc tính p h ổ hấp thụ hồng ngoại:
Phổ hấp thụ hồng ngoại của clorpheniramin maleat có các đỉnh chính
đặc trưng ở các số sóng sau: 1585, 1086, 746, 1010, 830, 1562 [18].
Tác dụng và công dụng :
Clorpheniramin maleat có tác dụng chống dị ứng, dùng để điều trị viêm
kết mạc dị ứng [2].


1.1.3. Riboflavin natri phosphat

Riboflavin natri phosphat là hỗn hợp chứa chủ yếu Riboflavin 5 ’- natri

hydrogen phosphat và các riboflavin natri monophosphat khác.
Công thức phân tử : Ci7 H 2 oN4 Na 0 9 P.2 H 2 0 .
Phân tử lượng : 514,4.
Công thức cấu tạo :

C H 2 -0 — 1>— ONa

Tính chất:
Riboflavin natri phosphat có dạng bột kết tinh màu vàng hay vàng cam,
dễ hút ẩm. Tan trong nước, rất khó tan trong ethanol 96%, thực tế không tan
trong ether.
Đặc tính p h ổ hấp thụ tử ngoại:
Trong môi trường đệm phosphat pH 7,0 có cực đại hấp thụ ở 266 nm
(E l% ,lcm = 580 - 640) [17], [21].
Đặc tính p h ổ hấp thụ hồng ngoại:
Phổ hấp thụ hồng ngoại của riboflavin có các đỉnh chính đặc trưng ở
các số sóng sau: 1544, 1575,1641,1715, 1235, 1070 [18].


Tác dụng và công dụng :
Riboflavin natri phosphat được dùng để phòng và điều trị thiếu
riboflavin. Nếu thiếu riboflavin có thể có những triệu chứng về mắt như ngứa
và rát bỏng, sợ ánh sáng và rối loạn phân bố mạch ở giác mạc [2]. Được chỉ
định để chữa quáng gà, viêm kết mạc, viêm loét giác mạc, chảy máu võng mạc
[3].
1.1.4. Pyridoxin hydroclorid
Tên khoa học;5-hydroxy-6-methylpyridin-3,4-dimethanol hydroclorid.
Công thức phân tử : CgHjjNOg. HCl.
Phân tử lượng : 205,6.
Công thức cấu tạo :

Me^
. HCI
CH pH

CHgOH

Tính chất:
Pyridoxin hydroclorid có dạng kết tinh trắng hoặc gần như trắng. Dễ tan
trong nước, khó tan trong ethanol 96%, thực tế không tan trong cloroform và
ether.
Đặc tính p h ổ hấp thụ tử ngoại:
Trong môi trường acid hydrocloric 0,1M có 1 cực đại hấp thụ ở khoảng
290nm (E l% ,lcm = 427). Trong môi trường đệm phosphat 0,025M có 2 cực
đại hấp thụ: một cực đại ở khoảng 248 - 256nm (E l% ,lcm = 175 - 195) và
một cực đại ở khoảng 320 - 327nm (E l% ,lcm = 345 - 365) [1], [17], [21].


Đặc tính p h ổ hấp thụ hồng ngoại:
Phổ hấp thụ hồng ngoại của pyridoxin hydroclorid có các đỉnh chính
đặc trưng ở các số sóng sau: 1277, 1212, 1015, 1540, 870, 1086 [18].
Tác dụng và công dụng :
Pyridoxin hydroclorid được dùng để phòng và điều trị thiếu vitamin B6
có thể dẫn đến các triệu chứng về mắt giống như thiếu vitamin B2 [2].
1.1.5. Dexpanthenol
Tên khoa học: (R)-2,4-dihydroxy-N-(3-hydroxypropyl)-3,3dimethylbutyramid.
Công thức phân tử : C9H19NO4.
Phân tử lượng : 205,3.
Công thức cấu tạo :

Tính chất:
Dexpanthenol có dạng chất lỏng sánh, dễ hút ẩm, không màu hay có
màu hơi vàng hoặc có dạng bột kết tinh trắng. Rất tan trong nước, dễ tan trong
ethanol 96%, khó tan trong ether ,
Đặc tính p h ổ hấp thụ tử ngoại:
Không có cực đại hấp thụ ở dải sóng từ 230 đến 360 nm [18].
Đặc tính p h ổ hấp thụ hồng ngoại:
Phổ hấp thụ hồng ngoại của dexpanthenol có các đỉnh chính đặc trưng ở
các số sóng sau: 1629, 1035, 1064, 1520, 1282, 1250 [18].
Tác dụng và công dụng :
Dexpanthenol được dùng tại chỗ để chữa ngứa và chữa bỏng, rát [2].


8

1.2. Một số phưong pháp định lượng riboflavin natri phosphat,
naphazolin nitrat, clorpheniramỉn maleat, pyridoxin hydroclorid và
dexpanthenol
Để định lượng naphazolin nitrat, clorpheniramin maleat, riboflavin natri
phosphat, pyridoxin hydroclorid và dexpanthenol người ta thường áp dụng các
phưcmg pháp sau;
1.2.1. Phương pháp chuẩn độ
Thường áp dụng để định lượng nguyên liệu
*. Naphazolin nitrat: Chuẩn độ môi trường khan bằng dung dịch acid percloric
0,1N. Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp đo thế [1], [17], bằng chỉ thị
tím tinh thể [30], [31].
*. Clorpheniramin maleat: Chuẩn độ môi trường khan bằng dung dịch acid
percloric 0,1N. Xác định điểm kết thúc bằng chỉ thị tím tinh thể [1], [25], [30],
[31], [32], bằng phương pháp đo thế [17], [21].
*. Pyridoxin hydroclorid: Chuẩn độ môi trường khan bằng dung dịch acid

percloric 0,1N với sự có mặt của dung dịch thuỷ ngân acetat. Xác định điểm
kết thúc bằng chỉ thị tím tinh thể [1], [17], [21], [25], bằng phương pháp đo thế
[30], [31].
*. Dexpanthenoh Chuẩn độ môi trường khan thừa trừ bằng dung dịch kali
biphtalat 0,1M. Xác định điểm kết thúc bằng chỉ thị tím tinh thể [32], bằng chỉ
thị naphthobenzein [17].
1.2.2. Phương pháp đo quang p h ổ tử ngoại khả kiến
Phương pháp này dựa trên định luật Lambert - Beer là mật độ quang của
dung dịch một chất ở một bước sóng nào đó tỉ lệ thuận với nồng độ và bề dày
của lớp dung dịch đem đo:
D = k .l.c


Trong đó: k là hệ số hấp thụ,

c

là nồng độ và 1 là bề dày của lớp dung

dịch đem đo.
Trong tniofng hợp

c

tính theo nồng độ phần trăm

(kl/tt), 1tính bằng cm

thì hệ số hấp thụ k được gọi là hệ số hấp thụ riêng, ký hiệu là A (l% ,lcm ) và
lúc này ta có:

D = A (l% ,lcm ). C.1
Phương pháp đo độ hấp thụ quang được áp dụng tương đối phổ biến
trong các dược điển như DĐ VN III, BP 2003, USP 26, JP 14 và một số tài liệu
khác để định lượng 5 thành phần trên trong các chế phẩm đơn thành phần hoặc
hỗn hợp bằng cách đo trực tiếp độ hấp thụ quang của dung dịch mẫu thử trong
môi trường thích hợp song song vói chuẩn hoặc so với A (1%, Icm) tại các
bước sóng xác định, hoặc đo độ hấp thụ quang của mẫu thử song song với
mẫu chuẩn sau khi tạo màu với thuốc thử thích hợp.
*. Clorpheniramin maleat: Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 264 nm hoặc
265nm trong môi trường acid, áp dụng để định lượng cloipheniramin maleat
trong các chế phẩm đơn thành phần [1], [17], [21], [25], [29], [30], [31], [32].
Các tác giả Nguyễn Việt Hoà, Trần Tử An và Thái Phan Quỳnh Như đã sử
dụng phương pháp tạo cặp ion chiết - đo quang để định lượng clorpheniramin
maleat trong thuốc đa thành phần: Clorpheniramin maleat được tạo cặp ion với
da cam methyl trong môi trường đệm acetat pH 4,6, sau đó được chiết bằng
cloroform và đo độ hấp thụ ở 422 ± 2 nm [7].
*. Pyridoxin hydroclorid: Đo độ hấp thụ ở bước sóng 290nm trong môi trường
acid, áp dụng để định lượng vitamin B6 trong các chế phẩm đơn thành phần
[1]» [17], [21], [25]. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 650nm sau khi tạo màu với
2,6-dicloroquinon clorimid [29], [32] hay với 2,6 dibromo-N-cloro-1,4-


10

benzoquinon monoimin [30], [31]. Reddy, M.N và cộng sự lại tạo màu với
dung dịch 3-methylbenzothiazolin-2-on hydrazon và ceii amoni sulfat, sau đó
đo độ hấp thụ ở bước sóng 620 nm [26].
*. Riboflavin natri phosphat: Đo độ hấp thụ ở bước sóng 444nm trong môi
trường natri aceat, áp dụng để định lượng vitamin B2 nguyên liệu và thuốc
tiêm đơn thành phần [17], [21], [25]. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 446nm trong

môi trường đệm phosphat pH = 4,0, áp dụng để định lượng vitamin B2 trong
thuốc tiêm vitamin B và

c [17]. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 445nm trong môi

trường acid acetic loãng, áp dụng để định lượng vitamin B2 nguyên liệu và
thuốc tiêm đofn thành phần [30], [31].
*. Dexpanthenol: Dexpanthenol không có cực đại hấp thụ tử ngoại nên không
định lượng được bằng cách đo trực tiếp độ hấp thụ quang. Mostafa A.M.
Shehata và cộng sự đã định lượng dexpanthenol trong mỹ phẩm và dược phẩm
bằng cách thuỷ phân dexpanthenol trong môi trường kiềm tạo thành ị3-alanol.
p-alanol được xác định bằng cách cho phản ứng với vanillin (thuốc thử
Duquenois) trong môi trường đệm Mcllvain pH 7,5, sau đó đo độ hấp thụ ở
bước sóng 406 nm; hoặc cho phản ứng với ninhydrin và đo huỳnh quang với
bước sóng kích thích là 385 nm và bước sóng phát xạ là 465 nm [23].
*. Naphazolin nitrat: Một số tác giả đã dùng phương pháp quang phổ tử ngoại
đạo hàm tỉ đối để định lượng naphazolin nitrat trong thuốc nhỏ mắt. Ngô Tuấn
Cộng và cộng sự đã định lượng naphazolin nitrat bằng cách lấy giá trị đạo
hàm bậc 1 của phổ tỉ đối ở bước sóng 226,12 nm khi có mặt cloramphenicol
[5]. Trịnh Văn Quỳ - Đặng Trần Phương Hồng đã định lượng naphazolin nitrat
bằng cách lấy giá trị đạo hàm bậc 1 của phổ tỉ đối ở bước sóng 239,4 nm khi
có mặt cloramphenicol và dexamethason natii phosphat [14]. Khadiga M.
Kelani đã định lượng đồng thời naphazolin hydroclorid và clorpheniramin


11

maleat trong thuốc nhỏ mắt và nhỏ mũi bằng cách lấy giá trị đạo hàm bậc 1 ở
bước sóng 295,5 nm khi xác định naphazolin hydroclorid và giá trị đạo hàm
bậc 2 ở bước sóng 261,7 nm khi xác định clorpheniramin maleat [22].

Nói chung phương pháp đo phổ tử ngoại khả kiến trực tiếp hoặc so sánh
với chuẩn chỉ được các dược điển sử dụng trong trường hợp định lượng các chế
phẩm đcrn thành phần. Trong trường hợp thuốc đa thành phần có thể tạo màu
với thuốc thử đặc trưng hoặc áp dụng phương pháp quang phổ đạo hàm để loại
ảnh hưởng của các thành phần khác có trong chế phẩm.

1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp
phân tích hoá lý dùng để tách, định tính và định lượng các thành phần trong
hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với hai pha luôn tiếp xúc
nhưng không trộn lẫn với nhau: pha tĩnh (được bao bên ngoài chất mang và
nhồi trong cột sắc ký) và pha động (dung môi rửa giải). Pha động cùng với
mẫu thử được bcfm qua cột dưới áp suất cao, các chất cần phân tích sẽ di
chuyển theo pha động qua cột với tốc độ khác nhau tuỳ theo ái lực của chúng
với hai pha và dẫn đến sự tách các chất. Sự tách này đạt được là do quá trình
phân bố, hấp phụ hoặc trao đổi ion...
Các chất sau khi ra khỏi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện là
detector. Tuỳ theo bản chất của chất cần phân tích mà sử dụng detector thích
hợp. Detector hay được sử dụng nhất là detector u v - VIS (phát hiện chất cần
phân tích dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại hoặc ánh sáng nhìn thấy
của chất cần phân tích ở một bước sóng xác định). Đường cong rửa giải sau
một qúa trình sắc ký được gọi là sắc ký đồ, nó thường có dạng như hình 1.1
[8], [13].


12

co m p o n a n ỉ

Ị

co m D o n o n ĩ 2

r__
'**

II

in je c t iD r i f m a k

Hình 1.1: Giản đồ sắc ký hai chất 1 và 2.
Trong đó:
to

(Thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống

sắc ký.
Ír (Thời gian lưu): Thời gian kể từ khi chất cần phân tích được bơm vào
cột cho đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.
Ir (Thời gian lưu thực) = tR - toô( (Độ lệch chuẩn): Độ rộng nửa pic tại các điểm uốn tương ứng.
©0 5

(Độ rộng pic ở nửa chiều cao) = 2,354ôf

©(,: Độ rộng đáy pic.
Thời gian lưu Ir là thông tin về mặt định tính của các sắc đồ, nó là một
hằng số đối với một cấu tử đã cho khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không
đổi. Để đặc trưng cho một chất thuận lợi hcfn người ta dùng hệ số dung lượng
k . Thường tính k theo công thức:
k’ = —

=

~ ^0 - Ỉ J L - l


13

Trên thực tế k' nằm trong khoảng từ 1-5 là tốt nhất, các giá trị k' lớn hơn
chỉ dẫn đến sự doãng pic, độ nhạy thấp và thời gian lưu kéo dài, k ’ thấp tương
ứng với chất bị rửa giải ở thời điểm gần với thời điểm bơm mẫu và do đó làm
giảm khả năng tách.
Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị k khác nhau và
được đánh giá thông qua thừa số chọn lọc hay hệ số chọn lọc a:
(k'2>k'i)

a =

Hiệu lực của cột sắc ký được biểu thị thông qua số đĩa lý thuyết trên cột
(N). Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức:

= 16

= 5,54

(O,0,5

Để đặc trưng cho mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký người ta
thường sử dụng độ phân giải R giữa 2 pic cạnh nhau. Độ phân giải giữa 2 pic
(pic số 1 và số 2) được tính theo công thức sau:

^0,5.1

*^0,5.2

Khi: R = 0,75 hai pic không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều.
R = 1,0 hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau khoảng 4%.
R = 1,5 hai pic tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ khoảng 0,3%.
Độ phân giải phụ thuộc hệ số kj (hệ số dung lượng của cấu tử ra sau), độ
chọn lọc a và số đĩa lý thuyết N của cột thông qua phương trình:

„_VĨV

a-1
a

R = - — X—

X-

ki

\ + k:


14

Như vậy, để tăng độ phân giải R ta có thể tăng N (dùng cột dài hơn hoặc
giảm tốc độ dòng pha động); tăng k ’2 (bằng cách thay đổi thành phần pha
động); tăng a (bằng cách thay loại pha tĩnh hoặc thay đổi thành phần pha

động).
T (hệ s ố bất đối xứng): cho biết mức độ đối xứng của pic trên sắc ký đồ.
rp _ ^0,05
2

/

f là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic đến mép
đường cong phía trước ở tại 1/20 chiều cao pic. Khi T quá lớn, điểm cuối của
pic rất khó xác định, pic bị kéo đuôi dài, nên khi tính diện tích pic sẽ mắc
nhiều sai số.
Trong phép định lượng để tính diện tích pic thì T < 2,5 là chấp nhận
được. Muốn làm cho pic cân xứng hcfn, ta có thể làm giảm thể tích chết, tức là
đoạn nối từ cột đến detector; thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng
rửa giải tăng lên; giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột, bằng cách pha loãng mẫu
phân tích hoặc giảm thể tích tiêm.
Ngày nay phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được ứng dụng ngày
càng rộng rãi trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc nói chung.
Theo các tài liệu mà chúng tôi đã tham khảo thì phương pháp này được nghiên
cứu áp dụng rất phổ biến cho việc định lượng các dược chất trong thuốc đa
thành phần
Dưới đây là một số chương trình HPLC dùng để định lượng 5 hoạt chất
mà chúng tôi quan tâm trong các hỗn hợp đa thành phần khác nhau:
* Định lượng Clorpheniramin maleat:
+ ƯSP 26 [32] giới thiệu các chương trình HPLC khác nhau để định lượng
clorpheniramin maleat trong các chế phẩm như:


15

- Trong viên có tác dụng kéo dài;
C ộtC lS ;
Pha động: Hoà tan 2,0g natri perclorat trong 350 ml nước, thêm 650 ml
methanol và 2,0 ml triethylamin, trộn đều;
Detector UV: 261 nm;
Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
-

Khi

có

mặt

paracetamol,

phenylpropanolamin

hydroclorid

và

dextromethorphan hydrobromid:
Cột P h en y l;
Pha động: lOOml hỗn hợp methanol : nước (60 : 40) chứa 0,34g kali
dihydrophosphat; 0,15ml triethylamin; 0,25g natri laurylsulfat và 0,1 ml
acid phosphoric;
Detector UV: 214 nm;
Tốc độ dòng: 2 ml/phút.
+ Bùi Thị Hoà và cộng sự [6] sử dụng chương trình HPLC pha thuận định

lượng đồng thời với phenylpropanolamin hydroclorid, dextromethorphan
hydrobromid và guaiphenesin:
Cột Si 60;
Pha động: Dung dịch amoni perclorat 0,00IM trong methanol đã được
chỉnh pH đến 6,7 bằng natri hydroxyd 0,1M trong methanol - nước (80 : 20);
Detector UV: 254 nm;
Tốc độ dòng; 0,8 ml/phút.
+ Dương Văn Trung [15] định lượng khi có mặt paracetamol và vitamin BI
với chương trình:
Cột Rp 18;
Pha động: Acetonitril - dung dịch đệm pH 6,5 (20 :80);
Detector UV: 224 nm;


16

Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.
+ Nhà sản xuất Hanil [19] đã định lượng clorpheniramin maleat trong thuốc
nhỏ mắt Pinkle với chương trình:
C ộtC lS ;
Pha động: Dung dịch natri laurylsulfat 0,0IM đã chỉnh pH = 4,0 bằng
dung dịch acid phosphoric 0 ,1% - acetonitiil ( 1 :1 ) ;

Detector UV: 214 nm;
Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
* Định lượng naphazolin: Naphazolin trong thuốc nhỏ mắt đã được định lượng
với các chương trình sau:
+ Chương trình của USP 26 [32[:
Cột Rp 8 duy trì ở nhiệt độ 40°C;
Pha động: Dung dịch đệm (Hoà tan 3 g kali dihydrophosphat trong 1000

ml nước, thêm 3 ml triethylamin, chỉnh pH đến 3,0 bằng acid phosphoric) acetonitril (8 : 2);

Detector UV: 285 nm;
Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
+ Chưoỉng trình định lượng đồng thời với berberin clorid [11]:
Cột Rp 18;
Pha động: 1000 ml hỗn hợp acetonitril - nước (48 : 52) chứa 3,4 g kali
dihydrophosphat và 1,4 g natri lauryl sulfat;
Detector ƯV: 280 nm;
Tốc độ dòng: Iml/phút.
+ Chương trình định lượng đồng thcíi với dexamethason và cloramphenicol
[10]:
Cột Rp 8;


17

Pha động: Dung dịch kali dihydrophosphat 10 mM pH 4,5 - acetonitril
(7 : 3);
Detector UV: 250 nm;
Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.
Naphazolin hay được kết hợp với clorpheniramin maleat trong các sản
phẩm thuốc nhỏ mắt khác nhau nên có nhiều chương trình HPLC đã được
dùng để định lượng đồng thời hai hoạt chất này. Sau đây là một số chương
trình HPLC mà chúng tôi đã tham khảo được:
+ Chương trình 1 [4]:
Cột Si 60;
Pha động: Methanol - dung dịch đệm amoni nitrat pH 9,5 (99 : 1);
Detector UV: 265 nm;
Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.

+ Chương trình 2 [28]:
Cột C18 duy trì ở nhiệt độ 40°C;
Pha động: Hoà tan Ig natri octansulfonat trong lOOOml hỗn hợp nước acetonitril - acid acetic khan ( 72 : 28 : 1);
Detector UV: 254nm;
Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
+ Chưcmg trình 3 [27]:
Cột Phenyl duy trì ở nhiệt độ 40°C;
Pha động: Dung dịch natri heptansulfonat (Hoà tan l,02g natri
heptansulfonat trong 20ml dung dịch acid acetic 12,5%, thêm 755ml
nước) - acetonitril (75 : 25);
Detector UV: 220nm.
Tốc độ dòng: 1 ml/phút.