Chế tạo và bước đầu ứng dụng cảm biến điện hóa phân tích acetaminophen trên cơ sở kết hợp vật liệu graphene oxide và poly (3,4 ethylenedioxythiophene)

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHAN CHIẾN THẮNG

CHẾ TẠO VÀ BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG
CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA PHÂN TÍCH
ACETAMINOPHEN TRÊN CƠ SỞ KẾT
HỢP VẬT LIỆU GRAPHENE OXIDE VÀ
POLY(3,4-ETHYLENEDIOXYTHIOPHENE)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHAN CHIẾN THẮNG
MSV: 1301389

CHẾ TẠO VÀ BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG
CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA PHÂN TÍCH
ACETAMINOPHEN TRÊN CƠ SỞ KẾT
HỢP VẬT LIỆU GRAPHENE OXIDE VÀ
POLY(3,4-ETHYLENEDIOXYTHIOPHENE)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Lý Công Thành
Nơi thực hiện:

1. Bộ môn Vật lý – Hóa lý
2. Khoa KH Vật liệu Tiên tiến và Công
nghệ Nano – Trƣờng Đại học KH&CN
Hà Nội

HÀ NỘI - 2018


Lời cảm ơn
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng sâu sắc đến ThS. Lý Công
Thành - Giảng viên Bộ môn Vật lý - Hóa lý, là người đã trực tiếp hướng dẫn và tạo
điều kiện về mọi mặt cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Vũ Thị Thu - Giảng viên trường Đại học Khoa học
và Công nghệ Hà Nội đã dành nhiều thời gian, công sức giúp đỡ trong suốt quá trình
thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên
trong Bộ môn Vật lý – Hóa lý trường Đại học Dược Hà Nội; Khoa Khoa học Vật liệu
Tiên tiến và Công nghệ Nano trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội đã quan
tâm, giúp đỡ nhiệt tình để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Cũng nhân đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo
và cán bộ công nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo và
giúp đỡ tôi trong suốt năm năm học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, những người đã
luôn ở bên động viên, cổ vũ và giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành khóa học này.
Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2018
Sinh viên

Phan Chiến Thắng

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về acetaminophen .................................................................................... 2
1.1.1. Công thức hóa học ........................................................................................... 2
1.1.2. Các tính chất đặc trưng .................................................................................... 2
1.1.2.1. Tính chất vật lý....................................................................................... 2
1.1.2.3. Độ ổn định .............................................................................................. 3
1.1.3. Tác dụng dược lý và dược động học................................................................ 3
1.1.3.1. Tác dụng dược lý.................................................................................... 3
1.1.3.2. Dược động học ....................................................................................... 3
1.1.4. Tác dụng không mong muốn ........................................................................... 3
1.1.5. Các phương pháp xác định acetaminophen ..................................................... 3
1.2. Cảm biến điện hóa ..................................................................................................... 5
1.2.1. Giới thiệu chung .............................................................................................. 5
1.2.2. Các kĩ thuật chế tạo cảm biến điện hóa ........................................................... 6
1.2.2.1. Điện cực ................................................................................................. 6
1.2.2.2. Vật liệu điện cực .................................................................................... 6
1.2.3. Ứng dụng của cảm biến điện hóa trong y dược ............................................... 6
1.3. Graphene oxide và Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) ............................................. 7
1.3.1. Graphene oxide – dẫn xuất của graphene ........................................................ 7
1.3.1.1. Cấu trúc của Graphene oxide và dẫn xuất của graphene ....................... 7
1.3.1.2. Các tính chất đặc trưng của GO ............................................................. 8
1.3.2. Poly (3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) ................................................. 8


1.3.2.1. Cấu trúc vật liệu PEDOT ....................................................................... 8

1.3.2.2. Các tính chất đặc trưng của PEDOT ...................................................... 9
1.3.3. Ứng dụng Graphene oxide và PEDOT trong cảm biến điện hóa .................... 9
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 10
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu ................................................... 10
2.1.1. Hóa chất, nguyên vật liệu ............................................................................... 10
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị .......................................................................................... 10
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 11
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 11
2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 13
2.3.1. Chế tạo màng PEDOT, rGO và rGO-PEDOT sử dụng kĩ thuật quét thế vòng13
2.3.2. Phân tích hình thái và cấu trúc ........................................................................ 13
2.3.3. Phân tích đặc trưng điện hóa ........................................................................... 13
2.3.3.1. Hằng số tốc độ dịch chuyển điện tử ...................................................... 13
2.3.3.2. Phổ tổng trở (EIS) ................................................................................. 13
2.4. Thẩm định phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 14
2.4.1. Xây dựng đường chuẩn xác định acetaminophen ........................................... 14
2.4.2. Thử nghiệm xác định acetaminophen trong thuốc đông dược ....................... 14
2.4.2.1. Thử trên mẫu Độc hoạt tang kí sinh ...................................................... 14
2.4.2.2. Thử trên mẫu thuốc bột Cây Bách Bệnh ............................................... 14
2.5. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................................ 15
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN ................................. 16
3.1. Tổng hợp màng composite kết hợp vật liệu Graphene oxide và PEDOT ................ 16
3.1.1. Tổng hợp màng PEDOT ................................................................................. 16
3.1.2. Tổng hợp màng rGO ....................................................................................... 19
3.1.3. Tổng hợp màng rGO-PEDOT ......................................................................... 19
3.2. Khảo sát đặc trưng màng composite đã tổng hợp .................................................... 20


3.2.1. Phân tích hình thái .......................................................................................... 20
3.2.2. Phân tích cấu trúc ............................................................................................ 21

3.2.3. Hằng số tốc độ dịch chuyển điện tử ks ............................................................ 22
3.2.4. Phổ tổng trở (EIS) ........................................................................................... 23
3.3. Thẩm định phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 25
3.3.1. Xây dựng đường chuẩn của cảm biến xác định acetaminophen ..................... 25
3.3.2. Thử nghiệm xác định acetaminophen trong đông dược ................................. 28
3.3.2.1. Mẫu độc hoạt tang kí sinh ..................................................................... 28
3.3.2.2. Mẫu thuốc bột Cây Bách Bệnh ............................................................. 29
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện lên quá trình hình thành màng
PEDOT
Phụ lục 2: Dữ liệu tính K


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tiếng anh

Tiếng việt

RE

Reference Electrode

Điện cực so sánh

WE

Working Electrode

Điện cực làm viêc

CE

Counter Electrode

Điện cực đối

CV

Cyclic voltammetry

Quét thế vòng

PEDOT

Poly(3,4-ethylendioxythiophene)

GO

Graphene oxide

rGO

Reduced Graphene oxide

SWV

Square Wave Voltammetry

Quét thế xung vuông

FTIR

IR-Infrared Spectrocopy

Phổ hấp thụ hồng ngoại

SEM

Scanning Electron Microscope

Kính hiển vi điện tử quét

rGO-PEDOT
PBS
NSAIDs
LOD
EIS

AOAC

Reduced Graphene oxide Poly(3,4-ethylendioxythiophene)
Phosphate buffered solution
Nonsteroidal anti-inflammatory
drugs
Limit of detection
Electrochemical impedance

spectroscopy

Muối đệm photphat
thuốc chống viêm không steroid
Giới hạn phát hiện
Đo phổ tổng trở điện hóa

Association of Official

Hiệp hội các nhà hóa phân tích

Analytical Chemists

chính thức


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 Giá trị ks của các màng PEDOT, rGO, rGO-PEDOT và điện cực trần GCE tại
vận tốc v=50mV/s..........................................................................................................23
Bảng 3.2 So sánh Rct giữa các màng PEDOT, rGO, rGO-PEDOT và điện cực trần
GCE ............................................................................................................................... 25
Bảng 3.3. Bảng giá trị giữa nồng độ C và ∆I của dãy dung dịch từ 10 μM đến 60μM.27
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá độ thu hồi và độ lặp lại của Acetaminophen ....................29

Bảng PL 2.1 Giá trị Epa và Epc của màng rGO và điện cực trần GCE tại vận tốc
v=10mV/s đến 500mV/s
Bảng PL 2.2 Giá trị Epa và Epc của màng PEDOT và rGO-PEDOT tại vận tốc
v=10mV/s đến 500mV/s

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức hóa học của acetaminophen ........................................................... 2
Hình 1.2. Phản ứng thủy phân của nhóm amid ............................................................... 2
Hình 1.3. Các loại điện cực trong cảm biến điện hóa......................................................6
Hình 1.4. Cấu trúc của graphene oxide theo mô hình của Lerf-Klinowski [18] .............8
Hình 1.5. Cấu trúc của PEDOT .......................................................................................9

Hình 2.1. Máy AUTOLAP/PGSTAT302 ......................................................................10
Hình 2.2. Hệ 3 điện cực .................................................................................................11
Hình 2.3. Hệ điện cực in ................................................................................................ 11

Hình 3.1. Phổ tổng hợp màng PEDOT trên điện cực GCE ...........................................16
Hình 3.2. Phản ứng polymer hóa EDOT diễn ra trên điện cực tạo thành PEDOT .......18
Hình 3.3. Đặc trưng điện hóa màng PEDOT trong dung dịch PBS 1X ........................ 18
Hình 3.4. Phổ tổng hợp màng rGO ................................................................................19
Hình 3.5. Phổ tổng hợp màng rGO-PEDOT .................................................................20
Hình 3.6. Hình ảnh FE-SEM của màng PEDOT, rGO và rGO-PEDOT ......................20
Hình 3.7. Phổ ATR-FTIR của các màng rGO, rGO-PEDOT, PEDOT ......................... 21
Hình 3.8. Phổ Raman của các màng rGO, rGO-PEDOT, PEDOT ............................... 22
Hình 3.9. Phổ đặc trưng của các màng PEDOT, rGO, rGO-PEDOT và điện cực trần
GCE tại vận tốc v=50mV/s............................................................................................ 23
Hình 3.10. Phổ tổng trở của các màng PEDOT, rGO, rGO-PEDOT và điện cực trần
GCE quét bằng phương pháp FRA impedance potentiostatic từ 0,01Hz đến 100000 Hz
.......................................................................................................................................24
Hình 3.11 Mạch Randles cho GCE và các màng rGO, PEDOT và rGO-PEDOT ........24
Hình 3.12. Phản ứng oxy hóa nhóm hydroxyl của Acetaminophen.............................. 25
Hình 3.13. Phổ phát hiện Acetaminophen nồng độ 10µM sử dụng phương pháp SWV
trong khoảng thế từ 0,2V đến 0,8V ở tần số 10Hz, biên độ 10mV, vận tốc 100 mV/s 26

Hình 3.14. Phổ phát hiện Acetaminophen nồng độ 10µM đến 60µM sử dụng phương
pháp SWV trong khoảng thế từ 0,2V đến 0,8V ở tần số 10Hz, biên độ 10mV, vận tốc
100 mV/s........................................................................................................................ 26
Hình 3.15. Đường tuyến tính biểu diễn mối tương quan giữa cường độ dòng điện theo
nồng độ của màng rGO-PEDOT ...................................................................................27
Hình 3.16. Phổ phát hiện Acetaminophen trong mẫu trắng và mẫu thử bằng phương
pháp SWV trong khoảng thế từ 0,2V đến 0,8V ở tần số 10Hz, biên độ 10mV, vận tốc
100 mV/s........................................................................................................................ 28
Hình 3.17. Phổ phát hiện Acetaminophen trong mẫu thuốc bột Cây Bách Bệnh bằng
phương pháp SWV trong khoảng thế từ 0,2V đến 0,8V ở tần số 10Hz, biên độ 10mV,
vận tốc 100 mV/s ...........................................................................................................30

Hình PL 1.1 Khảo sát màng PEDOT với số vòng quét khác nhau
Hình PL 1.2 Khảo sát màng PEDOT với tốc độ quét khác nhau

Hình PL 2.1 Phổ của màng PEDOT, rGO, rGO-PEDOT và GCE trong dung dịch
K3Fe(CN)6 10mM + K4Fe(CN)6 10mM + KCl 100mM ở các vận tốc khác nhau


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay các phương pháp phân tích hóa lý truyền thống cho kết quả với độ
chính xác cao nhưng đòi hỏi thiết bị đắt tiền, hóa chất có độ tinh khiết cao, xử lý mất
nhiều thời gian (lên đến vài ngày), kĩ thuật phân tích phức tạp, người vận hành đòi hỏi
phải có trình độ cao. Phương pháp phân tích sử dụng cảm biến với các ưu điểm: phân
tích nhanh, chính xác, ngay tại chỗ và tương đối rẻ đang được nhiều nhà khoa học
trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu.
Với sự phát triển của công nghệ Nano, các vật liệu Nano đặc biệt là Nano kim
loại, Nano carbon và các polymer dẫn đã được đưa vào sử dụng làm điện cực trong
cảm biến nhằm tăng độ nhạy và giảm giới hạn phát hiện. Cảm biến điện hóa là cảm
biến nhận biết các yếu tố cần phân tích dựa trên các quá trình điện hóa và được sử

dụng trong nhiều phân tích. Việc sử dụng cảm biến điện hóa để phân tích thuốc trong
mẫu là một phương pháp mới và đầy tiềm năng.
Acetaminophen (Paracetamol) là một thuốc có tác dụng giảm đau, hạ nhiệt
được dùng khá phổ biến. Đặc biệt, acetaminophen thường được trộn trái phép trong
đông dược nhằm mục đích tăng tác dụng tức thời cho thuốc nhưng gây ra những tác
hại trên người sử dụng. Việc phát hiện acetaminophen trong đông dược thường gặp
khó khăn trong việc xử lý mẫu và phải vận chuyển về phòng thí nghiệm để thực hiện.
Phương pháp xác định acetaminophen bằng cảm biến điện hóa có thể khắc phục được
các nhược điểm trên. Chính vì thế, nhóm nghiên cứu của chúng tôi thực hiện đề tài
“Chế tạo và bước đầu ứng dụng cảm biến điện hóa phân tích Acetaminophen trên
cơ sở kết hợp vật liệu Graphene Oxide và Poly(3,4-ethylenedioxythiophene)” với các
mục tiêu:
1. Chế tạo màng vật liệu composite trên cơ sở kết hợp vật liệu graphene oxide
và vật liệu polime dẫn PEDOT (màng rGO-PEDOT).
2. Phát triển cảm biến acetaminophen trên cơ sở màng vật liệu composite rGOPEDOT.
3. Thử nghiệm xác định acetaminophen trong thuốc đông dược sử dụng cảm
biến đã chế tạo.

1


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về acetaminophen
1.1.1. Công thức hóa học
Acetaminophen (tên gọi khác là paracetamol, tên khoa học N- (4-hydoxylphenyl)
acetamid, MW 151.2 Da, công thức hóa học C8H9NO2) [4].

Hình 1.1. Công thức hóa học của acetaminophen
1.1.2. Các tính chất đặc trưng
1.1.2.1. Tính chất vật lý

Acetaminophen tồn tại dưới dạng bột kết tinh màu trắng, không mùi, vị đắng
nhẹ, nóng chảy ở khoảng 170ºC. Dung dịch bão hòa của acetaminophen trong nước có
pH khoảng 5,3 đến 5,6 và pKa = 9,51. Acetaminophen tan ít trong nước, tan nhiều
trong nước sôi, dễ tan trong methanol và trong dung dịch kiềm, ít tan trong ether và
chloroform [4].
1.1.2.2. Tính chất hóa học
Acetaminophen thể hiện tính chất hóa học của nhân thơm và nhóm
hydroxylphenol. Acetaminophen còn thể hiện tính chất đặc trưng của nhóm amid là
phản ứng thủy phân khi có mặt xúc tác acid hay base tạo ra 4-aminophenol (4-AP) [4].

Hình 1.2. Phản ứng thủy phân của nhóm amid

2


1.1.2.3. Độ ổn định
Độ ổn định của acetaminophen trong nước chủ yếu liên quan đến phản ứng thủy
phân khi có mặt xúc tác acid hay base. Ánh sáng nhiệt độ và các chất oxy hóa cũng là
tác nhân thúc đẩy phản ứng thủy phân acetaminophen [4].
1.1.3. Tác dụng dược lý và dược động học
1.1.3.1. Tác dụng dược lý
Acetaminophen là thuốc hạ sốt giảm đau hữu hiệu, nhưng không có tác dụng
chống viêm như các thuốc giảm đau chống viêm không steroid khác.
Acetaminophen có tác dụng hạ sốt khi cơ thể bị sốt do bất kì nguyên nhân nào.
Thuốc không làm giảm thân nhiệt ở người bình thường [3].
1.1.3.2. Dược động học
- Hấp thu: Acetaminophen được hấp thu nhanh chóng và hầu như hoàn toàn qua
đường tiêu hóa. Sau khi uống 30 - 60 phút, thuốc đạt nồng độ tối đa trong máu [3].
- Phân bố: Acetaminophen phân bố nhanh và đồng đều tới hầu hết các mô trong cơ
thể, thể tích phân bố khoảng 0,94L/kg. Liên kết với protein huyết tương 25% [3].

- Chuyển hóa: Acetaminophen chuyển hóa ở cytocrom P450 ở gan tạo N-acetylbenzoquinonimin (NAPQI) là chất trung gian, chất này tiếp tục liên hợp với
nhóm sulfydryl của glutathion để tạo ra chất không có hoạt tính [3].
- Thải trừ: Thuốc thải trừ qua nước tiểu chủ yếu ở dạng đã chuyển hóa, độ thanh
thải là 19,3 L/h. Thời gian bán thải là 2,5 giờ [3].
1.1.4. Tác dụng không mong muốn
Khi dùng acetaminophen liều cao (>10 g/ngày), sẽ tạo ra nhiều N-acetylbenzoquinimine làm cạn kiệt glutathion gan, khi đó N-acetyl-benzoquinoniminesẽ
phản ứng với nhóm sulfydrid của protein gan gây tổn thương gan, hoại tử gan, có thể
gây chết người nếu không cấp cứu kịp thời [3].
Xử trí khi dùng quá liều acetaminophen: ngoài các biện pháp giải độc chung thì
cần phải cho bệnh nhân uống tiền chất của glutathione là acetylcystein hoặc methionin
càng sớm càng tốt. Nếu xử trí chậm (sau khi uống quá 36 giờ), gan đã bị tổn thương sẽ
khó hồi phục [3].
1.1.5. Các phương pháp xác định acetaminophen
Hiện nay có nhiều phương pháp xác định acetaminophen như phương pháp sắc
ký, phương pháp quang phổ UV-VIS [2], phương pháp sắc ký lớp mỏng [2],… Các
phương pháp phổ biến dùng để định lượng acetaminophen như phép đo nitrit, đo độ
3


hấp phụ tử ngoại trong môi trường methanol hoặc môi trường kiềm [4] và phương
pháp định lượng bằng HPLC [2].
-

Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng về bản chất là hệ sắc ký lỏng - rắn, trong đó pha tĩnh rắn (là chất
hấp phụ được chọn phù hợp theo yêu cầu phân tích) được trải thành lớp mỏng đồng
đều trên bản kính, nhựa hay kim loại. Sau đó đưa hỗn hợp chất cần tách lên pha tĩnh
bằng cách chấm dung dịch mẫu nghiên cứu lên bản mỏng (cách rìa bản mỏng 2 - 3
cm). Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo

một tỷ lệ nhất định. Cho dung môi pha động chạy bằng cách đặt bản mỏng vào hệ
dung môi này theo hướng phần có vết chấm ở dưới. Dưới tác dụng của lực mao quản,
dung môi sẽ chuyển động qua lớp hấp phụ, các cấu tử sẽ di chuyển theo hướng pha
động nhưng với vận tốc khác nhau dẫn đến việc tách cấu tử ra khỏi nhau, ta thu được
một sắc ký đồ trên lớp mỏng.
Phương pháp sắc ký lớp mỏng có ưu điểm là thiết bị đơn giản, thời gian phân tích
nhanh và khá chọn lọc, chủ yếu được dùng để định tính [1].
-

Phương pháp quang phổ UV-VIS

Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên việc đo phổ hấp phụ tử ngoại và khả
kiến của chất phân tích. Phổ hấp thụ là đồ thị biểu diễn giữa mật độ quang (độ hấp thụ)
của dung dịch chất phân tích vào bước sóng của tia sáng đơn sắc. Thiết lập phổ hấp
thụ bằng cách đo mật độ quang của một dung dịch có nồng độ xác định với các bức xạ
có độ dài sóng giảm hoặc tăng dần, sau đó vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của D – λ
ta sẽ có một phổ hấp thụ của dung dịch chất phân tích. Trên phổ hấp thụ sẽ nhận thấy
các cực đại hấp thụ (ứng với bước sóng, ở đó sự hấp thụ là cực đại) và các cực tiểu nếu
có. Các chất khác nhau thường có phổ hấp thụ khác nhau. Do vậy thường dùng phổ
hấp thụ để định tính các chất hoặc để thử tinh khiết các chất căn cứ vào dạng phổ, các
cực đại và các cực tiểu hấp thụ, tỷ lệ cường độ hấp thụ của các cực đại hoặc các cực
tiểu hấp thụ [1].
Phương pháp này khá đơn giản, cho kết quả tương đối chính xác.
-

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật sắc kí trong đó các chất phân tích
hòa tan trong pha động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tùy
thuộc vào ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất phân tích di

4


chuyển với tốc độ khác nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau. Thành phần pha động
đưa chất phân tích ra khỏi cột được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp lý.
Phương pháp này có độ nhạy độ chính xác cao tuy nhiên thiết bị đắt tiền và
cồng kềnh, không dùng được tại chỗ [5].
1.2. Cảm biến điện hóa
1.2.1. Giới thiệu chung
Cảm biến điện hóa là các cảm biến nhận biết yếu tố cần phân tích (điều kiện vật
lí, phân tử hóa học hoặc sinh học) dựa trên các quá trình điện hóa [6]. Dựa theo cơ chế
nhận biết, cảm biến điện hóa có thể được chia thành các dòng cảm biến hóa điện hóa,
cảm biến sinh học điện hóa, cảm biến quang điện hóa… Các kĩ thuật điện hóa khác
nhau có thể được sử dụng để ghi nhận tín hiệu trong cảm biến bao gồm quét thế vòng
(CV), quét đẳng áp (CA), quét thế xung vuông (SWV), quét thế xung vi phân (DPV),
hay tổng trở (EIS)… Cảm biến xây dựng trong đề tài này là cảm biến hóa điện hóa
hoạt động trên cơ sở nhận biết acetaminophen qua phản ứng oxy hóa của chất này trên
điện cực và ghi nhận lại sự nhận biết bằng tín hiệu dòng trong kĩ thuật quét thế xung
vuông (SWV).
* Các thông số kĩ thuật của cảm biến điện hóa
- Giới hạn phát hiện (Limit of detection – LOD): được xem là nồng độ thấp nhất
của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác, có nghĩa so
với tín hiệu mẫu trắng hay nền [6]. Giới hạn phát hiện được tính dựa vào đường hồi
quy tuyến tính:

[9]
trong đó: δ là độ lệch chuẩn của đáp ứng (the standard deviation of the response)
b là độ dốc của đường chuẩn
- Độ nhạy (Sensitivity): Độ nhạy là tính đáp ứng của hệ thống phân tích khi thay
đổi nồng độ chất phân tích hay khả năng phát hiện sự thay đổi tín hiệu khi có sự thay

đổi nhỏ nhất về nồng độ chất phân tích [6].
Công thức tính: S =
trong đó b: độ dốc của đường chuẩn
A: diện tích điện cực làm việc ( 0,071 cm2)

5


1.2.2. Các kĩ thuật chế tạo cảm biến điện hóa
1.2.2.1. Điện cực
Hiện có một số dòng điện cực chủ yếu được sử dụng trong điện hóa như hình
bên dưới:

a) Hệ vi điện cực in

b) Hệ vi điện cực

trên đế gốm

khắc trên đế Silic

c) Điện cực trụ

Hình 1.3. Các loại điện cực trong cảm biến điện hóa
1.2.2.2. Vật liệu điện cực
Các yêu cầu về đặc tính của vật liệu sử dụng trên điện cực điện hóa bao gồm:
độ dẫn điện tốt, độ bền cơ học và hóa học cao trong điều kiện phân tích, có tính tương
thích sinh học cao (trong trường hợp cảm biến sinh học điện hóa), có đặc tính hóa/ lí/
sinh học/ điện hóa mong muốn [6].
Các loại vật liệu thường được sử dụng trong cảm biến điện hóa là:

-

Polymer dẫn: Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT), Polyaniline (PANi),
Polypyrrole (PPy)…

-

Kim loại và hạt nano kim loại: thường sử dụng hạt nano vàng (AuNPs), nano
bạc (AgNPs) và nano oxit kim loại ( Fe3O4, ZnO, TiO2,…)

-

Vật liệu nano carbon: ống carbon (CNTs), carbon đơn lớp (graphene) [6]…

1.2.3. Ứng dụng của cảm biến điện hóa trong y dược
Trong y dược, cảm biến điện hóa được sử dụng chủ yếu trong phân tích các chỉ
số hóa sinh hoặc chẩn đoán bệnh, và phân tích dược phẩm. Các chỉ số hóa sinh được
phân tích bao gồm hàm lượng glucose, cholesterol, urea trong các dịch cơ thể như
máu, nước tiểu, nước bọt… Jeotikanta Mohapatraa và cộng sự đã sử dụng carbon
nano-onions ứng dụng vào cảm biến để phát hiện glucose. Trong nghiên cứu của
Jeotikanta, cảm biến có độ nhạy là 26,5μA/mM.cm2 trong dải tuyến tính từ 1-10 mM
[20]. Một số chỉ dấu sinh học trong chẩn đoán bệnh như CEA (ung thư) cũng đã được
phân tích sử dụng cảm biến sinh học điện hóa. Theo nghiên cứu của Joshiane P.
Lafleur và cộng sự (2016), cảm biến sinh học điện hóa được ứng dụng trong hệ kênh
6


vi lưu để phát hiện các thành phần sinh học như ADN, virus, ARN… có trong cơ thể
[21]. Bên cạnh đó, việc sử dụng cảm biến điện hóa trong phân tích các dược phẩm, đặc
biệt là các dược phẩm có tính oxy hóa khử như acetaminophen, cũng thu hút sự quan

tâm của nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới. Trong nghiên cứu của Abbas Afkhami
và cộng sự, việc kết hợp NiFe2O4 với hạt Nano carbon lên điện cực đã phát hiện
acetaminophen với giới hạn phát hiện 0,003 μM [7]. Cũng sử dụng graphene kết hợp
với hạt nano vàng để phát hiện acetaminophen, Sangmin Yu và cộng sự đã phát hiện
được acetaminophen ở nồng độ 0,005 μM [23]. Việc sử dụng các cảm biến điện hóa
với kích thước nhỏ gọn và khả năng tích hợp cao với các thiết bị điện tử sẽ cho phép
xây dựng các giải pháp sàng lọc trong chẩn đoán bệnh cũng như kiểm nghiệm dược
phẩm [22], [21].
1.3. Graphene oxide và Poly(3,4-ethylenedioxythiophene)
1.3.1. Graphene oxide – dẫn xuất của graphene
1.3.1.1. Cấu trúc của Graphene oxide và dẫn xuất của graphene
Graphene là một vật liệu nano carbon được phát minh vào năm 2004 (Noslov,
2004). Vật liệu này có cấu trúc xếp lớp đặc trưng của các nguyên tử carbon liên kết
với nhau chủ yếu thông qua lai hóa sp2. Với cấu trúc này, vật liệu graphene có những
đặc tính ưu việt phù hợp làm vật liệu điện cực trong cảm biến điện hóa như độ dẫn
điện cao, tốc độ dịch chuyển điện tử lớn, độ dẫn nhiệt tốt, và có độ linh hoạt cơ học
cao… Tuy nhiên, việc chế tạo vật liệu này đòi hỏi các kĩ thuật cao với chi phí tốn kém
(ví dụ như kĩ thuật lắng đọng vật lí pha hơi – Chemical Vapor Deposition – CVD)
[14], [13].
Để khắc phục vấn đề này, vật liệu graphene oxide (GO) – một dẫn xuất của
graphene – đã được sử dụng gần đây. Đây là một dạng oxi hóa của cấu trúc graphene
với các nguyên tử carbon được liên kết với nhau chủ yếu dựa trên lai hóa sp3. Bên
cạnh đó, các nhóm chức như carboxylic, hydroxyl hay epoxy cũng được hình thành
trong quá trình chế tạo vật liệu này. So với graphene, GO có độ dẫn điện rất kém. Tuy
nhiên, vật liệu này có thể được chuyển hóa dễ dàng thành dạng khử (rGO) có các đặc
trưng tương tự graphene. Ưu điểm của việc sử dụng rGO so với graphene bao gồm sự
đơn giản trong chế tạo vật liệu, dễ thao tác với vật liệu do khả năng phân tán tốt của
GO trong môi trường nước (dung môi thường gặp trong điện hóa), và giá thành thấp [15].
Cấu trúc của GO phụ thuộc nhiều vào phương pháp tổng hợp và được đưa ra
bởi nhiều nhà nghiên cứu. Trong đó, mô hình của Lerf-Klinowski [17] phổ biến hơn

7


cả, graphit sau khi bị oxy hóa, trên mặt phẳng nằm ngang của các lớp có các nhóm
hydroxyl, epoxy và trên các góc của mặt phẳng nằm ngang có thể hình thành các nhóm
chức cacbonyl hoặc cacboxylic.

C
B

A

Hình 1.4. Cấu trúc của graphene oxide theo mô hình của Lerf-Klinowski [17]
A: nhóm epoxy, B: nhóm hydroxyl, C: nhóm cacboxylic
1.3.1.2. Các tính chất đặc trưng của GO
Cấu trúc và đặc tính của GO phụ thuộc vào từng phương pháp tổng hợp và mức
độ oxy hóa. Các sản phẩm oxy hóa với tỉ lệ C:O trong khoảng từ 2,1 đến 2,9. GO chứa
các nhóm chức có chứa oxi, trong đó có 4 nhóm chức chủ yếu là: Hydroxyl (-OH),
epoxy (-O-) đính ở trên bề mặt, và cacboxyl (-COOH), cacbonyl (-CO-) đính ở rìa của
các đơn lớp, nhưng GO vẫn giữ nguyên dạng cấu trúc lớp ban đầu của graphit [13].
Các nhóm chức này đóng vai trò như vật chèn thêm vào khoảng cách giữa hai lớp
graphene và khi khoảng cách lớp được nới rộng thì lực hút giữa hai lớp sẽ bị giảm đi
nhanh chóng. Những động tác cơ học như siêu âm sẽ dễ dàng tách than chì thành các
mảng GO dưới dạng huyền phù. Sự có mặt của các nhóm chức trên, làm cho bề mặt
của GO có mật độ điện tích âm lớn, do đó GO là vật liệu ưa nước, rất dễ phân tán
trong nước mà không bị kết lắng [17].
1.3.2. Poly (3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT)
1.3.2.1. Cấu trúc vật liệu PEDOT
PEDOT là polymer dẫn bao gồm nhiều monomer 3,4-ethylenedioxythiphene
(EDOT) liên hợp có cấu trúc như sau [8], [26]:

8


Hình 1.5. Cấu trúc của PEDOT
1.3.2.2. Các tính chất đặc trưng của PEDOT
Do trong cấu trúc có hệ Л liên hợp nằm dọc theo chuỗi polymer nên PEDOT có
độ dẫn điện rất tốt. Bên cạnh đó, PEDOT cũng rất bền và độ ổn định cao [6]. Dựa vào
tính chất này PEDOT được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như pin năng lượng, điốt
phát quang, linh kiện điện tử và quan trọng nhất là trong cảm biến điện hóa [11], [16].
1.3.3. Ứng dụng Graphene oxide và PEDOT trong cảm biến điện hóa
Graphene oxide sau khi được khử sẽ chuyển hóa thành rGO (reduced graphene
oxide) với những đặc tính tương tự như graphene như dẫn điện tốt (sp2 chuyển hóa
thành sp3), độ bền cơ học và tính linh hoạt cao, dẫn nhiệt tốt, tính tương thích sinh học
cao… Do đó, rGO đã được lựa chọn là vật liệu tiềm năng để cải tiến hoạt động của
cảm biến điện hóa nói riêng và cảm biến điện hóa ứng dụng trong y dược nói riêng
[15].
Cùng với đó, polymer dẫn cũng được ứng dụng rộng rãi trong cảm biến điện hóa.
Các loại polymer dẫn có nhiều đặc tính như độ dẫn cao, tổng hợp dễ dàng, độ ổn định
cao, tính bền nhiệt lớn, có thời gian sử dụng dài [6]. Việc đưa polymer dẫn vào ứng
dụng để chế tạo cảm biến sẽ tạo ra bước tiến bộ vượt bậc cho lĩnh vực này nhờ các ưu
thế: tính đa dạng, linh hoạt của vật liệu, khả năng gia công dễ dàng hơn.
Gần đây, để tăng tính khả dụng của polymer dẫn, các nhà khoa học thế giới đã
nghiên cứu chế tạo composite của polymer dẫn với các vật liệu vô cơ và hữu cơ khác
nhau, tiêu biểu là graphene oxide [25], [27]. Theo một nghiên cứu mới nhất của Fariba
Saadati, graphene oxide đã được kết hợp với hạt nano polyaniline để chế tạo cảm biến
phát hiện p-nitrophenol với giới hạn phát hiện là 20μM [18]. Để xác định đồng thời
acid uric và tyrosin, Weihua Zheng và cộng sự đã kết hợp rGO trên nền polymer dẫn
và giới hạn phát hiện của acid uric là 0,3232 μM, của tyrosine là 0,046 μM [28]. Việc
kết hợp giữa vật liệu graphen và vật liệu polymer dẫn để chế tạo cảm biến đã và đang

mang đến những kết quả tốt, mở ra những triển vọng trong tương lai [21].
9


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Hóa chất, nguyên vật liệu
STT
Tên
Xuất xứ

Ghi chú

Dạng viên nén.

1

Phosphate Buffer Saline

Sigma,

(PBS)

Mĩ

Hòa tan 1 viên trong 200 mL nước để
thu được NaCl 137 mM; 2,7 mM KCl
và dung dịch đệm phosphat 10 mM
(pH 7,4 ở 25 ° C)

2

3,4 ethylenedioxythiophene

Sigma,

(EDOT)

Mĩ

3

Acetaminophene

4

Graphene oxide (GO)

Merck,

MW 142,18 g.mol-1, d = 1,33 g.L-1
MW = 151,163 g.mol-1, d = 1,263

Đức

g.cm-3

Việt

Chế tạo bằng phương pháp Hummer

Nam

biến đổi

2.1.2. Dụng cụ và thiết bị
- Hệ thiết bị điện hóa potentiostat Autolab Model AUTOLAB/PGSTAT302N
(hãng Metrohm, Hà Lan). Hệ được kết nối với tế bào điện hóa trong dung dịch
điện hóa và các điện cực.

Hình 2.1. Máy AUTOLAP/PGSTAT302

10


-

Hệ 3 điện cực rời (điện cực làm việc – glassy carbon, điện cực đối – Pt, và điện
cực so sánh – Ag/AgCl)

Hình 2.2. Hệ 3 điện cực
-

Điện cực in có cấu hình 3 điện cực phẳng (Working Electrode, Referennce
Elcetrode và Counter Electrode.

Hình 2.3. Hệ điện cực in
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu
- Màng vật liệu composite trên cơ sở kết hợp vật liệu graphene oxide và vật liệu
polime dẫn PEDOT (màng rGO-PEDOT).

- Cảm biến điện hóa phát hiện acetaminophen trên cơ sở kết hợp vật liệu graphene
oxide và vật liệu polime dẫn PEDOT (màng rGO-PEDOT).
- Thuốc đông dược: viên nang Độc hoạt tang kí sinh của Công ty TNHH dược phẩm
FITO Pharma số lô 0316 và thuốc bột Cây Bách Bệnh trên thị trường.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Các nội dung nghiên cứu được đặt ra trong đề tài này bao gồm:
11


ND1: Chế tạo màng vật liệu composite trên cơ sở kết hợp vật liệu graphene oxide
và vật liệu polime dẫn PEDOT (màng rGO-PEDOT)
Trong nội dung nghiên cứu này, màng vật liệu rGO-PEDOT sẽ được chế tạo sử
dụng phương pháp quét thế vòng trong dung môi nước với quy trình một bước. Nói
cách khác, quá trình khử vật liệu graphene (GO→rGO), quá trình oxy hóa monomer
EDOT, và quá trình lắng đọng vật liệu lên điện cực (chủ yếu sử dụng điện cực glassy
carbon) sẽ được tiến hành đồng thời. Chế tạo vật liệu composite bằng phương pháp
điện hóa trong một bước là một cách tiếp cận mới mẻ và cho phép tạo ra lớp màng vật
liệu đồng đều, dễ điều khiển chiều dày với thời gian và chi phí chế tạo tiết kiệm. Vật
liệu composite giữa graphene oxide và PEDOT cũng là một vật liệu khá mới được
nghiên cứu gần đây cho phép tăng cường độ nhạy và giảm giới hạn phát hiện của các
hệ cảm biến điện hóa. Lớp vật liệu này có độ dẫn điện tốt, độ bền cơ học cao, dễ biến
tính khi cần thiết, và có độ tương thích sinh học cao; do đó có thể sử dụng như một
nền tảng phổ biến và có thể được biến tính phù hợp để phát triển các dòng cảm biến
điện hóa khác nhau phù hợp với đối tượng phân tích.
ND2: Phát triển cảm biến acetaminophen trên cơ sở màng vật liệu composite rGOPEDOT.
Trong nội dung nghiên cứu này, màng vật liệu đã chế tạo sẽ được sử dụng làm
vật liệu điện cực để tăng cường độ nhạy của cảm biến điện hóa xác định
acetaminophen. Quá trình nhận biết acetaminophen dựa trên quá trình oxi hóa
acetaminophen thành N-acetyl-p-quinoneimine (NAPQI) và được ghi nhận bằng kĩ
thuật quét thế xung vuông (SWV). Đường chuẩn sẽ được xây dựng với nồng độ

acetaminophen trong dải 10µM tới 60µM
ND3: Thử nghiệm xác định acetaminophen trong thuốc đông dược sử dụng cảm
biến đã chế tạo.
Trong nội dung nghiên cứu này, cảm biến đã chế tạo sẽ được sử dụng để phân
tích bán định lượng tại chỗ lượng acetaminophen trong một số sản phẩm thuốc đông
dược. Việc phân tích thành phần acetaminophen trong các sản phẩm này cho phép có
một quá trình sàng lọc trước khi can thiệp các phân tích chuyên sâu hơn trong kiểm
định chất lượng của sản phẩm.

12


2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Chế tạo màng PEDOT, rGO và rGO-PEDOT sử dụng kĩ thuật quét thế vòng
Quá trình tổng hợp các vật liệu PEDOT, rGO, và rGO-PEDOT được tiến hành
giống nhau trên điện cực glassy carbon và điện cực in. Với điện cực glassy carbon, điện
cực được làm sạch theo quy trình tiêu chuẩn. Cụ thể, điện cực được mài với bột nhôm
mịn 0.3 μm, rửa sạch với nước cất và isopropanol, rồi sấy khô dưới súng nitơ trước khi
sử dụng. Để tổng hợp màng rGO-PEDOT, điện cực được quét bằng phương pháp CV
trong dung dịch điện hóa gồm GO (1 mg.ml-1) và EDOT (0.01 M) phân tán đều trong
PBS 1X (pH 7.4) trong khoảng thế từ -1,2 V tới +1,5V tại vận tốc quét 50 mV.s-1 với số
vòng bằng 5. Quá trình tổng hợp vật liệu rGO hoặc PEDOT được tiến hành tương tự.
2.3.2. Phân tích hình thái và cấu trúc
Hình thái của vật liệu được phân tích bằng chụp ảnh trên hệ thiết bị FE-SEM ở
điện thế 5 kV.
Cấu trúc của vật liệu được xác định bằng cách đo phổ ATR-FTIR trong dải số
sóng 300 – 3000 cm-1 và phổ Raman với nguồn bức xạ 532 nm trong dải số sóng 300 tới
3500 cm-1.
2.3.3. Phân tích đặc trưng điện hóa
Đặc trưng điện hóa của màng PEDOT, rGO, rGO-PEDOT được phân tích qua 2

thông số là hằng số tốc độ dịch chuyển điện tử (standard transfer rate constant) và điện
trở dịch chuyển (charge transfer resistance).
2.3.3.1. Hằng số tốc độ dịch chuyển điện tử
Hằng số tốc độ dịch chuyển điện tử của điện cực biến tính với vật liệu được xác
định bằng phương pháp Laviron [29], [24]. Điện cực được quét trong dung dịch KCl
100mM chứa K3Fe(CN)6 10mM + K4Fe(CN)6 10mM trong khoảng thế -200 mV tới
+600 mV tại các tốc độ quét khác nhau từ 10 tới 500 mV/s.
Công thức Laviron:
E0 +

-

Epa = E0 +

+

Ln(ks) = α.ln(1-α) + (1-α).lnα -ln(

)-

[24].

2.3.3.2. Phổ tổng trở (EIS)
Điện trở dịch chuyển (charge transfer resistance) của điện cực biến tính với vật
liệu được xác định bằng phương pháp tổng trở. Điện cực được quét trong dung dịch
13


KCl 100mM chứa K3Fe(CN)6 10mM + K4Fe(CN)6 10Mm trong khoảng tần số từ
0,01Hz đến 100000 Hz. Kết quả đo sẽ được xử lý với mạch tương đương phù hợp

bằng phần mềm Zview [19].
2.4. Thẩm định phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Xây dựng đường chuẩn xác định acetaminophen
Dung dịch Acetaminophen chuẩn được pha từ bột mẫu Acetaminophen chuẩn
của Merck trong dung dịch PBS 1X ở dải nồng độ khác nhau từ 10 µM – 60 µM và
được xác định bằng cảm biến thông qua phương pháp Square Wave Voltammetry
trong khoảng thế từ 0,2V đến 0,8V ở tần số 10Hz, biên độ 10mV, vận tốc 100 mV/s.
2.4.2. Thử nghiệm xác định acetaminophen trong thuốc đông dược
2.4.2.1. Thử trên mẫu Độc hoạt tang kí sinh
Mục đích : Định tính và đánh giá độ thu hồi, độ lặp lại của phương pháp.
Định tính: Cân khối lượng bột thuốc có trong viên nang Độc hoạt tang kí sinh, sau đó
hòa tan (có rung siêu âm trong 15 phút) vào trong 50 ml dung dịch PBS 1X. Dùng cảm
biến đã chế tạo để định tính sự có mặt của acetaminophen.
Làm song song 2 mẫu:
-

Mẫu trắng: chỉ có nền Độc hoạt tang kí sinh

-

Mẫu thử: nền Độc hoạt tang kí sinh thêm vào 200μl dung dịch chuẩn
acetaminophen 0,01M.

Đánh giá độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp:
-

Chuẩn bị 6 mẫu thử trên nền Độc hoạt tang kí sinh. Mỗi mẫu thử có thể tích
50ml sau đó thêm vào 200μl dung dịch chuẩn acetaminophen 0,01M để thu
được 6 mẫu có nồng độ 40 μM.

-

Dùng cảm biến đo các mẫu thử vừa pha được bằng phương pháp Square Wave
Voltammetry trong khoảng thế từ 0,2V đến 0,8V ở tần số 10Hz, biên độ 10mV,
vận tốc 100 mV/s. Nồng độ trong 6 mẫu thử được tính lại theo đường chuẩn.

2.4.2.2. Thử trên mẫu thuốc bột Cây Bách Bệnh
Mục đích: định tính và định lượng acetaminophen có trong mẫu thuốc bột Cây Bách
Bệnh bằng phương pháp ngoại chuẩn.
Quy trình tạo mẫu:
-

Xác định khối lượng gói thuốc bột bằng cân phân tích.

-

Pha 1 gói thuốc bột vào 100ml dung dịch PBS 1X (pH=7,4). Pha loãng 1000
lần thu được mẫu thử.
14


-

Dùng cảm biến đo mẫu vừa pha được bằng phương pháp Square Wave
Voltammetry trong khoảng thế từ 0,2V đến 0,8V ở tần số 10Hz, biên độ 10mV,
vận tốc 100 mV/s. Nồng độ acetaminophen có trong mẫu thử được tính lại theo
đường chuẩn.

-

Nồng độ thuốc trong gói thuốc bột được tính lại theo công thức :
m = Cx.M.f.V
trong đó: m là hàm lượng acetaminophen có trong 1 gói thuốc bột (mg)
Cx là nồng độ xác định được theo đường chuẩn (μM)
M = 151 là khối lượng phân tử của Acetaminophen
f = 1000 là độ pha loãng của mẫu thử
V = 100 ml là thể tích dùng để pha mẫu thuốc bột

2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Kết quả thu được trong quá trình tiến hành nghiên cứu đều được xử lí bằng
các phần mềm NOVA 1.11 có sẵn trong thiết bị AUTOLAP.
Sử dụng các phương pháp xử lí thống kê trong phân tích nhờ các hàm toán
học, bằng phần mềm tin học Microsoft Office Excel, Zview 4.0 và Origin 8.5 để
tính toán.

15