TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT (E)Nʹ (HYDROXYBENZYLIDEN)2 ACETOHYDRAZID MANG KHUNG 2HBENZOb1,4OXAZIN3(4H)ON

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  ------

LÊ CÔNG TRỰC
MÃ SINH VIÊN: 1401653

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH
KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA
MỘT SỐ DẪN CHẤT (E)-Nʹ(HYDROXYBENZYLIDEN)-2ACETOHYDRAZID MANG KHUNG
2H-BENZO[b][1,4]OXAZIN-3(4H)-ON
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ
HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  -----LÊ CÔNG TRỰC
MÃ SINH VIÊN: 1401653

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH
KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA
MỘT SỐ DẪN CHẤT (E)-Nʹ(HYDROXYBENZYLIDEN)-2ACETOHYDRAZID MANG KHUNG
2H-BENZO[b][1,4]OXAZIN-3(4H)-ON
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ
Người hướng dẫn:
TS. Trần Phương Thảo
ThS. Lê Công Huân
Nơi thực hiện:

Bộ môn Hóa Dược

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN
Trước khi trình bày khóa luận của mình, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành
nhất đến những người đã hết mình giúp đỡ, động viên tôi để tôi có thể hoàn thiện
khóa luận này một cách tốt nhất.
Trước hết, tôi xin được cảm ơn những người thầy, người cô đáng kính của mình:
TS. Trần Phương Thảo – Bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội và ThS.
Lê Công Huân – Khoa Dược, trường Đại học Y Dược Thái Bình. Các thầy, cô không
chỉ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi tiến hành đề tài khóa luận tốt nghiệp mà luôn có
những chỉ dẫn chính xác và động viên tôi những lúc khó khăn.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo, các anh chị kỹ
thuật viên, các bạn thuộc nhóm nghiên cứu tại Bộ môn Hóa Dược trường Đại học
Dược Hà Nội, Khoa Hóa – trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà
Nội, trường Đại học Quốc gia Chungbuk đã giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình, bạn bè, đặc biệt là các bạn Hoàng Mai
Anh, Phạm Trung Anh, Vũ Thị Thu Hiền, Nguyễn Như Thượng, em Lê Minh
Anh đã ở bên chia sẻ buồn vui, hỗ trợ tôi về nhiều mặt trong thời gian tôi thực hiện
nghiên cứu này.
Hà Nội, ngày 17 tháng 08 năm 2018
Sinh viên

Lê Công Trực


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................2
1.1. Chu trình chết tự nhiên của tế bào (apoptosis) ...............................................2
1.1.1. Định nghĩa ........................................................................................................2
1.1.2. Các giai đoạn của apoptosis ............................................................................2
1.1.3. Chu trình chết tự nhiên của tế bào và bệnh ung thư .....................................3
1.2. Enzym caspase ....................................................................................................4
1.2.1. Định nghĩa ........................................................................................................4
1.2.2. Phân loại ...........................................................................................................4
1.2.3. Vai trò của enzym caspase trong chu trình chết tự nhiên của tế bào ............5
1.3. Các chất hoạt hóa enzym caspase 3 ..................................................................7
1.3.1. Vai trò của ion kẽm trong sự hoạt hóa và hoạt động caspase 3 ....................7
1.3.2. Một số chất hoạt hóa caspase 3 .......................................................................7
1.4. Tác dụng kháng tế bào ung thư của một số hợp chất mang khung 2Hbenzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on ...................................................................................9
1.4.1. Giới thiệu sơ lược một số tác dụng sinh học của một số hợp chất mang khung
2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on .............................................................................9
1.4.2. Tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất mang khung 2Hbenzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on .................................................................................10


CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................................................13
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ...................................................................................13
2.1.1. Hóa chất..........................................................................................................13
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ.............................................................................................13
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................14

2.2.1. Tổng hợp hóa học...........................................................................................14
2.2.2. Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư của các chất tổng hợp được .............15
2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................15
2.3.1. Tổng hợp hóa học...........................................................................................15
2.3.4. Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư ............................................................16
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................17
3.1. Hóa học ..............................................................................................................17
3.1.1. Tổng hợp hóa học...........................................................................................17
3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết.....................................................................................27
3.1.3. Xác định cấu trúc ...........................................................................................28
3.2. Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư .............................................................35
3.3. Bàn luận ............................................................................................................38
3.3.1. Tổng hợp hóa học...........................................................................................38
3.3.2. Khẳng định cấu trúc ......................................................................................40
3.3.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư ...........................................................44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................46
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
13

C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị carbon-13
(Carbon-13 nuclear magnetic resonance)

1

H-NMR

: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

(Proton nuclear magnetic resonance)

5-FU

: 5-fluorouracil

AcOH

: Acid acetic

ADN

: Acid desoxyribonucleic

CGP

: Mức độ sinh trưởng tế bào (Cell growth percentage)

d

: Pic đôi trong phổ 1H-NMR (Doublet)

DCM

: Dicloromethan

dd

: Pic chẻ đôi 2 lần trong phổ 1H-NMR (Doublet of doublet)

DMF

: Dimethylformamid

DMSO

: Dimethylsulfoxid

DMSO-d6 : Dimethylsulfoxid deuteri hóa
ESI

: Ion hóa phun bụi điện tử (Electrospray ionization)

FDA

: Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ
(U.S. Food and Drug Administration)

H (%)

: Hiệu suất

IC50

: Nồng độ ức chế 50 %
(The half maximal inhibitory concentration)

IR

: Infrared (Hồng ngoại)

J

: Hằng số ghép cặp trong phổ 1H-NMR

m

: Đa pic trong phổ 1H-NMR (Multiplet)

MeCN

: Acetonitril

MeOH

: Methanol

MS

: Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

NCI-H23

: Tế bào ung thư phổi

NST

: Nhiễm sắc thể

PAC-1

: Chất hoạt hóa procaspase đầu tiên
(Procaspase-activating compound 1)

PC3

: Tế bào ung thư tuyến tiền liệt

Rf

: Hệ số lưu giữ trong sắc ký lớp mỏng

s

: Pic đơn trong phổ 1H-NMR (Singlet)

SW620

: Tế bào ung thư đại tràng

t

: Pic ba trong phổ 1H-NMR (Triplet)

tºnc

: Nhiệt độ nóng chảy

TLC

: Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)

TMS

: Tetramethylsilan

UV

: Tử ngoại (Ultraviolet)

δ

: Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) trong phổ NMR

ν

: Dao động hóa trị trong phổ IR


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Phân loại enzym caspase

4

Bảng 3.1. Các chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các chất Va-g

27

Bảng 3.2. Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy của các chất Va-g

28

Bảng 3.3. Kết quả phân tích phổ IR của các chất Va-g

29

Bảng 3.4. Kết quả phân tích phổ MS của các chất Va-g

30

Bảng 3.5. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất Va-g

31

Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các chất Va-g

33

Bảng 3.7. Kết quả thử tác dụng ức chế sinh trưởng một số dòng tế bào ung

36

thư của các chất Va-g ở nồng độ 30 µg/ml
Bảng 3.8. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các chất Va, Vc,

37

Vd, Ve, Vg

Bảng 3.9. Tỷ lệ đồng phân syn/anti của các chất Va-g

42


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Trang
Hình 1.1. Các giai đoạn của chu trình chết tự nhiên của tế bào

3

Hình 1.2. Quá trình hoạt hóa chu trình chết tự nhiên thông qua enzym

6

caspase
Hình 1.3. Cấu trúc chung của các acylhydrazon (a) và cấu trúc của phức

8

chất của acylhydrazon với ion kẽm (b)
Hình 1.4. Cấu trúc của PAC-1

8

Hình 1.5. Cấu trúc của các chất WF-208 và WF-210

8

Hình 1.6. Cấu trúc của dẫn chất 3q

9

Hình 1.7. Công thức cấu tạo của chất SB-590885 và dẫn chất 9c

10

Hình 1.8. Công thức cấu tạo của dẫn chất 3c

11

Hình 1.9. Công thức cấu tạo của semaxanib, sunitinib và dẫn chất 4r

11

Hình 3.1. Dẫn chất thế ái nhân acyl 2 lần

39

Hình 3.2. Phổ đồ MS của chất Vc

41

Hình 3.3. Các dạng đồng phân có thể có của các chất Va-g

42

Hình 3.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất Vb

43

Hình 3.5. Biểu đồ so sánh mức độ sinh trưởng các dòng tế bào ung thư ở

44

nồng độ chất ức chế 30 µg/ml
Hình 3.6. Biểu đồ so sánh hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất Va,
Vc, Vd, Ve, Vg với 5-FU và PAC-1 trên các dòng tế bào thử nghiệm

45


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ tổng hợp chung

17

Sơ đồ 3.2. Sơ đồ tổng hợp chất II

17

Sơ đồ 3.3. Sơ đồ tổng hợp chất III

18

Sơ đồ 3.4. Sơ đồ tổng hợp chất IV

19

Sơ đồ 3.5. Sơ đồ tổng hợp chất Va

20

Sơ đồ 3.6. Sơ đồ tổng hợp chất Vb

21

Sơ đồ 3.7. Sơ đồ tổng hợp chất Vc

22

Sơ đồ 3.8. Sơ đồ tổng hợp chất Vd

23

Sơ đồ 3.9. Sơ đồ tổng hợp chất Ve

24

Sơ đồ 3.10. Sơ đồ tổng hợp chất Vf

25

Sơ đồ 3.11. Sơ đồ tổng hợp chất Vg

26

Sơ đồ 3.12. Cơ chế phản ứng tạo chất II

38

Sơ đồ 3.13. Cơ chế phản ứng tạo chất III

39


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư là một bệnh hiểm nghèo, khó điều trị, gây hao tổn lượng lớn tiền bạc,
sức lực của người bệnh, gia đình và xã hội. Những năm trước đây, các thuốc điều trị
ung thư được lựa chọn chủ yếu theo kinh nghiệm điều trị, đều là các thuốc có độc
tính cao, gây nhiều tác dụng không mong muốn như 5-fluorouracil, doxorubicin,
melphalan… Hiện nay, cùng với sự tiến bộ của ngành sinh học phân tử, cơ chế bệnh
sinh của ung thư ngày càng được hiểu rõ hơn, tạo điều kiện cho việc thiết kế các phác
đồ hướng đích trong điều trị ung thư. Rất nhiều mục tiêu phân tử khác nhau đã được
nghiên cứu, hướng tới các quá trình thiết yếu trong sự phát triển của tế bào. Một trong
số những mục tiêu đó là nhóm enzym caspase. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhóm
enzym này có vai trò quan trọng trong việc hoạt hóa chu trình chết tự nhiên của tế
bào (apoptosis), từ đó kiểm soát sự phát triển bình thường số lượng các tế bào. Các
bất thường trong hoạt động của các enzym này là một trong những nguyên nhân gây
ra ung thư [12, 25]. Trong số các chất có khả năng hoạt hóa caspase đã được nghiên
cứu, nhóm các hợp chất mang hợp phần acylhydrazon thể hiện hoạt tính tương đối
tốt, điển hình là PAC-1 – một chất được công bố trong công trình nghiên cứu của K.
S. Putt và cộng sự [25] đăng trên tạp chí Nature vào tháng 8/2006. Đến năm 2016,
FDA đã đưa PAC-1 vào danh sách các chất được phê duyệt nhanh cho việc điều trị
các bệnh hiếm gặp. Bên cạnh đó, các hợp chất mang khung cấu trúc 2Hbenzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on cũng đang được nghiên cứu nhiều trong thời gian gần
đây. Nhiều hợp chất trong số đó đã thể hiện khả năng tiêu diệt tế bào ung thư đầy
triển vọng [15, 26, 41].
Trên cơ sở các nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Tổng hợp
và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất (E)-Nʹ(hydroxybenzyliden)-2-acetohydrazid mang khung 2H-benzo[b][1,4]oxazin3(4H)-on” với hai mục tiêu:

1. Tổng hợp được 07 hợp chất acetohydrazid mang khung 2Hbenzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on
2. Thử được tác dụng gây độc tế bào của các chất tổng hợp được.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Chu trình chết tự nhiên của tế bào (apoptosis)
1.1.1. Định nghĩa
Cơ thể sống đa bào là một hệ thống được tổ chức rất chặt chẽ. Trong đó, số
lượng các tế bào trong các bào quan được kiểm soát không chỉ bởi tốc độ phân chia
tế bào mà còn bởi tốc độ chúng chết đi. Khi một tế bào trở nên không cần thiết với
cơ thể, nó sẽ tự chết đi thông qua sự hoạt hóa một quá trình diễn ra ngay trong bản
thân tế bào, dẫn đến sự tan rã của tế bào đó. Quá trình này được gọi là chu trình chết
tự nhiên của tế bào (apoptosis) [18].
1.1.2. Các giai đoạn của apoptosis
Tế bào chết đi do bị tổn thương thường sưng to và vỡ ra, giải phóng vật chất tế
bào và kích hoạt quá trình viêm. Kiểu chết này của tế bào được gọi là hoại tử
(necrosis) [27]. Trái ngược với quá trình trên, tế bào đi theo chu trình chết tự nhiên
chết một cách “êm dịu”, không gây tổn thương các tế bào lân cận. Về cơ bản, chu
trình chết tự nhiên của tế bào gồm 5 bước như sau [6]:
- Tế bào nhận được tín hiệu dẫn đến sự khởi phát của apoptosis
- Bộ khung tế bào đứt gãy dẫn đến sự co ngót và thu nhỏ của tế bào
- Tế bào chất trở nên đậm đặc, nhân tế bào và các bào quan bị co ép lại và phân
rã
- Tế bào bị phân chia thành các mảnh nhỏ, được gọi là tiểu thể apoptotic, trong
đó tế bào chất vẫn được bao bọc nguyên vẹn bởi màng sinh học
- Các biến đổi xảy ra trên màng tế bào tạo nên các cảm ứng hóa học để lôi kéo
đại thực bào đến. Quá trình thực bào xảy ra trước khi vật chất tế bào bị giải phóng ra
môi trường.

Các giai đoạn này được mô tả trong hình 1.1.

2


Hình 1.1. Các giai đoạn của chu trình chết tự nhiên của tế bào
1.1.3. Chu trình chết tự nhiên của tế bào và bệnh ung thư
Như đã biết, chu trình chết tự nhiên của tế bào là một cơ chế của cơ thể sống để
kiểm soát số lượng tế bào ở mức bình thường. Trong khi đó, ung thư là tình trạng
bệnh lý trong đó tế bào của cơ thể tăng sinh một cách bất thường, mất kiểm soát. Điều
đó gợi ý mối liên hệ giữa các bất thường xảy ra trong chu trình chết tự nhiên của tế
bào và sự khởi phát ung thư.
Thông thường, tế bào có các cơ chế khác nhau để bảo vệ hệ gen của mình nhằm
ngăn chặn các đột biến gây ung thư, trong đó vai trò nổi bật thuộc về protein p53.
Protein p53 ngăn cản sự hình thành khối u thông qua ngăn chặn sự ảnh hưởng của
các tổn thương trên ADN cũng như các biến cố khác như sự tấn công của các gốc tự
do hay các tín hiệu kích thích tăng trưởng quá mức lên tế bào… Tùy vào mức độ
nghiêm trọng của biến cố, p53 đưa tế bào vào trạng thái bất hoạt, ngừng phân bào để
tiến hành sửa chữa ADN hoặc ra tín hiệu khởi phát chu trình chết tự nhiên của tế bào
[36]. Tuy nhiên, khi đột biến xảy ra quá mức kiểm soát của protein p53, nhiều sai sót
sẽ diễn ra trong chu trình chết tự nhiên của tế bào. Các tế bào này tiếp tục tồn tại, phát
triển vượt kiểm soát, hình thành nên các khối u [4].
3


1.2. Enzym caspase
1.2.1. Định nghĩa
Caspase là một họ các enzym cystein protease, giữ vai trò quan trọng trong việc
khởi phát chu trình chết tự nhiên của tế bào (apoptosis) cũng như trong phản ứng
viêm [25]. Tên gọi caspase là viết tắt của cụm “cysteine aspartate protease”, thể hiện

trực tiếp cơ chế hoạt động của họ enzym này: phân tử amino acid cystein tại trung
tâm hoạt động đóng vai là tác nhân nucleophil tấn công vào phân tử protein đích, từ
đó cắt liên kết peptid tạo bởi nhóm -COOH của acid aspartic [2].
1.2.2. Phân loại
Cho đến nay, đã phát hiện được 14 enzym caspase ở người và động vật và được
đánh số từ 1 đến 14. 14 enzym này được chia làm 3 nhóm dựa trên tác dụng sinh học
của chúng [11], chi tiết được trình bày trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Phân loại enzym caspase
Nhóm

Nhóm tham gia chu trình chết tự
nhiên (apoptosis)

Nhóm tham gia phản ứng viêm

Nhóm khác

Enzym

Nguồn gốc

Caspase 2

Người và động vật

Caspase 3

Người và động vật

Caspase 6

Người và động vật

Caspase 7

Người và động vật

Caspase 8

Người và động vật

Caspase 9

Người và động vật

Caspase 10

Người

Caspase 1

Người và động vật

Caspase 4

Người

Caspase 5

Người

Caspase 11

Động vật

Caspase 12

Người và động vật

Caspase 13

Động vật

Caspase 14

Người và động vật

4


Trong số các caspase, nhóm enzym tham gia chu trình apoptosis của tế bào ngày
càng được chú ý như là một đích tác dụng mới trong việc nghiên cứu thuốc điều trị
ung thư [5, 11, 13, 25].
1.2.3. Vai trò của enzym caspase trong chu trình chết tự nhiên của tế bào
Như đã liệt kê trong bảng 1.1, có 7 loại enzym caspase tham gia vào chu trình
apoptosis của tế bào. Chúng được chia làm 2 nhóm nhỏ, gồm:
- Nhóm khởi phát (initiator): gồm caspase 2, 8, 9, 10
- Nhóm thi hành (executioner): gồm caspase 3, 6, 7.
Thông qua các caspase, có 2 con đường hoạt hóa chu trình chết tự nhiên, gồm:
(1) con đường ngoại sinh thông qua receptor tại màng tế bào và (2) con đường nội

sinh xảy ra bên trong tế bào [12].
Con đường ngoại sinh được khởi phát khi các cơ chất bên ngoài gắn vào receptor
gây chết nằm trên màng tế bào. Quá trình này dẫn đến sự tạo thành phức hợp tín hiệu
gây chết (death inducing signalling complex). Kế đến, phức hợp này thu nhận và hoạt
hóa procaspase 8 thành caspase 8.
Trong khi đó, con đường nội sinh liên quan chủ yếu đến hoạt động của ti thể.
Các biến cố xảy ra như sự chiếu xạ, phơi nhiễm chất độc, tổn thương trên ADN…
kích thích sự chuyển các protein tiền apoptosis như Bax/Bak từ tế bào chất vào ti thể,
làm thay đổi tính thấm của màng. Cytochrom-c, theo chiều ngược lại, được giải phóng
từ khoảng trống giữa hai màng ti thể vào tế bào chất. Tại đây, cytochrom-c gắn với
các protein tiền apoptosis khác như Apaf1 tạo nên phức hợp được gọi là apoptosom.
Phức hợp này thu nhận và chuyển procaspase 9 thành caspase 9.
Kết quả của việc hình thành enzym caspase 8 theo con đường ngoại sinh hay
caspase 9 theo con đường nội sinh đều dẫn đến sự phân cắt procaspase 3 ở dạng không
có hoạt tính thành caspase 3 có hoạt tính nhờ vào tác dụng như một protease của hai
enzym này. Tương tự, với vai trò của một protease, caspase 3 khởi động một loạt các
phản ứng sinh hóa trong chu trình chết tự nhiên khi tác động lên đến hơn 300 cơ chất
khác nhau. Sự phân cắt ADN thành các đoạn nhỏ xảy ra do sự hoạt hóa endonuclease.
Song song với đó, các protein trong nhân tế bào cũng bị phân cắt, gây ra sự co ngót

5


nhân tế bào. Một cơ chất khác của caspase 3 là gelsolin bị ly giải, dẫn đến ức chế quá
trình polymer hóa tạo các vi sợi actin, làm gián đoạn các quá trình vận chuyển trong
nội bào và sự phân chia tế bào, dẫn đến sự phá vỡ bộ khung tế bào. Kết quả của quá
trình trên là sự hình thành các tiểu thể apoptotic và sau đó bị đại thực bào tiêu hủy.
Quá trình hoạt hóa chu trình apoptosis dưới tác dụng của enzym caspase được mô tả
tóm tắt trong hình 1.2.

Hình 1.2. Quá trình hoạt hóa chu trình chết tự nhiên thông qua enzym caspase

6


1.3. Các chất hoạt hóa enzym caspase 3
Như đã trình bày, caspase 3 là enzym tối quan trọng trong chu trình chết tự
nhiên. Các sai sót trong hoạt động của enzym này dẫn đến các sai sót trong chu trình
chết tự nhiên mà hậu quả có thể dẫn đến sự phát triển của các khối u ác tính. Thông
thường, caspase 3 tồn tại trong tế bào dưới dạng procaspase 3 không có hoạt tính.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự tăng nồng độ bất thường của proenzym này trong nhiều
loại tế bào ung thư khác nhau [9, 19, 21, 23, 25], gợi ý mối liên hệ giữa bệnh sinh của
ung thư với các thiếu sót trong quá trình chuyển procaspase 3 thành caspase 3.
1.3.1. Vai trò của ion kẽm trong sự hoạt hóa và hoạt động caspase 3
Kẽm là một nguyên tố vi lượng quan trọng trong các tế bào sống. Có đến 10 %
lượng protein trong cơ thể người có các vùng gắn kẽm trong cấu trúc của chúng [3].
Kẽm cũng giữ một vai trò quan trọng trong hoạt động của caspase 3. Nhiều
nghiên cứu đã chỉ ra bằng chứng về tác dụng ức chế enzym này của ion kẽm [1, 14].
Theo Eron và cộng sự [7], trong cấu trúc của caspase 3 có ba vùng liên kết gắn ion
kẽm. Một trong số chúng giữ vai trò ức chế sự hình thành caspase 3 từ proenzym của
nó, gây nên sự tăng nồng độ của proenzym này trong tế bào. Bên cạnh bất hoạt quá
trình trên, ion kẽm cũng gây ức chế hoạt động của caspase 3 do gây giảm đáng kể các
tương tác protein-protein trong quá trình nhận diện cơ chất. Trong khi đó, Truong
Tran và cộng sự [35] đặt ra giả thiết về tác dụng ức chế caspase 3 của ion kẽm thông
qua các tương tác của nó với nhóm thiol của Cys163 tại trung tâm hoạt động của
enzym này.
Do vậy, sử dụng các chất có khả năng “khóa” ion kẽm, ngăn sự tương tác của
nó với caspase 3 sẽ giúp làm tăng hoạt tính enzym của trong tế bào.
1.3.2. Một số chất hoạt hóa caspase 3
Một trong các cơ chế loại bỏ tác động của ion kẽm lên caspase 3 là sử dụng các

phân tử có khả năng tạo phức chelat bền vững với nó. Để có được khả năng này, các
hợp chất mang hợp phần acylhydrazon (-CONHN=) đã được đề xuất thiết kế và tổng
hợp. Cấu trúc chung của các hợp chất acylhydrazon và phức chất của chúng với ion
kẽm được thể hiện trong hình 1.3.

7


Hình 1.3. Cấu trúc chung của các acylhydrazon (a) và cấu trúc của phức chất của
acylhydrazon với ion kẽm (b)
Một trong số các chất đầu tiên hoạt hóa caspase 3 theo cơ chế này được tổng
hợp là PAC-1 (hình 1.4). Được công bố trong công trình nghiên cứu của K. S. Putt
và cộng sự đăng trên tạp chí Nature vào năm 2006, PAC-1 thể hiện tác dụng hoạt hóa
enzym caspase 3 tốt, với giá trị EC50 = 0,22 µM. Nó cũng đồng thời thể hiện tác dụng
gây độc tế bào trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau như bạch cầu, tế bào ung
thư vú, ung thư đại tràng, ung thư gan… [25, 38, 40].

Hình 1.4. Cấu trúc của PAC-1
Từ PAC-1, rất nhiều dẫn chất acylhydrazon khác nhau đã được tổng hợp và thử
tác dụng sinh học. WF-208 và WF-210 (hình 1.5) – hai dẫn chất của PAC-1 mang
khung oxadiazol được công bố bởi Wu và cộng sự [37, 38] cho giá trị độc tính tế bào
IC50 chỉ từ vài trăm nM đến vài µM và chúng đều cho độc tính mạnh hơn PAC-1 trên
các dòng tế bào thử nghiệm.

Hình 1.5. Cấu trúc của dẫn chất WF-208 và WF-210

8


Năm 2018, Kassab và cộng sự [17] đã thêm khung benzotriazol vào cấu trúc

của các acylhydrazon. Trong 17 dẫn chất được công bố, có 5 dẫn chất thể hiện tác
dụng gây độc tế bào ung thư tốt ở nồng độ thấp, trong đó dẫn chất 3q (hình 1.6) thể
hiện tác dụng gây độc trên 34 dòng tế bào ung thư khác nhau với giá trị ức chế sinh
trưởng tế bào trung bình là 45,80 % ở nồng độ 10 µM. Giá trị ức chế sinh trưởng tế
bào cao nhất của dẫn chất 3q được thể hiện trên dòng tế bào ung thư đại tràng HT-29
(86,86 %).

Hình 1.6. Cấu trúc của dẫn chất 3q
1.4. Tác dụng kháng tế bào ung thư của một số hợp chất mang khung 2Hbenzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on
1.4.1. Giới thiệu sơ lược một số tác dụng sinh học của một số hợp chất mang khung
2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on
Nhiều công trình nghiên cứu được công bố trên thế giới đã chỉ ra rằng nhiều
hợp chất mang khung 2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on mang nhiều tác dụng sinh
học phong phú, đa dạng. Có thể kể đến một số tác dụng sau:
- Tác dụng kháng khuẩn: năm 2010, Fang và cộng sự [8] đã công bố một số dẫn
chất mang khung 2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on với tác dụng ức chế một số
chủng vi khuẩn như Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli,
Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa với giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
nằm trong khoảng 16-64 µg/ml.
- Tác dụng chống viêm: là một tác dụng đáng chú ý của một số hợp chất mang
khung này. Trong công trình nghiên cứu của mình, Lanni và cộng sự [20] đã giới
thiệu một dãy các phenethyl benzo[1,4]oxazin-3-on với tác dụng chống viêm thông
cơ chế ức chế enzym PI3 kinase γ. Đây là loại enzym có mặt chủ yếu trong bạch cầu,
đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của viêm khớp dạng thấp cũng như
bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (COPD).

9


- Tác dụng chống kết tập tiểu cầu: công trình nghiên cứu của Tian và cộng sự

[33] vào năm 2011 đã công bố một dãy các chất mang khung 2Hbenzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on thể hiện tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu thông qua
việc ức chế ADP, một tác nhân thúc đẩy quá trình này.
1.4.2. Tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất mang khung 2Hbenzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on
Ngoài các tác dụng sinh học kể trên, tác dụng kháng ung thư của các hợp chất
mang khung 2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on cũng rất đáng chú ý. Trong các công
trình nghiên cứu công bố gần đây, cấu trúc của nhiều hợp chất kháng ung thư mới
được tìm ra chứa khung 2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on, trong đó nhiều hợp chất
cho tác dụng gây độc tế bào cao.
SB-590885 (hình 1.7) là một chất ức chế chọn lọc enzym B-Raf kinase [32],
một enzym đóng vai trò trong cơ chế bệnh sinh của nhiều loại ung thư, trong đó có
ung thư tế bào hắc tố ác tính và ung thư tuyến giáp [34]. Dựa trên khung cấu trúc 1,3imidazol với 3 nhóm thế aryl của SB-590885, Rajitha và cộng sự [26] đã thiết kế và
tổng hợp một số dẫn chất với khung 2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on đóng vai trò
là một trong ba nhóm thế. Khi tiến hành thử tác dụng ức chế sinh trưởng tế bào ung
thư, dẫn chất 9c (hình 1.7) cho hoạt tính sinh học mạnh với giá trị mức độ sống sót
của tế bào ung thư bạch cầu chỉ là 0,6 % ở nồng độ chất ức chế 20 µM.

Hình 1.7. Công thức cấu tạo của chất SB-590885 và dẫn chất 9c
Nhóm nghiên cứu của Zhou [41] đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của
benzoxazinon và thử hoạt tính sinh học của chúng trên dòng tế bào ung thư phổi
A549. Khi theo dõi ảnh hưởng của các chất lên chu trình sinh trưởng tế bào, nhóm
10


nhận thấy rằng chất 3c làm tăng thời gian pha G1 lên 24,76 %, đồng thời tăng nhẹ
thời gian pha G2 so với nhóm đối chiếu. Kéo dài thời gian pha G1, G2 được xem là
một trong các cơ chế giúp kéo dài thời gian phân chia tế bào, giảm sự phát triển của
tế bào ung thư [39].

Hình 1.8. Công thức cấu tạo của dẫn chất 3c
Hướng tới đích tác dụng là họ enzym tyrosin kinase và dựa trên cấu trúc của

semaxinib và sunitinib (là các chất thể hiện hoạt tính ức chế vượt trội nhiều loại
tyrosin kinase khác nhau [29, 30]) (hình 1.9), nhóm nghiên cứu của Honda và cộng
sự [15] đã tổng hợp một dãy các dẫn chất mang khung 1,4-benzoxazin-3-on. Trong
số các dẫn chất được công bố, dẫn chất 4r (hình 1.9) cho kết quả rất triển vọng với tỷ
lệ ức chế tyrosin kinase là 92,6 % ở nồng độ chất 4 µg/ml và giá trị IC50 chỉ là 0,29
µM.

Hình 1.9. Công thức cấu tạo của semaxanib, sunitinib và dẫn chất 4r
Kết quả từ các nghiên cứu về enzym caspase, các chất hoạt hóa enzym caspase
cũng như về tác dụng kháng tế bào ung thư của các hợp chất mang khung 3-oxo-2,3dihydro-4H-benzo[b][1,4]oxazin-4-yl đã tạo nền tảng lý thuyết và thực nghiệm cho
khóa luận tiếp cận hướng nghiên cứu tổng hợp và đánh giá tác dụng gây độc tế bào

11


ung thư của một số hợp chất acetohydrazid mang khung 2H-benzo[b][1,4]oxazin3(4H)-on. Khóa luận hy vọng tìm ra các dẫn chất acetohydrazid mới có tác dụng hoạt
hóa enzym caspase-3 với hoạt tính kháng tế bào ung thư cao vượt trội.

12


CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Hóa chất
Dung môi, hoá chất dùng phân tích, kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn HPLC.
Các dung môi, hóa chất dùng cho tổng hợp hóa học được nhập từ công ty Sigma
Aldrich hoặc Merck. Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp, không trải qua thêm
bất kỳ quá trình tinh chế nào. Bao gồm:
- Các benzaldehyd

- 2-Aminophenol

+ 2-Hydroxybenzaldehyd

- Cloroacetyl clorid

+ 4-Hydroxybenzaldehyd

- Ethyl cloroacetat

+ 2,3-Dihydroxybenzaldehyd

- Hydrazin monohydrat

+ 2,4-Dihydroxybenzaldehyd
+ 2,5-Dihydroxybenzaldehyd
+ 2,3,4-Trihydroxybenzaldehyd
+ 2-Hydroxy-4-methoxybenzaldehyd
Các dung môi, hóa chất khác như: nước cất, N,N-dimethylformamid (DMF),
aceton, isobutylmethyl ceton, dicloromethan (DCM), ethanol (EtOH), methanol
(MeOH), acid acetic (AcOH), K2CO3, KI, Na2SO4, NaOH, NaHCO3, HCl…
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC
- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, bình nón,
bình chiết, phễu thủy tinh, pipet, ống đong, cốc có mỏ các loại, sinh hàn hồi lưu
- Bình chạy sắc ký Camag
- Bản mỏng silica gel 60F254 để chạy sắc ký lớp mỏng
- Đèn tử ngoại VILBER LOURMAT bước sóng 254 nm và 366 nm
- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimadzu

- Máy cất quay chân không Buchi R-200
- Tủ lạnh, tủ sấy Memmert
13


- Máy siêu âm
- Máy Melting pointapparatus Smp3 để xác định nhiệt độ nóng chảy
- Máy FTIR Affinity-1S để xác định phổ IR, đặt tại khoa Hóa học – trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
- Máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM để ghi phổ MS, đặt tại khoa Hóa học –
trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
- Máy cộng hưởng từ Bruker AV-500 để ghi phổ 1H-NMR, 13C-NMR, đặt tại
khoa Hóa học – trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Tổng hợp hóa học
- Tổng hợp 7 chất:
✓ (E)-Nʹ-(2-Hydroxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-dihydro-4Hbenzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetohydrazid
✓ (E)-Nʹ-(4-Hydroxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-dihydro-4Hbenzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetohydrazid
✓ (E)-Nʹ-(2,3-Dihydroxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-dihydro-4Hbenzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetohydrazid
✓ (E)-Nʹ-(2,4-Dihydroxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-dihydro-4Hbenzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetohydrazid
✓ (E)-Nʹ-(2,5-Dihydroxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-dihydro-4Hbenzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetohydrazid
✓ (E)-Nʹ-(2,3,4-Trihydroxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-dihydro-4Hbenzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetohydrazid
✓ (E)-Nʹ-(2-Hydroxy-4-methoxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-dihydro-4Hbenzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetohydrazid
- Kiểm tra độ tinh khiết: bằng sắc ký lớp mỏng, đo nhiệt độ nóng chảy
- Xác định cấu trúc các chất vừa tổng hợp được: bằng phổ IR, MS, 1H-NMR,
13

C-NMR.

14

2.2.2. Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư của các chất tổng hợp được
Thử tác dụng gây độc tế bào trên 3 dòng tế bào ung thư, gồm: tế bào ung thư
đại tràng (SW620), tế bào ung thư tuyến tiền liệt (PC3), tế bào ung thư phổi (NCIH23).
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tổng hợp hóa học
- Dựa trên các nguyên tắc, phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tiến hành
tổng hợp các chất theo thiết kế. Các phản ứng cụ thể:
+ N-alkyl hóa với tác nhân ethyl cloroacetat
+ Phản ứng thế ái nhân acyl với tác nhân hydrazin monohydrat
+ Phản ứng ngưng tụ loại nước
+ Một số phản ứng cơ bản khác
- Theo dõi tiến trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC).
2.3.2. Kiểm tra độ tinh khiết
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau quá trình tinh chế bằng TLC và đo
nhiệt độ nóng chảy.
2.3.3. Xác định cấu trúc các chất tổng hợp được
Các chất sau khi được tổng hợp và đánh giá sơ bộ là tinh khiết được xác định
cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng
từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị carbon-13 (13CNMR).
- Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy FTIR Affinity-1S tại khoa Hóa học –
trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội với kỹ thuật viên nén
KBr. Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ
1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân
không để loại bỏ hơi ẩm. Quét phổ trong vùng 4000 – 400 cm-1 và ghi phổ ở độ phân
giải 4 cm-1.

15