Xác định hàm lượng một số whey protein trong thực phẩm bổ sung bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ THANH AN

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
MỘT SỐ WHEY PROTEIN TRONG
THỰC PHẨM BỔ SUNG BẰNG
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ THANH AN
Mã sinh viên: 1401007

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
MỘT SỐ WHEY PROTEIN TRONG
THỰC PHẨM BỔ SUNG BẰNG
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà
2. Ths. Nguyễn Thị Hồng Ngọc
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

2. Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực
phẩm Quốc gia
HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Phạm
Thị Thanh Hà và ThS. Nguyễn Thị Hồng Ngọc – những người thầy đã trực tiếp hướng
dẫn và chỉ bảo tận tình cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị tại
Khoa Nghiên cứu Thực phẩm- Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc
gia, các thầy cô giáo tại Bộ môn Hóa Phân tích- Độc chất… trong quá trình em thực
hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo tại Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất
đã giúp đỡ, chỉ bảo em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến:
Bộ môn Hóa phân tích- Độc chất
Khoa Nghiên cứu Thực phẩm- Viện Kiểm Nghiệm An toàn Vệ Sinh Thực phẩm Quốc gia
Đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn này.
Và cuối cùng em xin bày tỏ lòng yêu thương, biết ơn tới gia đình và bạn bè những
người đã luôn động viên, giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận
tốt nghiệp.
Hà Nội, ngày

tháng năm 2019

Sinh viên

Vũ Thị Thanh An

MỤC LỤC
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................................ 3

1.1. Tổng quan về Whey protein ........................................................................... 3
1.1.1. Giới thiệu về Whey protein ......................................................................... 3
1.1.2. Tổng quan về α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin .................................... 7
1.1.3. Phương pháp xác định hàm lượng α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin .... 9
1.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC .............................................................. 13
1.2.1. Khái niệm .................................................................................................. 13
1.2.2. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký ............................................ 14
1.2.3. Sắc ký trên gel ........................................................................................... 14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 15

2.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................... 15
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 15
2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký .......................................................................... 15
2.2.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu ............................................................. 16
2.2.3. Thẩm định phương pháp ........................................................................... 18
2.2.4. Áp dụng phương pháp để phân tích hàm lượng α-LA và β-LG trong mẫu
thực. ................................................................................................................... 18
2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất ........................................................................... 18
2.3.1. Thiết bị, dụng cụ........................................................................................ 18
2.3.2. Hóa chất, chất chuẩn ................................................................................. 19
2.4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 19
2.4.1. Phương pháp chuẩn bị dung dịch chuẩn ................................................... 19


2.4.2. Phương pháp xử lý mẫu dự kiến ............................................................... 19
2.4.3. Phương pháp phân tích bằng sắc ký dự kiến ............................................. 20

2.4.4. Phương pháp thẩm định ............................................................................ 20
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................................ 23

3.1. Xây dựng phương pháp phân tích ................................................................ 23
3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký .......................................................................... 23
3.1.2. Khảo sát và lựa chọn pha động ................................................................. 25
3.1.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn ......................................................................... 27
3.1.4. Khảo sát và xây dựng quy trình xử lý mẫu ............................................... 28
3.1.5. Thẩm định phương pháp ........................................................................... 32
3.2. Phân tích mẫu thực tế ................................................................................... 38
3.3. Bàn luận........................................................................................................ 38
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 40

4.1. Kết luận ........................................................................................................ 40
4.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 40


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

AF

Formic acid

Acid formic

Association of Official Analytical

Hiệp hội các cộng đồng phân

Commodities

tích chính thức

CE

Capillary Electrophoresis

Điện di mao quản

D

Dilute

Pha loãng

Enzyme-Linked Immune-Sorbent

Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch

AOAC

ELISA

Assay
HPLC

High Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography
LOD

Limit Of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit Of Quantification

Giới hạn định lượng

Mobile phase

Pha động

DAD

Diod Array Detector

Detector mảng diod

SEC

Size Exclusion Chromatography

Sắc ký loại cỡ

SP

Station phase

Pha tĩnh

TF

Total Flow

Tốc độ dòng

TFA

Trifluoroacetic acid

Acid trifluoroacetic

α-LA

α- Lactalbumin

α- Lactalbumin

β-LG

β- Lactoglobulin

β- Lactoglobulin

MP


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hàm lượng các acid amin trong whey protein ................................................4
Bảng 1.2. Tóm tắt các hoạt tính sinh học thường gặp của whey protein ........................6
Bảng 1.3. Một số phương pháp xác định α-LA và β-LG trong sữa và các sản phẩm sữa
.........................................................................................................................................9
Bảng 1.4. Một số phương pháp phân tích α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin sử dụng
thiết bị HPLC .................................................................................................................11
Bảng 3.1. Khảo sát thành phần pha động ......................................................................25
Bảng 3.2. Khảo sát và lựa chọn tốc độ dòng .................................................................26
Bảng 3.3. Khảo sát dung môi chiết................................................................................30
Bảng 3.4. Đường chuẩn α- Lactalbumin .......................................................................34
Bảng 3.5. Đường chuẩn β- Lactoglobulin .....................................................................34
Bảng 3.6. Kết quả độ chụm trên 3 nền mẫu ..................................................................36
Bảng 3.7. Kết quả độ chụm trung gian trên 3 nền mẫu .................................................36
Bảng 3.8. Kết quả phân tích độ đúng ............................................................................37
Bảng 3.9. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế ...................................................................38

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Sự khác biệt về thành phần α- LA và β-LG trong các 3 loại sữa ....................3
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của α- Lactalbumin ..............................................................7
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của β- Lactoglobulin ...........................................................8
Hình 1.4. Mô hình mô phỏng pha tĩnh cột SEC và chất phân tích bị lưu giữ ...............14
Hình 3.1. Lựa chọn pha tĩnh ..........................................................................................24
Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động.......................................................26
Hình 3.3. Sắc ký đồ khảo sát pha động .........................................................................27
Hình 3.4. Khảo sát quy trình chiết α-LA và β-LG ........................................................28
Hình 3.5. Biểu đồ đánh giá sự ảnh hưởng của pH đến α- LA và β- LG .......................28
Hình 3.6. Mẫu chiết tại các pH khác nhau ....................................................................29
Hình 3.7. Hình ảnh cảm quan dịch chiết của 4 dung môi chiết mẫu .............................30
Hình 3.8. Khảo sát số lần chiết ......................................................................................31
Hình 3.9. Sự thay đổi của α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin theo nhiệt độ chiết .....31
Hình 3.10. Quy trình chiết α-LA và β-LG từ mẫu ........................................................32
Hình 3.11. Sắc đồ và phổ của mẫu trắng, mẫu chuẩn đơn, mẫu chuẩn mix, mẫu thực và
mẫu thực thêm chuẩn của α-LA và β-LG trên nền sữa bột ...........................................33
Hình 3.12. Đường chuẩn α- Lactalbumin ......................................................................34
Hình 3.13. Đường chuẩn β- Lactoglobulin....................................................................35


ĐẶT VẤN ĐỀ
Chiếm gần 20% về khối lượng protein trong sữa, whey protein được biết đến như một
nguồn dinh dưỡng dồi dào, bổ sung các acid amin thiết yếu cho cơ thể cùng các lợi ích sức
khỏe khác như khả năng chống ung thư, tăng cường hệ miễn dịch, hỗ trợ điều trị cho các
bệnh nhân HIV, viêm gan B, bệnh tim mạch, loãng xương. Nhờ các lợi ích với cơ thể, whey
protein được bổ sung vào nhiều loại sản phẩm khác nhau, phù hợp với các nhóm người tiêu
dùng khác nhau, từ trẻ sơ sinh đến những người có nhu cầu đặc biệt [10]. Đó là các sản
phẩm thực phẩm bổ sung, thức uống dinh dưỡng cho người vận động mạnh (vận động viên,

người tập thể thao, thể hình…) và dùng cho một số tình trạng bệnh lý (kém hấp thụ và
chuyển hóa protein). Thị trường thực phẩm bổ sung whey protein toàn cầu dự kiến sẽ tăng
trưởng với tốc độ nhanh do tính chất chức năng đa dạng và ứng dụng rộng lớn của nó.
Hiện nay trên thế giới, nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản xuất whey protein là các
loại sữa bò, sữa dê và sữa cừu. Tuy nhiên tỷ lệ các thành phần của whey protein trong các
loại sữa lại là khác nhau [24], đặc biệt khác với sữa mẹ vì trong sữa mẹ lại không có thành
phần β- Lactoglobulin [21] (loại protein chiếm tỷ lệ lớn nhất trong whey protein) có thể gây
dị ứng ở trẻ sơ sinh. Ngoài β- Lactoglobulin, các thành phần sinh học của whey bao gồm αLactalbumin, lactoferrin, glycomacropeptide, và immunoglobulin. Trong các thành phần
trên, α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin, vừa là 2 protein chiếm tỷ lệ lớn nhất vừa có những
hoạt tính sinh học quan trọng, thường hay được tách riêng và bổ sung ghi trên nhãn của
nhiều sản phẩm.
Đang có đà phát triển mạnh với vô số các loại sản phẩm đang được lưu hành kèm theo
sự khác biệt về thành phần trong các nguồn nguyên liệu, thị trường thực phẩm bổ sung

whey protein cần được kiểm soát chặt chẽ hơn để đảm bảo quyền lợi của người tiêu
dùng. Theo FDA, đây cũng là một trong những loại mặt hàng thực phẩm bổ sung được
tập trung kiểm soát tại Hoa Kỳ. Tuy nhiên, tính đến thời điểm hiện tại trên thế giới chỉ có
duy nhất Trung Quốc là đã có công bố tiêu chuẩn chất lượng của whey protein [44]. Xét
riêng trên phạm vi Việt Nam thì chưa có nghiên cứu nào xác định đồng thời α- Lactalbumin
và β- Lactoglobulin trong các thực phẩm bổ sung có chứa whey protein.

1


Do đó đề tài: “Xác định hàm lượng một số whey protein trong thực phẩm bổ sung
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” được thực hiện với các mục đích sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời α-Lactalbumin và βLactoglobulin trong thực phẩm bổ sung trên 3 nền mẫu: sữa bột, sữa lỏng và bột
whey.
2. Áp dụng phương pháp để phân tích hàm lượng α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin
trong một số thực phẩm bổ sung trên thị trường.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Whey protein
1.1.1. Giới thiệu về Whey protein
Whey protein là một trong hai loại protein quan trọng được tìm thấy trong sữa, thu
được khi loại bỏ casein bằng cách acid hóa hoặc xử lý với chymosin [36]. Là một sản phẩm
phụ chiếm lượng lớn trong quá trình sản xuất phô mai (9 lít whey được sản xuất từ 10 lít
sữa trong quá trình làm phô mai) [27], whey được coi là nguồn cung cấp protein dồi dào
được sử dụng trong nhiều loại thực phẩm bổ sung.
Sự khác biệt về tính chất hóa lý của casein và whey protein tạo nên sự khác biệt về
công dụng của chúng khi sử dụng. Whey protein được tiêu hóa nhanh chóng trong khi casein
được tiêu hóa chậm hơn. Việc phân biệt casein và whey protein dựa trên sự đóng góp của
chúng để tổng hợp protein và ảnh hưởng của chúng đến nồng độ acid amin huyết tương
[42]. Ở người, lượng whey dung nạp 0,45 (g/kg) thể trọng dẫn đến sự gia tăng nhanh chóng,
nhưng ngắn và tạm thời của các acid amin huyết tương đạt cực đại sau 40 phút đến 2 giờ
sau khi uống và trở về giá trị cơ bản sau 3 đến 4 giờ. Ngược lại, casein chuyển hóa chậm,
dẫn đến nồng độ acid amin huyết tương tăng chậm hơn và thấp hơn, nhưng duy trì một nồng
độ kéo dài ít nhất 7 giờ sau khi tiêu thụ [26].
Sữa cừu

Sữa bò

Sữa dê

Hình 1.1. Sự khác biệt về thành phần α- LA và β-LG trong các 3 loại sữa
Để sản xuất ra whey protein, nguyên liệu đầu vào chính là các loại sữa. Tuy nhiên,
một nghiên cứu tiến hành dựa trên 120 mẫu sữa tươi thu hoạch từ 3 loài động vật: bò, cừu

và dê đã cho thấy sự khác nhau về hàm lượng α- LA và β-LG giữa 3 loài kể trên (Hình ảnh
1.1) [24]. Chính vì thế, tùy thuộc vào loại sữa đầu vào mà lượng whey protein thu được
cũng như các thành phần có trong bột whey protein cuối cùng sẽ có sự thay đổi.

3


Cấu trúc - Thành phần:
Cũng giống như bất kỳ một loại protein nào, whey protein có 4 bậc cấu trúc: Bậc
1_trình tự các acid amin liên kết với nhau bằng liên kết peptid; Bậc 2_sự gấp nếp β và xoắn
α (xoắn α là một đặc tính xác định của các protein dạng cầu nhỏ gọn với nhiều nếp gấp,
chẳng hạn như α-LA, ngược lại, gấp nếp β là một đặc tính xác định của các protein dạng
sợi dài và cứng hơn, như β-LG); Bậc 3_ Cấu trúc ba chiều tổng thể của một protein (sự liên
kết của α-helices và β-sheet của các cấu trúc bậc 2 trong protein); Bậc 4_được xác định bởi
sự kết hợp của nhiều chuỗi peptid được tổ chức với nhau bởi các liên kết cộng hóa trị. Dù
ở bậc cấu trúc nào whey protein cũng có thể bị biến tính bởi các tác nhân như nhiệt độ, pH
hay lực chia cắt. Khi biến tính, các hoạt tính sinh học của whey protein sẽ vì đó mà bị mất
đi [8].

Bảng 1.1. Hàm lượng các acid amin trong whey protein
Amino acid

Hàm lượng

Amino acid

(g/100g)

Hàm lượng
(g/100g)

Aspartatic

9,80

Tyrosin

3,76

Glutamic

16,37

Valin

4,53

Serin

3,56

Methionin

2,13

Glycin

1,64

Isoleucin

6,41

Histidin

2,04

Leucin

12,56

Arginin

2,30

Phenylalanin

4,00

Threonin

4,63

Lysin

10,68

Alanin

4,80

Tryptophan

2,86

Prolin

3,76

Cystein

4,17

Về mặt thành phần, whey protein là một hỗn hợp các phân tử protein hình cầu như: βLG (chiếm ~50% w/w), α- LA (chiếm ~20% w/w), immunoglobulin (IgG, chiếm ~10%
w/w), albumin huyết thanh (BSA, chiếm ~6% w/w) và một số các protein khác như:
lactoferrin, proteose peptone 3, osteopontin, glycomacropeptid, lactoperoxidase, lysozyme,
…[28] . Xét chi cụ thể về tỷ lệ các acid amin trong whey protein ta có thể tìm thấy lượng
lớn các acid amin thiết yếu như leucin, glutamic, lysin, … Hàm lượng cụ thể của các aicd
amin trong whey protein được thể hiện trong Bảng 1.1 [29].

4


Tác dụng- ứng dụng:
Khi xem xét whey protein dưới góc nhìn như 1 loại thực phẩm, các lĩnh vực được ứng
dụng chủ yếu của whey protein là trong sản xuất bánh kẹo, đố uồng, thực phẩm chứa hàm
lượng protein cao dành cho các đối tượng đặc biệt… Ngoài vai trò là một thành phần thức
ăn, whey protein còn có nhiều tính năng sinh lý có ý nghĩa quan trọng đối với việc điều trị
một số các bệnh [9]. Xét tổng thể (khi chưa tiến hành thủy phân tạo các peptid có hoạt tính
sinh học), 2 tác dụng lớn nhất của whey protein là có khả năng phòng ngừa ung thư và bổ

sung glutathione.
Đầu tiên, đối với khả năng phòng ngữa ung thư, có rất nhiều các nghiên cứu chỉ ra
tác dụng phòng ngữa ung thư vú, ung thư dạ dày hay ung thư do nhiễm hóa chất đã được
thực hiện. Điển hình, khi tiến hành nghiên khả năng ức chế tế bào ung thư trên chuột (ung
thư biểu mô đại tràng do 1,2-dimethylhydrazine) của whey protein và casein bằng cách cho
ăn với chế độ ăn 20g whey protein hoặc casein /100g trọng lượng cơ thể và theo dõi trong
4 tuần. Kết quả là diện tích khối u ở những con chuột được nuôi bằng whey protein nhỏ hơn
đáng kể so với nhóm casein; vào cuối thí nghiệm, tất cả các động vật liên tục cho ăn chế độ
ăn whey protein được tìm thấy còn sống, trong khi 33% những động vật ăn chế độ casein
đã chết [33].
Thứ hai, đối với khả năng bổ sung glutathione, trong thử nghiệm lâm sàng mù đôi tiến
hành trên 30 bệnh nhân (25 nam, 5 nữ, tuổi trung bình 42) bị nhiễm HIV (đối tượng có triệu
chứng là sự thụt giảm nồng độ glutathione trong máu) được chọn ngẫu nhiên vào nhóm có
chế độ ăn bổ sung hàng ngày 45 g whey protein trong hai tuần. Kết quả, tiền trị liệu, nồng
độ glutathione huyết tương thấp hơn bình thường; sau hai tuần bổ sung bằng whey protein,
nồng độ glutathione trong huyết tương đã tăng trong nhóm có sử dụng whey protein [30].
Ngoài ra, khi tiến hành nghiên cứu sâu hơn vào từng thành phần của whey protein,
người ta nhận thấy tiềm năng có tác dụng sinh lý của chúng là rất lớn. Từ thành phần có
hàm lượng nhỏ như lactoferrin cũng có khả năng kích thích miễn dịch, tăng cường đáp ứng
kháng thể- kháng nguyên, … hay 2 protein chính là α- LA và β- LG đều có hoạt tính opioid,
ức chế enzymm ACE… Cụ thể một số hoạt tính sinh học khác của whey protein được thể
hiện ở bảng 1.2 [34].

5


Bảng 1.2. Tóm tắt các hoạt tính sinh học thường gặp của whey protein
Hoạt tính sinh học

Chức năng

soát Chuyển đổi Angiotensin I thành Angiotensin II gây co mạch, kiểm

Kiểm

cholesterol máu

soát huyết áp cao bằng cách co giãn các mạch máu, giảm HDL
cholesterol, ức chế sự hấp thụ cholesterol, giảm cholesterol toàn phần

Chống ung thư

Bảo vệ cơ thể, chống lại khối u đại tràng và vú, chống lại sự oxy hóa
gây chết tế bào, hạn chế sự phân chia tế bào trong đường ruột, điều
trị để hạn chế sự phát triển của khối u.

Hệ

thống

miễn Tăng cường đáp ứng miễn dịch, thúc đẩy các quá trình chống viêm,

dịch

kích hoạt các tế bào thực bào (tế bào mast, bạch cầu trung tính, bạch
cầu đơn nhân), tăng cường khả năng miễn dịch của tế bào.

Phát triển mô, cơ

Giảm thoái hóa ở gan, hạn chế mất cơ trong quá trình lão hóa,

kích thích tiết insulin, giảm dị hóa ở bệnh nhân chấn thương

Kháng khuẩn

Kháng khuẩn với Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes,
Salmonella sp, Escheria choli 0157: H7, chống vi khuẩn gram dương

Kháng vi-rút

Kháng virus, chống virus herpes, virus parainfluenza bò, virus viêm
gan C.

Đặc tính lý hóa
-

Độ hòa tan: Các đặc tính liên quan đến độ hòa tan của whey protein bao gồm tương

tác nhiệt động giữa protein và dung môi, các điều kiện môi trường của pH, ion và tương tác
với các thành phần khác [38]. Whey protein có độ hòa tan tốt trong khoảng pH rộng (từ pH
2-9) [32]. Tuy nhiên, chúng hòa tan nhiều hơn trong điều kiện pH acid mạnh hoặc kiềm
mạnh do lực đẩy của các phân tử khi mang điện tích chung vượt quá dẫn đến độ hòa tan
Ngoài ra, độ hòa tan protein giảm khi tiến đến gần điểm đẳng điện pKi~4,5 dù ở mức nhiệt
độ nào (do có cấu tạo bao gồm nhiều thành phần protein khác nhau nên pKi của whey protein
không phải pKi của β-LG hay α-LA) [13].
Xem xét khả năng hòa tan của bột whey protein, ta thấy dung môi thường là nước.
Khả năng hydrat hóa của whey protein ~ 0,45 – 0,52 (g nước/g protein) [19]. Các đặc tính
độ nhớt, tạo bọt, nhũ hóa và tạo gel đều bị ảnh hưởng bởi độ hòa tan protein [14].

6

-

Độ nhớt: Vì whey protein chủ yếu là α-LA và β-LG, là các protein hình cầu, bột

whey protein có khả năng hòa tan lớn trong điều kiện tự nhiên. Độ nhớt của dung dịch whey
protein phụ thuộc nồng độ protein và sự biến tính protein trong bột protein whey. Ví dụ, sự
gia tăng nồng độ whey protein làm cho các tương tác giữa các phân tử điều này dẫn đến
tăng độ nhớt [8].
1.1.2. Tổng quan về α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin
α- Lactalbumin
- Đặc điểm: α-LA là một loại protein liên kết cation nhỏ, có tính acid, chiếm khoảng
20% - 25% về khối lượng trong whey protein; α-LA có khối lượng phân tử 14200 Da, bao
gồm 123 acid amin tạo thành cấu trúc hình cầu nhỏ gọn được ổn định bởi bốn liên kết
disulfide (Cys6, Cys120, Cys61, Cys77, Cy73, Cys91, và Cys28, Cys11). Có hai biến thể
A và B do sự khác biệt về mặt di truyền giữa các loài nhưng cả 2 biến thể đều chứa 4 liên
kết disulfide và không có nhóm thiol tự do. Trong thành phần cấu tạo, α-LA có liên kết
mạnh với một Ca2+, α-LA có pKi = 4-5 và bị phân hủy tại 60℃ [12].

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của α- Lactalbumin
-

Hoạt tính sinh học- chức năng: α- LA là 1 loại lactose synthase; enzym xúc tác phản

ứng tạo lactose, phản ứng diễn ra trong lòng Golgi và cần các ion Mn2+: UDP-gal + glucose
→ lactose + UDP. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng α- LA có nhiều hoạt tính sinh học điển
hình như giảm căng thẳng, kháng khuẩn, hoạt tính opioid, chống tăng huyết áp, chống loét
và điều hòa miễn dịch [31]. Đặc biệt, α- LA làm giảm nguy cơ mắc một số bệnh ung thư vì
nó hạn chế sự phân chia tế bào, gây ra sự chết rụng tế bào ung thư thông qua apoptosis_ chu
trình tự chết của tế bào [5]. α- LA rất giàu acid amin thiết yếu, đóng vai trò quan trọng trong

7


việc cung cấp các loại acid amin cho cơ thể nhất là đối với các đối tượng đặc biệt như trẻ sơ
sinh hay người già.
Beta-Lactoglobulin
-

Đặc điểm: β- LG là protein chính trong whey, chiếm 60-65% khối lượng whey. β-

LG là dải trình tự gồm 162 acid amin xếp theo cấu trúc bậc 3 protein, trong đó có 2 cầu
disulfide và 1 nhóm -SH tự do. Acid amin chủ yếu của β- LG là Leucine (13,5 %). β- LG
có khối lượng phân tử khoảng 18400Da, gồm 2 loại là β- LG A (pKi =5,1) và β- LG B
(pKi=5,2). Trong khoảng pH 3,5 – 7,5, β- LG tồn tại dưới dạng dimer (β- LG A và B), ngoài
khoảng pH này β- LG có thể tồn tại dưới dạng monomeric, tetrameric, octameric. β- LG bị
phân hủy bởi nhiệt ở nhiệt độ 60℃ [20].

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của β- Lactoglobulin
-

Hoạt tính sinh học- chức năng: β- LG không có mặt trong thành phần sữa mẹ nên có

vai trò quan trọng trong việc hình thành hệ miễn dịch thụ động cho trẻ sơ sinh và điều hòa
chuyển hóa phospho ở tuyến vú đồng thời cũng được xem như một trong những dị tố có thể
gây dị ứng ở trẻ [21]. Hàm lượng acid amin của protein này khá quan trọng, vì bên cạnh
việc thúc đẩy tăng trưởng cơ bắp, nó là một nguồn giàu cysteine thiết yếu, rất quan trọng
để tổng hợp glutathione [40]. Cụ thể, protein này liên kết với các acid béo tự do khi chúng
được giải phóng bởi các lipase pregastric, để tạo điều kiện cho việc tiêu hóa chất béo trong
sữa [25]. Do các lợi ích đem lại, β- LG hiện đang được quan tâm trong ngành công nghiệp

chế biến các sản phẩm sữa.

8


1.1.3. Phương pháp xác định hàm lượng α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin
Hiện tại trên thế giới đã có một số nghiên cứu và các phương pháp tiêu chuẩn xác định
hàm lượng α- LA và β- LG trong thực phẩm bổ sung như trong Bảng 1.3.

Bảng 1.3. Một số phương pháp xác định α-LA và β-LG trong sữa và các sản phẩm sữa
PPPT

Kết quả đạt được

Nguyên tắc

Tài liệu

Ưu – nhược điểm
Phương

Định lượng protein thông Phương pháp này đơn giản, dễ thực

[22]

pháp đo qua hàm lượng Nitơ tổng hiện nhưng chỉ áp dụng được cho mẫu
độ

hấp bằng phản ứng phản ứng tạo nguyên liệu đơn thành phần và không

thụ UV- phức màu với Cu2+ trong môi chọn lọc cho đúng protein đang cần
trường

VIS

kiềm

(phản

ứng phân tích.

Biuret); bước sóng 560 nm.
Phương

Phương pháp ELISA đặc Phương pháp này cho độ chụm và độ

pháp

hiệu cho β-LG do phản ứng đúng đạt yêu cầu về thẩm định của

ELISA

miễn dịch xảy ra giữa β- LG AOAC với giới hạn định lượng 0,22
và kháng thể tương ứng.

[7]

mg/kg và giới hạn phát hiện 0,07
mg/kg.
Chi phí đắt, khả năng nhiễm chéo lớn

và không có khả năng định lượng đồng
thời, phương pháp này chưa được áp
dụng nhiều tại Việt Nam.

Phương

Sử dụng mao quản kỵ nước, Tách hoàn toàn β- LG và p--casein,

pháp

kết hợp với dung dịch đệm cho phép định lượng của cả hai thành

điện

di

[11]

điện di acid citric 0,48 M – phần. Các giới hạn xác định là 0,16 và

mao

citrate 13,6 mM – urê 4,8 M 0,14 mg/mL với độ thu hồi trung bình

quản

ở pH 2,3, và điện áp tách 25 lần lượt là 99,54 và 105,18% đối với βkV.

LG và p--casein.

Phương

Xác định đồng thời α-LA và Phương pháp đã được thẩm định

pháp sắc

β-LG bằng phương pháp sắc khoảng tuyến tính (R2 ≥ 0,9991), độ

ký lỏng

ký lỏng hiệu năng cao ghép nhạy (giới hạn định lượng 0,15 –

9

[43]


phổ. 0,19 μg/mL), độ thu hồi (94,0 –

rửa

giải 98,7%), độ chụm (độ lệch chuẩn tương

nối

detector

Chương

khối phổ

gradien với pha động gồm đối ≤ 11,1%) và độ chụm trung gian
acid

detector

khối

sử dụng

trình

trifluoroacetic

acid (độ lệch chuẩn tương đối ≤ 5,7%);

(TFA) 0,1% trong nước giảm thời gian phân tích và giảm giới
(kênh A) và TFA 0,1% trong hạn phát hiện.
acetonitril (kênh B), cột sắc
ký Acquity UPLC BEH300
C18

(150 mm × 2,1 mm,

1,7 μm) được sử dụng để thu
được hiệu quả tách tốt nhất.
Phương

Xác định đồng thời α-LA, β- Độ chụm tốt với độ lệch chuẩn tương

pháp sắc

LG,

ký lỏng

pepton, caseinomacropeptid cả

sử dụng

trong mẫu bột whey. Phương immunoglobulin G và albumin (RSD

detector

pháp sử dụng cột Resource đạt 7 – 10%). Giới hạn định lượng và

UV-VIS

RPC cho phép tách protein giới hạn phát hiện trên nền mẫu whey

albumin,

[18]

proteose đối trong và giữa các ngày ≤ 5% với tất
các

protein

ngoại

trừ

trong 30 phút và có thể áp protein cô đặc và whey protein phân
dụng để phân tích protein lập lần lượt là 0,3% và 1,0% cho tất cả
hòa tan trong nhiều sản các protein, trừ IgG có LOD và LOQ
phẩm whey thương mại và lần lượt là 0,6% và 2,0%.
trong phòng thí nghiệm.
Phương pháp điện di mao quản và phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detector khối
phổ có độ nhạy và độ chọn lọc cao, tuy nhiên yêu cầu quá trình xử lý mẫu phức tạp, trang
thiết bị đắt tiền. Trong khi đó, phương pháp HPLC là phương pháp ổn định, hiệu quả, sử
dụng hóa chất và thiết bị thông thường, dễ triển khai, phù hợp với điều kiện của các phòng
thí nghiệm tại Việt Nam. Tính đến thời điểm hiện tại, đã có rất nhiều các phương pháp phân
tích đồng thời α- LA và β- LG theo hướng sử dụng thiết bị HPLC với các loại cột khác nhau
như trong Bảng 1.4.

10


Bảng 1.4. Một số phương pháp phân tích α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin
sử dụng thiết bị HPLC
Phương pháp phân tích

Kết quả đạt được
Ưu – nhược điểm

Phân

tích

đồng -

TLTK

Kết quả cho thấy độ thu hồi của α-LA và β-LG

thời α-LA và β-LG là 86,12% -104,38%, cột C18 có khả năng chịu acid và
trong sữa bò bằng ổn định hơn, tăng độ phân giải giữa các peak so với cột
Sắc
ký

cột C4 và C18 trên C4.
hệ thống HPLC.

hấp
phụ

Phương pháp này có thể tách hai protein rõ ràng,

-

điều kiện tiến hành đơn giản, nhưng mới chỉ áp dụng

lỏng
-

[23]

trong nền mẫu sữa bò tươi.
So sánh hiệu năng

-

2 phương pháp CE

α-LA, β-LG A và β-LG B trong bột sữa, sữa non và sữa

với detector UV và

bò nguyên liệu trong khi phương pháp HPLC chỉ có thể

HPLC (cột C8) với

được sử dụng để định lượng β-LG A và β-LG B do sự

detector PDA.

đồng rửa giải của lactoferrin với α-LA. Độ thu hồi của

Phương pháp CE phù hợp để xác định đồng thời

[41]

cả hai phương pháp đạt khoảng 90,7% đến 116,8%.
Phân tích một số

-

thành phần whey

(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden); các

protein trên nền

dung dịch đệm citrate phosphate có độ pH khác nhau

mẫu

hoàn

(2,6 đến 7,0); NaCl có nồng độ cuối là 0,2 M hoặc 0,4

Sắc

nguyên sử dụng

M; pH được điều chỉnh bằng NaOH 2M hoặc HCl 2M;

ký

cột sắc ký loại cỡ

Tốc độ dòng 1,0 mL / phút, thể tích tiêm mẫu:10 µL.

sữa

Cột sắc ký loại cỡ Superose 12 column

lỏng

Bước sóng phát hiện là 280nm. Kết quả đã định lượng

–

được cả α- LA và β- LG tương ứng là 0,14% và 0,38%
trong mẫu sữa.

loại
cỡ

[6]

Xác

định

whey

-

Cột SEC (Superose 6HR 10/30 và 12HR 10/30

protein có trong

được sản xuất bởi Amersham Pharmacia Biotech AB,

các

thực

Uppsala, Sweden) Pha động bao gồm 20mM

phẩm bổ sung hệ

Imidazole, 50mM NaCl và NaN3 0.1%(w/w) được

thống sắc ký lỏng

điều chỉnh về pH 7,0; tốc độ dòng là 0,4mL/ph; thể

mẫu

11

[39]


với cột SEC kết

tích tiếm là 50µL; bước sóng phát hiện 280nm.

hợp cùng detector

Phương pháp đã xác định được Immunoglobulin G,

PDA

BSA, α- LA và β- LG với các chất chuẩn tương ứng.
-

Hàm lượng α- LA và β- LG trung bình tương ứng

khoảng 15-21% và 48-73%, kết quả này tương đồng
với nhiều báo cáo trước đây về hàm lượng α- LA và
β- LG có trong các mẫu whey protein.
Tác giả Carina Pinho cùng các cộng sự vào năm 2012 đã tiến hành nghiên cứu so
sánh 2 phương pháp là sắc ký lỏng hiệu năng cao với cột sắc ký loại cỡ (SEC) và sắc ký
pha đảo (RP) để theo dõi quá trình xử lý nhiệt của các mẫu sữa bò và sữa lừa. Với cách tiếp
cận thứ nhất sử dụng cột sắc ký loại cỡ, cột SEC được sử dụng là cột Gilson chromatograph
(Gilson Medical Electronics, France); pha động bao gồm: NaCl 0,075M; KH2PO4 0,025M
được điều chỉnh về pH 7,0 bằng KOH 1M; tốc độ dòng 0,5mL/ph; bước sóng phát hiện
280nm. Với cách tiếp cận thứ 2 là sử dụng RP-HPLC, cột RP được sử dụng là cột
polystyrene-divinylbenzene Chrompack P 300 RP column (Sao Paulo, Brazil) (8 μm, 300
Å, 150×4·6 I.D); pha động gồm 2 kênh A: 0,1% acid trifluoroacetic trong nước và kênh B:
0,1% acid trifluoroacetic trong acetonitril; gradien: 0–5 ph: 33–35% B, 5–9 ph: 35–37% B,
9–18ph: 37–39% B, 18–33ph: 39% B, 33–45ph: 39–55% B, 45–50ph: 55– 33% B, 50–
55ph: 33% B; kết hợp cùng detector PDA (JMBS Developments, Le Fontanil, France) bước
sóng phát hiện là 214nm. Cả 2 cách tiếp cận đều được thẩm định dựa trên các tiêu chí như
độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ chụm, độ đúng và LOD và có các kết quả tương đương
giữa 2 cách tiếp cận trong việc định lượng đồng thời α- LA; β- LG, lysozyme và casein
trong các mẫu sữa bò và sữa lừa [15].
Theo TCVN 9660:2013 (ISO 13875:2005) về Sữa dạng lỏng - Xác định hàm
lượng β-LG tan trong acid, mẫu sữa lỏng (sữa tươi, thanh trùng và sữa đặc) được chỉnh pH
đến mức dưới 4,6 để kết tủa casein. Dịch chiết mẫu còn lại sẽ được pha loãng thích hợp và
phân tích trên hệ thống HPLC. Phương pháp này có ưu điểm là dễ thực hiện, có thể áp dụng
được tại nhiều phòng thí nghiệm, nhưng mới chỉ áp dụng cho nền sữa lỏng, chưa có thử
nghiệm với các nền sữa bột và một số sản phẩm sữa khác như phomat. Mặt khác, phương

12

pháp mới chỉ dừng lại tại một loại protein là β-LG, còn thành phần α-LA không được đề
cập đến [1].
Dựa trên quá trình nghiên cứu viết báo (bài báo “Thẩm định phương pháp phân tích
hàm lượng một số whey protein trong thực phẩm bổ sung bẳng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu
năng cao” trên tạp chí của Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia), nhóm
nghiên cứu rút ra một số nhận xét khi sử dụng HPLC với cột C18 để xác định đồng thời αLA và β-LG: kỹ thuật xử lý mẫu đơn giản, dễ làm; tuy nhiên sau khi đã tiến hành khảo sát
và lựa chọn được điều kiện phân tích tối ưu, khả năng tách α-LA và β-LG vẫn còn bị hạn
chế. Đầu tiên là do ảnh hưởng lớn từ nền mẫu. Thứ hai là có thể do sự thay đổi dạng tồn tại
monome, dime của β-LG và sự biến tính α-LA (khả năng liên kết với ion Ca2+ của α-LA)
dưới ảnh hưởng của pH khi thay đổi gradien. Cuối cùng là do giới hạn định lượng cao nên
khó xác định với các mẫu có hàm lượng nhỏ (α-LA: 0,21g/100g, β-LG: 0,95g/100g). Về
cột SEC, một loại cột với nguyên lý tách hoàn toàn khác so với cột C18, phạm vi ứng dụng
phân tích của cột SEC thường là các đường, polyme, lipid, polypeptid, protein. Hiện nay,
cột SEC nói riêng sắc ký loại cỡ (sắc ký rây phân tử) nói chung đang được áp dụng chính
trong việc phân tích các phân tử phức tạp, chất hóa sinh hay các chất cao phân tử. Từ các
tài liệu tham khảo cùng thực tế nghiên cứu, để hoàn thiện hơn phương pháp xác định đồng
thời α-LA và β-LG trong các thực phẩm bổ sung, nhóm nghiên cứu lựa chọn kỹ thuật HPLC
với cột SEC kết hợp detector PDA để xác định các whey protein trong đề tài này.
1.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC
1.2.1. Khái niệm
Sắc ký lỏng là một phương pháp tách sắc ký các chất dựa trên sự phân bố khác nhau
của chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất lỏng chảy qua pha tĩnh
chứa trong cột. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hoá
của các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác
nhau. Do vậy chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [2], [3].
Dựa vào bản chất quá trình sắc ký người ta chia thành:
- Sắc ký phân bố (Partition Chromatography: PC).
- Sắc ký hấp phụ, có 2 loại: Pha thuận, pha đảo (Reverse phase: RP- HPLC).
- Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC).

- Sắc ký trên gel (GP-HPLC và FG-HPLC).

13


1.2.2. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký
Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký là thời gian lưu, hệ số phân bố, hệ số chọn
lọc, số đĩa lý thuyết, chiều cao đĩa lỹ thuyết… và độ phân giải RS dùng để đánh giá khả
năng tách của một chất trong một hệ.

1.2.3. Sắc ký trên gel
Sắc ký trên gel (sắc ký loại cỡ) - Size Exclusion Chromatography là một loại sắc ký
lỏng có nguyên tắc dựa dựa trên cơ sở là khối lượng hoặc kích thước phân tử (một đặc tính
vật lý của chất phân tích) thay vì các lực tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh như hấp
phụ, phân bố hay trao đổi ion. Pha tĩnh trong cột thường tạo thành các hố hình nón có kích
thước phù hợp để “bẫy” các chất phân tích do đó chất phân tích có kích thước càng nhỏ sẽ
bị lưu giữ càng lâu, chất phân tích có kích thước lớn sẽ ra sớm hơn (Hình 1.4).
Pha tĩnh của cột SEC thường là các loại polyme (dextran, polyacrylamide…),
polysaccharide (agar, agarose…). Ngoài ra, từ năm 1970 hạt silica đã trở thành pha tĩnh phổ
biến nhờ độ bền cơ học vượt trội, tính chất không trương nở và tính trơ trong một phạm vi
điều kiện khá rộng.

Hình 1.4. Mô hình mô phỏng pha tĩnh cột SEC và chất phân tích bị lưu giữ
Phân loại: dựa vào pha động ta có 2 loại sắc ký rây phân tử là Gel Filtration
Chromatography (GFC) với pha động là nước và Gel Permeation Chromatograpny (GPC)
với pha động là các dung môi hữu cơ.
Phạm vi ứng dụng: một trong những lĩnh vực phương pháp sắc ký rây phân tử được
ứng dụng nhiều nhất là phân tích protein nhất là trong các nghiên cứu theo dõi sự biến đổi
cấu trúc, theo dõi hàm lượng protein, xác định cấu trúc bậc 4 của protein[37].

14


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là hai protein chiếm phần lớn trong whey protein
gồm α-LA và β-LG.
Đối tượng mẫu được lựa chọn để xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của phương
pháp là sữa, sản phẩm có nguồn gốc từ sữa và thực phẩm bổ sung chứa whey protein.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký
Khảo sát điều kiện tách sắc ký gồm:
- Lựa chọn cột sắc ký
- Khảo sát và lựa chọn pha động: thành phần pha động và tốc độ rửa giải.

Lựa chọn điều chọn cột sắc ký:
Tiến hành trên mẫu chuẩn: Đối với mỗi cột sẽ tiến hành chạy 4 mẫu gồm: mẫu trắng
(nước cất); mẫu chuẩn đơn α- LA ; mẫu chuẩn đơn β- LG; mẫu chuẩn α- LA (384,2ppm)
và β- LG (401,4ppm). So sánh sắc ký đồ về hình dạng peak, khả năng tách, tín hiệu.
Khảo sát pha động:
-

Khảo sát thành phần pha động:
Sau khi tham khảo tài liệu kỹ thuật về cột SEC [35], khảo sát và lựa chọn thành phần

pha động được tiến hành dựa trên mẫu chuẩn: các mẫu chuẩn gồm α- LA (384,2ppm) và βLG (401,4ppm) được tiêm vào hệ thống với các pha động khác nhau:
MP

ACN (V/V)

AF(V/V)

TFA (V/V)

1

20%

0,10%

0,00%

2

20%

0,10%

0,01%

3

20%

0,10%

0,05%

4

20%

0,10%

0,10%

5

20%

0,10%

0,20%

Kết quả được đánh giá dựa trên hình ảnh sắc ký đồ, Rs, thời gian lưu, thời gian phân tích.

15


-

Khảo sát tốc độ rửa giải: Khảo sát tốc độ rửa giải được tiến hành trên mẫu

chuẩn gồm α- LA (384,2ppm) và β- LG (401,4ppm) được tiêm vào hệ thống với tốc độ
dòng thay đổi tại 2 mức là 0,5mL/ph và 1,0mL/ph.
2.2.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu
Do đối tượng nghiên cứu của đề tài là nền mẫu sữa và các thực phẩm bổ sung có
nguồn gốc từ sữa, thực phẩm bổ sung chứa whey là nền mẫu phức tạp, α-LA và β-LG có
mặt trong nền sữa với lượng nhỏ trong khi mẫu chứa lượng lớn casein cũng như một số
protein khác, nên quy trình xử lý mẫu cần làm sạch casein cũng như loại bỏ một số protein

đồng rửa giải trong quá trình sắc ký.
Trên cơ sở quy trình xử lý mẫu dự kiến, một số khảo sát đã được thực hiện nhằm tối ưu quá
trình phân tích, tăng hiệu quả chiết α-LA và β-LG và loại bỏ casein từ nền mẫu:
-

Đánh giá ảnh hưởng pH đến α- LA và β- LG

-

Khảo sát và lựa chọn khoảng pH chiết mẫu

-

Khảo sát lựa chọn dung môi chiết

-

Khảo sát và lựa chọn số lần chiết mẫu

-

Khảo sát và lựa chọn nhiệt độ chiết mẫu.
Đánh giá ảnh hưởng pH đến α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin
Để đánh giá ảnh hưởng pH đến α- LA và β- LG, các dung dịch chuẩn mix α- LA

384,2ppm và β- LG 401,4ppm ở các pH khác nhau từ 3,0- 7,0. Tại mỗi điểm pH, 3 dung
dịch chuẩn được chuẩn bị và tiêm vào hệ thống phân tích. Kết quả tính dựa trên sự thay đổi
diện tích trung bình của 2 chất chuẩn α- LA và β- LG.
Khảo sát và lựa chọn khoảng pH chiết mẫu
Để khảo sát và lựa chọn khoảng pH chiết mẫu, các mẫu sữa bột được cân chính xác

khoảng 1-2g vào ống ly tâm 50ml, hòa tan bằng khoảng 10ml nước cất 2 lần. Trước khi tiến
hành chiết như trong quy trình dự kiến, mẫu được điều chỉnh về pH từ 3,0 -7,0 bằng dung
dịch HCl 0,01M và máy đo pH. Dịch chiết sau khi định mức được đem đi phân tích kết quả
hàm lượng trung bình của α- LA và β- LG tại mỗi điểm pH từ đó đưa ra nhận xét.

16


Khảo sát và lựa chọn dung môi chiết mẫu
Để khảo sát và lựa chọn dung môi chiết mẫu, 4 dung môi chiết mẫu được chọn và tiến
hành như quy trình dự kiến. Dịch chiết sau khi định mức được lọc vào ống nghiệm thủy
tinh so sánh cảm quan và phân tích kết quả hàm lượng trung bình của α- LA và β- LG tại
mỗi điểm pH từ đó đưa ra nhận xét.
Khảo sát và lựa chọn số lần chiết mẫu
Để khảo sát và lựa chọn số lần chiết mẫu, cân chính xác 1-2 g mẫu bột whey vào ống
ly tâm 50ml. Và tiến hành như sau:
- Lần 1: Sử dụng 30-35mL dung môi lắc đều bằng tay và lắc xoáy trong 1 phút; Ly
tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút; Thu dịch ly tâm vào bình định mức 50mL, vừa đủ bằng
nước cất sau đó phân tích hàm lượng α- LA và β- LG.
- Lần 2: Cắn sau chiết lần 1 được bổ dung khoảng 15-20mL dung môi lắc đều bằng
tay và lắc xoáy trong 1 phút; Ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút; Thu dịch ly tâm vào
bình định mức 25mL, vừa đủ bằng nước cất sau đó phân tích hàm lượng α- LA và β- LG.
- Lần 3: Cắn sau chiết lần 2 được bổ dung khoảng 15-20mL dung môi lắc đều bằng
tay và lắc xoáy trong 1 phút; Ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút; Thu dịch ly tâm vào
bình định mức 25mL, vừa đủ bằng nước cất sau đó phân tích hàm lượng α- LA và β- LG.
- Lần 4: Cắn sau chiết lần 3 được bổ dung khoảng 10-15mL dung môi lắc đều bằng
tay và lắc xoáy trong 1 phút; Ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút; Thu dịch ly tâm vào
bình định mức 20mL, vừa đủ bằng nước cất sau đó phân tích hàm lượng α- LA và β- LG.
- Lần 5: Cắn sau chiết lần 4 được bổ dung khoảng 10-15mL dung môi lắc đều bằng
tay và lắc xoáy trong 1 phút; Ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút; Thu dịch ly tâm vào

bình định mức 20mL, vừa đủ bằng nước cất sau đó phân tích hàm lượng α- LA và β- LG.
Dựa trên sự thay đổi hàm lượng α- LA và β- LG qua các lần chiết đưa ra nhận xét.
Khảo sát và lựa chọn nhiệt độ chiết mẫu
Để khảo sát và lựa chọn nhiệt độ chiết mẫu, cân chính xác 1-2g mẫu bột whey và tiến
hành theo quy trình dự kiến nhưng trước khi ly tâm, ống ly tâm được ngâm trong bể điều
nhiệt ở các nhiệt độ 40℃ và 60℃ trong 15ph. Dịch chiết sau khi định mức sẽ phân tích
hàm lượng trung bình của α- LA và β- LG tại mỗi nhiệt độ, dựa trên sự thay đổi hàm lượng
hai chất từ đó đưa ra nhận xét.

17