Xác định đồng thời một số hormon steroid trong sữa và các sản phẩm từ sữa bằng LC MSMS

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẬU CHI MAI

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ
HORMON STEROID TRONG SỮA VÀ
CÁC SẢN PHẨM TỪ SỮA BẰNG
LC-MS/MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẬU CHI MAI
Mã sinh viên: 1401393

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ
HORMON STEROID TRONG SỮA VÀ
CÁC SẢN PHẨM TỪ SỮA BẰNG
LC-MS/MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn
1. TS. Trần Cao Sơn
2. TS. Lê Đình Chi
Nơi thực hiện
Viện KNATVSTPQG

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin được gửi lời biết ơn sâu sắc nhất đến thầy giáo TS. Lê Đình
Chi và TS. Trần Cao Sơn đã luôn luôn tận tâm hướng dẫn, động viên và giúp đỡ em
trong quá trình học tập nghiên cứu cũng như hoàn thành khóa luận này.
Em xin được gửi lời cảm ơn tới toàn thể thầy cô giáo bộ môn Hóa Phân Tích, chị
Ths. Vũ Ngọc Tú và các anh chị đang công tác tại Viện kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh
Thực phẩm Quốc gia đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để em
hoàn thành được khóa luận này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo trường Đại
học Dược Hà Nội đã tận tâm giảng dạy, tạo điều kiện học tập tốt nhất cho em trong
những năm vừa qua.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, cảm ơn những người
bạn đã luôn ở bên, quan tâm, giúp đỡ động viên em vượt qua những khó khăn trong
cuộc sống, học tập và nghiên cứu ở những năm qua.
Em xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 10 tháng 6 năm 2019
Sinh viên
Đậu Chi Mai

i


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG..............................................................................................i
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ..................................................................... ii
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .........................................................................................2
1.1. Tổng quan về một số hormon steroid .......................................................................2
1.1.1. Khái quát về một số hormon steroid......................................................................2
1.1.2. Độc tính của một số hormon steroid......................................................................7
1.2. Phương pháp xác định một số hormon steroid .........................................................8
1.2.1. Phương pháp xử lý mẫu .........................................................................................8
1.2.2. Kỹ thuật phân tích ...............................................................................................11
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................15
2.1. Nguyên liệu, thiết bị ..............................................................................................15
2.1.1. Thiết bị, dụng cụ ..................................................................................................15
2.1.1.1. Thiết bị ................................................................................................... 15
2.1.1.2. Dụng cụ .................................................................................................. 15
2.1.2. Dung môi, hóa chất..............................................................................................15
2.1.3. Chất chuẩn ...........................................................................................................16
2.1.3.1. Chất chuẩn gốc ....................................................................................... 16
2.1.3.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn ..................................................................... 16
2.2. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................................17
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................17
2.2.2. Khảo sát, tối ưu các điều kiện phân tích ..............................................................18
2.2.2.1. Khảo sát, tối ưu các điều kiện LC, MS .................................................. 18
2.2.2.2. Khảo sát, tối ưu các điều kiện xử lý mẫu ............................................... 18
2.2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng nền ......................................................................... 19
2.2.3. Xác nhận giá trị sử dụng ......................................................................................19
2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................19
2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu .......................................................................................19
2.3.2. Phương pháp phân tích trên thiết bị LC-MS/MS ................................................20
2.3.3. Phương pháp thẩm định .......................................................................................21
ii

2.3.3.1. Tính chọn lọc .......................................................................................... 21
2.3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) ......................... 21
2.3.3.3.Xây dựng đường chuẩn ........................................................................... 21
2.3.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi .......................................................................... 22
2.3.4. Phương pháp lấy mẫu ..........................................................................................22
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ......................................23
3.1. Xây dựng phương pháp xác định đồng thời một số hormon bằng LC-MS/MS .....23
3.1.1. Tối ưu các điều kiện phân tích ............................................................................23
3.1.1.1. Điều kiện khối phổ ................................................................................. 23
3.1.1.2. Điều kiện sắc ký lỏng ............................................................................. 24
3.1.2. Khảo sát, tối ưu quy trình xử lý mẫu ..................................................................26
3.1.2.1. Khảo sát ban đầu .................................................................................... 26
3.1.2.2. Khảo sát pH ............................................................................................ 27
3.1.2.3. Khảo sát lượng enzym ............................................................................ 28
3.1.2.4. Khảo sát nhiệt độ thủy phân .................................................................. 29
3.1.2.5. Khảo sát thời gian thủy phân .................................................................. 29
3.1.2.6. Khảo sát muối chiết ................................................................................ 30
3.1.2.7. Khảo sát thành phần d-SPE .................................................................... 31
3.1.2.8. Đánh giá ảnh hưởng nền......................................................................... 33
3.2. Thẩm định phương pháp phân tích .........................................................................34
3.2.1. Độ đặc hiệu ..........................................................................................................34
3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ..................................36
3.2.3. Xây dựng đường chuẩn ......................................................................................37
3.2.4. Độ lặp lại và độ thu hồi .......................................................................................40
3.3. Kết quả xác định 7 hormon steroid trong sữa và sản phẩm sữa .............................42
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .........................................................................................47
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

iii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Quy định của các hormon steroid trong thực phẩm ........................................8
Bảng 1.2. Một số ứng dụng thủy phân hormon steroid bằng enzym ..............................9
Bảng 1.3. Một số kỹ thuật chiết và làm sạch .................................................................10
Bảng 1.4. Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật QuEChERS ........................................11
Bảng 1.5. Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật LC-MS/MS .........................................13
Bảng 2.1. Các loại hormon steroid được sử dụng trong nghiên cứu .............................17
Bảng 3.1. Các điều kiện phân tích 7 hormon steroid bằng LC-MS/MS .......................23
Bảng 3.2. Các thông số đã được tối ưu của MS ............................................................24
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát hệ dung môi pha động .......................................................25
Bảng 3.5: Số điểm IP của 7 hormon steroid ..................................................................35
Bảng 3.6: Bảng tỷ lệ ion của 7 hormon steroid .............................................................35
Bảng 3.7. Giá trị LOD và LOQ của 7 hormon steroid ..................................................36
Bảng 3.8. Đường chuẩn, hệ số tương quan của các hormon steroid trên nền mẫu sữa .38
Bảng 3.9. Đường chuẩn, hệ số tương quan của các hormon steroid trên nền mẫu bơ ..39
Bảng 3.10. Độ lặp lại và độ thu hồi của 7 hormon trên nền mẫu sữa ở 3 mức thêm
chuẩn ..............................................................................................................................40
Bảng 3.11. Độ lặp lại và độ thu hồi của 7 hormon trên nền mẫu bơ ở 3 mức thêm
chuẩn ..............................................................................................................................41
Bảng 3.13. Tổng hợp kết quả xác định 7 hormon steroid trong mẫu sữa bột ..............43
Bảng 3.14. Tổng hợp kết quả xác định 7 hormon steroid trong mẫu sữa dạng lỏng ...43
Bảng 3.15. Tổng hợp kết quả xác định 7 hormon steroid trong các sản phẩm sữa ......44

i


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 3.1. Kết quả khảo sát ban đầu trên nền mẫu thực .................................................27

Hình 3.2. Kết quả khảo sát pH ......................................................................................28
Hình 3.3. Kết quả khảo sát lượng enzym ......................................................................28
Hình 3.4. Kết quả khảo sát nhiệt độ thủy phân .............................................................29
Hình 3.5. Kết quả khảo sát thời gian thủy phân ............................................................30
Hình 3.6. Kết quả khảo sát muối chiết ..........................................................................30
Hình 3.7. Kết quả khảo sát thành phần d-SPE ..............................................................31
Hình 3.8. Quy trình chiết 7 hormon steroid trên nền mẫu sữa và các sản phẩm sữa ....32
Hình 3.9. Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu sữa đến tín hiệu các hormon ..................33
Hình 3.10. Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu bơ đến tín hiệu các hormon ...................34
Hình 3.11. Sắc đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn testosteron cùng
nồng độ 10 µg/kg trên nền mẫu sữa ..............................................................................34
Hình 3.12. Sắc đồ của hormon Trenbolon tại giá trị LOD ...........................................37
Hình 3.13. Đường chuẩn của các hormon trên nền sữa, bơ ..........................................38

ii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Acceptable Daily Intake

Lượng ăn vào hàng ngày chấp
nhận được

Association of Official Analytical

Hiệp hội các cộng đồng phân

Communities

tích chính thức

Collisionally Activated Dissociation

Áp suất khi va chạm

Collision energy

Năng lượng va chạm

CUR

Curtain

Màn chắn (khí)

d-SPE

Dispersive solid phase extraction

Chiết pha rắn phân tán

ELISA

Enzym-linked Immune-sorbent
Assay

Định lượng qua chất gắn miễn
dịch kết nối enzyme

ESI

Electrospray Ionization

Ion hóa phun điện tử

GC

Gas chromatography

Sắc ký khí

GCB

Graphite carbon black

Than chì

GS1

Ion Source Gas 1

Áp suất khí nguồn tạo ion 1

GS2

Ion Source Gas 2

Áp suất khí nguồn tạo ion 2

HLB

Hydrophylic lipophilic balance

Cân bằng thân nước, thân dầu

IS

Internal standard

Chất chuẩn nội

ISV

IonSpray Voltage

Thế phun ion

ADI

AOAC
CAD
CE

LC-MS/MS

Liquid chromatography tandem mass
Sắc ký lỏng khối phổ hai lần
spectrometry

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Qualification

Giới hạn định lượng

iii


Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Matrix effect

Ảnh hưởng nền

MRL

Maximum residue limit

Giới hạn tồn dư tối đa

MRM

Multi reaction monitoring

Kiểm soát đa phản ứng

MS

Mass spectrometry

Khối phổ

PSA

Primary secondary amines

Các amin bậc 1, bậc 2

Quick, Easy, Cheap, Effective,
Rugged, Safe

Nhanh, dễ, rẻ, hiệu quả, ổn
định, an toàn

Recovery

Hiệu suất thu hồi

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SPE

Solid phase extraction

Chiết pha rắn

ME

QuEChERS
R

iv


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, sữa và sản phẩm từ sữa là nhóm sản phẩm phổ biến trong đời sống ,
đặc biệt là không thể thiếu đối với trẻ em. Nó đóng vai trò trong việc cung cấp dinh
dưỡng, đảm bảo cho cho cơ thể phát triển về trí tuệ và thể chất. Tuy nhiên, nhằm tăng
lợi nhuận về kinh tế, một số nhà sản xuất đã sử dụng hormon để tăng sản lượng thịt và

sữa đã dẫn đến việc tồn dư trong các sản phẩm sữa bò và gây ảnh hưởng đến sức khỏe
con người. Các hormon steroid (estradiol, melengestrol acetat, progesteron,
testosteron, trenbolon) là những hormon được phát hiện thường xuyên trong sữa bò.
Estradiol và progesteron là các hormon sinh dục nữ tự nhiên; testosteron là hormon
sinh dục nam tự nhiên; zeranol, trenbolon và melengesterol acetat là các chất kích
thích tăng trưởng tổng hợp. Các loại hormon đã được chứng minh có thể gây các tác
dụng không mong muốn trên người.
Hiện nay, Việt Nam chưa có quy định về giới hạn tồn dư của các hormon này
trong sữa và các sản phẩm từ sữa cũng như chưa có phương pháp chính thức nhằm xác
định đồng thời các hormon này. Do đó, việc xây dựng phương pháp xác định các
hormon steroid này trong sữa và các sản phẩm từ sữa là rất cần thiết. Vì vậy, đề tài
"Xác định đồng thời một số hormon steroid trong sữa và các sản phẩm từ sữa bằng
LC-MS/MS" đã được thực hiện với các mục tiêu:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời 7 hormon steroid
(estron, 17-estradiol, progesteron, testosteron, trenbolon, melengestrol
acetat, zeranol) trong sữa và sản phẩm sữa bằng kỹ thuật LC-MS/MS.
2. Ứng dụng phương pháp để xác định hormon steroid trong một số đối tượng
sữa và sản phẩm sữa.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về một số hormon steroid
1.1.1. Khái quát về một số hormon steroid
Hormon là những hóa chất được sản xuất tự nhiên trong cơ thể của tất cả các
loài động vật và con người. Chúng là những chất truyền tin hóa học được giải phóng
vào máu bởi các cơ quan nội tiết tố, chúng di chuyển đến và ảnh hưởng đến các bộ
phận khác nhau của cơ thể. Hormon có thể được sản xuất với số lượng nhỏ, nhưng
chúng kiểm soát các chức năng quan trọng của cơ thể như tăng trưởng, phát triển và

sinh sản [2, 16, 20].
Hormon có thể có các dạng hóa học khác nhau, có thể có bản chất là steroid
hoặc protein. Hormon steroid hoạt động trong cơ thể qua đường ăn uống (Ví dụ: thuốc
ngừa thai là hormon steroid và có thể uống). Ngược lại, hormon protein bị phá vỡ
trong dạ dày, và mất khả năng tác động trong cơ thể khi ăn. Do đó, thông thường các
hormon protein cần phải được tiêm vào cơ thể để có tác dụng (ví dụ: insulin là một
hormon protein, bệnh nhân tiểu đường cần phải được tiêm insulin để điều trị) [16, 17].
Một số hormon có thể làm cho động vật tăng cân nhanh hơn. Chúng giúp giảm
thời gian chờ đợi và lượng thức ăn của động vật trước khi giết mổ trong các ngành
công nghiệp chế biến thịt. Ở bò sữa, hormon có thể được sử dụng để tăng sản lượng
sữa. Do đó, hormon có thể làm tăng lợi nhuận của ngành công nghiệp chế biến thịt và
sữa. Ngay từ những năm 1930, người ta nhận ra rằng những con bò được tiêm chất lấy
từ tuyến yên bò (cơ quan tiết hormon) tạo ra nhiều sữa hơn. Sau đó, người ta phát hiện
ra hormon tăng trưởng bò (bGH) từ tuyến yên là nguyên nhân của tác dụng này.
Nhưng phải đến những năm 1980, người ta mới có thể sản xuất bGH tinh khiết với số
lượng lớn bằng cách sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp. Năm 1993, cơ quan Quản lý
Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã phê chuẩn hormon tăng trưởng tái tổ hợp
bò (rbGH) còn được gọi là somatotropin bò (rbST) được sử dụng cho bò sữa. Ước tính
gần đây của nhà sản xuất hormon chỉ ra rằng 30% số bò ở Mỹ có thể được sử dụng
rbGH. Hiện nay có sáu loại hormon steroid khác nhau hiện đang được FDA chấp thuận
để sử dụng trong sản xuất thực phẩm ở Mỹ: estradiol, progesteron, testosteron,
zeranol, trenbolon acetat và melengestrol acetat. Estradiol và progesteron là các hoócmôn sinh dục nữ tự nhiên; testosteron là hormon sinh dục nam tự nhiên; zeranol,
trenbolon acetat và melengesterol acetat là các chất kích thích tăng trưởng tổng hợp

2


(các hóa chất giống hormon) có thể làm cho động vật phát triển nhanh hơn. Tuy nhiên,
các hormon này bên cạnh giá trị tăng sản lượng thịt và sữa trong chăn nuôi chúng có
rất nhiều nguy cơ tiềm ẩn.

Về phân loại, các tuyến sinh dục và tuyến thượng thận sản xuất các steroid được
xếp thành 5 nhóm chính, bao gồm: estrogen, progestin, androgen, glucocorticoids và
mineralocorticoid. Hormon sinh dục kiểm soát sự khác biệt và tăng trưởng của hệ
thống sinh sản, tạo ra và duy trì các đặc tính sinh dục. Hormon tuyến thượng thận cũng
ảnh hưởng đến sự khác biệt cũng như được điều chỉnh trao đổi chất. Những ảnh hưởng
của mỗi steroid phụ thuộc chủ yếu vào các thụ thể của nó, cũng là cơ sở để phân loại
hormon steroid [18].
 Estradiol (estron, 17β-estradiol )
Hormon estradiol (estron, 17β-estradiol ) là những hormon đại diện cho nhóm
estrogen. Nhóm estrogen là những hormon steroid 18C đặc trưng bởi nhân thơm, do
đó nhóm này còn được gọi là các phenosteroid. Estrogen tự nhiên được tiết ra từ
buồng trứng trong giai đoạn nang, giúp nang phát triển và tạo môi trường thuận lợi
trong tử cung để trứng làm tổ. Về mặt chuyển hóa, estrogen có khả năng tăng tổng hợp
lipid dự trữ, tăng tổng hợp protein. Một số đại diện nhóm estrogen: estron, 17βestradiol và estriol…
Estradiol là estrogen mạnh nhất có trong tự nhiên và là estrogen chủ yếu ở tuổi
sinh đẻ. Estradiol và các estrogen khác có vai trò quan trọng đối với sự phát triển và
duy trì bộ máy sinh sản và những đặc tính sinh dục phụ của nữ. Estrogen tác động trực
tiếp làm tử cung, vòi trứng và âm đạo phát triển. Cùng với các hormon khác như
hormon tạo hoàng thể (LH), hormon kích thích nang trứng (FSH) và progesteron,
estradiol làm tuyến vú phát triển cả phần ống dẫn và phần chất đệm và lớp mỡ.
Estradiol cùng với các hormon khác, đặc biệt với progesteron, có liên quan mật thiết
đến quá trình thai nghén. Các hormon trên ảnh hưởng đến sự giải phóng các
gonadotrophin tuyến yên và tham gia vào quá trình định hình và duy trì cấu trúc bè của
xương, duy trì sự tăng sản của tế bào biểu mô [3]. Công thức cấu tạo của 17-estradiol
và estron được trình bày ở hình 1.1.

3


Hình 1.1. Công thức cấu tạo của 17-estradiol và estron

 Progesteron
Progesteron là hormon đại diện điển hình của nhóm progestin. Nhóm progestin
là những hormon steroid có 21C. Nó được sản xuất mạnh ở thời kỳ hoàng thể, tạo điều
kiện cho sự thụ thai và trong thời kỳ mang thai đóng vai trò quan trọng đối với sự phát
triển của bào thai. Công thức cấu tạo của progesteron được trình bày ở hình 1.2.

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của progesteron
Progesteron (PGT) là một hormon steroid nội sinh được hình thành từ các tiền
chất steroid trong buồng trứng, tinh hoàn, vỏ thượng thận và nhau thai. Hormon tạo
hoàng thể (LH) kích thích tổng hợp và xuất tiết PGT từ hoàng thể. PGT có trong chu
kỳ kinh nguyệt, thời kỳ mang thai và phát triển phôi thai của người và các loài khác
[3]. PGT là một hormon thiết yếu của hệ thống sinh sản nữ giới và ngoài ra nó còn
đóng vai trò quan trọng trong hệ thống thần kinh trung ương nơi mà chúng gắn với các
thụ thể PR-A và PR-B [19].
 Testosteron
Testosteron là hormon tiêu biểu của nhóm androgen. Nó là hormon sinh dục
nam, chịu trách nhiệm quy định đặc tính sinh dục nam. Công thức cấu tạo của
testosteron được trình bày ở hình 1.3.

4


Hình 1.3. Công thức cấu tạo của testosteron
Trong

cơ

thể, testosteron được

chuyển

đổi

không

thể

phục

hồi

thành dihydrotestosteron (DHT) trong các mô đích bằng enzym reductase 5alpha. Các phức hợp thụ thể testosteron hoặc DHT ligand-androgen hoạt động như các
phức hệ nhân tố phiên mã, kích thích sự biểu hiện của các gen đáp ứng khác
nhau. DHT gắn kết với ái lực cao hơn với thụ thể androgen hơn testosteron , kích hoạt
biểu hiện gen hiệu quả hơn. Ngoài ra, testosteron là không thể đảo ngược chuyển đổi
thành estradiol bởi enzym aromatase phức tạp, đặc biệt là ở gan và mô mỡ.
Testosteron và DHT thúc đẩy sự phát triển và duy trì các đặc tính sinh dục nam liên
quan đến cơ quan sinh dục bên trong và bên ngoài, cơ xương và nang lông [3].
 Melengestrol acetat
Melengestrol là một hợp chất giống như progestogen được sử dụng như một
chất phụ gia thức ăn gia súc cho các tác động thúc đẩy tăng trưởng và ức chế động dục
(nhiệt) ở bò cái [8]. Công thức cấu tạo của melengestrol acetat được trình bày ở hình
1.4.

Hình 1.4. Công thức cấu tạo của melengestrol acetat
 Trenbolon
Trenbolon thường được gọi là Finaplix. Nó đã được cố tình phát triển để thúc
đẩy androgen và tăng khối lượng cơ bắp của gia súc. Do đặc điểm này của nó, người ta

5

đã tận dụng làm tăng lượng cơ của vật nuôi trước khi được vận chuyển đến lò mổ để
tăng lợi nhuận. Công thức cấu tạo của trenbolon được trình bày ở hình 1.5.

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của trenbolon
Trenbolon có hoạt tính androgenic. Đối với các đặc tính androgen của
trenbolon, các tác dụng phụ thường gặp khi sử dụng bao gồm da nhờn, mụn trứng cá,
tiết bã nhờn, tăng trưởng tóc trên mặt và cơ thể, và rụng tóc da đầu… Các tính chất
androgenic mạnh mẽ của Trenbolon làm tăng sự nam tính nên nó không được khuyến
khích cho phụ nữ [3].
 Zeranol
Zeranol đã được sử dụng rộng rãi như một chất kích thích tăng trưởng với hoạt
tính estrogen và cũng được sử dụng để giảm căng thẳng ở động vật; ứng dụng của nó
đã bị cấm ở EU từ năm 1985. Gần đây, người ta đã chứng minh rằng zeranol cũng có
thể được hình thành invivo từ mycotoxin zearalenone và α-zearalenol, được sản xuất
bởi một số loài khuẩn lạc Fusarium. Chúng được tìm thấy lượng lớn trên ngô, lúa mì,
lúa mạch và yến mạch và có thể chuyển từ thức ăn bị nhiễm vào động vật [12]. Công
thức cấu tạo của zeranol được trình bày ở hình 1.6.

Hình 1.6. Công thức cấu tạo của zeranol

6


1.1.2. Độc tính của một số hormon steroid
Bên cạnh giá trị tăng sản lượng thịt và sữa trong chăn nuôi, các hormon steroid
chứa rất nhiều nguy cơ tiềm ẩn. Thông thường các hormon được tạo ra bởi cơ thể
chúng ta và rất cần thiết cho sự phát triển bình thường của các mô khỏe mạnh, nhưng
các hormon steroid tổng hợp được sử dụng làm dược phẩm đã cho thấy các ảnh hưởng

tiêu cực [26] [10] [21].
Nguy cơ ung thư
Một số nghiên cứu cho thấy tiếp xúc lâu dài với hormon estrogen steroid tự
nhiên cũng có liên quan đến tăng nguy cơ ung thư vú. Những nghiên cứu khác, khi các
sản phẩm có tồn dư hormon estradiol làm cho bé gái dậy thì sớm và dễ dẫn đến ung
thư vú và các dạng ung thư khác (Jayson, 2001) [26]. Cơ quan nghiên cứu Quốc tế về
ung thư (IARC) cũng kết luận estradiol là chất gây ung thư ở người, đặc biệt là ung
thư vú [3].
Zeranol có vai trò trong việc kích thích và ức chế các biểu hiện gen trong dòng
tế bào ung thư vú, tạo ra sự biến đổi tế bào biểu mô tế bào vú của con người [25].
Ngoài ra zeranol còn gây ra rối loạn nội tiết con người [24].
 Nguy cơ gây rối loạn nội tiết tố
Theo nghiên cứu của Jayson (2001) [26] chỉ ra rằng dư lượng hormon trong thịt
khi ăn vào có thể làm rối loạn cân bằng hormon trên người và gây rối loạn hệ thống
sinh sản làm tăng tỷ lệ vô sinh.
 Ảnh hưởng tới hệ sinh thái
Do việc sử dụng hormon trong chăn nuôi dẫn đến phân của các loại gia súc còn
dư lượng hormon được thải ra môi trường đất và nước làm cho hệ sinh thái nước bị
thay đổi, gây nên rối loạn sinh sản ở cá.
1.1.3. Quy định hiện hành đối với một số hormon steroid
Hiện nay, Việt Nam chưa có quy định nào về dư lượng các hormon steroid
(17β-estradiol, estron, melengestrol acetat, progesteron, testosteron, trenbolon,
zeranol) trong sữa và sản phẩm sữa.
Thông tư 24/2013/TT-BYT chỉ quy định các hormon này trong thịt, mỡ, gan và
thận [4]. Quy định mức dư lượng tối đa của các hormon steroid trong thực phẩm được
đưa ra tại bảng 1.1.

7

Bảng 1.1. Quy định của các hormon steroid trong thực phẩm
Tên chất

ADI
(µg/kg thể
trọng/ngày)

Loại sản phẩm

MRL
(µg/kg)

Thịt trâu, bò
17-estradiol

Gan trâu, bò

0 ÷ 0,05

Thận trâu, bò

Không quy định

Mỡ trâu, bò
Melengestrol
acetat

0 ÷ 0,03

Thịt gà

1

Gan gà

10

Thận gà

2

Mỡ gà

18

Thịt trâu, bò
Progesteron

Gan trâu, bò

0 ÷ 30

Thận trâu, bò

Không quy định

Mỡ trâu, bò
Thịt trâu, bò
Testosteron

Gan trâu, bò

0÷2

Thận trâu, bò

Không quy định

Mỡ trâu, bò
Trenbolon
acetat

0 ÷ 0,02

Zeranol

0 ÷ 0,5

Thịt trâu, bò

2

Gan trâu, bò

10

Thịt trâu, bò

2

Gan trâu, bò

10

1.2. Phương pháp xác định một số hormon steroid
Hiện nay, nhiều phương pháp xác định đồng thời được xây dựng nhằm xác định
dư lượng hormon trong các sản phẩm từ chăn nuôi. Các kỹ thuật phân tích chủ yếu
được sử dụng là GC-MS, LC-MS/MS và ELISA.

1.2.1. Phương pháp xử lý mẫu
 Phương pháp thủy phân bằng enzym
Enzym được coi là tác nhân xúc tác trong quá trình thủy phân. Mẫu được ủ
trong dung dịch đệm với pH, nhiệt độ và thời gian thích hợp. Đối với các hormon
steroid, mẫu sẽ được ủ trong dung dịch đệm acetat có pH = 4,6 ÷ 5,2; nhiệt độ 37 ÷
52ºC; 12 ÷ 22 giờ. Trong quá trình thủy phân, enzym β-glucuronidase sẽ cắt mạch của

8


hormon thành các mạch ngắn hơn. Các hormon steroid có chứa nhóm OH, -COOH tạo
liên kết với acid glucuronic. Enzym glucuronidase cắt đứt liên kết giữa hormon với
acid glucuronidase, chuyển từ dạng hormon liên hợp sang dạng hormon tự do.
Một số ứng dụng thủy phân hormon steroid bằng enzym được đưa ra tại bảng 1.2.
Bảng 1.2. Một số ứng dụng thủy phân hormon steroid bằng enzym
Số
Hormon phân
STT
Tác giả
lượng
tích trong

hormon
đề tài
Progesteron,
Patricia
6
1
Testosteron,
Regal
Estron
Progesteron,
Trenbolon,
22
2
Xueyin Qu
Testosteron,
Estradiol,
Estron
17β-estradiol,
14
Trenbolon,
hormon
Testosteron

3

Bing Shao

4

Barbara

Hauser

5

Bárbara
SocasRodríguez

2

6

Frédérique
Courant

7

23

Estradiol;
Testosteron,
Estron

Nền
mẫu

Thủy phân

Nguồn

Sữa

công
thức

β-glucuronidase,

[7]

Sữa
tươi

arylsulfate
(37oC/12h)

[29]

Thịt,
thận,
mô gan,
sữa

glucuronidase/
arylsulfat ủ qua
đêm 54 C.

[32]

Nước
tiểu
Sữa
tươi,

sữa
chua
Trứng,
sữa

Estron,
estradiol,
testosteron

enzym βglucuronidase
(pH = 5,2, 37oC,
16 giờ).
enzym βglucuronidase
(pH = 5, 37oC, 15
giờ).
glucuronidase(ủ
qua đêm ở 52 ◦C)

[23]

[33]

[9]

 Phương pháp chiết và phương pháp làm sạch
Mục đích của quá trình chiết là thu tối đa lượng các hormon trong nền mẫu vào
dung môi chiết. Các hormon steroid là các hợp chất hữu cơ có bản chất tương đối phân
cực nên chúng hòa tan khá tốt trong dung môi hữu cơ phân cực. Hiện nay, hai loại
dung môi chiết được sử dụng phổ biến là methanol [11, 16, 32] và acetonitril [7, 23,
30].

Bước làm sạch thường áp dụng cho các kỹ thuật phân tích nhằm loại bỏ các ảnh
hưởng của nền mẫu. Hơn nữa, quá trình làm sạch thường kèm theo làm giầu mẫu do
đó giảm được giới hạn phát hiện của phương pháp. Kỹ thuật làm sạch mẫu thường

9


được sử dụng nhất sau khi chiết các hormon từ sữa và nguyên liệu sữa là kỹ thuật chiết
pha rắn (SPE).
Chiết pha rắn là kỹ thuật phổ biến được áp dụng để làm sạch mẫu. Dịch chiết
mẫu được đưa qua cột SPE đã được hoạt hóa, chất phân tích được giữ lại trên cột, các
tạp chất được rửa qua cột, sau đó sử dụng dung môi có ái lực mạnh hơn với chất phân
tích để rửa giải các chất này ra khỏi cột [1]. Dịch rửa giải có thể được cô đến cạn sau
đó hòa lại trong một dung môi thích hợp nhằm làm giầu mẫu. Do các hormon có tính
phân cực và độ tan khác nhau, nên khó lựa chọn được một loại cột đặc hiệu cho tất cả
các hormon [32].
Cột C18 là cột chứa các pha tĩnh không phân cực như octadecylsilane (C18).
Dịch chiết được cho vào cột C18, các chất không phân cực sẽ được giữ lại trên cột và
được thu hồi thông qua quá trình rửa giải; các chất phân cực sau khi bị loại ra khỏi cột
C18 lại tiếp tục được cho vào cột SPE-silicagel để làm sạch và làm giàu.
Một số kỹ thuật chiết và làm sạch được đưa ra tại bảng 1.3.
Bảng 1.3. Một số kỹ thuật chiết và làm sạch
Tác giả

Xueyin Qu

Bing Shao

Barbara
Hauser

Frédérique
Courant

Số
Hormon phân
Nền
lượng
tích trong đề
mẫu
hormon
tài
Progesteron,
22
Trenbolon,
Sữa
Testosteron,
tươi
Estradiol
thịt,
17β-estradiol,
thận,
14
Trenbolon,
mô
Testosteron
gan,
sữa
Estradiol;
Nước
23

Estosterone,
tiểu
Estron
Estron,
trứng
7
Estradiol,
sữa
testosteron

Quy trình xử lý

Nguồn

- Chiết: MeOH
-Làm sạch: cột GCB,
amino

[29]

- Chiết: MeOH
- Làm sạch: cột HLB,
amino-propyl, silica

[32]

- Chiết: TBME (tertbutylmethyl ether)
- Làm sạch: cột C18
- Chiết: diethyl ether.
- Làm sạch:

cột silica

[23]

[9]

 Phương pháp QuEChERS
QuEChERS là tên viết tắt của Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged và Safe
phương pháp do hai nhà khoa học Anasstasiades và Lehotay phát triển để phân tích
hóa chất bảo vệ thực vật trong rau quả [5]. Gần đây phương pháp trên đang được
nghiên cứu, phát triển để phân tích hormon steroid trong các nền mẫu và đã thu được
hiệu quả tốt [27].
10


Các tác giả sử dụng acetonitril để chiết hormon steroid từ sữa [5]. Các hormon
này tan tốt trong ACN, ít tan trong nước. Hỗn hợp muối chiết (MgSO4, NaCl) được
sử dụng để làm tăng độ phân cực của pha nước, làm cho các hormon được chiết vào
acetonil dễ dàng hơn. Lớp acetonitril được tách khỏi nước nhờ muối chiết. Dịch chiết
acetonitril sau đó được làm sạch bằng chiết phân tán pha rắn (d-SPE) với hỗn hợp
chất hấp phụ như MgSO4, C18.
Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật QuEChERS được đưa ra tại bảng 1.4.
Bảng 1.4. Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật QuEChERS
STT Tác giả

Hormon
Số lượng
phân tích
hormon
trong đề tài

1

TAN Xintong

2

Bárbara
SocasRodríguez

2

3

Masayo
Yabu

3

13

Nền
Xử lý mẫu
mẫu

17β-estradiol,
Estron,
Testosteron,
Sữa
Melengestrol, tươi

acetat,
Progesteron

Testosteron,
Progestron

- Chiết: MgSO4, NaCl,
tri-sodium citrat
dihydrat, di-sodium
hydrogencitrat
sesquihydrate
-Làm sạch: MgSO4,
PSA, alumina tính axit

Sữa
- Chiết: MgSO4, NaCl
tươi,
- Làm sạch: MgSO4,
sữa
C18
chua
- Chiết: MgSO4, NaCl
Sữa,
- Làm sạch: MgSO4,
thịt
PSA,C18

Nguồn

[34]

[33]

[27]

1.2.2. Kỹ thuật phân tích
 ELISA [22]
ELISA là một kỹ thuật miễn dịch hóa học để phát hiện kháng thể hay kháng
nguyên trong mẫu cần phân tích. Phương pháp ELISA dựa trên sự kết hợp đặc hiệu
giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzym. Khi
cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzym sẽ thủy phân cơ chất thành một chất
có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với
kháng nguyên. Nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện được biết thông
qua cường độ màu.
ELISA là kỹ thuật đơn giản và có độ nhạy khá cao. Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ
có thể xác định được số ít hormon steroid.
Với kỹ thuật này, Scippo và cộng sự [22] đã xây dựng phương pháp sàng lọc đa
dư lượng được phát triển dựa trên kỹ thuật miễn dịch để phát hiện các hợp chất hoạt

11


động sử dụng các thụ thể tái tổ hợp với estrogen, gestagenic, androgenic hoặc
glucocorticoidic. Giới hạn của phương pháp đối với các hormon là 2 µg/kg.
 GC-MS
Sắc ký khí khối phổ (Gas chromatography – mass spectrometry) là phương pháp
được dùng trong phân tích lượng vết các hợp chất cần nhận danh chính xác bằng tỉ lệ
giữa khối lượng và điện tích (m/z). Ưu điểm của phương pháp là có độ nhạy và độ
chính xác cao.
Iwona Matraszek-Zuchowska và các cộng sự [28] đã xác định được đồng thời

18 hormon steroid anabolic từ các stilbenes tổng hợp, steroid và các nhóm lactat
resorcylic acid (RAL) trong sữa tươi và sữa bột bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ (GC
- MS), cột HP - 5MS (30 m x 0,25 mm, cỡ hạt 0,25 μm). Mẫu được chiết lỏng-lỏng với
dietyl ete và làm sạch bằng chiết pha rắn (SPE) sau đó được dẫn xuất với anhydrit
heptafluorobutyric hoặc N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide. Hiệu suất thu
hồi của tất cả các chất phân tích ở mức 1 μg/L (1 μg /kg) dao động trong khoảng từ
70,4 đến 119,4% với hệ số biến thiên nhỏ hơn 30%. Giới hạn quyết định (CCα) có giá
trị trong khoảng từ 0,11 đến 0,44 μg/L (μg /kg) và khả năng phát hiện (CCβ) có giá trị
0,19 đến 0,75 μg/ L (μg /kg) tương ứng.
Tuy nhiên, phương pháp cũng có những hạn chế nhất định. Cụ thể, phương pháp
đòi hỏi quy trình xử lý mẫu phức tạp và chi phí cao. Dung dịch mẫu phải dẫn xuất
trước khi phân tích và phải dùng các loại dẫn xuất khác nhau cho từng chất[15, 31].
 LC-MS [7, 13, 23, 27, 29, 32, 34]
Nguyên lý của phương pháp LC-MS tương tự GC-MS, chỉ khác pha động là chất
lỏng. Điều này có nghĩa là các chất phân tích không phải dễ bay hơi, bền nhiệt.
Với các ưu điểm vượt trội là quy trình xử lý mẫu đơn giản, thời gian phân tích
ngắn và phân tích đồng thời các hormon steroid, phương pháp LC-MS hiện đang được
sử dụng phổ biến hơn cả.
Xueyin Qu, Chuanyou Su [29] xây dựng phương pháp xác định 22 hormon
steroid trong sữa nguyên liệu sử dụng phương pháp LC-MS/MS. Cột Acquity BEH
C18 (1,7 µm, 100 mm × 2,1 mm, Waters) pha động 0,1 % acid formic và methanol.
Mẫu được ủ trong dung dịch đệm acetat (pH 5,2) trong 12 giờ ở 37ºC. Sau đó mẫu
được chiết bằng methanol. Dịch chiết pha loãng bằng nước, làm sạch bằng cột chiết
pha rắn ENVI-Carb và GCB. Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp đối với các
hormon từ 0,4 đến 2 (µg/kg).

12


Rocío Barreiro, Patricia Regal [7] xác định sáu hormon giới tính tự nhiên

(pregnenolone,

progesteron,

estron,

dehydroepiandrosterone,

testosteron

và

androstenedione) trong sữa công thức cho trẻ sơ sinh. Phân tích bằng phương pháp sắc
ký lỏng khối phổ hai lần (HPLC - MS/MS). Cột Synergi Fusion - RP (100 × 2 mm, 2,5
μm) pha động 0,1% formic acid và methanol. Các mẫu được pha loãng và thủy phân
với β-glucuronidase để xác định tổng các steroid tự do và liên hợp. Mẫu được cho vào
ống 2 mL chứa 1000 μL dung dịch IS. Các ống được đậy nắp, lắc xoáy và ly tâm. Lớp
axetonitril được tách ra từ kết tủa và bay hơi dưới dòng khí nitơ ở 37°C. Steroid tự do
được tạo dẫn xuất với 300 μL dung dịch hydroxylamine 1,5 M (pH = 10) ở 90 °C
trong 30 phút. Dẫn xuất oxime được chiết xuất hai lần bằng MTBE. Lớp hữu cơ được
bay hơi dưới dòng nitơ, phần còn lại được hòa tan trong 100 μL nước methanol đã
được axit hóa (30:70 v/v) và được phân tích ngay lập tức bằng HPLC - MS/MS.
Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật LC-MS/MS được đưa ra tại bảng 1.5.
Bảng 1.5. Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật LC-MS/MS
Tác giả

Số
Hormon
lượng phân tích
hormon trong đề tài

Nền
mẫu

Kỹ thuật
phân tích

Patricia
Regal

6

Progesteron,
Testosteron,
Estron

Sữa
công
thức

LC-MS/MS

22

Progesteron,
Trenbolon,
Testosteron,
Estradiol,
Estron

Sữa
tươi

LC-MS/MS

14

thịt,
17β-Estradiol, thận,
Trenbolon,
mô
Testosteron
gan,
sữa

Xueyin
Qu

Bing
Shao

Barbara
Hauser

TAN
Xin-tong

23

Estradiol,

Testosteron,
Estron

Nước
tiểu

13

17β-estradiol,
Estron,
Testosteron,
Melengestrol
acetat,
Progesteron

Sữa
tươi

LC-MS/MS

LC-MS/MS

UHPLCMS/MS

13

Kết quả

Nguồn

- LOQ: 0,881,54 (μg/L)
- R (%): 92,6102,6

[7]

- LOQ: 0.4-2
µg / kg
- R (%): 70,392,5

[29]

R (%): 80-105

[32]

- LOQ: 0.5-3,0
μg/L
- R (%): 60,4103,0
- RSD (%): 2,714,3
- LOQ: 0,23-1,7
µg/kg.
- R (%): 74,2–
99,7
- RSD < 12%

[23]

[34]

Stefan
Ehling
Masayo
Yabu

17

Melengestrol
acetat,
Trenbolon

Sữa
bột

3

Testosteron,
Progestron

Sữa,
thịt

- LOQ: 0.2 −2.0
μg/kg
LC−MS/MS
- R (%): 62 −82
- RSD < 10%
LOQ: 0.8-5.4
UPLCμg/kg
MS/MS

R (%): 86-95

14

[13]

[27]


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị

2.1.1. Thiết bị, dụng cụ
2.1.1.1. Thiết bị
-

Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ gồm sắc ký lỏng HPLC LC20AD-XR của
Shimadzu và khối phổ ABSciex Triple Quad 5500.

-

Cột sắc ký pha đảo Waters Symmetry C18 (150 mm x 3,0 mm id; 3,5 m) và
tiền cột.

-

Máy đồng nhất mẫu, Phillips.
Tủ ấm, Amerex – Mỹ.

-

Máy đo pH, Metter Toledo.

-

Cân phân tích chính xác đến 0,1 mg và 0,01 mg, Metter Toledo.
Cân kỹ thuật, chính xác 0,01 g, Metter Toledo.

-

Máy ly tâm có thể đạt được tốc độ tối thiểu 6000 rpm đối với ống ly tâm 50
mL, Mikro 200R, Hettich.
Máy ly tâm có thể đạt được tốc độ tối thiểu 13000 rpm đối với ống ly tâm 2
mL, Mikro 200R, Hettich.

-

Máy lắc xoáy vortex, IKA.

- Máy siêu âm, Elma – Đức
2.1.1.2. Dụng cụ
- Micropipet 10-100, 20-200, 100-1000, 500 - 5000 µL.
- Bình định mức các loại: 5, 10, 50 và 100 mL.
- Ống ly tâm nhựa 50 mL có nắp kín.
- Ống ly tâm nhựa 2 mL có nắp kín
- Ống đong 50, 100 mL.
- Lọ đựng mẫu 1,8 mL có nắp kín.
- Pipet pasteur

2.1.2. Dung môi, hóa chất

-

Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết dùng cho phân tích.-Dung
môi tinh khiết LC-MS/MS (Merck): Methanol, acetonitril, acid formic, acid
acetic, nước cất hai lần.
Dung môi, hóa chất tinh khiết: MgSO4 khan (Merck), NaCl khan (Merck),

-

CH3COONa (Merck), enzym β- glucuronidase 5000 U (ecoli from type VII-A)
(Sigma).
Bột làm sạch d-SPE tinh khiết: bột PSA (Agilent), bột C18 (Agilent)

-

15


- Dung dịch acid formic 0,1%: Hút 1 mL acid formic vào bình định mức 1 L,
định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần đã lọc qua màng lọc dung môi.
- Dung dịch acid acetic 0,2 M: Hút 11,49 mL acid acetic vào bình định mức 1 L,
định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần, lắc đều.
- Dung dịch natri acetat 0,2 M: Cân 16,4 g natri acetat vào bình định mức 1 L,
định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần, lắc đều.
- Dung dịch đệm acetat pH = 4,6: Dùng ống đông 100 mL đong 51 mL dung dịch
acid acetic 0,2 M và 49 mL dung dịch natri acetat 0,2 M vào bình định mức 1 L, định
mức tới vạch bằng nước cất 2 lần, chỉnh pH.
- Dung dịch đệm acetat pH = 5: Dùng ống đong 50 mL đong 29,5 mL dung dịch
acid acetic 0,2 M và 70,5 mL dung dịch natri acetat 0,2 M vào bình định mức 1 L, định

mức tới vạch bằng nước cất 2 lần.
- Dung dịch đệm acetat pH = 5,2: Dùng ống đong 50 mL đong 21 mL dung dịch
acid acetic 0,2 M và 79 mL dung dịch natri acetat 0,2 M vào bình định mức 1 L, định
mức tới vạch bằng nước cất 2 lần.

2.1.3. Chất chuẩn
2.1.3.1. Chất chuẩn gốc
- Chuẩn trenbolon (≥99,1%), 17-estradiol (≥97,5%), progesteron (≥100,25%),
estron (98,5%), testosteron (≥99,2%), melengestrol acetat (≥97,7%), zeranol (≥99,9%)
có độ tinh khiết ≥ 97% (LGC)
- Nội chuẩn progesteron – d9 có độ tinh khiết ≥ 98% (LGC)
2.1.3.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn
 Dung dịch chuẩn gốc các hormon 500 µg/mL
Cân chính xác khoảng 10 mg các chất chuẩn trên cân phân tích có độ chính xác
đến 0,01mg. Hòa tan bằng MeOH và chuyển vào bình định mức 20 mL, định mức đến
vạch và lắc đều.
Bảo quản các dung dịch ở 2 ÷ 8ºC, tránh ánh sáng, sử dụng được trong vòng 6
tháng.
Ghi chú: Nồng độ dung dịch chuẩn gốc cần được tính thực tế theo lượng chuẩn
cân và độ tinh khiết của chất chuẩn.
 Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 µg/mL
Dùng micropipet hút chính xác 200 µL các dung dịch chuẩn gốc cho vào bình
định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng MeOH.
Bảo quản các dung dịch này ở 2 ÷ 8ºC, tránh ánh sáng, sử dụng được trong 1
tháng.
 Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 100 ng/mL
16