Nghiên cứu phân lập, phân loại 2 loài Aspergillus flavus và A. parasiticus trên vị thuốc Cam thảo (Radix Glycyrrhizae)

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MALITA KHOUNTHAVONG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, PHÂN LOẠI
2 LOÀI ASPERGILLUS FLAVUS VÀ
A.PARASITICUS TRÊN VỊ THUỐC
CAM THẢO (RADIX GLYCYRRHIZAE)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI-2019

1


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MALITA KHOUNTHAVONG
MÃ SINH VIÊN: 1401327

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, PHÂN LOẠI
2 LOÀI ASPERGILLUS FLAVUS VÀ
A.PARASITICUS TRÊN VỊ THUỐC
CAM THẢO (RADIX GLYCYRRHIZAE)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Quỳnh Lê
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Vi Sinh và Sinh Học

HÀ NỘI - 2019

1


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và biết ơn sâu sắc
tới TS. Nguyễn Quỳnh Lê – Giảng viên Bộ môn Vi Sinh và Sinh Học trường Đại
Học Dược Hà Nội , cô là người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình , giúp đỡ và tạo
mọi điều kiện để em thực hiện và hoàn thành khóa luận này.
Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy giáo, cô giáo, các
chị kỹ thuật viên của Bộ môn Vi sinh và Sinh học cùng toàn thể thầy cô trường
Đại học Dược Hà Nội đã chia sẻ và giúp đỡ em có được những kiến thức quý báu
trong học tập và hành trang trong quá trình thực hiện khóa luận.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình cùng
bạn bè đã luôn động viên và giúp đỡ em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Malita KHOUNTHAVONG

1


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 2
1.1. Vài nét về chi Aspergillus Fr.: Fr ............................................................. 2
1.1.1. Loài Aspergillus flavus Link.............................................................. 3
1.1.2. Loài Aspergillus parasiticus Speare .................................................. 4
1.2. Tình hình nghiên cứu vi nấm và mycotoxin trên thảo dược ở trong
nước ............................................................................................................... 5
1.3. Tình hình nghiên cứu vi nấm và mycotoxin trên thảo dược ở ngoài
nước ............................................................................................................... 6
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 13
2.1. Đối tượng, trang thiết bị nghiên cứu........................................................ 13
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................... 13
2.1.2. Môi trường phân lập và xác định nấm mốc ....................................... 13
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu .......................................................................... 13
2.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 14
2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 14
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu ....................................................................... 14
2.3.2. Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu ......................................... 14


2.3.3. Phương pháp phân lập nấm mốc.. ..................................................... 15
2.3.4. Phương pháp phân loại nấm mốc...................................................... 15
2.3.5. Các chỉ số đánh giá mức độ nhiễm nấm............................................ 16
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN........................ 17
3.1. Hàm ẩm của các mẫu cam thảo bắc nghiên cứu ..................................... 17
3.2. Mức độ nhiễm 2 loài A. flavus và A. parasiticus trên các mẫu cam thảo
bắc nghiên cứu.............................................................................................. 17

3.2.1. Kết quả phân lập và phân loại ......................................................... 17
3.2.2. Đặc điểm sinh hóa của các chủng thuộc 2 loài A. flavus,A. parasiticus
và một số loài khác của chi Aspergillus Fr.: Fr. phân lập được ................. 25
3.2.3. Đặc điểm khuẩn lạc và vi học của 2 loài A. flavus, A. parasiticus và
một số loài khác phân lập được của chi Aspergillus Fr.: Fr. từ các mẫu cam
thảo bắc nghiên cứu .................................................................................. 28
3.3. Một số ý kiến bàn luận………………………………………………....30
3.3.1. Hàm ẩm của dược liệu……………………………………………...30
3.3.2. Phương pháp xác định các chủng thuộc 2 loài A. flavus và A.
parasiticus bằng phương pháp sinh hóa .................................................... 30
3.3.3. Phương pháp xác định các chủng thuộc 2 loài bằng phương pháp hình
thái ............................................................................................................ 32
3.3.4. Mức độ nhiễm 2 loài A.flavus và A. parasiticus trên vị thuốc cam
thảo bắc..................................................................................................... 32
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................................... 33
1. Kết luận .................................................................................................... 33
2. Đề xuất ..................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADM

Aspergillus Differentiation Medium Base

AFAP

Aspergillus flavus and parasiticus Agar

CREA

Creatine Sucrose Agar

DĐVN

Dược điển Việt Nam IV

DGM

Dichloran Glycerol Medium Base

HPLC

High Performe Liquid Chromatography

LÔ

LÃN ÔNG

MEA

Malt Extract Agar

PDA

Potato Dextrose Agar


DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 3.1

Hàm ẩm của các mẫu cam thảo bắc nghiên cứu

17

Bảng 3.2

Mức độ nhiễm 2 loài A. flavus, A. Parasiticus và một số

18

loài chủ yếu khác từ 10 mẫu cam thảo bắc nghiên cứu
Bảng 3.3

Đặc điểm khuẩn lạc của 2 loài A. flavus, A. parasiticus

28

và một số loài khác phân lập được từ các mẫu cam thảo
bắc
Bảng 3.4

Đặc điểm vi học của 2 loài A. flavus, A. parasiticus và
một số loài khác phân lập được từ các mẫu cam thảo bắc

29

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 3.1 Loài A. flavus nhiễm trên vị thuốc cam thảo bắc

20

Hình 3.2 Loài A. parasiticus nhiễm trên vị thuốc cam thảo bắc

21

Hình 3.3 Loài A. niger nhiễm trên vị thuốc cam thảo bắc

22

Hình 3.4 Loài A. fumigatus nhiễm trên vị thuốc cam thảo bắc

23

Hình 3.5 Loài A. terreus nhiễm trên vị thuốc cam thảo bắc

24

Hình 3.6 Các chủng thuộc 2 loài A. flavus & A. parasiticus

26

Hình 3.7 Các chủng không thuộc 2 loài A. flavus & A. parasiticus

27


ĐẶT VẤN ĐỀ
Thảo dược đang được sử dụng chế biến các phương thuốc gia truyền và
nguồn nguyên liệu thô cho ngành công nghiệp dược ngày một tăng. Tuy nhiên,
nguồn nguyên liệu này chưa đáp ứng được các yêu cầu về chất lượng, độ an toàn
và tính hiệu quả. Trong quá trình thu hoạch, vận chuyển, bảo quản và phân phối,
các thảo dược là mục tiêu lây nhiễm của nhiều loại nấm mốc khác nhau, đặc biệt
là 2 loài sinh độc tố aflatoxin là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus.
Cam thảo bắc (Radix Glycyrrhizae) là một vị thuốc rất thông dụng trong đông y và
tây y. Vị thuốc có tác dụng bổ tỳ vị, nhuận phế, thanh nhiệt, giải độc và thường
được dùng để trị loét dạ dày - ruột, bệnh addison … [2]. Tuy nhiên, cho đến nay
vẫn còn rất ít các đề tài trong nước nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và
mycotoxin trên vị thuốc này. Để góp phần đảm bảo chất lượng thuốc và an toàn
cho người sử dụng dược thảo nói chung, vị thuốc cam thảo bắc nói riêng, đề tài:
“Nghiên cứu phân lập, phân loại 2 loài Aspergillus flavus và A. parasiticus trên
vị thuốc cam thảo (Radix Glycyrrhizae)” đã được triển khai với 2 mục tiêu sau:
1. Phân lập các chủng thuộc 2 loài Aspergillus flavus và A. parasiticus nhiễm
trên vị thuốc cam thảo bắc.
2. Phân loại các chủng thuộc 2 loài Aspergillus flavus và A. parasiticus bằng
phương pháp sinh hóa và hình thái.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Vài nét về chi Aspergillus Fr.: Fr

Chi Aspergillus do Micheli mô tả lần đầu vào năm 1729, sau đó đến năm

1832 được Fries chấp nhận và theo luật quốc tế về danh pháp thực vật, chi
Aspergillus chính thức được mang tên Aspergillus Micheli ex Fries. Sau này Fries
lại xem xét bổ sung nên được mang tên Aspergillus Fries ex Fries [8].
Về mặt phân loại học chi Aspergillus có một số đặc điểm sau (hình 1.1):

Hình 1.1: Đặc điểm vi học của chi Aspergillus [20]
- Hệ sợi nấm: gồm các sợi ngăn vách, phân nhánh, không màu, màu nhạt hay
trong một số trường hợp có màu nâu hoặc nâu sẫm khác ở các vùng trên khuẩn
lạc.
- Bộ máy mang bào tử trần: phát triển từ một tế bào có đường kính lớn hơn, thành
tế bào dày hơn các tế bào lân cận của sợi nấm (tế bào chân – foot cell).
- Giá bào tử trần (Conidiophore): phát triển từ tế bào chân, như một nhánh của
sợi nấm, gần như thẳng góc với trục của tế bào chân và thường ở trên bề mặt cơ
chất. Giá bào tử trần không phân nhánh, không có hoặc có vách ngăn.
2


- Bọng đỉnh giá (Vesicle): là phần phình to ở đỉnh giá bào tử trần, thường có hình
chùy, hình elip, hình gần cầu hoặc hình cầu, không có vách ngăn. Bọng hữu thụ
này mang các thể bình.
- Thể bình (Phialide): là tế bào trực tiếp sinh conidi, nằm ở trên các bọng đỉnh
giá. Các thể bình hoặc song song và hợp thành cụm ở phần đỉnh bọng hoặc xếp
thành hình tia sát nhau trên toàn bộ bề mặt của bọng. Thể bình hoặc chỉ một tầng
hoặc hai tầng. Trong cả 2 trường hợp, mỗi thể bình cấp 1 (cuống thể bình – metula)
mang một cụm gồm 2 – 3 (hoặc nhiều hơn) thể bình cấp 2 ở phần đỉnh.
- Các bào tử trần (Conidia): được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình,
thành chuỗi hướng gốc, không phân nhánh. Bào tử trần không ngăn vách, thay đổi
cả về kích thước, màu sắc, hình dạng, dấu vết trên mặt ngoài tùy từng loài.

- Khối bào tử trần (Conidial head): tất cả các chuỗi bào tử trần tạo thành từ các
thể bình ở bọng đỉnh giá hợp thành khối bào tử trần đỉnh bọng. Khối bào tử trần
đỉnh bọng có hình cầu, hình cột hoặc hình tia tỏa tròn [20].
Chi Aspergillus nằm trong họ Moniliceae (Nấm bông) – là một trong 4 họ
thuộc bộ Hyphomycetales.[9].
1.1.1. Loài Aspergillus flavus Link
Đặc điểm khuẩn lạc: Khuẩn lạc trên môi trường Czapek ở 25oC, sau 7 ngày nuôi
có đường kính 3-5 cm, có màu xanh hơi vàng, sau chuyển thành màu xanh, hơi
vàng tối. Khuẩn lạc trên môi trường MEA phát triển nhanh hơn; các đặc điểm
khác tương tự như trên môi trường Czapek. Phát triển chậm trên môi trường
CREA; mặt trái khuẩn lạc có màu vàng cam trên môi trường AFPA [34].
Đặc điểm vi học: Khối conidi đỉnh bọng (conidial head) có dạng phóng xạ
(radiate), sau tách thành các cột lỏng lẻo; màu sắc xanh hơi vàng chuyển dần sang
màu xanh vàng tối (dark yellow –green). Giá conidiophore không màu, có gai,
một số chủng có thể dài tới 2,5 mm. Bọng (vesicle) có dạng hình cầu tới gần cầu,
đường kính 25-45 μm. Thể bình (phialide) được sinh trực tiếp từ bọng hoặc cuống
thể bình (metula), kích thước 6-10 x 4,0-5,5 μm. Cuống thể bình (metulae) có kích
thước 6,5-10 x 3-5 μm. Conidi (conidium/conidia): có dạng hình cầu, tới gần cầu,
3


đường kính 3,6 μm, màu xanh nhạt, có gai (echinulate). Hạch nấm (sclerotia)
thường xuất hiện ở các chủng mới phân lập, có hình dạng và kích thước thay đổi,
thường có màu nâu hay đen [34].
Khả năng sinh độc tố: Loài nấm này có khả năng sinh các chất chuyển hóa độc
(mycotoxin) như acid kojic, acid 3-nitropropionic, acid cyclopiazonic, aflatoxin
B1, B2, và acid aspergillic [34].
Các cơ chất thường gặp: Thường gặp trên lạc, các loại gia vị từ thực vật, các
loại hạt có dầu, các loại hạt ngũ cốc, các loại quả khô và thảo dược,…[34].
1.1.2. Loài Aspergillus parasiticus Speare

Đặc điểm khuẩn lạc: Khuẩn lạc trên môi trường Czapek agar ỏ 25oC, sau 5 ngày
nuôi, có đường kính 2,5 – 3,5 cm, có màu xanh tối. Khối conidi đỉnh bọng có màu
xanh, dạng phóng xạ. Các giá conidiophore hầu hết có chiều dài trong khoảng
300-700 μm, không màu (hyaline), thành ráp (có gai). Bọng (vesicle) có dạng gần
cầu, đường kính 20-35μm. Thể bình (phialides) thường mọc trực tiếp trên bọng,
kích thước 7-9 x 3-4μm, không màu hoặc xanh nhạt. Conidi hình cầu, đường kính
3,5-5,5μm. Màu xanh vàng (yellow-green), có gai ráp.
- Khuẩn lạc trên môi trường MEA phát triển nhanh hơn, các đặc diểm khác tương
tự. Phát triển kém trên môi trường CREA [34].
Khả năng sinh độc tố: Loài A. parasiticus có khả năng sinh các chất chuyển hóa
thứ cấp độc (mycotoxin) như: acid Kojic, acid aspergillic, aflatoxin B1, B2, G1,
G2 [34].
Các cơ chất thường gặp: Các loại hạt ngũ cốc, các loại quả hạch (nuts), trong
đất (soil) [34].

4


1.2. Tình hình nghiên cứu vi nấm và mycotoxin trên thảo dược ở trong nước
Việt Nam là một trong những quốc gia sử dụng lượng thảo dược lớn hàng
năm, lại có khí hậu nóng ẩm, phương pháp thu hoạch, chế biến, bảo quản còn lạc
hậu, chủ yếu theo kinh nghiệm. Điều này làm cho nguồn nguyên liệu và chế phẩm
dược thảo rất dễ bị nấm mốc xâm nhiễm, phát triển và sinh độc tố.
Trong khoảng vài thập niên trở lại đây, mặc dù chưa nhiều nhưng cũng đã
có một số công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và mycotoxin trên
thảo dược [3], [4], [5]. Trong đó, đáng chú ý là công trình nghiên cứu về mức độ
nhiễm nấm mốc và aflatoxin của tác giả Trần Trịnh Công và cộng sự [5] trên 9 vị
thuốc gồm: Hạt sen (Semen Nelumbinis): 70 mẫu; Ngũ vị tử (Fructus Kadsurae),
ý dĩ (Semen coicis): mỗi vị 20 mẫu; Nhân sâm (Radix ginseng), đẳng sâm (Radix
Codonopsis), sa sâm (Launae pinnatifida Cass., rễ nhiều cây khác nhau, họ thực

vật khác nhau), ngưu tất (Radix Achyranthis bidentatae), bạch truật (Rhizoma
Atractylodis macrocephalae, thân rễ phơi hay sấy khô của cây bạch truật) và
hòang kỳ (Radix Astragali membranacei, rễ phơi hay sấy khô của cây hoàng kỳ):
mỗi vị 15 mẫu, được thu thập từ các hiệu thuốc đông dược thuộc phố Lãn Ông,
Hà Nội; thành phố Hải Dương, tỉnh Hải Dương; thị xã Bắc Ninh, Tỉnh Bắc Ninh,
được chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ phòng trước khi phân lập,
phân loại nấm và phân tích độc tố aflatoxin. Kết quả cho thấy, các chủng nấm
phân lập được chủ yếu thuộc chi Aspergillus, tiếp sau là Penicillium và nhóm nấm
tiếp hợp với các chi Rhizopus, Absidia và Mucor. Trong đó, các loài có khả năng
sinh độc tố như A. flavus, A. parasiticus, A. niger thường chiếm tỷ lệ cao trên các
thảo dược dạng quả, hạt: 10/20 mẫu ý dĩ nghiên cứu bị nhiễm 2 loài A. flavus và
A. parasiticus với số lượng chủng phân lập được dao động 4-18 chủng/mẫu (60
hạt); 20/70 mẫu hạt sen nghiên cứu bị nhiễm loài A. flavus với tỷ lệ chủng dao
động từ 10-60 chủng/mẫu (60 hạt). Kết quả phân tích độc tố bằng HPLC cho thấy:
13/20 bị nhiễm aflatoxin toàn phần (tổng của B1, B2, G1 và G2) dao động trong
khoảng 2,2-364,3 ppb; trong đó, có 12 mẫu vượt quá qui định của DĐVN IV
(PL12.2), lớn hơn 4ppb (5,3-364,3 ppb). Với vị thuốc ý dĩ: 6/10 mẫu phân tích
5


độc tố bị nhiễm aflatoxin toàn phần dao động từ 3,3-24,1 ppb; trong đó có 5 mẫu
vượt quá 4ppb (8,8-24,1). Vị thuốc ngũ vị tử có 5/10 mẫu phân tích độc tố bị
nhiễm aflatoxin toàn phần dao động từ 0,1- 0,9 ppb. Với kết quả thu được cho
thấy nguồn nguyên liệu thảo dược này cần phải được giám sát chặt chẽ trước khi
chuyển đến các nhà máy sản xuất thuốc và cộng đồng sử dụng bởi việc sử dụng
các dược liệu này là rất thường xuyên và kéo dài.

1.3. Tình hình nghiên cứu vi nấm và mycotoxin trên thảo dược ở ngoài nước
Nấm mốc có thể phát triển trên nhiều loại sản phẩm, hàng hóa khác nhau,
đặc biệt là các sản phẩm có nguồn gốc thực vật khi gặp các điều kiện thuận lợi về

nhiệt độ, độ ẩm và sinh độc tố (mycotoxin). Mycotoxin là các sản phẩm chuyển
hóa thứ cấp độc được tạo bởi các chi nấm chủ yếu như Aspergillus, Penicillium,
Fusarium và Alternaria. Mycotoxin có thể gây ra nhiều tác động khác nhau như
ung thư, độc với hệ thần kinh, gây quái thai, và làm tổn thương hệ miễn dịch. Cho
đến nay, có khoảng 400 mycotoxin đã được phát hiện [9]. Tuy nhiên, xét về tác
hại đối với sức khỏe con người và động vật nuôi, các mycotoxin quan trọng là:
aflatoxin, ochratoxin A, fumonisin, zearalenone, và deoxynivalenol. Các độc tố
này thường được phát hiện trên các sản phẩm như ngũ cốc, các loại quả hạch
(nuts), thảo dược (herbal medicines), và các loại gia vị (spices). Các sản phẩm có
nguồn gốc thực vật, khi được bảo quản lâu (thường trên 48 giờ) sẽ nhạy cảm với
sự phát triển của nấm mốc và hình thành mycotoxin [9].
Các dữ liệu từ Ấn Độ cho thấy, mycotoxin đã được phát hiện ở mức độ cao
so với hàm lượng cho phép, trên các thực vật làm thuốc thường gặp ở quốc gia
Nam Á này. Các nghiên cứu từ Thổ Nhĩ Kỳ cũng cho thấy, các loại sản phẩm từ
quả vả khô (dried figs) đã bị nhiễm ở mức độ cao các mycotoxin như aflatoxin,
ochratoxin A, và fumonisin B1. Đây cũng là khu vực có tỷ lệ nhiễm độc tố
ochratoxin A cao trên sản phẩm được điều chế từ rễ cây cam thảo. Các thuốc
truyền thống của Trung Quốc cũng đã được ghi nhận bị nhiễm các aflatoxin và
ochratoxin A cao hơn mức cho phép [9].
6


Sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc thực vật trong thực hành trị liệu, là một
thực tế tồn tại từ ngàn xưa, trước khi thuốc tân dược phát triển, phổ biến, và vẫn
được sử dụng cho đến tận ngày nay. Mặc dù các thuốc kháng sinh đã được đưa
vào sử dụng từ những năm 1940, nhưng vẫn có tới 80% dân số tin dùng các cây
thuốc bản địa trong điều trị bệnh [18]. Do các dược thảo có nguồn gốc thực vật,
chúng thường bị nhiễm, hư hỏng bởi nấm trước thu hoạch, trong quá trình vận
chuyển và bảo quản. Trong quá trình phát triển, nhiều mycotoxin được tạo thành,
và là các chất gây hại cho sức khỏe người tiêu dùng. Sự gây hư hỏng cho dược

thảo không chỉ gây ra nhiều tác động bất lợi đến cộng đồng sử dụng, mà còn làm
giảm hiệu quả và tiềm năng sử dụng của thuốc. Một số nhà nghiên cứu còn nhận
xét, nấm mốc và mycotoxin là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây tụt hậu
của nền công nghiệp dược thảo Ấn Độ (một nước có nền y học cổ truyền lâu đời
nhất trên thế giới với dược thảo là nguồn nguyên liệu chính) [18].
Tosun và cộng sự [36] đã nghiên cứu mức độ nhiễm độc tố aflatoxin trên 12
mẫu chè thuốc (herbal tea) đang lưu hành ở các cửa hiệu ở Manisa (Thổ Nhĩ Kỳ)
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết quả cho thấy: Trong số 48 mẫu được phân
tích, có 43 mẫu bị nhiễm aflatoxin. Hàm lượng cao nhất của độc tố này (34,18
µg/kg) đã phát hiện thấy trên một mẫu của chè thuốc “Cúc La Mã” (camomile
tea). Sự xuất hiện của các aflatoxin B1, B2, G1 và G2 đã được phát hiện trong các
mẫu chè thuốc ở các tỷ lệ lần lượt là 54, 29, 71 và 46%. Hàm lượng các độc tố
này trong các mẫu được phát hiện lần lượt dao động trong các khoảng 0-14,2; 012,4; 0-13,5 và 0-28,7 µg/kg. Độc tố aflatoxin đã không phát hiện thấy trong 5
mẫu của 3 loại chè thuốc khác.
Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và mycotoxin trên 12 dược thảo dạng
hạt gồm: Thảo quyết minh (cassia seed), hạt cây tơ hồng (chinese dodder seed),
hạt ý dĩ (coix seed), sa uyển tử (flastem milkvetch seed), hạt sen (lotus seed), hạt
vải (lychee seed), đào nhân (peach seed), hạt tiêu (pepperweed seed), hạt mạ đề
(plantain seed), bá tử nhân (platycladi seed), hạt màn màn (spiderflower seed), và
hạt quýt (tangerine seed) cho thấy: 27 loài thuộc 12 chi nấm phân lập được từ các
7


mẫu hạt được tiệt trùng bề mặt. Trong đó, loài Chaetomium globosporum là phổ
biến nhất (chiếm tỷ lệ 23%), tiếp sau là loài Microascus trigonosporus (12%) và
Alternaria alternata (9%). Với hệ vi nấm bề mặt, 34 loài thuộc 7 chi đã được phát
hiện. Trong đó, Aspergillus niger và Penicillium polonicum là các loài phổ biến
nhất (lần lượt là 12% và 15%). Các mẫu hạt dược thảo đã được kiểm tra khả năng
nhiễm 2 độc tố chính là ochratoxin và aflatoxin (B1, B2, G1 và G2) bằng thiết bị
siêu hiệu năng cao kết nối với khối phổ 2 lần (UPLC-MS/MS) cho thấy: Các mẫu

hạt trắc bách diệp (bá tử nhân) đã bị nhiễm độc tố aflatoxin B1 (52,0 µg/kg) và
hạt quýt đã phát hiện thấy độc tố ochratoxin A (92,3 µg/kg), quá qui định cho
phép (lần lượt là 5 µg/kg và 20 µg/kg) của châu Âu [13].
Nghiên cứu 36 mẫu chè thuốc (Pu-erh tea), có xuất xứ từ tỉnh Yunnan, tây
nam Trung Quốc cho thấy: Nấm mốc đã phân lập được ở tất cả các mẫu ở nồng
độ 1,0 x 101 - 2,6 x 106 CFU/g chè. Trong đó, 36 loài thuộc 19 chi nấm đã được
nhận diện. Các loài phổ biến nhất là Aspergillus acidus và A. fumigatus, tiếp sau
là nhóm nấm tiếp hợp Zygomycetes và các loài thuộc chi Penicillium. Các độc tố
aflatoxin và fumonisin không phát hiện thấy trong các mẫu nghiên cứu. Độc tố
ochratoxin A đã được phát hiện trong 4/36 (11,1%) mẫu chè nghiên cứu [21].
Nghiên cứu chất lượng thuốc về tiêu chuẩn vi sinh của 303 mẫu thuộc 3
nhóm thảo dược và gia vị gồm: 11 loại thuộc nhóm sử dụng lá, 6 loại sử dụng quả
và 3 loại sử dụng hoa. Kết quả xác định và đếm vi sinh vật bằng các môi trường
chuẩn cho thấy: Bên cạnh bị nhiễm tỷ lệ cao vi khuẩn (coliform, tụ cầu vàng,
Salmonella), nấm men, nấm sợi đã phát hiện thấy trong tất cả các mẫu nghiên cứu.
Trong đó, Aspergillus và Penicillium là các chi nấm có số loài phân lập được
nhiều hơn so với các chi Alternaria, Absidia, Mucor, Rhizoctonia và
Cladosporium. Các mẫu phân tích không phát hiện thấy độc tố aflatoxin (B1, B2,
G2 và G2). Tuy nhiên, các tác giả đã khuyến cáo: các loại thảo dược và gia vị
thực vật là những sản phẩm có rủi ro cao, cần có nhiều nghiên cứu để tìm ra các
biện pháp chống lây nhiễm [17].

8


Mahajan và cộng sự [25] đã nghiên cứu mức độ nhiễm nấm trên 15 mẫu dược
liệu có nguồn gốc từ 3 cây: Saraca indica Linn. (5 mẫu), Terminalia arjuna
(Roxb) Wight and Arn. (5 mẫu), và Hemidesmus indicus (L.) R. Br. (5 mẫu) được
thu thập từ các chợ ở vùng Agra và lân cận (Ấn Độ) giai đoạn 2013-2014, kết quả
cho thấy: 93% các mẫu nghiên cứu bị nhiễm 13 loài nấm khác nhau, chủ yếu thuộc

5 chi Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Rhizopus và Syncephalastrum. Trong
đó, Aspergillus là chi nấm phổ biến nhất (71,95%), tiếp sau là Penicillium
(15,44%), Rhizopus (9,51%), Alternaria (1,67%), và Syncephalastrum (1,41%).
Hầu hết các loài phân lập được của các chi Aspergillus, Penicillium, và Alternaria
đều có khả năng sinh độc tố như aflatoxin, ochratoxin, citrinin, altertoxin và acid
tennuazonic. Sự có mặt của nhiều loài nấm bảo quản (storage fungi) cho thấy nấm
mốc có khả năng lây nhiễm trên thảo dược thô (chưa chế biến) trong quá trình thu
hoạch, sau thu hoạch (nhất là trong quá trình làm khô, bảo quản, vận chuyển và
chế biến). Trên cơ sở kết quả của nghiên cứu này, các tác giả đã kết luận rằng: Sự
lây nhiễm nấm trên các nguyên liệu thực vật làm thuốc là đáng báo động, và các
nguyên liệu này cần phải được nghiên cứu kỹ trước khi được chuyển đến các nhà
máy sản xuất thuốc và cộng đồng sử dụng.
Một nghiên cứu khác, khảo sát khả năng nhiễm aflatoxin B1, B2, G1 và G2
trong các mẫu hạt của 2 loài cây: Mucuna pruriens L., Portulaca oleracceae L.,
và rễ của cây: Delphinium denudatum Wall, được thu thập từ các chợ ở New Delhi
(Ấn Độ) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với khối phổ 2 lần (HPLCMS/MS) cho thấy: các aflatoxin B1, B2 đã được phát hiện ở dạng vết (thấp hơn
giới hạn phát hiện) trong hạt của cây M. pruriens, không phát hiện được trong rễ
của cây D. denudatum. Hạt của cây P. oleraceae đã bị nhiễm aflatoxin B1 và B2
[35].
Đánh giá mức độ nhiễm nấm và aflatoxin trên vỏ quế (từ cây quế
Cinamomum zeylanicum Blume), 50 mẫu dược liệu này được thu thập từ các hiệu
bán lẻ ở khu vực miền đông của Arập Xeút. Tổng số 1,126 chủng nấm thuộc 8
loài của 2 chi Aspergillus, Penicillium đã được phân lập và nhận diện từ 50 mẫu
9


nghiên cứu. Các chủng nấm đã phân lập được từ tất cả các mẫu vỏ, thuộc các loài
Aspergillus terreus, A. glaucus, A. flavus, A. fumigatus, A. clavatus, A. niger
Penicillium restrectum và Penicillium sp. Xác định mycotoxin trên các mẫu vỏ
cho thấy: các aflatoxin B1, B2 và G1 được phát hiện ở nồng độ thấp (không quá

4,67 µg/kg) từ 62% các mẫu nghiên cứu [7].
Nghiên cứu sự xuất hiện tự nhiên của nấm mốc và độc tố trên 5 loại rễ (cả
dạng tươi và khô sau thu hoạch) của 5 loài thực vật: Aegle marmelos,
Clerodendrum phlomoides, Desmodium gangeticum, Gmelina arborea và
Oroxylum indicum bằng các phương pháp chuẩn cho thấy: có 43 và 37 chủng nấm
được phân lập từ các mẫu tươi (genuine) và khô ở các chợ, chủ yếu thuộc 2 chi
Fusarium và Aspergillus. Xác định aflatoxin B1, B2, G1 và G2 bằng test huỳnh
quang vàng xanh sáng dưới bức xạ tử ngoại 365 nm (BGYF test) và HPLC cho
thấy: Các mẫu rễ tươi và khô của 5 loại dược thảo trên đã bị nhiễm aflatoxin với
lượng khác nhau, đặc biệt là aflatoxin B1 và B2. Tuy nhiên, các độc tố này có mặt
với lượng thấp hơn so với qui định (20 µg/kg) của tổ chức Y tế Thế giới [31].
Khati [24] đã khảo sát mức độ nhiễm nấm và aflatoxin trên 10 mẫu thảo dược
thô của 10 cây thuốc (Emblica officinalis, Terminalia chebula, T. belerica,
Zingiber officinalis, Piper nigrum, Cinnamomum tamala, Piper longum, Wthania
somnifera, Asparagus racemosus và Chlorophytum borivilianum), được bảo quản
ở các địa điểm khác nhau của bang Haridwar, Ấn Độ, kết quả cho thấy: Tất cả các
mẫu đã bị nhiễm một hoặc nhiều các chi nấm Alternaria, Aspergillus, Fusarium,
Chaetomium, Cladosporium, Curvularia, Penicillium, Mucor, Rhizopus,
Rhizoctonia và Verticillium. Trong số các chủng nấm phân lập được, loài
Aspergillus flavus chiếm tỷ lệ cao nhất (23,6%), tiếp sau là A. niger (19,2%). Kết
quả phân tích aflatoxin cho thấy: 2/10 mẫu bị nhiễm aflatoxin B1. Kết quả phân
tích nấm và độc tố cho thấy: các thảo dược đã tiềm ẩn rủi ro đối với sức khỏe của
người tiêu dùng và cần phải được kiểm tra chặt chẽ trước khi cho phép đưa vào
sử dụng trong cộng đồng.

10


Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm và mycotoxin trên 84 mẫu thảo dược và gia
vị thực phẩm thường dùng (có nguồn gốc từ 14 loại thực vật khác nhau, được

nhập khẩu từ Ấn Độ) được thu thập từ các hiệu bán lẻ của thủ đô Cairo, Ai Cập.
Kết quả cho thấy: 10 chi nấm đã được nhận diện. Trong đó, các loài Aspergillus
flavus, A. parasiticus, A. niger, Fusarium oxysporum, và Penicillium viricatum đã
xuất hiện với tần suất cao nhất. Kết quả phân tích mycotoxin cho thấy: 17 mẫu đã
bị nhiễm aflatoxin B1, với lượng trung bình từ 10-160 µg/kg. Độc tố ochratoxin
được phát hiện trong 3 mẫu, trung bình từ 20-80 µg/kg [10].
Đánh giá chất lượng 36 mẫu hạt tiêu (hot red pepper) được bảo quản sau khi
làm khô bằng ánh nắng mặt trời (thuộc tỉnh Razavi Khorasan, Iran trong khoảng
thời gian cuối mùa hè đầu mùa thu) về mặt vi sinh và mycotoxin bằng các phương
pháp phân tích chuẩn. Kết quả cho thấy: Bên cạnh tiêu chuẩn vi khuẩn, tất cả các
mẫu nghiên cứu đã bị nhiễm nấm dao động trong khoảng 2,4 x 10 3 – 4,6 x 106
khuẩn lạc (cfu)/g. Trong đó, chủ yếu là các chi Aspergillus, Penicillium và
Rhizopus. Đánh giá kết quả thu được cho thấy: các mẫu hạt tiêu đã bị nhiễm vi
sinh cao, chỉ có 2 mẫu (6%) là đạt tiêu chuẩn qui định của EU (2004/24/EC). Về
kết quả phân tích độc tố: có 69% và 17% các mẫu nghiên cứu lần lượt bị nhiễm
aflatoxin và ochratoxin A, có thể gây nguy hại cho sức khỏe người tiêu dùng. Kết
quả nghiên cứu là một cảnh báo về tiêu chuẩn vi sinh của nguồn nguyên liệu thảo
dược và gia vị thực vật sau thu hoạch [33].
Rashidi và cộng sự [30] đã nghiên cứu mức độ nhiễm nấm và mycotoxin trên
các mẫu của 5 loại rễ thảo dược, cả dạng tươi (lấy ở cây khỏe, giai đoạn ra hoa,
sinh quả ở các khu vực khác nhau thuộc bang Maharashtra, Ấn Độ) và dạng khô
(ở các cửa hiệu thuộc bang Pune và Mumbai, Ấn Độ) bằng các phương pháp chuẩn
(đặt trực tiếp trên môi trường thạch dinh dưỡng, test Blotter, test BGYF và HPLC).
Kết quả cho thấy: Nấm mốc đã được phát hiện trên tất cả các mẫu rễ tươi và khô.
Trong đó, các chi Fusarium và Aspergillus có tần suất phân lập được cao hơn các
chi khác. Các mẫu rễ tươi và khô đã phát hiện thấy aflatoxin B1, B2, G1 và G2
với lượng khác nhau, nhưng thấp hơn mức cho phép (20 µg/kg) của tổ chức Y tế
11

thế giới. Mặc dù vậy, các nhà nghiên cứu vẫn cảnh báo về mức độ nhiễm bởi việc
sử dụng các dược liệu này là rất thường xuyên và kéo dài.
Đánh giá mức độ nhiễm nấm và khả năng sinh độc tố trên 152 mẫu dược
liệu thô có nguồn gốc từ 56 loài thảo dược, được thu thập từ 13 cơ sở sản xuất của
Achentina [32], bằng các phương pháp phân lập, nhận diện chuẩn cho thấy: có
52% mẫu nghiên cứu bị nhiễm các loài của chi Aspergillus. Trong số này, nhóm
loài A. flavus chiếm 27% và 25% thuộc nhóm loài A. niger. Ngoài ra, 16% tổng
số mẫu đã bị nhiễm các loài của chi Fusarium. Các loài A. flavus và A. parasiticus
phân lập được nhiều nhất, với 50% trong số 40 chủng phân lập được có khả năng
sinh độc tố, và nồng độ aflatoxin xác định được dao động trong khoảng 10-2000
ng/g. Trái lại, chỉ có 26% số chủng của nhóm loài A. niger phân lập được có khả
năng sinh độc tố ochratoxin A ở nồng độ thấp, trong khoảng 0,12-9,0 ng/g. Trong
số 29 chủng thuộc các loài của chi Fusarium phân lập được, có 27,5% số chủng
thuộc 2 loài F. verticilloides và F. proliferatum có khả năng sinh độc tố fumonisin
B1 và fumonisin B2, lần lượt dao động trong các khoảng 20,0-22.000 µg/g và 5,03.000 µg/g. Các loài còn lại gồm F. equiseti, F. oxysporum, F. semitectum, F.
compactum, F. sambucinum và F. solani có khả năng sinh trichothecene nhóm A
và B hoặc Zearalenone. Qua tỷ lệ nhiễm các loài nấm có khả năng sinh độc tố trên
các mẫu thảo dược nghiên cứu, cho thấy sự cần thiết phải điều tra mức độ nhiễm
tự nhiên của mycotoxin. Trên cơ sở đó mới có thể xác định được giới hạn hợp lý
về các loại độc tố, giúp quản lý hiệu quả nguồn nguyên liệu thảo dược, tránh rủi
ro về sức khỏe của cộng đồng người sử dụng.

12


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, trang thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
10 mẫu vị thuốc cam thảo bắc được thu thập từ các hiệu thuốc đông dược
thuộc địa bàn Hà Nội (phố Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm) vào tháng 10 của năm

2018, được chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ phòng trước khi
phân lập và phân loại nấm.
2.1.2. Môi trường phân lập và xác định nấm mốc
- Môi trường PDA (Himedia, Ấn Độ). Thành phần (g/l): Khoai tây gọt vỏ: 200;
Glucose: 20; Thạch: 15; pH cuối cùng (25oC) 5,6 ±0,2.
- Môi trường Dichloran Glycerol Medium Base - DGM (Himedia, Ấn Độ). Thành
phần (g/l): Peptone: 5; Glucose: 10; KH2PO4: 1; MgSO4: 0,5; Dichloran: 0,002;
Chloramphenicol: 0,1; Thạch: 15; pH cuối cùng (25oC): 5,6 ± 0,2.
- Môi trường xác định 2 loài A. flavus và A. parasiticus: Aspergillus
Differentiation Medium Base - ADM (Himedia, Ấn Độ). Thành phần (g/l):
Peptone: 10; Cao nấm men: 20; Ferric amonium citrate: 0,5; Dichloran: 0,002;
Thạch: 15; pH cuối cùng (25oC): 6,3 ± 0,2.
- Môi trường Czapek Dox Agar (Himedia, Ấn Độ). Thành phần (g/l): Đường
kính: 30; NaNO3: 2,0; KCl: 0,5; K2HPO4: 1,0; MgSO4.7H2O: 0,5; FeSO4.7H2O:
0,01; Thạch: 15; pH cuối cùng (25oC): 7,3 ± 0,2.
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu
- Kính hiển vi Axiostar plus, Carl Zeiss (Đức), gắn máy chụp ảnh kỹ thuật số
Canon (Nhật Bản).
- Tủ cấy vô trùng Aura VF48 (Đức).
- Tủ ấm Memmert (Đức)
- Tủ sấy SEL LAB (Đức)
- Nồi hấp tiệt trùng Hiclave HVE - 25, Hirayama (Nhật Bản).

13


2.2. Nội dung nghiên cứu
Quá trình nghiên cứu gồm 5 nội dung chính như sau:
- Xác định hàm ẩm, xử lý các mẫu dược liệu nghiên cứu, đặt lên các đĩa Petri chứa
môi trường phân lập (PDA hoặc DGM) đã được chuẩn bị và ủ ở 27ºC trong 5-7

ngày.
- Phân lập các chủng nấm nhiễm trên các mẫu thảo dược nghiên cứu.
- Nuôi cấy các chủng nấm phân lập được trên môi trường Czapek Dox Agar ở
25ºC trong 7 ngày.
- Nuôi cấy xác định các chủng thuộc 2 loài A. flavus và A. parasiticus trên môi
trường ADM (AFPA).
- Khảo sát đặc điểm khuẩn lạc, vi học, sinh hóa của các chủng nấm và xác định
chi, loài.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu
Lấy mẫu là việc lựa chọn, thu thập các mẫu dược liệu cho việc kiểm tra chất
lượng. Mức độ đại diện của mẫu có ảnh hưởng trực tiếp đến độ chính xác và độ
đúng của việc kiểm tra. Việc lấy mẫu dược liệu để tiến hành phân tích nấm và độc
tố được tiến hành dựa trên cơ sở phụ lục 12.1, DĐVN IV [2]: Dược liệu được lấy
ở trên, giữa và cuối của mỗi bao gói, với khối lượng 200g. Mẫu được trộn đều và
san phẳng theo hình vuông; chia mẫu theo 2 đường chéo thành 4 phần bằng nhau.
Lấy 2 phần đối diện, trộn đều và san phẳng theo hình vuông, chia thành 2 phần
bằng nhau theo đường chéo; một phần được dùng để phân tích nấm, phần còn lại
được dùng để phân tích độc tố.
2.3.2. Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu
Hàm ẩm các mẫu dược liệu được xác định bằng phương pháp "Mất khối
lượng do làm khô" (Phụ lục 9.6, DĐVN IV). Cách tiến hành: Dược liệu được
nghiền thô, thành mảnh nhỏ đường kính không quá 3 mm. Cân một lượng mẫu
thử (m), tiến hành làm khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 105C 5 giờ (với cam thảo bắc)
14


và đến khối lượng không đổi. Sau khi sấy, làm nguội tới nhiệt độ phòng trong
bình hút ẩm rồi cân ngay (m’).
Tính kết quả hàm ẩm theo công thức sau:

𝐻à𝑚 ẩ𝑚 (%) =

𝑚 − 𝑚′
× 100%
𝑚

2.3.3. Phương pháp phân lập nấm mốc:
Phương pháp phân lập nấm mốc trên dược liệu được áp dụng trên cơ sở
phương pháp của Samson và cộng sự (phương pháp đặt trực tiếp trên môi trường
PDA hoặc DGM) [36]: Các mẫu dược liệu (40g/mẫu, được cắt thành các mẫu có
chiều dài 1-1,5 cm) được khử trùng hệ vi nấm bề mặt bằng dung dịch natri
hypoclorid 1% mới pha trong 1 phút. Sau đó rửa 3 lần bằng nước cất đã khử trùng.
Để ráo nước, đặt nhanh vào các đĩa Petri đã có môi trường PDA (hoặc DGM)
bằng kẹp vô trùng (thực hiện trong tủ cấy vô trùng). Ủ ở nhiệt độ 27°C, sau 5-7
ngày tiến hành phân lập các chủng nấm nhiễm trên các mẫu dược liệu nghiên cứu.
2.3.4. Phương pháp phân loại nấm mốc:
- Phân loại các chi nấm theo khóa phân loại của Barnet và Hunter [11].
- Phân loại các chủng nấm đến cấp loài thuộc chi Aspergillus dựa trên mô tả đặc
điểm khuẩn lạc, vi học các loài của Samson và cộng sự 1995 [34], Raper và
Fennell 1965 [29], Pitt và Hocking 2009 [27]. Nguyên lý của phương pháp là dựa
trên sự so sánh đặc điểm khuẩn lạc (đường kính khuẩn lạc, màu sắc mặt trước và
sau của khuẩn lạc, các chất tiết trên khuẩn lạc …) và đặc điểm vi học (chủ yếu là
cấu trúc sinh conidi, kích thước, màu sắc của cấu trúc sinh conidi và conidi, …)
của các chủng khi được nuôi cấy trên môi trường chuẩn (Czapek Dox), trong cùng
điều kiện (nhiệt độ, thời gian: 25oC, 7 ngày).
- Xác định 2 loài A. flavus, A. paraciticus theo phương pháp sinh hóa của Pitt và
Hocking [27]. Nguyên lý của phương pháp là các chủng của 2 loài A. flavus, A.
paraciticus khi nuôi cấy trên môi trường ADM, ủ ở nhiệt độ 30°C sau 42-48 giờ
sẽ xuất hiện màu vàng cam sáng ở mặt trái (mặt sau) khuẩn lạc.

15


2.3.5. Các chỉ số đánh giá mức độ nhiễm nấm
Mức độ nhiễm 2 loài A. flavus và A. parasiticus được đánh giá bằng 2 chỉ số:
- Chỉ số có mặt hay tần suất xuất hiện loài trên các mẫu nghiên cứu: FQ (isolation
frequency; %) = số mẫu có mặt loài/ tổng số mẫu nghiên cứu x 100% [20].
- Chỉ số có nhiều hay mật độ loài: RD (relative fungal density; %) = số chủng của
loài/ tổng số chủng nấm phân lập được của chi Aspergillus x 100% [20].

16


CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Hàm ẩm của các mẫu cam thảo bắc nghiên cứu
Hàm ẩm của cơ chất là một yếu tố sinh thái quan trọng ảnh hưởng tới sự lây
nhiễm và phát triển của nấm. Do vậy, các mẫu của vị thuốc này trước khi tiến
hành phân lập và phân loại nấm, được xác định hàm ẩm. Kết quả xác định hàm
ẩm được liệt kê trong bảng 3.1 dưới đây.
Bảng 3.1. Hàm ẩm của các mẫu cam thảo bắc nghiên cứu
TT

Mẫu

Hàm ẩm (%)

TT

Mẫu

Hàm ẩm (%)

1

55 LÔ

11,3

6

32 LÔ

9,6

2

30 LÔ

14,1

7

24 LÔ

8,4

3

63ALÔ

13,7

8

69A LÔ

13,8

4

44A LÔ

7,4

9

51A LÔ

7,1

5

36 LÔ

14,8

10

62 LÔ

10,3

(Ghi chú. LÔ: Phố Lãn Ông)

Nhận xét: Trong 10 mẫu cam thảo bắc nghiên cứu có 6/10 mẫu có hàm ẩm đạt
yêu cầu của DĐVN IV (≤ 12%), dao động trong khoảng 7,1-11,3%; và có 4/10
mẫu có hàm ẩm không đạt yêu cầu của DĐVN IV, dao động trong khoảng 13,7 14,8%.
3.2. Mức độ nhiễm 2 loài A. flavus và A. parasiticus trên các mẫu cam thảo
bắc nghiên cứu
3.2.1. Kết quả phân lập và phân loại
Kết quả phân lập và phân loại các chủng nấm thuộc 2 loài A. flavus, A.
parasiticus và một số loài khác thuộc chi Aspergillus Fr.: Fr. nhiễm trên 10 mẫu
cam thảo bắc nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.2.

17