Xây dựng mô hình máy tính mô phỏng mạng lưới trao đổi chất sinh tổng hợp vitamin B12 của vi khuẩn Pseudomonas denitrificans
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.15 MB, 57 trang )
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----- -----
NGUYỄN THỊ LY
XÂY DỰNG MÔ HÌNH MÁY TÍNH MÔ
PHỎNG MẠNG LƯỚI TRAO ĐỔI CHẤT
SINH TỔNG HỢP VITAMIN B12 CỦA VI
KHUẨN PSEUDOMONAS DENITRIFICANS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2019
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----- -----
NGUYỄN THỊ LY
Mã sinh viên: 1401390
XÂY DỰNG MÔ HÌNH MÁY TÍNH MÔ
PHỎNG MẠNG LƯỚI TRAO ĐỔI CHẤT
SINH TỔNG HỢP VITAMIN B12 CỦA VI
KHUẨN PSEUDOMONAS DENITRIFICANS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
TS. ĐỖ NGỌC QUANG
Nơi thực hiện:
Bộ môn Vi sinh và Sinh học
HÀ NỘI - 2019
HÀ NỘI - 2019
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này trước tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân
thành và sâu sắc tới TS. Đỗ Ngọc Quang là người thầy đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và
tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. Sự đam mê,
nhiệt huyết và lòng yêu nghề của thầy đã truyền động lực để em phấn đấu và cống hiến
hết mình.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô ở bộ môn Vi sinh và Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ để em hoàn thành khóa luận
tốt nghiệp này.
Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô cùng cán bộ Trường Đại học Dược Hà Nội đã
dạy dỗ, quan tâm em trong suốt 5 năm học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè những người đã
luôn bên cạnh, động viên em cố gắng để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này.
Do trình độ còn hạn chế nên bài báo cáo khóa luận tốt nghiệp của em không thể tránh
khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy, cô để em có thể
hoàn thành tốt hơn bài báo cáo tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Nguyễn Thị Ly
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
Chương 1. TỔNG QUAN .......................................................................................... 2
1.1. Đặc điểm sinh học và quá trình sinh tổng hợp vitamin B12 của Pseudomonas
denitrificans ................................................................................................................ 2
1.1.1. Đặc điểm sinh học của Pseudomonas denitrificans ...................................... 2
1.1.2. Quá trình sinh tổng hợp vitamin B12 của Pseudomonas denitrificans ......... 2
1.1.2.1. Giới thiệu về vitamin B12 ......................................................................... 2
1.1.2.2. Con đường sinh tổng hợp vitamin B12 của Pseudomonas denitrificans .... 3
1.2. Mô hình hóa quá trình trao đổi chất .................................................................. 6
1.2.1. Nguyên lý quá trình trao đổi chất .................................................................. 6
1.2.1.1. Quá trình trao đổi chất ............................................................................. 6
1.2.1.2. Con đường trao đổi chất ........................................................................... 6
1.2.1.3. Năng lượng cần thiết cho các con đường trao đổi chất hoạt động ............ 6
1.2.2. Biểu diễn quá trình trao đổi chất dưới dạng mô hình toán học .................... 7
1.2.3. Sử dụng COBRA để xây dựng mô hình trao đổi chất.................................... 9
1.2.3.1. Constraint-based modeling (CMB) ........................................................... 9
1.2.3.2. COBRA..................................................................................................... 9
1.2.4. Phân tích cân bằng thông lượng của mô hình trao đổi chất ....................... 11
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 12
2.1. Nguyên vật liệu .................................................................................................. 13
2.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 13
2.2.1. Xây dựng mô hình ....................................................................................... 13
2.2.2. Đánh giá độ tin cậy của mô hình ............................................................... 134
2.3. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………………….14
2.3.1. Xây dựng cơ sở dữ liệu……………………………………………………..14
2.3.1.1. Cơ sở dữ liệu KEGG_PD........................................................................ 14
2.3.1.2. Cơ sở dữ liệu KEGG_RXN và KEGG_MET............................................ 15
2.3.2. Xây dựng mô hình ....................................................................................... 15
2.3.2.1. Tạo chất trao đổi .................................................................................... 16
2.3.2.2. Tạo phản ứng ......................................................................................... 17
2.3.2.3. Tạo mô hình............................................................................................ 18
2.3.3. Phân tích thông lượng của mô hình ............................................................ 19
2.3.4. Mô phỏng hoạt động của mô hình trong các điều kiện môi trường khác
nhau....................................................................................................................... 20
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN................................................................... 22
3.1. Xây dựng mô hình ............................................................................................. 22
3.1.1. Thu thập dữ liệu từ KEGG .......................................................................... 22
3.1.2. Xây dựng mô hình trao đổi chất sơ bộ của Pseudomonas denitrificans
ATCC 13867 .......................................................................................................... 23
3.1.3. Hoàn thiện mô hình ..................................................................................... 24
3.1.3.1. Bổ sung các phản ứng thiếu .................................................................... 24
3.1.3.2. Tạo phản ứng nối các chất chuyển hóa ................................................... 26
3.1.3.3. Điều chỉnh chiều phản ứng ..................................................................... 27
3.1.3.4. Tạo phản ứng trao đổi với môi trường .................................................... 29
3.1.3.5. Tạo chuỗi phản ứng hô hấp sinh ATP ..................................................... 30
3.1.3.6. Tạo phản ứng sinh khối .......................................................................... 31
3.2. Đánh giá độ tin cậy của mô hình ...................................................................... 32
3.2.1. Khả năng tạo sinh khối trong điều kiện có và không có oxy ....................... 32
3.2.2. Khả năng tạo sinh khối từ các nguồn carbon khác nhau ........................... 35
3.2.3. Khả năng sinh tổng hợp vitamin B12 từ các nguồn carbon khác nhau ...... 36
3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của glutamat và cobinamid đến sự sinh tổng hợp
vitamin B12............................................................................................................ 37
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................... 39
4.1. Kết luận ............................................................................................................. 39
4.2. Đề xuất ............................................................................................................... 39
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
AdoCbl
Adenosylcobalamin
Adenosylcobalamin
ADN
Deoxyribonucleic acid
Acid deoxyribonucleic
ADP
Adenosin diphosphate
Adenosin diphosphat
ALA
δ-aminolevulinic acid
Acid δ-aminolevulinic
ARN
Ribonucleic acid
Acid ribonucleic
ATCC
American Type Culture
Tập hợp các chủng vi sinh
Collection
vật Mỹ
ATP
Adenosin triphosphate
Adenosin triphosphat
CBM
constraint-based model
Mô hình dựa trên giới hạn
CNCbl
cyanocobalamin
cyanocobalamin
COBRA
constraint-based reconstruction Sự xây dựng lại và phân tích
and analysis
dựa trên giới hạn
Constraints-Based
Sự xây dựng lại và phân tích
Reconstruction and Analysis
dựa vào các giới hạn sử
for Python
dụng lập trình Python
DMBI
5,6-dimethylbenzimidazole
5,6-dimethylbenzimidazol
FBA
Flux balance analysis
Phân tích cân bằng thông
COBRApy
lượng
KEGG
NADH
NCBI
Kyoto Encyclopedia of Genes
Bách khoa toàn thư Kyoto
and Genomes
về gen và bộ gen
Nicotinamide adenine
Nicotinamid adenin
dinucleotide
dinucleotid
National Center for
Trung tâm thông tin công
Biotechnology Information
nghệ sinh học quốc gia
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1: Các tham số của phản ứng chuyển hóa N-acetyl-L-glutamat-5-semialdehyd
thành N-acetylornithin (R002283) ............................................................................. 26
Bảng 3.2: Tham số giới hạn của một số phản ứng trong các con đường trao đổi chất
của P. denitrificans ATCC 13867. ............................................................................. 29
Bảng 3.3: Tham số của một số phản ứng trao đổi với môi trường của P. denitrificans
ATCC 13867. ............................................................................................................ 29
Bảng 3.4: Tỷ lệ các thành phần trong sinh khối của P. putida KT2440...................... 31
Bảng 3.5: Thành phần môi trường của mô hình PD13867 ......................................... 32
Bảng 3.6: So sánh thông lượng tạo sinh khối (mmol/gDW/h) của 3 mô hình: PD13867
(P. denitrificans ATCC 13867), iJN746 (P. puttida KT2440) và iECW_1372 (E. coli
W) trong điều kiện môi trường nuôi cấy tương tự nhau. ............................................. 34
Bảng 3.7: Kết quả sinh khối tạo ra của mô hình từ 3 nguồn carbon (glucose, sucrose
và maltose) trong điều kiện có oxy............................................................................. 36
Bảng 3.8: So sánh thông lượng sinh tổng hợp vitamin B12 từ các nguồn carbon và so
với hiệu suất thực nghiệm. ......................................................................................... 37
Bảng 3.9: Thông lượng tạo sinh khối của môi trường ban đầu và môi trường bổ sung
L-glutamat và cobinamid. .......................................................................................... 38
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Các con đường sinh tổng hợp Adenosylcobalamin của Pseudomonas
denitrificans . ............................................................................................................... 5
Hình 1.2: Ma trận cân bằng hóa học. ........................................................................... 8
Hình 1.3: Các giai đoạn chính của quá trình xây dựng mô hình trao đổi chất bằng
phương pháp Constraint-based modeling . ................................................................. 11
Hình 1.4: Quá trình phân tích cân bằng thông lượng. ................................................ 12
Hình 3.1: Dữ liệu thông tin về con đường trao đổi chất Glycolysis (pdr00010) nằm trong
cơ
sở
dữ
liệu
KEGG_PD
của
Pseudomonas
denitrificans
ATCC
13867…………………………………………………………………………………. 23
Hình 3.2: Ma trận của hai phản ứng trao đổi chất được lấy ra từ chu trình citrat
(pdr00020) của P. denitrificans ATCC 13867. ......................................................... 244
Hình 3.3: Phản ứng thiếu trong con đường sinh tổng hợp arginin của P. denitrificans
ATCC 13867. .......................................................................................................... …5
Hình 3.4: (A) Phản ứng thiếu trong con đường sinh tổng hợp leucin (pdr00290) của P.
denitrificans ATCC 13867. ...................................................................................... 277
Hình 3.5: Đổi chiều phản ứng tạo pyruvat từ phosphoenol-pyruvat (R00200) của con
đường đường phân…………………………………………………………………… 28
Hình 3.6: Con đường phosphoryl oxy hóa (pdr00190) của Pseudomonas denitrificans
ATCC 13867. ............................................................................................................ 31
Hình 3.7: Thông lượng tối ưu của phản ứng bio1 trong điều kiện có và không có oxy
của mô hình PD13867. ............................................................................................... 33
Hình 3.8: Thông lượng các phản ứng kết thúc chuỗi phosphoryl oxy hóa trong điều kiện
có oxy của mô hình PD13867. ................................................................................... 34
Hình 3.9: Thông lượng các phản ứng kết thúc chuỗi phosphoryl oxy hóa trong điều kiện
không có oxy của mô hình PD13867.......................................................................... 35
Hình 3.10: Thông lượng sinh khối tạo ra trong điều kiện không có oxy và không có hô
hấp khử nitrat của mô hình PD13867. ........................................................................ 35
Hình 3.11: Quá trình chuyển hóa tạo vitamin B12 từ ba nguồn carbon: glucose, sucrose,
maltose của P. denitrificans ATCC 13867. ................................................................ 37
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong điều kiện phát triển của công nghệ thông tin hiện nay, mô hình mô phỏng đang
trở thành một công cụ hiệu quả để nghiên cứu hệ thống sinh học của các quá trình trao
đổi chất. Mô hình mô phỏng cung cấp một nền tảng để trực quan hóa và phân tích dữ
liệu gen và chức năng gen, protein và chức năng protein và dữ liệu chuyển hóa. Từ đó,
nó cho phép nghiên cứu về mối tương quan giữa các phản ứng trong một mạng lưới trao
đổi chất cũng như ảnh hưởng của các yếu tố như dinh dưỡng, độc tố, di truyền, … lên
từng phản ứng trao đổi chất của sinh vật. [7]
Vitamin B12 là một vitamin thiết yếu và được sử dụng rộng khắp trong y khoa và
trong công nghiệp thực phẩm [5]. Do cấu trúc phức tạp, vitamin B12 hiện nay chủ yếu
được sản xuất bằng vi sinh vật. Pseudomonas denitrificans là một trong những vi sinh
vật đang được sử dụng rộng rãi để sản xuất vitamin B12 trên quy mô công nghiệp [28].
Quá trình trao đổi chất của P. denitrificans đã và đang được cải biến theo nhiều hướng
khác nhau nhằm gia tăng hiệu suất sinh tổng hợp vitamin B12 [5]. Việc sử dụng mô hình
trao đổi chất mô phỏng có thể giúp thu ngắn quá trình sàng lọc đối tượng cho các nghiên
cứu thực nghiệm. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có một mô hình trao đổi chất nào
của P. denitrificans được công bố.
Để góp phần tạo thêm một công cụ cho nghiên cứu trao đổi chất của P. denitrificans.
chúng tôi quyết định thực hiện đề tài nghiên cứu: “Xây dựng mô hình máy tính mô phỏng
mạng lưới trao đổi chất sinh tổng hợp vitamin B12 của vi khuẩn Pseudomonas
denitrificans”. Mục tiêu của đề tài là bước đầu xây dựng được mô hình trao đổi chất mô
phỏng của P. denitrificans đạt được độ tin cậy để phục vụ cho nghiên cứu.
1
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm sinh học và quá trình sinh tổng hợp vitamin B12 của Pseudomonas
denitrificans
1.1.1. Đặc điểm sinh học của Pseudomonas denitrificans
Pseudomonas denitrificans, một loại vi khuẩn kị khí tùy tiện gram âm, có khả năng
thực hiện hô hấp khử nitrat và có khả năng sinh tổng hợp vitamin B12 trong điều kiện
hiếu khí [1],[5].
Pseudomonas denitrificans ATCC 13967 là chủng hay được sử dụng trong nghiên
cứu và trong công nghiệp sinh tổng hợp vitamin B12. Kích thước bộ gen của
Pseudomonas denitrificans ATCC 13867 là 5696307 bp với 65,2% hàm lượng G+C. Bộ
gen của P.denitrificans ATCC 13867 có 2567 operon và 5059 gen mã hóa protein. Trong
số 5059 protein, 3013 protein (chiếm 59,56%) được dự kiến nằm trong tế bào chất, 982
protein (19,4%) nằm trên màng. Vị trí còn lại 1045 protein (21,02%) chưa được xác
định. Bộ gen của P. denitrificans ATCC 13867 chứa đầy đủ các gen mã hóa cho 26
enzym cần thiết để tổng hợp coenzym B12 khi có oxy. Các gen được phân bố ở hai
nhóm khác nhau trên nhiễm sắc thể [1].
1.1.2. Quá trình sinh tổng hợp vitamin B12 của Pseudomonas denitrificans
1.1.2.1. Giới thiệu về vitamin B12
Vitamin B12 hay còn gọi là cyanocobalamin là một trong những phân tử sinh học
phức tạp. Các dạng sinh học của vitamin B12 bao gồm adenosylcobalamin,
hydroxocobalamin và methylcobalamin. Vitamin B12 là một yếu tố tăng trưởng quan
trọng đối với vi sinh vật và động vật. Vitamin B12 được phát hiện lần đầu tiên vào
năm 1926 và khi đó được gọi là “yếu tố chống lại thiếu máu nguy hiểm” [15],[19].
Phân tử vitamin B12 gồm ba phần: một vòng Corrin trung tâm chứa bốn phối tử với
ion coban ở trung tâm, một phối tử (alpha) thấp hơn được cho bởi DMBI (5,6dimethylbenzimidazol) và phối tử trên (beta) được tạo từ một nhóm adenosyl hoặc một
nhóm methyl. Các sản phẩm cuối cùng tạo ra trong tự nhiên từ sinh tổng hợp vitamin
B12 là 5′-deoxyadenosylcobalamin (coenzym B12), methylcobalamin và
hydroxocobalamin. Dạng vitamin B12 chủ yếu được sản xuất trong công nghiệp là
2
cyanocobalamin (CNCbl), một cobalamin ổn định, nhóm adenosyl hoặc methyl được
thay thế bằng nhóm cyano là kết quả của quá trình chiết xuất. [15]
Hiện nay, vitamin B12 được sử dụng rộng rãi trong điều trị thiếu máu ác tính, viêm
dây thần kinh ngoại biên [22] và là cofactor cần thiết cho enzym methionine synthase
và (R)-methylmalonyl-CoA mutase ở động vật và người [23].
1.1.2.2. Con đường sinh tổng hợp vitamin B12 của Pseudomonas denitrificans
Do quá trình tổng hợp vitamin B12 hóa học rất phức tạp và tốn kém, vitamin B12
thương mại chỉ được sản xuất thông qua quá trình lên men sinh tổng hợp từ vi sinh vật.
Trong tự nhiên có nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp vitamin B12 như
Pseudomonas
freudenreichii,
denitrificans,
Salmonella
Propionibacterium
typhimurium,
shermanii,
Propionibacterium
Bacillus
megaterium,
Rhodopseudomonas protamicus, Rhizobium cobalaminogenum, và Streptomyces
olivaceus. Hầu hết các vi sinh vật sản xuất vitamin B12 trong điều kiện kỵ khí, trong khi
P. denitrificans tạo ra vitamin B12 trong điều kiện hiếu khí. Năng suất lên men sản xuất
vitamin B12 của P.denitrificans cao hơn so với các vi sinh vật lên men kỵ khí, có thể
đạt tới 300 mg/l. [28]
Pseudomonas denitrificans sinh tổng hợp adenosylcobalamin theo cả hai con đường
tổng hợp mới (de novo) và tổng hợp nối tiếp (salvage). Tổng hợp nối tiếp cần cung cấp
cobinamid từ bên ngoài thông qua các hệ thống vận chuyển liên kết ATP (ABC), bao
gồm BtuC, BtuD và BtuF [5].
Pseudomonas denitrificans chủ yếu tổng hợp vitamin B12 hiếu khí qua con đường
tổng hợp mới (hình 1.1). Tiền chất để sinh tổng hợp vitamin B12 là δ-aminolevulinic
acid (ALA). ALA được tổng hợp bởi con đường C4 hoặc C5. Hai phân tử ALA được
ngưng tụ để tạo monopyrrol porphobilinogen và bốn phân tử này sau đó được trùng hợp
và đóng vòng để tạo uroporphyrinogen III. Tiếp đó, Uroporphyrinogen III được methyl
hóa ở vị trí C-2 và C-7 bởi enzym CobA để tạo ra precorrin-2 (là một tiền chất chính
của cobalamin). Tám phản ứng methyl hóa tiếp theo tạo ra Adenosyl cobyrinic acid a,
c-diamide. Chất này nhờ bốn phản ứng amid hóa các nhóm carboxyl ở các vị trí b, d, e
và g để tạo ra acid adenosylcobyric. Sau đó, (R)-1-amino-2-propanol được gắn trực tiếp
vào vòng corrinoid của acid adenosylcobyric thông qua protein α và được phosphoryl
3
hóa bởi CobP. Hai phản ứng tiếp theo chuyển các phối tử trục dưới vào AdoCbi-GDP
và tạo ra adenosylcobalamin (AdoCbl). [5]
Pseudomonas Denitrificans có ba hợp chất bao gồm cobalamin, heme và
bacteriochlorophyll đều có chung con đường sinh tổng hợp từ ALA đến
Uroporphyrinogen III. Ba hợp chất này có mối quan hệ cạnh tranh, tương tác và phụ
thuộc lẫn nhau. Mối quan hệ phức tạp giữa các hợp chất này là kết quả của quá trình tiến
hóa tự nhiên và có ảnh hưởng quan trọng đến sự sinh tổng hợp vitamin B12 của vi sinh
vật. [5]
4
Hình 1.1: Các con đường sinh tổng hợp Adenosylcobalamin của Pseudomonas
denitrificans [5].
5
1.2. Mô hình hóa quá trình trao đổi chất
1.2.1. Nguyên lý quá trình trao đổi chất
1.2.1.1. Quá trình trao đổi chất
Trao đổi chất là tập hợp tất cả các phản ứng enzym cần cho sự tăng trưởng, phát triển
và phân chia tế bào. Các phản ứng hóa học của sự trao đổi chất được biểu diễn thành
các con đường trao đổi chất, trong đó một chất được biến đổi thông qua hàng loạt các
bước thành các chất khác, bởi một chuỗi các enzym. Enzym hoạt động như là chất xúc
tác cho phép các phản ứng tiến hành nhanh hơn. Enzym cũng cho phép điều chỉnh các
con đường trao đổi chất để đáp ứng với những thay đổi trong môi trường của tế bào hoặc
tín hiệu từ các tế bào khác [11]. Trong cơ sở dữ liệu như BRENDA [21], METACYC
[3] hoặc KEGG [9], các enzym được xác định bởi mã EC, một mã cụ thể đề cập đến một
loại enzyme hoặc một nhóm enzym có chức năng cụ thể.
1.2.1.2. Con đường trao đổi chất
Mỗi con đường trao đổi chất là một mạng lưới của toàn bộ quá trình trao đổi chất, kết
nối một nhóm các chất chuyển hóa với các chất chuyển hóa khác thông qua các phản
ứng. Trong một con đường trao đổi chất, sản phẩm của một phản ứng trở thành chất
tham gia phản ứng cho phản ứng tiếp theo. Hướng của các con đường trao đổi chất
thường được coi là một chiều [11].
Các con đường trao đổi chất trung tâm là những con đường liên quan đến các chất
dinh dưỡng quan trọng cốt lõi như carbohydrat, acid béo và acid amin. Một số con đường
trung tâm như là: đường phân, chu trình citrat, con đường pentose phosphat và chu trình
Calvin. Các con đường trao đổi chất trung tâm thường được chấp nhận là gần như giống
nhau trong tất cả các sinh vật [11].
1.2.1.3. Năng lượng cần thiết cho các con đường trao đổi chất hoạt động
Quá trình trao đổi chất và các phản ứng vận chuyển yêu cầu năng lượng. Năng lượng
này được tạo ra thông qua quá trình dị hóa, khi các chất dinh dưỡng bị phá vỡ tạo ra
NADH và ATP [11].
NADH là chất mang điện tử. Các electron năng lượng cao từ NADH được truyền dọc
theo chuỗi vận chuyển điện tử trong màng trong của ty thể, khi đó năng lượng được giải
6
phóng và được sử dụng để phosphoryl oxy hóa ADP thành ATP, điều khiển quá trình
tạo ATP và tiêu thụ oxy phân tử (O2). Phần lớn năng lượng được giải phóng bởi quá
trình phosphoryl oxy hóa được sử dụng để tạo ra hầu hết ATP của tế bào. [2]
ATP là một phân tử mang năng lượng được hình thành theo từng bước, có thể được
tạo ra bởi quá trình quang hợp, sự phosphoryl oxy hóa được thực hiện bởi ty thể, hoặc
bởi sự phosphoryl hóa các chất môi trường. ATP có thể cung cấp năng lượng cho các
quá trình tế bào bằng cách chuyển một nhóm phosphat sang một phân tử khác (quá trình
này gọi là phosphoryl hóa). Sự chuyển đổi này được thực hiện bởi các enzym đặc biệt,
kết hợp lấy năng lượng giải phóng từ ATP cho các hoạt động của tế bào cần năng lượng.
[11]
Các tế bào liên tục phá vỡ ATP để lấy năng lượng, ATP cũng liên tục được tổng hợp
từ ADP và phosphat thông qua các quá trình hô hấp tế bào. Hầu hết ATP trong các tế
bào được sản xuất bởi ATP synthase, giúp chuyển đổi ADP và phosphat thành ATP.
Các vi sinh vật thu năng lượng thông qua quá trình lên men sẽ có mức năng lượng thấp
hơn so với các sinh vật thực hiện hô hấp hoặc quang hợp, vì ATP chỉ có thể được tạo ra
thông qua quá trình phosphoryl hóa ở mức cơ chất [11].
1.2.2. Biểu diễn quá trình trao đổi chất dưới dạng mô hình toán học
Mô hình trao đổi chất có thể chuyển thành một mô hình toán học mà thành phần chính
là ma trận cân bằng hóa học (ma trận S) (Hình 1.2) [20].
Trong ma trận cân bằng hóa học, mỗi hàng tương ứng với một chất chuyển hóa duy nhất,
mỗi cột tương ứng với một phản ứng cụ thể diễn ra trong hệ thống. Ở trạng thái ổn định,
tỉ lệ thay đổi nồng độ chất chuyển hóa là bằng 0 trong tất cả các phản ứng, có nghĩa là,
tất cả các chất chuyển hóa được tiêu thụ với cùng tốc độ mà chúng được tạo ra. Do đó,
ma trận cân bằng hóa học trình bày một hệ phương trình tuyến tính, mô tả mọi thông
lượng phản ứng của hệ thống. Nồng độ của mỗi chất chuyển hóa sau đó sẽ ở trạng thái
ổn định được mô tả bởi một phương trình tuyến tính, thay cho phương trình vi phân
trước khi đạt được trạng thái ổn định. Ví dụ, đối với chất chuyển hóa B ở hàng thứ tư
trong hình 2, phương trình tuyến tính mô tả nồng độ chất chuyển hóa ở trạng thái ổn
định sẽ là:
𝑣𝑅3 + 𝑣𝑅5 – 𝑣𝑅6 – 𝑣𝑅7 = 0
7
Hình 1.2: Ma trận cân bằng hóa học.
Ma trận trên bao gồm 14 chất chuyển hóa, 13 phản ứng nội bào, 7 phản ứng trao đổi, 1
phản ứng tạo biomass. Các số 0, 1, -1,… là hệ số cân bằng hóa học của các chất chuyển
hóa, dấu (-) thể hiện là các chất tham gia phản ứng, dấu (+) thể hiện là các chất tạo thành
sau phản ứng. [20]
Hệ phương trình tuyến tính của hệ thống trong hình 1.2 sẽ là [20]:
8
1.2.3. Sử dụng COBRA để xây dựng mô hình trao đổi chất
1.2.3.1. Constraint-based modeling (CBM)
Constraint-based modeling (tạm dịch là “Mô hình hóa dựa vào các giới hạn”) là
phương pháp mô hình hóa các hệ thống nói chung đã và đang được sử dụng trong hơn
30 năm. Đặc điểm chính của Constraint-based modeling là các đối tượng trong hệ thống
không có một giá trị duy nhất mà nằm trong khoảng giá trị đã được xác định trước gọi
là các giới hạn. Constraint-based modeling được sử dụng rộng rãi trong mô phỏng các
hệ thống sinh học.
Nghiên cứu của Fell, D.A. and Small J.R là một trong số những công bố đầu tiên sử
dung CMB để tổng hợp acid béo từ glucose vào năm 1986 [6]. Vào năm 1989, R.A.
Majewski and M.M.Domach là các nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu sản xuất acetat ở
E.coli bằng CBMs [14]. Năm 2009, một mô hình trao đổi chất quy mô hệ gen mới của
Bacillus subtilis được giới thiệu. Mô hình này dựa trên chú thích bộ gen B.subtilis 168
được tạo ra bởi SEED, một trong số những chú thích gen chính xác và cập nhật nhất của
B.subtilis 168 sẵn có với 1103 gen và 1437 phản ứng [8]. Năm 2014, Elena Vinay-Lara
và các đồng nghiệp đã xây dựng lại mô hình trao đổi chất quy mô hệ gen để so sánh sự
khác biệt về trao đổi chất giữa hai chủng Lactobacillus casei (ATCC 334 và 12A) [27].
Trong đầu năm 2016, Levering, J. và cộng sự [12] đã xây dựng một mô hình mới cho
Streptococcus pyogenes M49 với 480 gen liên quan đến 576 phản ứng và 558 chất
chuyển hóa.
1.2.3.2. COBRA
COBRA (Constraint-based reconstruction and analysis) là công cụ tin học do Thiele
và cộng sự phát triển, dùng để xây dựng và phân tích mô hình trao đổi chất của sinh vật
theo phương pháp Constraint-based modeling [24].
Quá trình xây dựng mô hình và phân tích mô hình trao đổi chất được tiến hành theo
các giai đoạn chính như sau (hình 1.3):
- Dự đoán các sản phẩm được mã hóa (protein, ARN) trên trình tự bộ gen của sinh vật.
- Từ các sản phẩm dự kiến, kết hợp với các cơ sở dữ liệu thực nghiệm để xác định các
phản ứng trao đổi chất có ở sinh vật.
9
- Các phản ứng được tập hợp lại thành mạng lưới trao đổi chất, được biểu thị dưới dạng
ma trận toán học.
- Thiết lập các giới hạn về không gian hoạt động và giá trị của ma trận trao đổi chất.
- Phân tích các trạng thái hoạt động của mô hình, điều chỉnh các sai sót nếu có.
- Sử dụng mô hình hoàn thiện để phân tích các hoạt động trao đổi chất của sinh vật.
Với các công cụ tin học sẵn có, việc xây dựng mô hình trao đổi chất bắt nguồn từ
genom của sinh vật có thể được thực hiện một cách tự động. Tuy nhiên mô hình ban đầu
thường chưa có đủ độ tin cậy do gặp phải một số khó khăn nhất định. Các khó khăn
chính bao gồm: xác định sai sản phẩm mã hóa của gen dẫn đến các phản ứng không tồn
tại ở sinh vật, không xác định được các sản phẩm mã hóa của gen dẫn đến thiếu các phản
ứng trao đổi chất, cơ sở dữ liệu tham khảo không chính xác dẫn đến sai thông tin phản
ứng. Các khó khăn trên dẫn đến việc chỉnh sửa mô hình đòi hỏi rất nhiều thời gian và
công sức. Để xây dựng được một mô hình hoàn chỉnh có thể mất từ nhiều tháng đến
nhiều năm tùy vào số lượng phản ứng. [24]
10
Hình 1.3: Các giai đoạn chính của quá trình xây dựng mô hình trao đổi chất bằng phương
pháp Constraint-based modeling [17].
1.2.4. Phân tích cân bằng thông lượng của mô hình trao đổi chất
Thông lượng trao đổi chất (gọi tắt là thông lượng) là tốc độ chuyển hóa các chất trong
phản ứng. Phân tích cân bằng thông lượng (FBA-Flux Balance Analysis) là phương
pháp được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu mô hình trao đổi chất sinh vật. FBA tính toán
thông lượng chuyển hóa các chất trong toàn bộ mạng lưới trao đổi chất, từ đó xác định
được trạng thái cân bằng của mô hình trong điều kiện cho trước như tạo sinh khối, sinh
tổng hợp một sản phẩm trao đổi chất, hoạt động trong sự có mặt của một số hợp chất,
v.v… (hình 1.4). [16]
11
Hình 1.4: Quá trình phân tích cân bằng thông lượng.
Mô hình trao đổi chất (a) được biểu diễn dưới dạng ma trận S (b). Các phản ứng trong
mô hình có sự ràng buộc lẫn nhau và có giới hạn thông lượng riêng. Các ràng buộc và
giới hạn này sẽ tính được giá trị cân bằng tối ưu của mô hình với điều kiện cho trước
(c).
Phân tích cân bằng thông lượng tồn tại một số hạn chế như: không có tham số động
học (nồng độ enzym, …), chỉ áp dụng với giả thiết hệ thống ở trạng thái cân bằng, v.v..
[20]. Mặc dù còn một số hạn chế nhưng phân tích cân bằng vẫn được áp dụng rộng rãi
và đã được kiểm chứng trong thực nghiệm về giá trị dự đoán [4].
12
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu
Dữ liệu sử dụng để xây dựng mô hình Pseudomonas defnitrificans được lấy từ cơ sở
dữ liệu Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) tại địa chỉ:
/>Các mô hình tham khảo của các vi sinh vật đã công bố được lấy từ cơ sở dữ liệu BiGG
Models tại địa chỉ: />2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng mô hình
KEGG
Web
Cơ sở dữ liệu
- KEGG_PD: chứa
danh mục các phản ứng
và chất trao đổi.
- KEGG_RXN: chứa
thông tin chi tiết của tất
cả các phản ứng có
trong KEGG_PD
- KEGG_MET: chứa
thông tin chi tiết của tất
cả các chất chuyển hóa
có trong KEGG_PD
Xây dựng mô hình
sơ bộ
Hoàn thiện mô hình
- Bổ sung các phản ứng thiếu
- Tạo phản ứng nối các chất
chuyển hóa
- Điều chỉnh chiều phản ứng
- Tạo phản ứng trao đổi với môi
trường
- Tạo chuỗi phản ứn ghô hấp sinh
ATP
- Tạo phản ứng sinh khối
Đánh giá mô
hình
Không đạt
Đạt
Mô hình cuối
Hinh 2.1: Sơ đồ các bước xây dựng mô hình.
13
2.2.2. Đánh giá độ tin cậy của mô hình
Thứ nhất là khả năng tạo sinh khối trong điều kiện có và không có oxy. Chúng tôi
tiến hành cung cấp cho mô hình một số thành phần môi trường tương tự thực nghiệm,
sau đó so sánh thông lượng tạo sinh khối trong điều kiện có và không có oxy của mô
hình, rồi so sánh thông lượng này với kết quả của hai mô hình đã được công bố là
Pseudomonas puttida KT2440 (iJN746) và E. coli W (iECW_1372). Tiếp đó, chúng tôi
khảo sát thông lượng các phản ứng kết thúc chuỗi phosphoryl oxy hóa trong điều kiện
có và không có oxy, so sánh với thực nghiệm. Từ đó khảo sát thông lượng tạo sinh khối
trong điều kiện không có oxy và hô hấp nitrat của mô hình.
Thứ hai là khả năng tạo sinh khối từ các nguồn carbon khác nhau. Chúng tôi tiến hành
khảo sát và so sánh với thực nghiệm khả năng tạo sinh khối của mô hình từ 3 nguồn
carbon: sucrose, maltose, glucose.
Thứ ba là khả năng sinh tổng hợp vitamin B12 từ các nguồn carbon khác nhau. Tương
tự trên, chúng tôi tiến hành khảo sát và so sánh với thực nghiệm khả năng sinh tổng hợp
vitamin B12 của mô hình từ 3 nguồn carbon: sucrose, maltose, glucose.
Cuối cùng, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của glutamat và cobinamid đến thông lượng
tạo sinh khối và vitamin B12 của mô hình.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Xây dựng cơ sở dữ liệu
2.3.1.1. Cơ sở dữ liệu KEGG_PD
Các dữ liệu trao đổi chất của Pseudomonas denitrificans ATCC 13867 trong KEGG
được tổ chức dưới dạng các tệp tin ở định dạng xml. Mỗi tệp tin chứa thông tin của một
con đường trao đổi chất. Dữ liệu trong các tệp tin KEGG được chiết xuất và chuyển
sang định dạng dictionary với tên gọi KEGG_PD bằng ngôn ngữ lập trình Python 3.6.
Cấu trúc của dictionary như sau:
KEGG_PD[‘Con đường trao đổi chất 1’] = {‘Phản ứng 1’:{‘Chất tham gia’: [],
‘Chất tạo thành’: [],
‘Gen’: [],
‘Loại phản ứng’: ‘...’,}
14
‘Phản ứng 2’: {…},
…,}
KEGG_PD[‘Con đường trao đổi chất 2’] = {...}
...
2.3.1.2. Cơ sở dữ liệu KEGG_RXN và KEGG_MET
Sau khi xây dựng KEGG_PD, toàn bộ tên của các phản ứng và chất trao đổi có trong
KEGG_PD được tập hợp vào danh sách tương ứng gọi là RXN và MET. Thông tin của
từng phản ứng và chất trao đổi trong hai danh sách RXN và MET sẽ được lấy từ cơ sở
dữ liệu KEGG và lưu vào hai dictionary với tên gọi là KEGG_RXN và KEGG_MET.
Cấu trúc của hai dictionary như sau:
KEGG_RXN[‘Phản ứng 1’] = {‘ID’: ‘...’,
‘Tên’: ‘...’,
‘Phương trình’: ‘...’,
‘Enzym’: ‘...’,}
KEGG_RXN[‘Phản ứng 2’] = {…}
...
KEGG_MET[‘Chất 1’] = {‘ID’: ‘...’,
‘Tên’: ‘...’,
‘Công thức hóa học’: ‘...’,
‘Khốí lượng phân tử’: ‘...’,}
KEGG_MET[‘Chất 2’] = {…}
...
2.3.2. Xây dựng mô hình
Mô hình trao đổi chất của Pseudomonas denitrificans ATCC 13867 được xây dựng
bằng công cụ COBRApy của Python ( COBRApy
là công cụ xây dựng mô hình theo phương pháp do Thiele và cộng sự đề xuất [24]. Các
15
thông số về chất và phản ứng để xây dựng mô hình được lấy từ các cơ sở dữ liệu
KEGG_PD, KEGG_RXN, KEGG_MET. Mô hình trao đổi chất được xây dựng qua ba
bước: tạo chất trao đổi, tạo phản ứng, tạo mô hình.
2.3.2.1. Tạo chất trao đổi
Các chất trao đổi được định nghĩa bằng câu lệnh:
Metabolite(‘Mã chất’,
formula = ‘Công thức hóa học’,
name = ‘Tên chất’
compartment = ‘Vị trí’)
Ví dụ, để tạo định nghĩa cho bốn chất là acyl-carrier-protein, 3-oxotetradecanoyl-acylcarrier-protein, CO2, H+, dodecanoyl-ACP-n-C120ACP, các câu lệnh được viết như sau:
# Khởi động công cụ COBRA
from cobra import Model, Reaction, Metabolite
# Tạo định nghĩa cho acyl-carrier-protein
ACP_c = Metabolite('ACP_c',
formula='C11H21N2O7PRS',
name='acyl-carrier-protein',
compartment='c')
# Tạo định nghĩa cho 3-Oxotetradecanoyl-acyl-carrier-protein
omrsACP_c = Metabolite('3omrsACP_c',
formula='C25H45N2O9PRS',
name='3-Oxotetradecanoyl-acyl-carrier-protein',
compartment='c')
# Tạo định nghĩa cho CO2
16
co2_c = Metabolite('co2_c',
formula='CO2',
name='CO2',
compartment='c')
# Tạo định nghĩa cho Malonyl-acyl-carrier-protein
malACP_c = Metabolite('malACP_c',
formula='C14H22N2O10PRS',
name='Malonyl-acyl-carrier-protein',
compartment='c')
# Tạo định nghĩa cho H+
h_c = Metabolite('h_c',
formula='H',
name='H',
compartment='c')
# Tạo định nghĩa cho Dodecanoyl-ACP-n-C120ACP
ddcaACP_c = Metabolite('ddcaACP_c',
formula='C23H43N2O8PRS',
name='Dodecanoyl-ACP-n-C120ACP',
compartment='c')
2.3.2.2. Tạo phản ứng
Phản ứng trao đổi chất được định nghĩa bằng các câu lệnh:
reaction = Reaction('Mã phản ứng')
reaction.name = 'Tên phản ứng'
reaction.subsystem = 'Nhóm phản ứng'
reaction.lower_bound = 0. # Giới hạn thông lượng dưới (mặc định)
reaction.upper_bound = 1000. # Giới hạn thông lượng trên (mặc định)
17
