Bước đầu xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Glôcôm ở trẻ em là một trong những nguyên nhân thường gặp gây mù
lòa ở trẻ em, đặc biệt là glôcôm bẩm sinh nguyên phát do trẻ còn quá nhỏ,
khó khám, khó đo nhãn áp, chẩn đoán do đó dễ bị bỏ sót, phẫu thuật dễ bị tái
phát. Bệnh thường xảy ra ở hai mắt (65-80%), xuất hiện sớm ngay từ những
năm đầu sau sinh và có thể điều trị khỏi hay phòng ngừa với những kỹ thuật
y học hiện đại [1], [2]. Tỷ lệ bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát có tần suất
khoảng 1/10.000 đến 1/20.000 trẻ sinh sống ở các nước châu Âu và Mỹ.
Bệnh chiếm 55% tổng số trường hợp glôcôm nguyên phát trẻ em, 60% được
chẩn đoán vào lúc 6 tháng tuổi và 80% trong vòng năm đầu tiên. Khoảng
65% là trẻ nam và bệnh thường xảy ra ở cả hai mắt trong 65-80% các trường
hợp với các mức độ không tương đương nhau. Tuy hiếm gặp nhưng đây là
một trong hai nguyên nhân hàng đầu gây mù lòa ở trẻ nhỏ [1], [3], [4].
Các tác giả Shaffer và Weiss từ năm 1970 đã xác định glôcôm bẩm
sinh nguyên phát là một thể bệnh glôcôm di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể
thường [5]. Ba đột biến gen được nghiên cứu nhiều nhất liên quan đến
glôcôm là CYP1B1, LTBP2, MYOC [6]. Trong đó gen CYP1B1 tổng hợp
protein CYP1B1 đóng vai trò quan trọng nhất trong việc hình thành cấu trúc
và duy trì chức năng của mắt. Có nhiều giả thiết đưa ra mối liên quan đột
biến gen CYP1B1 và bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát ở trẻ em [7], [8].
Gen CYP1B1 nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 2 tại vị trí 2p22.2 và
bao gồm 3 exon và 2 intron, dài 12 kb, mã hóa phân tử mRNA gồm 1.631 base
[9], [10]. Đột biến gen CYP1B1 hay gặp nhất là đột biến thay thế acid amin
(missense) phát hiện được ở 733 trường hợp trong số 1096 đột biến (66,76%).
Trong đó đột biến ở exon 3 được phát hiện nhiều nhất với 516 trường hợp
chiếm 47,08% [11]. Một báo cáo khác trong năm 2011 cũng kết luận đột biến
thay thế acid amin là loại đột biến gen CYP1B1 hay gặp nhất [12].

2

Ở nước ta, các nghiên cứu trước đây về bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên
phát mới chỉ đề cập đến tỉ lệ mắc bệnh, biểu hiện lâm sàng, kết quả điều trị
phẫu thuật thành công rất thấp (trung bình khoảng 30%) và các biến chứng
rất nặng nề như nghiên cứu của V. T. B. Thủy (1998), hay nghiên cứu 103 trẻ bị
glôcôm điều trị ở Khoa Nhi bệnh viện Mắt TP Hồ Chí Minh (2006), nghiên cứu
của Đ. Y. Lục (2006) trên 36 bệnh nhân. Trong những năm gần đây, xu hướng
nghiên cứu sâu về cơ chế bệnh sinh ở mức độ phân tử hứa hẹn làm tiền đề triển
khai chẩn đoán trước sinh cũng như liệu pháp điều trị gen, đồng thời giúp việc
quản lý tốt những người mang gen gây bệnh. Các nghiên cứu phát hiện đột biến
gen trong một số bệnh lý di truyền cũng đã bắt đầu được triển khai và thu được
kết quả khá tốt như bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne, thoái hóa cơ tủy, tăng sản
thượng thận bẩm sinh, tạo xương bất toàn... Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào
về đột biến gen gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát. Vì vậy chúng tôi tiến
hành đề tài “Bước đầu xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm
sinh nguyên phát” với mục tiêu:
Xác định đột biến exon 3 của gen CYP1B1 trên bệnh nhân glôcôm
bẩm sinh nguyên phát.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về glôcôm bẩm sinh nguyên phát
1.1.1. Khái niệm và dịch tễ học glôcôm bẩm sinh nguyên phát
Khái niệm
Theo Shaffer và Weiss, Glôcôm bẩm sinh nguyên phát được định nghĩa
là glôcôm di truyền phổ biến nhất ở trẻ em, di truyền lặn nhiễm sắc thể

thường, với bất thường đặc biệt về góc gồm không có sự lùi điểm gắn chân
mống tạo góc tại vùng bè và không kèm theo bất thường phát triền nào khác.
Tăng nhãn áp là nguyên nhân gây giác mạc to, đục và chảy nước mắt do rạn
màng Descemet [1].
Glôcôm bẩm sinh thứ phát thì kèm theo bất thường ở các phần khác
của mắt.
 Tổn thương của giác mạc: hội chứng tách lớp bán phần trước
(Axenfeld, Reiger, Peters).
 Tổn thương của mống mắt: tật không mống mắt, tồn lưu màng
Wachendorf.
 Dị thường thể thủy tinh: hội chứng Lowe, Marfan, Machesani.
Việc phát hiện và điều trị sớm bệnh glôcôm bẩm sinh có thể ngăn ngừa
dẫn đến mù lòa.
Dịch tễ học
Glôcôm bẩm sinh nguyên phát là bệnh hiếm gặp với tỷ lệ 1/10000 đến
1/20000 trẻ mắc. Trong khi đó tỷ lệ này rất cao ở cộng đồng có cha mẹ cùng
huyết thống như Ấn Độ 1/3.300, Trung Đông 1/2.500 và 1/1.250 ở Slovakia
hay Rumani [1].


4

1.1.2. Phân loại glôcôm bẩm sinh nguyên phát
Etienne dựa theo kiểu góc tiền phòng quan sát được khi soi góc tiền
phòng để chia glôcôm bẩm sinh thành hai loại:
 Glôcôm góc mở (do có di tích phôi kín đáo).
 Glôcôm góc đóng: có tổ chức trung phôi không bình thường rất
dày che lấp vùng bè.
Tùy thuộc vào tuổi xuất hiện bệnh, Glôcôm bẩm sinh nguyên phát còn
được chia làm 3 nhóm:

 Glôcôm bẩm sinh thực sự (True congenital glaucoma): trong
nhóm này nhãn áp tăng cao khi bệnh nhân vẫn còn nằm trong
bụng mẹ, triệu chứng của bệnh xuất hiện ngay sau khi đẻ.
 Glôcôm ở trẻ nhỏ nguyên phát (Primary infantile glaucoma):
bệnh được phát hiện trong những năm đầu tiên của cuộc đời.
 Glôcôm ở người trẻ (Juvenile congenital glaucoma): được phát
hiện muộn hơn ở trẻ em sau 3 tuổi hoặc ở tuổi vị thành niên.
1.1.3. Giải phẫu bệnh, sinh lí bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát
* Góc tiền phòng trong glôcôm bẩm sinh:
Các nghiên cứu quá trình phát triển phôi thai học và giải phẫu học góc
tiền phòng cho thấy cơ chế tăng nhãn áp trong glôcôm bẩm sinh khác hoàn
toàn so với người trưởng thành [3].
Có rất nhiều giả thiết khác nhau giải thích về cơ chế gây tăng nhãn áp
trong glôcôm bẩm sinh. Tuy nhiên các tác giả đều cho rằng áp lực nội nhãn
tăng trong glôcôm bẩm sinh là do sự phát triển bất thường của góc tiền phòng
dẫn đến cản trở lưu thông thủy dịch [13], [14], [15].
Mann cho rằng đó là sự teo không hoàn toàn của tổ chức trung bì ở góc
tiền phòng làm tắc nghẽn sự lưu thông thủy dịch gây tăng nhãn áp. Barkan


5

cho rằng sự tiêu tan không hoàn toàn của các tế bào trung mô ở góc tạo nên
một màng bịt góc tiền phòng (gọi là màng Barkan) là cơ chế tăng nhãn áp.
Anderson và cộng sự khi nghiên cứu dưới kính hiển vi điện tử không tìm
thấy sự hiện diện của màng Barkan nhưng lại thấy mặt trước của màng bồ
đào bám cao của vùng bè [14].
Các tác giả khác như Allen, Burian và Braley thấy rằng cơ chế sinh
bệnh của glôcôm bẩm sinh là do sự tách lớp không hoàn toàn của tổ chức
trung bì trong góc tiền phòng. Worst cho rằng sự phát triển không hoàn toàn

của cựa củng mạc dẫn đến sự bám cao của cơ thể mi vào vùng bè, thêm vào
đó có một lớp tế bào nội mô đơn thuần bao phủ góc tiền phòng trong suốt
thời kì thai nghén.
Smelser và Ozanics giải thích glôcôm bẩm sinh nguyên phát đơn thuần
là do sự thay đổi cấu trúc của mạng lưới bè màng bồ đào, đồng thời có một
lớp dày chất vô định trong lớp nội mô thành trong ống Schlemm, điều này
được phát hiện thấy có trong giải phẫu bệnh của những bệnh nhân glôcôm
bẩm sinh nguyên phát đơn thuần. Kupfer lại nhấn mạnh có sự hiện diện của
các tế bào mào thần kinh thuộc xương sọ có trong góc tiền phòng, điều này
gợi ý sự phát triển bất thường của cấu trúc góc tiền phòng.
Tóm lại có rất nhiều giả thiết giải thích cơ chế sinh bệnh trong glôcôm
bẩm sinh nguyên phát đơn thuần. Các tác giả [3], [14], [15] đều cho rằng cơ
chế gây glôcôm bẩm sinh nguyên phát là do:
- Sự ngừng phát triển ở các mức độ khác nhau của góc tiền phòng hoặc
phát triển không hài hòa các thành phần của góc.
- Sự bám bất thường của cơ thể mi và mống mắt vào phần sau của
vùng bè, nếp thể mi và cơ thể mi bị kéo ra phía trung tâm, cựa củng mạc dịch
chuyển ra phía trước.
Thuyết di truyền trong bệnh lý glôcôm bẩm sinh cũng được nói đến:


6

glôcôm bẩm sinh di truyền theo kiểu lặn nguyên phát đơn độc, thuần túy và
di truyền trội trong các thể phối hợp. Người ta cũng nói đến di truyền đa gen,
đa nhân tố [3], [13].
1.1.4. Chẩn đoán và điều trị glôcôm bẩm sinh nguyên phát
1.1.4.1. Chẩn đoán xác định
 Triệu chứng chủ quan
-Sợ ánh sáng, co quắp mi: thường là triệu chứng khởi đầu và quan

trọng. bệnh nhân thường nheo mắt hoặc quay mắt đi nơi khác khi có ánh
sáng chiếu vào mắt, ở trẻ nhỏ thường hay gục đầu vào lòng mẹ. Sợ ánh sáng
là do kích thích các tế bào biểu mô giác mạc khi áp lực nội nhãn tăng.
- Chảy nước mắt.
- Mờ mắt.
 Triệu chứng khách quan:
- Mi mắt: có xu hướng khép lại nhằm hạn chế ánh sáng vào mắt.
- Giác mạc:
Trong glôcôm bẩm sinh thường giác mạc to đi cùng nhãn cầu to đặc
biệt khi xuất hiện ở trẻ dưới 3 tuổi. Bình thường giác mạc trong và có đường
kính ngay khi sinh là 10 mm theo Kluys Ken, 9,4 - 11 mm theo Aminlari.
Đường kính giác mạc khi 1 tuổi là 11,5 mm theo Kluys Ken, 10,5 - 11,7 mm
theo Aminlari [16]. Trong glôcôm bẩm sinh giác mạc to hơn bình thường ,
phù, có thể có rách và rạn màng Descemet.
- Lồi mắt trâu: ở giai đoạn muộn nhãn cầu bị dãn rộng do hậu quả tăng
nhãn áp lâu ngày. Khi củng mạc dãn mỏng thường có màu đen hoặc hơi xanh
do nhìn thấy hắc mạc ở phía dưới diện củng mạc dãn lồi. Dây Zinn có thể
dãn ra gây lệch thể thủy tinh.
- Tiền phòng sâu.
- Mống mắt: có thể có các dị tật kèm theo. Đồng tử có thể giãn, mất


7

phản xạ nhất là những trường hợp không còn chức năng.
- Khám đáy mắt có thể thấy dấu hiệu teo lõm gai tùy theo mức độ
bệnh. Lõm gai trong glôcôm bẩm sinh có thể hồi phục hoàn toàn nếu nhãn áp
được điều chỉnh tốt. Đây là một điểm khác với lõm gai ở người lớn [17].
- Soi góc tiền phòng
Trong glôcôm bẩm sinh nguyên phát khi soi góc tiền phòng thường thấy:

+ Chân mống mắt bám cao và bám ra trước hơn so với bình thường.
+ Bè màng bồ đào biến đổi nhạt màu hơn điều này dễ làm cho ta khó
phân biệt dải thể mi, vùng bè và cựa củng mạc.
- Nhãn áp
Ở trẻ lớn có thể đo được nhãn áp theo các phương pháp hay dùng
nhưng ở trẻ nhỏ thường phải đo nhãn áp khi trẻ ngủ hoặc dưới gây mê.
- Thị lực: nếu thử được thường là giảm.
- Thị trường: thường bị tổn hại.
- Siêu âm: đo trục trước sau nhãn nhãn cầu. Ở trẻ sơ sinh trục nhãn cầu
bình thường dài khoảng 17mm. Trong 2 năm đầu của cuộc đời nhãn cầu phát
triển rất nhanh, đến 2 tuổi trục nhãn cầu đạt kích thước gần tương tự của
người lớn (23 đến 24mm). Trong glôcôm bẩm sinh nguyên phát đặc biệt là
trẻ dưới 2 tuổi, nhãn cầu dãn lồi theo mọi hướng khi nhãn áp tăng, do đó trục
nhãn cầu thường lớn hơn kích thước bình thường cùng lưới tuổi.
 Triệu chứng toàn thân:
- Đối với glôcôm bẩm sinh nguyên phát thường không có các dị tật
bẩm sinh tại mắt và toàn thân kèm theo. Ngược lại ở glôcôm bẩm sinh thứ
phát có thể phát hiện được các dị tật tại mắt và toàn thân.
1.1.4.2. Chẩn đoán giai đoạn
- Ở Việt Nam, các tác giả phân loại giai đoạn bệnh theo đường kính
giác mạc như sau [17]:


8

+ Giai đoạn 1: đường kính giác mạc ≤ 12 mm, giác mạc trong.
+ Giai đoạn 2: đường kính giác mạc từ 12 đến 14 mm, giác mạc phù đục.
+ Giai đoạn 3: đường kính giác mạc > 14mm, giác mạc phù đục trắng,
nhãn cầu giãn lồi không hồi phục, mất chức năng.
1.1.4.3. Điều trị glôcôm bẩm sinh nguyên phát

 Điều trị nội khoa:
- Điều trị nội khoa chỉ là bước đầu chuẩn bị cho một cuộc phẫu thuật
hoặc điều trị bổ sung cùng phẫu thuật. Các thuốc co đồng tử không có tác
dụng hoặc tác dụng rất ít [17].
 Điều trị ngoại khoa:
- Đối với glôcôm bẩm sinh, phương pháp điều trị duy nhất là bằng
phẫu thuật. Mục đích của phẫu thuật là tạo điều kiện cho sự lưu thông thủy
dịch tốt hơn. Hiện nay, có 4 phương pháp phẫu thuật chính: Mở góc tiền
phòng, Mở bè củng giác mạc, Phẫu thuật cắt bè củng giác mạc và Phẫu thuật
điện đông, lạnh đông thể mi [17].
- Mở góc tiền phòng: Phẫu thuật này được thực hiện ở lần khám đầu tiên,
giác mạc còn trong và có thể nhìn thấy được góc tiền phòng. Đây là phương
pháp đơn giản, mang lại kết quả tốt, kết quả có thể đạt 85%. Tuy nhiên, phẫu
thuật này không thực hiện được nếu đường kính giác mạc trên 14 mm.
- Mở bè củng giác mạc: Kỹ thuật này được chỉ định khi giác mạc mờ đục
ngăn cản việc nhìn rõ góc tiền phòng hoặc sự phẫu thuật mở góc tiền phòng bị
thất bại. Mục đích của phương pháp này là mở bè củng giác mạc một đoạn dài
để làm sự lưu thông giữa ống Schlemm và góc tiền phòng được dễ dàng. Tuy
nhiên, khó khăn của kỹ thuật này là việc xác định được ống Schlemm.
- Phẫu thuật cắt bè củng - giác mạc: Kỹ thuật này có thể áp dụng cho
tất cả các giai đoạn glôcôm bẩm sinh. Mục đích là cắt một mẩu bè củng giác mạc và một đoạn ống Schlemm tạo điều kiện cho lưu thông thủy dịch


9

tốt hơn.
- Phẫu thuật điện đông, lạnh đông thể mi: Phẫu thuật này chỉ áp dụng ở
những mắt hầu như đã mắt chức năng và thất bại với các phương pháp phẫu
thuật đã nêu trên.
1.2. Vị trí, cấu trúc gen và protein CYP1B1

1.2.1. Vị trí gen
Gen CYP1B1 nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 2 tại vị trí 2p22.2 và
bao gồm 3 exon, phần mã hóa gen bắt đầu từ exon thứ 2, chiều dài gen là
1629 cặp base [9].

Hình 1.1: Vị trí của gen CYP1B1 [18]
Trong một loạt nghiên cứu về nhiễm sắc thể 2, vùng chứa gen
CYP1B1 đã được xác định là GLC3A [19].
1.2.2. Cấu trúc gen
Gen CYP1B1 có 3 exon và 2 intron, dài 12 kb, mã hóa phân tử mRNA
gồm 1.631 base tổng hợp protein CYP1B1 [10]. Ba exon của gen CYP1B1
lần lượt có độ dài là 371; 1044 và 3707 bp. Tuy nhiên, vùng mã hóa của gen
CYP1B1 bắt đầu từ đầu 5’ exon 2 và kết thúc trong exon 3. Vùng mã hóa này
có chiều dài 1629 bp mã hóa protein 543 acid amin [20].
Vị trí gen quy định tổng hợp từng vùng cũng đã được xác định trên gen
CYP1B1.


10

Hình 1.2: Sơ đồ vị trí gen tổng hợp các vùng cấu trúc của protein
CYP1B1 [21].
1.2.3. Protein CYP1B1: Cấu trúc và chức năng
Sản phẩm protein của gen CYP1B1 là protein CYP1B1, một phân họ
của enzym cytochrom P450.
Chức năng của men CYP1B1 chưa rõ ràng, nhưng nó được giả thiết rằng
đóng một vai trò trong việc hình thành các cấu trúc ở phía trước của mắt và cũng
có thể tham gia vào một quá trình điều chỉnh sự bài tiết thủy dịch.
Năm 1988, Ivaylo Stoilov và cộng sự đã xây dựng mô hình ba chiều về
vùng C' tận (C-terminal) của protein CYP1B1. Cấu trúc này gồm 4 vùng I, J,

K, L và vùng gắn Hem.


11

Hình 1.3: Hình ảnh không gian 3 chiều vùng C' tận của protein
CYP1B1 [22].
Tác giả cũng phát hiện 16 đột biến gen và 6 đa hình gen CYP1B1 và dự
đoán các đột biến này có thể ảnh hưởng đến khả năng gắn hem của phân tử P450
do thay đổi vùng bản lề và cấu trúc vùng lõi (CCS).
Bảng 1.1. Bảng mô tả đột biến gen CYP1B1 và dự đoán
vùng ảnh hưởng [22].


12

Có nhiều giả thiết về cơ chế gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát khi
đột biến gen CYP1B1. Năm 1987, Schwartzman và cộng sự đã xác định có mối
liên quan giữa arachidonate phụ thuộc cytochrome P450 với ức chế Na+, K+ATPase trong giác mạc trong việc điều chỉnh tính trong suốt của giác mạc và tiết
thủy dịch. Phát hiện này phù hợp với triệu chứng mờ đục của giác mạc và tăng
nhãn áp, 2 tiêu chuẩn chẩn đoán chính cho bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát [7].
Stoilov I. (2000) đã đưa ra giả thuyết rằng CYP1B1 chuyển hóa một
phân tử có nguồn gốc nội sinh (như steroid, axit béo hoặc hợp chất
prostanoid) cần thiết cho phát triển bình thường và chức năng của mắt. Hoạt
động của CYP1B1 có thể dưới hai dạng: tạo ra một hợp chất hoạt động trên
một số mục tiêu hoặc ngừng tác dụng của các hợp chất sinh học khác và
chiếm vị trí của nó. Tuy nhiên các phân tử này được chuyển hóa bởi quá trình
kích hoạt có tổ chức của các men. Vì vậy, CYP1B1 có thể thuộc về một con
đường tín hiệu sinh hóa nội sinh chưa được biết rõ, liên quan đến trưởng
thành cuối cùng của góc tiền phòng. Đột biến gen CYP1B1 sẽ gây ra rối loạn

sản xuất men, làm bất thường cấu trúc mạng lưới vùng bè, nơi có các ống


13

tuyến giúp lưu thoát thủy dịch khỏi mắt. Sự ứ trệ thủy dịch này làm tăng
nhãn áp gây bệnh glôcôm [8].

Hình 1.4: Sơ đồ minh họa cơ chế ảnh hưởng của đột biến gen CYP1B1
[8].
Protein CYP1B1 của thể hoang dại và thể đột biến có sự khác biệt về
đích tác động. Phân tử CYP1B1 thể hoang dại được neo trên màng của lưới
nội nguyên sinh. Chức năng bình thường của nó đòi hỏi sự tham gia của một
số đối tác oxy hóa khử P450 reductase. P450 reductase có khả năng đưa một
nguyên tử của phân tử oxy vào cơ chất của nó. Khi đó có 2 khả năng xảy ra:
Một là cơ chất được hoạt hóa và tác động đến một mục tiêu chưa được biết rõ.
Một cách khác, oxy phân tử có thể làm tăng tính ưa nước của cơ chất làm tăng
bài xuất và giải phóng từ tế bào hoặc vị trí biểu hiện bình thường của nó.
Đột biến gen CYP1B1 làm thay đổi 2 khả năng trên. Sự điều hòa
không gian và thời gian của các gen kiểm soát phát triển của góc tiền phòng
sẽ bị thay đổi bởi sự vắng mặt của một phân tử điều hòa (ví dụ như steroid)
do CYP1B1 tạo ra. Ngoài ra, các dấu hiệu dừng phát triển góc tiền phòng
quan sát thấy ở các bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát có thể phản ánh
ảnh hưởng độc hại của một chất chuyển hóa thường được loại bỏ bởi


14

CYP1B1.
1.3. Đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát

1.3.1. Các dạng đột biến cấu trúc của gen CYP1B1
Theo các nghiên cứu, tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 thay đổi ở bệnh nhân
glôcôm bẩm sinh nguyên phát ở các vùng địa lý khác nhau. Tỷ lệ đột biến
này dao động từ 17,2% ở Trung Quốc, 20% ở Nhật, 33,3% ở bệnh nhân
Indonesia cho đến 75,9% ở bệnh nhân Ả rập [23], [24], [25], [26].
Theo tổng kết của Li và cộng sự (2010) trong một nghiên cứu cộng
gộp trên 542 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát tìm thấy 1096 đột biến
gen CYP1B1. Trong đó, đột biến thay thế acid amin (missense) phát hiện
được ở 733 các trường hợp (66,76%), xóa đoạn (deletion) phát hiện được ở
155 trường hợp (14,12%), mất hoặc thêm nucleotid (deletion/insertion) phát
hiện được ở 1 trường hợp (0,09%), lặp đoạn (duplication) phát hiện được ở
47 trường hợp (4,28%), lặp hoặc mất nucleotid (duplication/deletion) phát
hiện được ở 1 trường hợp (0,09%), thêm nucleotid (insertion) phát hiện được ở
31 trường hợp (2,82%), đột biến vô nghĩa (nonsense) phát hiện được ở 39
bệnh nhân (3,55%) và 89 bệnh nhân (8,11%) không phát hiện được đột biến.
Tác giả cũng báo cáo đột biến trên exon 3 chiếm tỷ lệ cao nhất với 516 đột
biến chiếm tỷ lệ 47.08% [11].
Các tác giả khác cũng đưa ra kết luận, đột biến thay thế acid amin là
loại đột biến hay gặp nhất. Ở châu Á, tỷ lệ đột biến loại này chiếm khoảng
20% trong tổng số bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát và khoảng 60%
trong tổng số đột biến gen CYP1B1 [12].
Bảng 1.2. Bảng về tỉ lệ các đột biến gen CYP1B1 ở một số nước châu
Á
Quốc gia
(số lượng BN)

Thay thế

Vô

Loại đột biến
Xóa

axit amin

nghĩa

đoạn

BN không đột
Lặp

Thêm

đoạn

Nucleotid

biến gen


15

Ả rập (n=62)
Brazil (n=52)
Iran (n=104)
Úc (n=37)
Nhật (n=65)
Thổ nhĩ kỳ(n=35)
Ecuador (n=15)

Kuwait (n=17)
Indonesia(n=21)
Marốc(n=32)
Pháp (n=31)
Mexico (n=12)
Mỹ&Brazil(n=21)
Trung Đông (n=10)

(%)
55 (88,7)
5 (9,6)
81 (77,9)
8 (21,6)
10 (15,4)
13 (37,1)
2 (13,3)
11 (64,7)
5 (23,8)
9 (28,1)
6 (19,4)
4 (33,3)
2 (9,5)
3 (30)

(%)
3 (5,8)
1 (0,96)
1 (2,7)
1 (1,5)

(%)
2 (3,2)
16 (30,8)
4 (3,84)
1 (2,7)
1 (1,5)

1 (5,9)
1 (4,8)
9 (29,0)
-

1 (6,7)
2 (9,5)
4 (12,5)
2 (6,5)
2 (9,5)
-

(%)
4 (7,8)
3 (2,9)
1 (2,7)
1 (2,9)
1 (8,3)
2 (9,5)
-

(%)
1 (0,96)

3 (4,6)
1 (2,9)
-

CYP1B1
5 (8,1)
24 (46,1)
14 (13,5)
26 (70)
50 (76,9)
20 (57,1)
12 (80)
5 (29,4)
13 (61,9)
19 (59,4)
14 (45,2)
7 (58,3)
15 (71,4)
7 (70)

1.3.2. Các vị trí đột biến gen CYP1B1 trên DNA
Theo thống kê của tác giả Li và cộng sự cho đến năm 2010, trong 52
nghiên cứu đã được báo cáo đã phát hiện 542 bệnh nhân mang 147 vị trí đột
biến khác nhau trên gen CYP1B1. Trong số đó, 11 vị trí thường gặp đột biến
là: 3987G>A (G61E) được phát hiện ở trong 207 trường hợp (18,85%),
7940G>A/T (R368H/L) ở 89 trường hợp (8,11%), 8006G>A (R390H) ở 74
trường hợp (6,74%), 7996G>A (E387K) ở 65 trường hợp (5,92%), 8242C>T
(R469W) ở 53 trường hợp (4,83%), 8037dup10 ở 39 trường hợp (3,55%),
4340delG ở 34 trường hợp (3,10%), 7901del13 ở 30 trường hợp (2,73%),
4490G>A ở 29 trường hợp (2,64%), 8005C>T/A (R390C/S) ở 27 trường hợp

(2,46%), 4339delG ở 24 trường hợp (2,19%).


16

Hình 1.5: Sự phân bố đột biến gen CYP1B1 [11].
Cũng trong báo cáo này, tác giả đã tổng kết các loại đột biến gen
CYP1B1 ở bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát trên các chủng tộc khác
nhau là khác nhau.
Người da trắng: trong 252 bệnh nhân da trắng phát hiện 522 đột biến
gen. 9 đột biến phổ biến nhất là: R368H, 8037dup10, R390H, 7901del13,
4340delG, G61E, E387K, E229KvàR390C/S. Tỷ lệ các loại đột biến phân bố
như sau: 7940G>A (R368H) được tìm thấy trong 61 trường hợp (61 trong số
522, 11,69%), 8037dup10 trong 35 trường hợp (6,70%), 8006G>A (R390H)
đột biến trong 29 trường hợp (5,56%), 7901del13 đột biến trong 27 trường
hợp (5,17%), 4340delG trong 26 trường hợp (4,98%), 3987G>A (G61E)
trong 24 trường hợp (4,60%), 7996G>A (E387K) trong 22 trường hợp
(4,21%), 4490G>A (E229K) trong 21 trường hợp (4,02%), 8005C>T/
A(R390C /S) trong 20 trường hợp (3,83%).


17

Hình 1.6: Sự phân bố đột biến gen CYP1B1 thường gặp ở người da
trắng [11].
Người châu Á: báo cáo ghi nhận trên 64 bệnh nhân châu Á phát hiện
120 đột biến gen CYP1B1. Các đột biến hay gặp nhất là V364M, L385F và
R390H. Đột biến 7927G>A (V364M) được tìm thấy trong 15 trường hợp (15
trong số 120 đột biến, 12,50%), 7990C>T(L385F) đột biến trong 14 trường
hợp (11,67%), 8006G>A (R390H) đột biến trong10 trường hợp (8,33 %).

Hình 1.7: Sự phân bố đột biến gen CYP1B1 ở người châu Á [11].


18

Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về đột biến gen CYP1B1
gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát tại các nước châu Á được báo cáo
ngày càng nhiều. Năm 2011, nghiên cứu của tác giả Kim Hee-Jung và cộng
sự trên 85 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát đã phát hiện 22 bệnh
nhân mang đột biến gen CYP1B1 (chiếm 25,9%). Trong đó 11 bệnh nhân
mang đột biến 1 alen và 11 bệnh nhân đột biến cả 2 alen. Đột biến hay gặp là
đột biến lệch khung dịch mã (frameshift mutation) (c.970_971dupAT;
p.T325SfsX104) với tỷ lệ 6 trong số 33 alen (18,2%). Hai đột biến mới được
phát hiện là p.G329S và p.V419Gfs11X [27].

Hình 1.8: Giải trình tự gen CYP1B1, p.V419Gfs11X là đột biến xóa
đoạn mới phát hiện ở một bệnh nhân dị hợp tử [27].
Một nghiên cứu trong năm 2011 trên 54 bệnh nhân Ả rập phát hiện
41 trường hợp đột biến gen CYP1B1 (75,9%). Trong đó 35 bệnh nhân đột


19

biến cả 2 alen (85.3%) và 6 bệnh nhân đột biến 1 alen (14.7%). 13 đột biến
hay gặp là: 9 đột biến thay thế (G61E, A119S, R390H, P437L, D441G,
A443G, G466S, G466D, và R469W), 2 đột biến xóa đoạn (g.4238_4247del
và g.7901_7913del) và 2 đột biến tạo mã kết thúc sớm (R355X and R444X).
Đột biến G61E hay gặp nhất chiếm 59% tổng số đột biến [26].
Trong nghiên cứu tại Bắc Triều Tiên (2012) trên 85 bệnh nhân đã phát

hiện 63 trường hợp mang đột biến gen (74,1%). Bên cạnh đó, tác giả cũng đề
cập đến ảnh hưởng của gen với biểu hiện lâm sàng và kết quả điều trị. Ở
nhóm mang gen đột biến, bệnh thường biểu hiện sớm hơn, nặng hơn, xuất
hiện ở cả hai mắt và kết quả điều trị kém hơn [28].
Trong một nghiên cứu mới đây (2014) trên 238 bệnh nhân ở Trung
Quốc đã phát hiện 17,2% bệnh nhân mang gen CYP1B1 đột biến, trong đó có
9 đột biến mới. Tác giả cũng đưa ra kết luận tuổi xuất hiện bệnh trung bình ở
nhóm có đột biến gen (2 tháng tuổi) sớm hơn nhóm không có đột biến (6
tháng tuổi) [23].
1.4. Các kĩ thuật phát hiện đột biến gen CYP1B1
1.4.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)
Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) do nhà khoa học Kary
Mullis phát minh vào năm 1983 đã tạo ra một cuộc cách mạng trong lĩnh
vực Y-Sinh học, nó giúp các nhà khoa học đi từ những quy trình cơ bản nhất
để thực hiện các nghiên cứu chuyên sâu trong nhiều lĩnh vực, trong đó có Y
học. PCR là kỹ thuật khuếch đại một đoạn DNA ở môi trường ngoài cơ thể
mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E.coli hay nấm men. Nguyên
lý của kỹ thuật PCR cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép
DNA trong cơ thể như: đoạn DNA khuôn cần tháo xoắn, cần có các cặp
mồi, nguyên liệu và môi trường thích hợp, cần enzym DNA polymerase và
các nucleotid gắn vào sợi DNA khuôn theo nguyên tắc bổ sung. Tuy nhiên
kỹ thuật PCR có khác biệt là dùng nhiệt độ để tháo xoắn thay cho enzym


20

helicase, enzym DNA polymerase là enzym chịu nhiệt và có hệ thống điều
chỉnh nhiệt độ cho từng giai đoạn của phản ứng [29], [30], [31].
Một phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi
chu kỳ gồm 3 giai đoạn [29], [30]:

Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation). Chuỗi xoắn kép DNA
khuôn bị biến tính bởi nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy của phân
tử), thường là 94 - 95 0C trong vòng 30 - 60s, DNA tách khỏi nhau thành hai
chuỗi đơn.
Giai đoạn 2: Giai đoạn bắt cặp (annealing) nhiệt độ được hạ thấp
xuống, thường dao động trong khoảng (40 - 70 0C) cho phép các đoạn mồi
gắn với các sợi DNA khuôn. Giai đoạn này kéo dài khoảng 30 - 60s.
Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (extension). Nhiệt độ được nâng lên đến
nhiệt độ tối ưu để enzym DNA polymerase, xúc tác cho quá trình tổng hợp sợi
DNA (thường là 720C). Giai đoạn này kéo dài tùy thuộc vào kích thước đoạn
gen được khuếch đại.
Như vậy từ một sợi DNA xoắn kép ban đầu sau n chu kỳ của phản ứng
PCR ta thu được 2n bản copy có chiều dài được quyết định bởi vị trí bám
của mồi. Phương pháp PCR là một phương pháp rất nhạy, từ một lượng
DNA rất ít ban đầu, với cặp mồi tương ứng đặc hiệu, sau khi dùng kĩ
thuật PCR sẽ thu được một lượng lớn DNA đủ dùng để phân tích và
nghiên cứu [29].
Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuân
DNA ban đầu, thường từ 35 đến 40 chu kỳ. Sau khi kết thúc phản ứng
PCR sẽ có đủ số lượng DNA để tiến hành điện di kiểm tra, tiếp tục tạo
dòng hoặc giải trình tự gen sau đó. Trong quá trình thực hiện phản ứng
PCR, ở những chu kỳ sau lượng khuân tăng lên nhưng lượng mồi có hạn,
dNTP tự do giảm và hoạt động của enzym DNA polymerase sẽ yếu dần.


21

Do đó, cần tính toán hàm lượng mồi, dNTP và enzym để đảm bảo phản
ứng PCR có hiệu suất cao nhất [32].

Hình 1.9: Các bước cơ bản của kĩ thuật PCR
(Nguồn Andy Vierstraete, 1999)
* Ứng dụng kĩ thuật PCR để khuyếch đại gen CYP1B1
Năm 2011, Abu-Amero KK và cộng sự đã sử dụng PCR để khuyếch đại
exon 2 và exon 3. Tác giả đã sử dụng chu trình nhiệt: 95oC- 5 phút, 35 chu kỳ
(950C – 1 phút, 560C – 30 giây, 720C – 1 phút), 720C – 10 phút.


22

Bảng 1.3. Bảng cặp mồi khuyếch đại gen CYP1B1 [26].
1.4.2. Kỹ thuật PCR-RFLP (Polymerase chain reaction-restriction
fragment length polymorphism)
Kỹ thuật PCR-RFLP là kĩ thuật kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều
dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzyme giới hạn
(Restriction Enzyme, RE). Nguyên lý dựa trên sự khuyếch đại gen bằng phản
ứng PCR sau đó sử dụng enzym cắt giới hạn để phân tích sản phẩm PCR.
Trình tự gen hoang dại có vị trí đặc hiệu với enzym cắt giới hạn nên sản
phẩm PCR sẽ bị cắt trong khi đột biến làm mất vị trí cắt của enzym nên sản
phẩm PCR của gen đột biến không bị cắt và được phát hiện khi điện di trên
gel agarose.
Đây là phương pháp truyền thống, đơn giản, rẻ tiền nhưng rất hiệu quả
và có độ tin cậy cao trong trường hợp xác định đột biến điển hình.
*Ứng dụng kĩ thuật PCR-RFLP phát hiện đột biến gen CYP1B1:
Năm 2007, trong nghiên cứu trên 104 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh
nguyên phát ở Iran, tác giả Fereshteh Chitsazian và cộng sự đã sử dụng
enzym cắt giới hạn để phát hiện đột biến R390H (g.8006G>A) sau khi
khuyếch đại exon 3 của gen CYP1B1. Exon 3 được khuyếch đại có chiều dài
872 bp, khi có đột biến R390H enzym cắt giới hạn Hha I sẽ cắt thành 2 sản
phẩm có chiều dài 618 bp và 254 bp. Điện di sản phẩm sau khi cắt bằng

enzym sẽ thấy 2 băng nếu đột biến cả 2 alen và 3 băng nếu đột biến 1 alen.


23

Hình 1.10: Hình ảnh điện di sản phẩm sau khi dùng enzym cắt giới hạn
[33].
Năm 2009, nghiên cứu của Mukesh Tanwar và cộng sự trên 50 bệnh
nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát ở Bắc Ấn độ đã sử dụng kĩ thuật PCRRFLP để sàng lọc 6 đột biến hay gặp (Stop233, Gly61Glu, Pro193Leu,
Glu229Lys, Arg368His và Arg390Cys) sau đó kiểm tra lại bằng kĩ thuật giải
trình tự gen. Kết quả tác giả phát hiện 21/50 bệnh nhân (42%) có một hoặc
nhiều hơn các đột biến nêu trên. Tuy nhiên, khi giải trình tự gen tác giả phát
hiện 23/50 bệnh nhân (46%) có đột biến gen và phát hiện thêm 3 đột biến
mới là p.L24R, p.F190L, and p.G329D [20].
1.4.3. Kỹ thuật SSCP (Single strand conformational polymorphism)
Kỹ thuật phân tích đa hình thái cấu trúc chuỗi đơn SSCP (Single strand
conformational polymorphism) là một trong những phương pháp đơn giản
nhất trong những phương pháp để sàng lọc nhanh các đa hình trình tự
nucleotid của các phân đoạn DNA. Mặc dù độ nhạy tương đương các phương
pháp khác nhưng khi được thiết kế đúng, phương pháp SSCP có thể phát hiện


24

đột biến với tỷ lệ 100%.
Kỹ thuật dựa trên sự thay đổi khả năng di chuyển của DNA chuỗi đơn
gây ra do sự thay thế một cặp base trong gel polyacrylamid ở trạng thái biến
tính. Kỹ thuật SSCP gồm 2 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: đoạn DNA đích được khuếch đại nhờ PCR
- Giai đoạn 2: sản phẩm PCR sau đó được biến tính và phân đoạn nhờ

điện di trên gel polyacrylamid ở điều kiện không biến tính (native PAGE)
Sau khi bị biến tính bởi nhiệt độ, khả năng di chuyển của các phân
đoạn DNA khi điện di trên gel polyacrylamid phụ thuộc vào kích thước và
cấu trúc bậc 2 nội phân tử của chuỗi đơn (tạo ra do sự cặp đôi của các base).
Như vậy, so với sợi đôi DNA đối chứng khi điện di trên gel polyacrylamid, sẽ
có 2 vạch tương ứng với mỗi sợi đơn của phân tử DNA ban đầu. Nếu sợi
DNA đích chỉ khác với DNA đối chứng 1 đôi base thì các sợi đơn DNA này
sẽ có cấu trúc khác và có thể phân biệt nhờ PAGE ở trạng thái không biến
tính. Sự khác biệt này được xác định trên cơ sở sự khác nhau về tốc độ di
chuyển giữa sợi DNA đích (có đột biến điểm) với sợi DNA đối chứng.
Trong kỹ thuật này, người ta thường sử dụng nucleotid được gắn [α 32P]
trong phản ứng PCR ở giai đoạn đầu để đánh dấu phóng xạ đoạn gen đích
được khuếch đại. Gel PAGE sau đó được chụp hình phóng xạ hoặc máy xạ
hình phospho (phosphoimager).
Năm 2002, Stoilov và cộng sự đã sử dụng kĩ thuật PCR-SSCP với 13
đoạn khuếch đại gen CYP1B1 với kích thước dưới 250 bp và thiết kế mồi
chồng 50 bp đã phát hiện tất cả các đột biến và đa hình thái trước đây được
phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự. Kết quả đã phát hiện 11 đột biến trong
đó có 4 đột biến mới ở 26 bệnh nhân (chiếm tỷ lệ 50%) [34].


25

1.4.4. Kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System)
Kỹ thuật ARMS-PCR là kỹ thuật khuếch đại các đột biến bền với nhiệt
hay PCR đặc hiệu alen. Nguyên lý kỹ thuật này dựa nào tiến hành hai quy
trình PCR với cùng một khuân DNA song khác nhau về một mồi đặc hiệu
alen. Mồi đặc hiệu alen được thiết kế khác biệt về các nucleotid ở đầu 3’ cho
mỗi alen, tương ứng vị trí mà có sự khác biệt về trình tự nucleotid giữa các
alen. Điều quan trọng ở đây là Taq hay DNA polymerase phải không có chức

năng sửa chữa 3’→5’ (proofreading activity). Nếu enzym này có hoạt tính
sửa chữa thì nó sẽ tự sửa những cặp đôi nhầm ở đầu 3’ của mồi và sẽ làm
thay đổi hoàn tooàn sự khác biệt trong quá trình phân tích. Ngoài ra để chắc
chắn không có sản phẩm thì phản ứng khuếch đại alen đã không diễn ra thì
người ta thường tiến hành mẫu chứng dương đi kèm, sự dụng cặp mồi khếch
đại một đoạn gen nào đó trong bộ gen.
Năm 1999, một nghiên cứu sử dụng ARMS-PCR sàng lọc đột biến
E387K ở 158 người khỏe mạnh Di-gan, đã phát hiện 17 người lành mang đột
biến (chiếm 10.8%). Đột biến E387K là đột biến được tìm thấy ở tất cả 26
gia đình bệnh nhân người Di-gan trước đó với 43 bệnh nhân. Tác giả đã sử
dụng hai mồi xuôi cho alen dại và alen đột biến, tương ứng là FW 5'TGTCCTGGCCTTCCTTTATG-3' và mồi FM thay G bằng A ở đầu 3’ cho
alen đột biến. Mồi ngược là 5'-TCATCACTCTGCTGGTCAGG-3' và sản
phẩm PCR có kích thước 245bp. Cặp mồi của STR marker D9S938 được
dùng làm chứng dương cho phản ứng PCR với sản phẩm 400bp (hình 1.13).