Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen CYP1B1 trong bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát tại hà nội

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A
Bp
C
CYP1B1
DNA
dNTP
G
PCR
RFLP

: Adenin
: Base pair
: Cytosine
: Cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1
: Deoxyribonucleotid Acid
: Deoxyribonucleotid-5-triphosphate
: Guanine
: Polymerase chain reaction (phản ứng khuếch đại chuỗi gen).
: Restriction fragment length polymorphism

T

(đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn)
: Thymine


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................3
1.1. Sơ lược về glôcôm bẩm sinh nguyên phát...............................................3

1.1.1. Khái niệm và dịch tễ học glôcôm bẩm sinh nguyên phát...............3
1.1.2. Phân loại glôcôm bẩm sinh nguyên phát........................................4
1.1.3. Giải phẫu bệnh, sinh lí bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát..........4
1.1.4. Chẩn đoán và điều trị glôcôm bẩm sinh nguyên phát....................6
1.2. Vị trí, cấu trúc gen và protein CYP1B1...................................................9
1.2.1. Vị trí gen.........................................................................................9
1.2.2. Cấu trúc gen....................................................................................9
1.2.3. Protein CYP1B1: Cấu trúc và chức năng.....................................10
1.3. Đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát..........13
1.3.1. Các dạng đột biến cấu trúc của gen CYP1B1...............................13
1.3.2. Các vị trí đột biến gen CYP1B1 trên DNA..................................15
1.4. Các kĩ thuật phát hiện đột biến gen CYP1B1........................................19
1.4.1. Kỹ thuật PCR ...............................................................................19
1.4.2. Kỹ thuật PCR-RFLP.....................................................................21
1.4.3. Kỹ thuật SSCP..............................................................................22
1.4.4. Kỹ thuật ARMS-PCR ...................................................................23
1.4.5. Kỹ thuật giải trình tự gen..............................................................25
1.4.6. Kỹ thuật MLPA.............................................................................29
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............32
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................32
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................33
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu......................................................................33


2.2.2. Kỹ thuật thu thập thông tin...........................................................35
2.2.3. Nội dung các biến số nghiên cứu..................................................35
2.2.4. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu............................36
2.2.5. Quy trình kỹ thuật.........................................................................37
4.5.4. Kỹ thuật MLPA xác định đột biến dị hợp tử xóa đoạn.................40
2.2.6. Xử lý và phân tích số liệu.............................................................43

2.3. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu..........................................................43
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.......................................................44
3.1. Thông tin chung về đối tượng nghiên cứu.............................................44
3.2. Kết quả tách chiết DNA.........................................................................45
3.3. Kết quả điện di DNA tổng số kiểm tra chất lượng DNA......................48
3.4. Kết quả khuếch đại exon 2 và exon 3 gen CYP1B1.............................48
3.5. Kết quả xác định đột biến gen CYP1B1................................................49
3.5.1. Kết quả xác định đột biến gen CYP1B1 bằng kỹ thuật giải trình tự. .49
3.5.2. Kết quả xác định đột biến gen CYP1B1 bằng kỹ thuật MLPA....64
3.6. Mối liên quan giữa đột biến gen CYP1B1 và một số đặc điểm lâm sàng
của bệnh nhân nghiên cứu.........................................................................67
3.6.1. Mối liên quan thời gian khởi phát bệnh với đột biến gen CYP1B1...67
3.6.2. Mối liên quan của giới tính và đột biến gen CYP1B1.................68
3.6.3. Mối liên quan số mắt biểu hiện bệnh và đột biến gen CYP1B1. .68
3.6.4. Mối liên quan nhãn áp và đột biến gen CYP1B1.........................69
3.6.5. Mối liên quan đường kính giác mạc và đột biến gen CYP1B1....70
3.6.6. Mối liên quan giữa giai đoạn bệnh và đột biến gen CYP1B1......71
3.7. Kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh trong thành viên gia đình
bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát.................................................71
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN..............................................................................80


4.1. Bàn luận về thông tin chung của đối tượng nghiên cứu........................80
4.2. Bàn luận về kết quả tách chiết DNA.....................................................81
4.3. Bàn luận về kết quả điện di DNA tổng số kiểm tra chất lượng DNA...82
4.4. Bàn luận về kết quả PCR khuếch đại exon 2 và exon 3 gen CYP1B1..82
4.5. Bàn luận về kết quả xác định đột biến gen CYP1B1............................82
4.6. Bàn luận về mối liên quan đột biến gen CYP1B1 và một số đặc điểm
lâm sàng của nhóm bệnh nhân nghiên cứu...............................................87
4.7. Bàn luận về kết quả phát hiện người lành mang gen:...........................89

4.7.1. Biện luận kết quả gia đình mã số G08..........................................89
4.7.2. Biện luận kết quả gia đình số mã số G43.....................................89
4.7.3. Biện luận kết quả gia đình số mã số G12.....................................90
KẾT LUẬN.....................................................................................................95
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.

Bảng mô tả đột biến gen CYP1B1 và dự đoán vùng ảnh hưởng ....11

Bảng 1.2.

Bảng về tỉ lệ các đột biến gen CYP1B1 ở một số nước châu Á. 14

Bảng 2.1.

Trình tự mồi dùng cho phản ứng PCR........................................38

Bảng 2.2 . Tên, kích thước và vị trí của các sản phẩm PCR trong Kit MLPA
P128-CYP450 (MRC- Holland)..................................................41
Bảng 3.1:

Đặc điểm tuổi của bệnh nhân nghiên cứu...................................44

Bảng 3.2:

Nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu DNA được tách chiết từ

mẫu máu bệnh nhân nghiên cứu..................................................46

Bảng 3.3:

Bảng tổng kết các dạng đột biến điểm trên gen CYP1B1...........56

Bảng 3.4:

Kết quả dự đoán gây bệnh của các đột biến điểm trên gen
CYP1B1......................................................................................58

Bảng 3.5:

Tỷ lệ các dạng đột biến điểm gen CYP1B1................................63

Bảng 3.6:

Các đa hình SNP của gen CYP1B1 trên bệnh nhân nghiên cứu. 63

Bảng 3.7:

So sánh thời gian khởi phát của nhóm có đột biến và nhóm không
có đột biến gen CYP1B1.............................................................67

Bảng 3.8:

Mối liên quan giơí của nhóm bệnh nhân có đột biến và nhóm
bệnh nhân không có đột biến gen CYP1B1................................68

Bảng 3.9.

Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen với số mắt bị bệnh. .69

Bảng 3.10. So sánh nhãn áp của nhóm có đột biến và không có đột biến gen
CYP1B1......................................................................................69
Bảng 3.11. Mối liên quan giữa đường kính giác mạc với đột biến gen
CYP1B1......................................................................................70
Bảng 3.12. Mối liên quan giữa giai đoạn bệnh với tình trạng đột biến gen. .71
Bảng 3.13. Kết quả phát hiện đột biến gen của các thành viên gia đình bệnh


nhân.............................................................................................78
Bảng 3.14. Kết quả đột biến và đa hình SNP một số gia đình bệnh nhân.......79
Bảng 4.1: Kết quả phát hiện tỷ lệ đột biến ở bệnh nhân châu Á.....................84

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1:

Biểu đồ về tỷ lệ giới của đối tượng nghiên cứu.....................44

Biểu đồ 3.2:

Phân bố các đột biến điểm gen CYP1B1................................57

Biểu đồ 3.3:

Phân bố đột biến trên exon 2 và exon 3.................................58


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1:

Vị trí của gen CYP1B1 ................................................................9

Hình 1.2:

Sơ đồ vị trí gen tổng hợp các vùng cấu trúc của protein CYP1B1 10

Hình 1.3:

Hình ảnh không gian 3 chiều vùng C' tận của protein CYP1B1 .. .11

Hình 1.4:

Sơ đồ minh họa cơ chế ảnh hưởng của đột biến gen CYP1B1.. 12

Hình 1.5:

Sự phân bố đột biến gen CYP1B1 .............................................15

Hình 1.6:

Sự phân bố đột biến gen CYP1B1 thường gặp ở người da trắng...16

Hình 1.7:

Sự phân bố đột biến gen CYP1B1 ở người châu Á ...................17

Hình 1.8:

Giải trình tự gen CYP1B1, p.V419Gfs11X là đột biến xóa
đoạn mới phát hiện ở một bệnh nhân dị hợp tử.......................18

Hình 1.9:

Các bước cơ bản của kĩ thuật PCR.............................................20

Hình 1.10: Hình ảnh điện di sản phẩm sau khi dùng enzym cắt giới hạn .......22
Hình 1.11:

Phát hiện đột biến E387K trên gen CYP1B1 bằng KT ARMS-PCR.. 24

Hình 1.12. Cấu trúc phân tử dNTP và ddNTP ..........................................25
Hình 1.13: Phản ứng gắn ddNTP làm dừng tổng hợp DNA ........................26
Hình 1.14: Nguyên lý giải trình tự theo phương pháp dideoxynucleotid .........27
Hình 1.15: Nguyên lý của kỹ thuật giải trình tự gen [..................................28
Hình 1.16. Các giai đoạn của kỹ thuật MLPA..............................................30
Hình 1.17.

Hình ảnh đột biến xóa đoạn dạng đồng hợp tử...........................31

Hình 2.1.

Hình ảnh minh họa kết quả MLPA sử dụng Kit MLPA P128CYP450.......................................................................................41

Hình 3.1:

Minh họa đo OD của mẫu DNA tách chiết bằng máy Nanodrop
1000 của bệnh nhân mã số G13..................................................45

Hình 3.2:

Kết quả điện di DNA tổng số......................................................48


Hình 3.3:

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 2 (A), exon 3
(B) của gen CYP1B1. (+) mẫu đối chứng dương, (-) mẫu đối
chứng âm; (1-5) mẫu bệnh nhân; (MK) Marker.........................49

Hình 3.4:

Kết quả giải trình tự bệnh nhân MS G15...................................49

Hình 3.5:

Kết quả giải trình tự bệnh nhân MS G9......................................50

Hình 3.6:

Kết quả giải trình tự bệnh nhân MS G10...................................50

Hình 3.7:

Kết quả giải trình tự bệnh nhân MS G20...................................51

Hình 3.8:

Kết quả giải trình tự bệnh nhân MS G20...................................51

Hình 3.9:

Kết quả giải trình tự bệnh nhân MS G20...................................52

Hình 3.10: Kết quả giải trình tự bệnh nhân MS G8......................................52
Hình 3.11: Kết quả giải trình tự bệnh nhân MS G19...................................53
Hình 3.12: Kết quả giải trình tự bệnh nhân MS G21...................................53
Hình 3.13: Kết quả giải trình tự bệnh nhân MS G40...................................54
Hình 3.14: Kết quả giải trình tự bệnh nhân MS G70...................................54
Hình 3.15: Kết quả giải trình tự bệnh nhân MS G24...................................55
Hình 3.16: Kết quả giải trình tự bệnh nhân MS G44...................................55
Hình 3.17: Hình ảnh cấu trúc protein CYP1B1 với đột biến p.D218H........59
Hình 3.18: Hình ảnh cấu trúc protein CYP1B1 với đột biến p.D242N........60
Hình 3.19: Hình ảnh cấu trúc protein CYP1B1 với đột biến p.G365E........61
Hình 3.20: Hình ảnh cấu trúc protein CYP1B1 với đột biến p.Q86K..........62
Hình 3.21: Hình ảnh cấu trúc protein CYP1B1 với đột biến p.A133T........62
Hình 3.22:

Hình ảnh MLPA (hình trên) và kết quả tính toán (Relative Peak
Area) bằng phần mềm coffalyser (hình dưới) của BN MS G40 và
MS2. Ex1, Ex3 là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, exon 3
của gen CYP1B1.........................................................................65


Hình 3.23:

Hình ảnh MLPA (hình trên) và kết quả tính toán (Relative Peak
Area) bằng phần mềm coffalyser (hình dưới) của bệnh nhân MS
G45 và MS68. Ex1, Ex3 là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1,

exon 3 của gen CYP1B1.............................................................66

Hình 3.23: Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G40.............................72
Hình 3.24: Hình ảnh giải trình tự gia đình bệnh nhân G40..........................73
Hình 3.25: Phả hệ gia đình bệnh nhân G24..................................................74
Hình 3.26: Hình ảnh giải trình tự gia đình bệnh nhân G24 (E229K)...........75
Hình 3.27: Phả hệ gia đình bệnh nhân G70..................................................76
Hình 3.28: Hình ảnh giải trình tự gia đình bệnh nhân G70 (E229K)...........77
Hình 3.29: Hình ảnh MLPA (hình trên) và kết quả tính toán (Relative Peak
Area) bằng phần mềm coffalyser (hình dưới) gen CYP1B1 của
bố bệnh nhân MS G28 (G28B). Ex1, Ex3 là các đỉnh tương ứng
với vị trí exon 1, exon 3 của gen CYP1B1.................................78


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Glôcôm ở trẻ em là một trong những nguyên nhân thường gặp gây mù
lòa ở trẻ em, đặc biệt là glôcôm bẩm sinh nguyên phát do trẻ còn quá nhỏ,
khó khám, khó đo nhãn áp, chẩn đoán do đó dễ bị bỏ sót, phẫu thuật dễ bị tái
phát. Bệnh thường xảy ra ở hai mắt (65-80%), xuất hiện sớm ngay từ những
năm đầu sau sinh và có thể điều trị khỏi hay phòng ngừa với những kỹ thuật
y học hiện đại [1], [2]. Tỷ lệ bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát có tần suất
khoảng 1/10.000 đến 1/20.000 trẻ sinh sống ở các nước châu Âu và Mỹ.
Bệnh chiếm 55% tổng số trường hợp glôcôm nguyên phát trẻ em, 60% được
chẩn đoán vào lúc 6 tháng tuổi và 80% trong vòng năm đầu tiên. Khoảng
65% là trẻ nam và bệnh thường xảy ra ở cả hai mắt trong 65-80% các trường
hợp với các mức độ không tương đương nhau. Tuy hiếm gặp nhưng đây là
một trong hai nguyên nhân hàng đầu gây mù lòa ở trẻ nhỏ [1], [3], [4].
Các tác giả Shaffer và Weiss từ năm 1970 đã xác định glôcôm bẩm

sinh nguyên phát là một thể bệnh glôcôm di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể
thường [5]. Ba đột biến gen được nghiên cứu nhiều nhất liên quan đến
glôcôm là CYP1B1, LTBP2, MYOC [6]. Trong đó gen CYP1B1 tổng hợp
protein CYP1B1 đóng vai trò quan trọng nhất trong việc hình thành cấu trúc
và duy trì chức năng của mắt. Có nhiều giả thiết đưa ra mối liên quan đột
biến gen CYP1B1 và bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát ở trẻ em [7], [8].
Gen CYP1B1 nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 2 tại vị trí 2p22.2 và
bao gồm 3 exon và 2 intron, dài 12 kb, mã hóa phân tử mRNA gồm 1.631
base [9], [10]. Đột biến gen CYP1B1 hay gặp nhất là đột biến thay thế acid
amin (missense) phát hiện được ở 733 trường hợp trong số 1096 đột biến
(66,76%). Trong đó đột biến gen CYP1B1 được phát hiện chủ yếu trên exon
2 và exon 3 [11]. Một báo cáo khác trong năm 2011 cũng kết luận đột biến
thay thế là loại đột biến gen CYP1B1 hay gặp nhất [12].


2
Ở nước ta, các nghiên cứu trước đây về bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên
phát mới chỉ đề cập đến tỉ lệ mắc bệnh, biểu hiện lâm sàng, kết quả điều trị
phẫu thuật thành công rất thấp (trung bình khoảng 30%) và các biến chứng
rất nặng nề như nghiên cứu của V. T. B. Thủy (1998), hay nghiên cứu 103 trẻ bị
glôcôm điều trị ở Khoa Nhi bệnh viện Mắt TP Hồ Chí Minh (2006), nghiên cứu
của Đ. Y. Lục (2006) trên 36 bệnh nhân. Trong những năm gần đây, xu hướng
nghiên cứu sâu về cơ chế bệnh sinh ở mức độ phân tử hứa hẹn làm tiền đề triển
khai chẩn đoán trước sinh cũng như liệu pháp điều trị gen, đồng thời giúp việc
quản lý tốt những người mang gen gây bệnh. Các nghiên cứu phát hiện đột biến
gen trong một số bệnh lý di truyền cũng đã bắt đầu được triển khai và thu được
kết quả khá tốt như bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne, thoái hóa cơ tủy, tăng sản
thượng thận bẩm sinh, tạo xương bất toàn... Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào
về đột biến gen gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát. Vì vậy chúng tôi tiến
hành đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột

biến gen CYP1B1 trong bệnh Glôcôm bẩm sinh nguyên phát tại Hà Nội”
Mục tiêu chung:
1. Xây dựng quy trình xác định đột biến gen CYP1B1 trong bệnh
Glôcôm bẩm sinh nguyên phát bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại Hà Nội.
2. Xây dựng quy trình phát hiện người lành mang gen bệnh trong gia
đình bệnh nhân Glôcôm bẩm sinh nguyên phát tại Hà Nội.
Mục tiêu cụ thể:
1. Xác định đột biến gen CYP1B1 trong bệnh Glôcôm bẩm sinh
nguyên phát bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
2. Xác định mối liên quan giữa đột biến gen CYP1B1 và một số đặc
điểm lâm sàng của bệnh nhân Glôcôm bẩm sinh nguyên phát.
3. Xác định người lành mang gen bệnh trong gia đình bệnh nhân
Glôcôm bẩm sinh nguyên phát.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về glôcôm bẩm sinh nguyên phát
1.1.1. Khái niệm và dịch tễ học glôcôm bẩm sinh nguyên phát
Khái niệm
Theo Shaffer và Weiss, Glôcôm bẩm sinh nguyên phát được định nghĩa
là glôcôm di truyền phổ biến nhất ở trẻ em, di truyền lặn nhiễm sắc thể
thường, với bất thường đặc biệt về góc gồm không có sự lùi điểm gắn chân
mống tạo góc tại vùng bè và không kèm theo bất thường phát triền nào khác.
Tăng nhãn áp là nguyên nhân gây giác mạc to, đục và chảy nước mắt do rạn
màng Descemet [1].
Glôcôm bẩm sinh thứ phát thì kèm theo bất thường ở các phần khác
của mắt.

 Tổn thương của giác mạc: hội chứng tách lớp bán phần trước
(Axenfeld, Reiger, Peters).
 Tổn thương của mống mắt: tật không mống mắt, tồn lưu màng
Wachendorf.
 Dị thường thể thủy tinh: hội chứng Lowe, Marfan, Machesani.
Việc phát hiện và điều trị sớm bệnh glôcôm bẩm sinh có thể ngăn ngừa
dẫn đến mù lòa.
Dịch tễ học
Glôcôm bẩm sinh nguyên phát là bệnh hiếm gặp với tỷ lệ 1/10000 đến
1/20000 trẻ mắc. Trong khi đó tỷ lệ này rất cao ở cộng đồng có cha mẹ cùng
huyết thống như Ấn Độ 1/3.300, Trung Đông 1/2.500 và 1/1.250 ở Slovakia
hay Rumani [1].


4
1.1.2. Phân loại glôcôm bẩm sinh nguyên phát
Etienne dựa theo kiểu góc tiền phòng quan sát được khi soi góc tiền
phòng để chia glôcôm bẩm sinh thành hai loại:
 Glôcôm góc mở (do có di tích phôi kín đáo).
 Glôcôm góc đóng: có tổ chức trung phôi không bình thường rất
dày che lấp vùng bè.
Tùy thuộc vào tuổi xuất hiện bệnh, Glôcôm bẩm sinh nguyên phát còn
được chia làm 3 nhóm:
 Glôcôm bẩm sinh thực sự (True congenital glaucoma): trong
nhóm này nhãn áp tăng cao khi bệnh nhân vẫn còn nằm trong
bụng mẹ, triệu chứng của bệnh xuất hiện ngay sau khi đẻ.
 Glôcôm ở trẻ nhỏ nguyên phát (Primary infantile glaucoma):
bệnh được phát hiện trong những năm đầu tiên của cuộc đời.
 Glôcôm ở người trẻ (Juvenile congenital glaucoma): được phát
hiện muộn hơn ở trẻ em sau 3 tuổi hoặc ở tuổi vị thành niên.

1.1.3. Giải phẫu bệnh, sinh lí bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát
* Góc tiền phòng trong glôcôm bẩm sinh:
Các nghiên cứu quá trình phát triển phôi thai học và giải phẫu học góc
tiền phòng cho thấy cơ chế tăng nhãn áp trong glôcôm bẩm sinh khác hoàn
toàn so với người trưởng thành [3].
Có rất nhiều giả thiết khác nhau giải thích về cơ chế gây tăng nhãn áp
trong glôcôm bẩm sinh. Tuy nhiên các tác giả đều cho rằng áp lực nội nhãn
tăng trong glôcôm bẩm sinh là do sự phát triển bất thường của góc tiền phòng
dẫn đến cản trở lưu thông thủy dịch [13], [14], [15].
Mann cho rằng đó là sự teo không hoàn toàn của tổ chức trung bì ở góc
tiền phòng làm tắc nghẽn sự lưu thông thủy dịch gây tăng nhãn áp. Barkan


5
cho rằng sự tiêu tan không hoàn toàn của các tế bào trung mô ở góc tạo nên
một màng bịt góc tiền phòng (gọi là màng Barkan) là cơ chế tăng nhãn áp.
Anderson và cộng sự khi nghiên cứu dưới kính hiển vi điện tử không tìm
thấy sự hiện diện của màng Barkan nhưng lại thấy mặt trước của màng bồ
đào bám cao của vùng bè [14].
Các tác giả khác như Allen, Burian và Braley thấy rằng cơ chế sinh
bệnh của glôcôm bẩm sinh là do sự tách lớp không hoàn toàn của tổ chức
trung bì trong góc tiền phòng. Worst cho rằng sự phát triển không hoàn toàn
của cựa củng mạc dẫn đến sự bám cao của cơ thể mi vào vùng bè, thêm vào
đó có một lớp tế bào nội mô đơn thuần bao phủ góc tiền phòng trong suốt
thời kì thai nghén.
Smelser và Ozanics giải thích glôcôm bẩm sinh nguyên phát đơn thuần
là do sự thay đổi cấu trúc của mạng lưới bè màng bồ đào, đồng thời có một
lớp dày chất vô định trong lớp nội mô thành trong ống Schlemm, điều này
được phát hiện thấy có trong giải phẫu bệnh của những bệnh nhân glôcôm
bẩm sinh nguyên phát đơn thuần. Kupfer lại nhấn mạnh có sự hiện diện của

các tế bào mào thần kinh thuộc xương sọ có trong góc tiền phòng, điều này
gợi ý sự phát triển bất thường của cấu trúc góc tiền phòng.
Tóm lại có rất nhiều giả thiết giải thích cơ chế sinh bệnh trong glôcôm
bẩm sinh nguyên phát đơn thuần. Các tác giả [3], [14], [15] đều cho rằng cơ
chế gây glôcôm bẩm sinh nguyên phát là do:
Sự ngừng phát triển ở các mức độ khác nhau của góc tiền phòng hoặc
phát triển không hài hòa các thành phần của góc.
Sự bám bất thường của cơ thể mi và mống mắt vào phần sau của vùng
bè, nếp thể mi và cơ thể mi bị kéo ra phía trung tâm, cựa củng mạc dịch
chuyển ra phía trước.


6
Thuyết di truyền trong bệnh lý glôcôm bẩm sinh cũng được nói đến:
glôcôm bẩm sinh di truyền theo kiểu lặn nguyên phát đơn độc, thuần túy và
di truyền trội trong các thể phối hợp. Người ta cũng nói đến di truyền đa gen,
đa nhân tố [3], [13].
1.1.4. Chẩn đoán và điều trị glôcôm bẩm sinh nguyên phát
1.1.4.1. Chẩn đoán xác định
 Triệu chứng chủ quan
-Sợ ánh sáng, co quắp mi: thường là triệu chứng khởi đầu và quan
trọng. bệnh nhân thường nheo mắt hoặc quay mắt đi nơi khác khi có ánh
sáng chiếu vào mắt, ở trẻ nhỏ thường hay gục đầu vào lòng mẹ. Sợ ánh sáng
là do kích thích các tế bào biểu mô giác mạc khi áp lực nội nhãn tăng.
- Chảy nước mắt.
- Mờ mắt.
 Triệu chứng khách quan:
- Mi mắt: có xu hướng khép lại nhằm hạn chế ánh sáng vào mắt.
- Giác mạc:
Trong glôcôm bẩm sinh thường giác mạc to đi cùng nhãn cầu to đặc

biệt khi xuất hiện ở trẻ dưới 3 tuổi. Bình thường giác mạc trong và có đường
kính ngay khi sinh là 10 mm theo Kluys Ken, 9,4 - 11 mm theo Aminlari.
Đường kính giác mạc khi 1 tuổi là 11,5 mm theo Kluys Ken, 10,5 - 11,7 mm
theo Aminlari [16]. Trong glôcôm bẩm sinh giác mạc to hơn bình thường ,
phù, có thể có rách và rạn màng Descemet.
- Lồi mắt trâu: ở giai đoạn muộn nhãn cầu bị dãn rộng do hậu quả tăng
nhãn áp lâu ngày. Khi củng mạc dãn mỏng thường có màu đen hoặc hơi xanh
do nhìn thấy hắc mạc ở phía dưới diện củng mạc dãn lồi. Dây Zinn có thể
dãn ra gây lệch thể thủy tinh.


7
- Tiền phòng sâu.
- Mống mắt: có thể có các dị tật kèm theo. Đồng tử có thể giãn, mất
phản xạ nhất là những trường hợp không còn chức năng.
- Khám đáy mắt có thể thấy dấu hiệu teo lõm gai tùy theo mức độ
bệnh. Lõm gai trong glôcôm bẩm sinh có thể hồi phục hoàn toàn nếu nhãn áp
được điều chỉnh tốt. Đây là một điểm khác với lõm gai ở người lớn [17].
- Soi góc tiền phòng
Trong glôcôm bẩm sinh nguyên phát khi soi góc tiền phòng thường thấy:
+ Chân mống mắt bám cao và bám ra trước hơn so với bình thường.
+ Bè màng bồ đào biến đổi nhạt màu hơn điều này dễ làm cho ta khó
phân biệt dải thể mi, vùng bè và cựa củng mạc.
- Nhãn áp
Ở trẻ lớn có thể đo được nhãn áp theo các phương pháp hay dùng
nhưng ở trẻ nhỏ thường phải đo nhãn áp khi trẻ ngủ hoặc dưới gây mê.
- Thị lực: nếu thử được thường là giảm.
- Thị trường: thường bị tổn hại.
- Siêu âm: đo trục trước sau nhãn nhãn cầu. Ở trẻ sơ sinh trục nhãn cầu
bình thường dài khoảng 17mm. Trong 2 năm đầu của cuộc đời nhãn cầu phát

triển rất nhanh, đến 2 tuổi trục nhãn cầu đạt kích thước gần tương tự của
người lớn (23 đến 24mm). Trong glôcôm bẩm sinh nguyên phát đặc biệt là
trẻ dưới 2 tuổi, nhãn cầu dãn lồi theo mọi hướng khi nhãn áp tăng, do đó trục
nhãn cầu thường lớn hơn kích thước bình thường cùng lưới tuổi.
 Triệu chứng toàn thân:
- Đối với glôcôm bẩm sinh nguyên phát thường không có các dị tật
bẩm sinh tại mắt và toàn thân kèm theo. Ngược lại ở glôcôm bẩm sinh thứ
phát có thể phát hiện được các dị tật tại mắt và toàn thân.


8
1.1.4.2. Chẩn đoán giai đoạn
- Ở Việt Nam, các tác giả phân loại giai đoạn bệnh theo đường kính
giác mạc như sau [17]:
+ Giai đoạn 1: đường kính giác mạc ≤ 12 mm, giác mạc trong.
+ Giai đoạn 2: đường kính giác mạc từ 12 đến 14 mm, giác mạc phù đục.
+ Giai đoạn 3: đường kính giác mạc > 14mm, giác mạc phù đục trắng,
nhãn cầu giãn lồi không hồi phục, mất chức năng.
1.1.4.3. Điều trị glôcôm bẩm sinh nguyên phát
 Điều trị nội khoa:
- Điều trị nội khoa chỉ là bước đầu chuẩn bị cho một cuộc phẫu thuật
hoặc điều trị bổ sung cùng phẫu thuật. Các thuốc co đồng tử không có tác
dụng hoặc tác dụng rất ít [17].
 Điều trị ngoại khoa:
- Đối với glôcôm bẩm sinh, phương pháp điều trị duy nhất là bằng
phẫu thuật. Mục đích của phẫu thuật là tạo điều kiện cho sự lưu thông thủy
dịch tốt hơn. Hiện nay, có 4 phương pháp phẫu thuật chính: Mở góc tiền
phòng, Mở bè củng giác mạc, Phẫu thuật cắt bè củng giác mạc và Phẫu thuật
điện đông, lạnh đông thể mi [17].
- Mở góc tiền phòng: Phẫu thuật này được thực hiện ở lần khám đầu tiên,

giác mạc còn trong và có thể nhìn thấy được góc tiền phòng. Đây là phương
pháp đơn giản, mang lại kết quả tốt, kết quả có thể đạt 85%. Tuy nhiên, phẫu
thuật này không thực hiện được nếu đường kính giác mạc trên 14 mm.
- Mở bè củng giác mạc: Kỹ thuật này được chỉ định khi giác mạc mờ đục
ngăn cản việc nhìn rõ góc tiền phòng hoặc sự phẫu thuật mở góc tiền phòng bị
thất bại. Mục đích của phương pháp này là mở bè củng giác mạc một đoạn dài
để làm sự lưu thông giữa ống Schlemm và góc tiền phòng được dễ dàng. Tuy
nhiên, khó khăn của kỹ thuật này là việc xác định được ống Schlemm.


9
- Phẫu thuật cắt bè củng - giác mạc: Kỹ thuật này có thể áp dụng cho tất
cả các giai đoạn glôcôm bẩm sinh. Mục đích là cắt một mẩu bè củng - giác
mạc và một đoạn ống Schlemm tạo điều kiện cho lưu thông thủy dịch tốt hơn.
- Phẫu thuật điện đông, lạnh đông thể mi: Phẫu thuật này chỉ áp dụng ở
những mắt hầu như đã mắt chức năng và thất bại với các phương pháp phẫu
thuật đã nêu trên.
1.2. Vị trí, cấu trúc gen và protein CYP1B1
1.2.1. Vị trí gen
Gen CYP1B1 nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 2 tại vị trí 2p22.2 và
bao gồm 3 exon, phần mã hóa gen bắt đầu từ exon thứ 2, chiều dài gen là
1629 cặp base [9].

Hình 1.1: Vị trí của gen CYP1B1 [18]
Trong một loạt nghiên cứu về nhiễm sắc thể 2, vùng chứa gen
CYP1B1 đã được xác định là GLC3A [19].
1.2.2. Cấu trúc gen
Gen CYP1B1 có 3 exon và 2 intron, dài 12 kb, mã hóa phân tử mRNA
gồm 1.631 base tổng hợp protein CYP1B1 [10]. Ba exon của gen CYP1B1
lần lượt có độ dài là 371; 1044 và 3707 bp. Tuy nhiên, vùng mã hóa của gen

CYP1B1 bắt đầu từ đầu 5’ exon 2 và kết thúc trong exon 3. Vùng mã hóa này
có chiều dài 1629 bp mã hóa protein 543 acid amin [20].


10

Vị trí gen quy định tổng hợp từng vùng cũng đã được xác định trên gen
CYP1B1.

Hình 1.2: Sơ đồ vị trí gen tổng hợp các vùng cấu trúc của
protein CYP1B1 [21].
1.2.3. Protein CYP1B1: Cấu trúc và chức năng
Sản phẩm protein của gen CYP1B1 là protein CYP1B1, một phân họ
của enzym cytochrom P450.
Chức năng của men CYP1B1 chưa rõ ràng, nhưng nó được giả thiết rằng
đóng một vai trò trong việc hình thành các cấu trúc ở phía trước của mắt và cũng
có thể tham gia vào một quá trình điều chỉnh sự bài tiết thủy dịch.
Năm 1988, Ivaylo Stoilov và cộng sự đã xây dựng mô hình ba chiều về
vùng C' tận (C-terminal) của protein CYP1B1. Cấu trúc này gồm 4 vùng I, J,
K, L và vùng gắn Hem.


11

Hình 1.3: Hình ảnh không gian 3 chiều vùng C' tận của protein
CYP1B1 [22].
Tác giả cũng phát hiện 16 đột biến gen và 6 đa hình gen CYP1B1 và dự
đoán các đột biến này có thể ảnh hưởng đến khả năng gắn hem của phân tử P450
do thay đổi vùng bản lề và cấu trúc vùng lõi (CCS).
Bảng 1.1. Bảng mô tả đột biến gen CYP1B1 và dự đoán vùng ảnh

hưởng [22]


12
Có nhiều giả thiết về cơ chế gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát khi
đột biến gen CYP1B1. Năm 1987, Schwartzman và cộng sự đã xác định có mối
liên quan giữa arachidonate phụ thuộc cytochrome P450 với ức chế Na+, K+ATPase trong giác mạc trong việc điều chỉnh tính trong suốt của giác mạc và tiết
thủy dịch. Phát hiện này phù hợp với triệu chứng mờ đục của giác mạc và tăng
nhãn áp, 2 tiêu chuẩn chẩn đoán chính cho bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát [7].
Stoilov I. (2000) đã đưa ra giả thuyết rằng CYP1B1 chuyển hóa một
phân tử có nguồn gốc nội sinh (như steroid, axit béo hoặc hợp chất
prostanoid) cần thiết cho phát triển bình thường và chức năng của mắt. Hoạt
động của CYP1B1 có thể dưới hai dạng: tạo ra một hợp chất hoạt động trên
một số mục tiêu hoặc ngừng tác dụng của các hợp chất sinh học khác và
chiếm vị trí của nó. Tuy nhiên các phân tử này được chuyển hóa bởi quá trình
kích hoạt có tổ chức của các men. Vì vậy, CYP1B1 có thể thuộc về một con
đường tín hiệu sinh hóa nội sinh chưa được biết rõ, liên quan đến trưởng
thành cuối cùng của góc tiền phòng. Đột biến gen CYP1B1 sẽ gây ra rối loạn
sản xuất men, làm bất thường cấu trúc mạng lưới vùng bè, nơi có các ống
tuyến giúp lưu thoát thủy dịch khỏi mắt. Sự ứ trệ thủy dịch này làm tăng
nhãn áp gây bệnh glôcôm [8].

Hình 1.4: Sơ đồ minh họa cơ chế ảnh hưởng của đột biến gen CYP1B1


13
[8].
Protein CYP1B1 của thể hoang dại và thể đột biến có sự khác biệt về
đích tác động. Phân tử CYP1B1 thể hoang dại được neo trên màng của lưới
nội nguyên sinh. Chức năng bình thường của nó đòi hỏi sự tham gia của một

số đối tác oxy hóa khử P450 reductase. P450 reductase có khả năng đưa một
nguyên tử của phân tử oxy vào cơ chất của nó. Khi đó có 2 khả năng xảy ra:
Một là cơ chất được hoạt hóa và tác động đến một mục tiêu chưa được biết rõ.
Một cách khác, oxy phân tử có thể làm tăng tính ưa nước của cơ chất làm tăng
bài xuất và giải phóng từ tế bào hoặc vị trí biểu hiện bình thường của nó.
Đột biến gen CYP1B1 làm thay đổi 2 khả năng trên. Sự điều hòa
không gian và thời gian của các gen kiểm soát phát triển của góc tiền phòng
sẽ bị thay đổi bởi sự vắng mặt của một phân tử điều hòa (ví dụ như steroid)
do CYP1B1 tạo ra. Ngoài ra, các dấu hiệu dừng phát triển góc tiền phòng
quan sát thấy ở các bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát có thể phản ánh
ảnh hưởng độc hại của một chất chuyển hóa thường được loại bỏ bởi
CYP1B1.
1.3. Đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát
1.3.1. Các dạng đột biến cấu trúc của gen CYP1B1
Theo các nghiên cứu, tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 thay đổi ở bệnh nhân
glôcôm bẩm sinh nguyên phát ở các vùng địa lý khác nhau. Tỷ lệ đột biến
này dao động từ 17,2% ở Trung Quốc, 20% ở Nhật, 33,3% ở bệnh nhân
Indonesia cho đến 75,9% ở bệnh nhân Ả rập [23], [24], [25], [26].
Theo tổng kết của Li và cộng sự (2010) trong một nghiên cứu cộng
gộp trên 542 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát tìm thấy 1096 đột biến
gen CYP1B1. Trong đó, đột biến thay thế acid amin (missense) phát hiện
được ở 733 các trường hợp (66,76%), xóa đoạn (deletion) phát hiện được ở
155 trường hợp (14,12%), mất hoặc thêm nucleotid (deletion/insertion) phát


14
hiện được ở 1 trường hợp (0,09%), lặp đoạn (duplication) phát hiện được ở
47 trường hợp (4,28%), lặp hoặc mất nucleotid (duplication/deletion) phát
hiện được ở 1 trường hợp (0,09%), thêm nucleotid (insertion) phát hiện được ở
31 trường hợp (2,82%), đột biến vô nghĩa (nonsense) phát hiện được ở 39

bệnh nhân (3,55%) và 89 bệnh nhân (8,11%) không phát hiện được đột biến.
Tác giả cũng báo cáo đột biến trên exon 3 chiếm tỷ lệ cao nhất với 516 đột
biến chiếm tỷ lệ 47.08% [11].
Các tác giả khác cũng đưa ra kết luận, đột biến thay thế acid amin là
loại đột biến hay gặp nhất. Ở châu Á, tỷ lệ đột biến loại này chiếm khoảng
20% trong tổng số bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát và khoảng 60%
trong tổng số đột biến gen CYP1B1 [12].
Bảng 1.2. Bảng về tỉ lệ các đột biến gen CYP1B1 ở một
số nước châu Á
Loại đột biến
Quốc gia

Thay thế

(số lượng BN)

axit amin

Ả rập (n=62)
Brazil (n=52)
Iran (n=104)
Úc (n=37)
Nhật (n=65)
Thổ nhĩ kỳ(n=35)
Ecuador (n=15)
Kuwait (n=17)
Indonesia(n=21)
Marốc(n=32)
Pháp (n=31)
Mexico (n=12)

Mỹ&Brazil(n=21)
Trung Đông (n=10)

(%)
55 (88,7)
5 (9,6)
81 (77,9)
8 (21,6)
10 (15,4)
13 (37,1)
2 (13,3)
11 (64,7)
5 (23,8)
9 (28,1)
6 (19,4)
4 (33,3)
2 (9,5)
3 (30)

Vô nghĩa

Xóa đoạn

(%)

(%)

3 (5,8)
1 (0,96)
1 (2,7)

1 (1,5)

2 (3,2)
16 (30,8)
4 (3,84)
1 (2,7)
1 (1,5)

1 (5,9)
1 (4,8)
9 (29,0)
-

1 (6,7)
2 (9,5)
4 (12,5)
2 (6,5)
2 (9,5)
-

Lặp

Thêm

đoạn

Nucleotid

(%)
4 (7,8)

3 (2,9)
1 (2,7)
1 (2,9)
1 (8,3)
2 (9,5)
-

(%)
1 (0,96)
3 (4,6)
1 (2,9)
-

BN không đột
biến gen
CYP1B1
5 (8,1)
24 (46,1)
14 (13,5)
26 (70)
50 (76,9)
20 (57,1)
12 (80)
5 (29,4)
13 (61,9)
19 (59,4)
14 (45,2)
7 (58,3)
15 (71,4)
7 (70)

1.3.2. Các vị trí đột biến gen CYP1B1 trên DNA
Theo thống kê của tác giả Li và cộng sự cho đến năm 2010, trong 52


15
nghiên cứu đã được báo cáo đã phát hiện 542 bệnh nhân mang 147 vị trí đột
biến khác nhau trên gen CYP1B1. Trong số đó, 11 vị trí thường gặp đột biến
là: 3987G>A (G61E) được phát hiện ở trong 207 trường hợp (18,85%),
7940G>A/T (R368H/L) ở 89 trường hợp (8,11%), 8006G>A (R390H) ở 74
trường hợp (6,74%), 7996G>A (E387K) ở 65 trường hợp (5,92%), 8242C>T
(R469W) ở 53 trường hợp (4,83%), 8037dup10 ở 39 trường hợp (3,55%),
4340delG ở 34 trường hợp (3,10%), 7901del13 ở 30 trường hợp (2,73%),
4490G>A ở 29 trường hợp (2,64%), 8005C>T/A (R390C/S) ở 27 trường hợp
(2,46%), 4339delG ở 24 trường hợp (2,19%).

Hình 1.5: Sự phân bố đột biến gen CYP1B1 [11].
Cũng trong báo cáo này, tác giả đã tổng kết các loại đột biến gen
CYP1B1 ở bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát trên các chủng tộc khác
nhau là khác nhau.
Người da trắng: trong 252 bệnh nhân da trắng phát hiện 522 đột biến
gen. 9 đột biến phổ biến nhất là: R368H, 8037dup10, R390H, 7901del13,


16
4340delG, G61E, E387K, E229KvàR390C/S. Tỷ lệ các loại đột biến phân bố
như sau: 7940G>A (R368H) được tìm thấy trong 61 trường hợp (61 trong số
522, 11,69%), 8037dup10 trong 35 trường hợp (6,70%), 8006G>A (R390H)
đột biến trong 29 trường hợp (5,56%), 7901del13 đột biến trong 27 trường
hợp (5,17%), 4340delG trong 26 trường hợp (4,98%), 3987G>A (G61E)

trong 24 trường hợp (4,60%), 7996G>A (E387K) trong 22 trường hợp
(4,21%), 4490G>A (E229K) trong 21 trường hợp (4,02%), 8005C>T/
A(R390C /S) trong 20 trường hợp (3,83%).

Hình 1.6: Sự phân bố đột biến gen CYP1B1 thường gặp ở người da
trắng [11].
Người châu Á: báo cáo ghi nhận trên 64 bệnh nhân châu Á phát hiện
120 đột biến gen CYP1B1. Các đột biến hay gặp nhất là V364M, L385F và
R390H. Đột biến 7927G>A (V364M) được tìm thấy trong 15 trường hợp (15
trong số 120 đột biến, 12,50%), 7990C>T(L385F) đột biến trong 14 trường
hợp (11,67%), 8006G>A (R390H) đột biến trong10 trường hợp (8,33 %).