Nghiên cứu chiết xuất tối ưu capsaicinoid từ quả ớt

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

KHỔNG THỊ MINH THƯ

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT TỐI ƯU
CAPSAICINOID TỪ QUẢ ỚT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

KHỔNG THỊ MINH THƯ
MÃ SINH VIÊN: 1401597

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT TỐI ƯU
CAPSAICINOID TỪ QUẢ ỚT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Đỗ Quyên
2. ThS. Phạm Tuấn Anh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược liệu

HÀ NỘI - 2019

LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp này đã được hoàn thành tại Bộ môn Dược liệu – Trường
Đại học Dược Hà Nội. Để hoàn thành khóa luận này, lời đầu tiên em xin được bày tỏ
lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới ThS. Phạm Tuấn Anh, người đã luôn tận
tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, niềm đam mê nghiên cứu và luôn tạo điều kiện
tốt nhất giúp em hoàn thành khóa luận này. Phong cách làm việc của thầy sẽ luôn là
tấm gương để em học tập sau này.
Em xin bày tỏ lòng kính trọng sâu sắc tới PGS.TS. Đỗ Quyên, TS. Nguyễn
Quỳnh Chi đã trực tiếp tận tình giúp đỡ, giải đáp những thắc mắc, khó khăn gặp phải
trong suốt quá trình nghiên cứu để em hoàn thành đề tài được giao một cách tốt nhất.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo, các kỹ thuật viên
của Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho
em trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Xin được ghi nhận công sức và những đóng góp quý báu, nhiệt tình của các bạn
sinh viên tham gia nghiên cứu khoa học tại bộ môn Dược liệu đã đóng góp ý kiến và
giúp đỡ cùng em triển khai đề tài này.
Mặc dù em đã cố gắng để khóa luận được hoàn thiện nhất nhưng không tránh
khỏi có những sai sót trong quá trình thực hiện. Kính mong các thầy cô chỉ bảo, góp ý
để khóa luận của em được hoàn thiện hơn.
Em xin trân trọng cảm ơn !
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Khổng Thị Minh Thư


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ ----------------------------------------------------------------------------1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ------------------------------------------------------------2
1.1. Tổng quan về cây Ớt .................................................................................2
1.1.1. Vị trí phân loại ....................................................................................2
1.1.2. Thành phần hóa học ...........................................................................2
1.1.3. Công dụng ..........................................................................................4
1.1.4. Tác dụng dược lý và ứng dụng của capsaicin ....................................5
1.2. Tổng quan về chiết xuất ............................................................................7
1.2.1. Các phương pháp chiết xuất capsaicinoid từ quả Ớt ..........................7
1.2.2. Các dung môi chiết xuất capsaicinoid từ quả Ớt ................................8
1.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất. .....................9
1.3.1. Phương pháp thay đổi một yếu tố.......................................................9
1.3.2. Phương pháp bề mặt đáp ứng ...........................................................10
1.3.2.1. Một số thuật ngữ: ......................................................................10
1.3.2.2. Các bước tối ưu hóa quy trình bằng RSM .................................11
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ------------ 14
2.1. Đối tượng nghiên cứu ..............................................................................14
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................14
2.1.2. Thuốc thử, dung môi, hóa chất .........................................................14
2.1.3. Phương tiện và máy móc ..................................................................14
2.2. Phương pháp nghiên cứu .........................................................................15
2.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng.........................................................15
2.2.1.1. Lựa chọn dung môi chiết và nồng độ ethanol ...........................15
2.2.1.2. Lựa chọn phương pháp chiết .....................................................16
2.2.1.3. Lựa chọn kích thước dược liệu ..................................................16
2.2.1.4. Khảo sát nhiệt độ chiết ..............................................................16
2.2.1.5. Khảo sát thời gian chiết .............................................................17
2.2.1.6. Khảo sát tỉ lệ dung môi: dược liệu ............................................17

2.2.1.7. Khảo sát số lần chiết ..................................................................17
2.2.2. Mô tả thiết kế thí nghiệm .................................................................18
2.2.3. Phương pháp định lượng ..................................................................20
2.2.4. Tối ưu hóa quy trình chiết capsaicinoid ...........................................22
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ---------------------- 26
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình chiết xuất
capsaicinoid từ quả Ớt ...............................................................................................26
3.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ ...................................................................26
3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất .................................................26
3.1.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: dược liệu.........................................27
3.1.4. Ảnh hưởng của số lần chiết ..............................................................28
3.2. Tối ưu quá trình chiết xuất capsaicinoid từ quả Ớt .................................28
3.3. Bàn luận ...................................................................................................33
3.3.1. Lựa chọn phương pháp chiết. ...........................................................33
3.3.2. Xu hướng ảnh hưởng của các yếu tố thời gian chiết, tỉ lệ dung môi:
dược liệu và nồng độ ethanol đến hàm lượng capsaicinoid. .................................33
3.3.3. Chọn phương án chiết xuất tối ưu ....................................................35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT----------------------------------------------------------- 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Nội dung đầy đủ

Tên viết tắt
HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)

OFAT

Phương pháp thay đổi một yếu tố (One factor at a time)

RSM

Phương

pháp

đáp

ứng

bề

mặt

(Response

surface

methodology)
BBD

Thiết kế Box – Behnken (Box – Behnken design)

RSD

Độ lệch chuẩn tương tối (Relative standard deviation)

RESID

Tổng bình phương phần dư (The residual sum of squares)

REGR

Tổng bình phương hồi quy (The regression sum of squares)

ERR

Tổng bình phương sai số thí nghiệm ở tâm (The pure error
sum of squares)

LOF

Tổng bình phương sự không tương thích (Lack of fit)

TRPV1

Transient Receptor Potential V1

CRGP

Calcitonin gene-related peptide

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 1.1. So sánh các phương pháp chiết .......................................................................7
Bảng 2.1. Các mức và khoảng biến thiên của biến đầu vào ..........................................19
Bảng 2.2. Thiết kế thí nghiệm theo mô hình BBD ........................................................19
Bảng 2.3. Bảng phân tích phương sai ............................................................................23
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng capsaicinoid .........................26
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng capsaicinoid ........................27
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: dược liệu đến hàm lượng ............................27
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng capsaicinoid ............................28
Bảng 3.5. Các mức thí nghiệm sử dụng trong mô hình RSM .......................................28
Bảng 3.6. Kết quả hàm mục tiêu quy hoạch thực nghiệm.............................................29
Bảng 3.7. Kết quả phân tích phương sai các yếu tố bằng phần mềm R ........................30
Bảng 3.8. Kết quả phân tích tối ưu các yếu tố bằng phần mềm R ................................30
Bảng 3.9. Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm .......................31
Bảng 3.10. Kết quả chiết xuất capsaicinoid theo thực nghiệm .....................................36


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của 6 capsaicinoid chính trong quả Ớt ................................4
Hình 1.2. Sơ đồ phương pháp RSM để thiết kế thí nghiệm tối ưu [14] ........................11
Hình 2.1. Mô hình quá trình lựa chọn và sàng lọc biến ................................................18
Hình 3.1. Bề mặt đáp ứng của từng cặp yếu tố ảnh hưởng hàm lượng capsaicinoid ....34


ĐẶT VẤN ĐỀ

Quả Ớt là một loại quả rất quen thuộc trong đời sống hàng ngày, là một phần
quan trọng trong ẩm thực của người Việt. Trong những năm gần đây, nhóm các

alcaloid có trong quả Ớt đang được chú ý, điển hình nhất là capsaicin với tác dụng
giảm đau ngoại vi. Điều trị giảm đau và chống viêm bằng capsaicin đã được nghiên
cứu có hiệu quả tương đương, thậm chí có phần nhỉnh hơn so với NSAIDs [33], [54].
Nghiên cứu trên chuột so sánh khả năng giảm đau và chống viêm giữa diclofenac và
capsaicin cho thấy: liều sử dụng 100 mg/kg của diclofenac và capsaicin với liều 2,5
mg/kg cho hiệu quả dược lý là tương đương nhau [33]. Với mức liều thấp hơn rất
nhiều cùng với hiệu quả điều trị như vậy, cộng thêm tác dụng không mong muốn và
chi phí chi trả cho chế phẩm từ capsaicin là ít hơn so với NSAIDs [30], việc nghiên
cứu chiết xuất capsaicin từ Ớt là vô cùng cần thiết.
Rõ ràng với tác dụng sinh học quý và tiềm năng phát triển như vậy, việc nghiên
cứu các chế phẩm từ Ớt là nhu cầu tất yếu và rất quan trọng. Nghiên cứu của Cao Hà
Phương đã bước đầu khảo sát hàm lượng capsaicinoid trong các mẫu Ớt ở Việt Nam
[6]. Tuy nhiên, để phát triển thành dạng chế phẩm thì cần có thêm những nghiên cứu
về chiết xuất quả Ớt, đặc biệt là nghiên cứu về chiết tối ưu để có thể có những sản
phẩm đạt hàm lượng cao phục vụ cho công nghiệp dược phẩm.
Từ thực tế và nhu cầu trên, đề tài “Nghiên cứu chiết xuất tối ưu Capsaicinoid
từ quả Ớt” được thực hiện với các mục tiêu sau :
-

Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố trong quá trình chiết xuất capsaicinoid từ
quả Ớt.

-

Lựa chọn điều kiện chiết xuất tối ưu capsaicinoid từ quả Ớt.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về cây Ớt
1.1.1. Vị trí phân loại
Theo Hệ thống phân loại của Takhtajan [62], vị trí của chi Capsicum L. được
tóm tắt như sau:
Giới: Thực vật (Plantae)
Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp: Hoa môi (Lamiidae)
Bộ: Cà (Solanales)
Họ: Cà (Solanaceae)
Chi: Capsicum L.
1.1.2. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học chính của quả Ớt gồm carbohydrat, protein, chất béo, chất
xơ và khoáng chất, các thành phần này thay đổi rất nhiều khi quả chuyển từ xanh sang
chín. Quả Ớt chứa 5 - 8% chất vô cơ, acid hữu cơ (acid malic, acid citric), glucid
(pentosan), 1,5% tinh dầu. Lipid chiếm 15 – 18% có nhiều ở hạt và gồm chủ yếu là
glycerid của acid oleic [1].
Hai thành phần quan trọng của Ớt là chất màu và chất cay (capsaicinoid), tuy
nhiên hàm lượng 2 thành phần này thấp, chiếm chưa đến 1%, và phụ thuộc rất nhiều
vào giống, thứ, quá trình chế biến và bảo quản. Thông thường loại Ớt cay thì hàm
lượng chất màu ít và ngược lại quả ít cay có hàm lượng chất màu cao [20].
Chất màu chiếm 0,15 – 0,35% của quả Ớt [1] chủ yếu nằm ở vỏ quả, mức độ
màu phụ thuộc vào giống, độ trưởng thành, thời gian thu hái, ảnh hưởng của ánh sáng
(nắng, UV), chế biến (nhiệt độ sấy, độ ẩm), bảo quản… tạo thành các sắc độ màu khác
nhau. Trong đó thành phần chính là dẫn chất carotenoid như các hợp chất có oxy như
capsanthin (30 – 60%), capsorubin (6 – 18%), zeaxanthin và cryptoxanthin [56]. Màu
2


đỏ của quả là do các chất capsanthin và capsorubin. Các chất khác có màu vàng. Các

chất màu còn gồm các flavonoid, chủ yếu là quercetin và luteolin [1].
Hoạt chất cay là capsaicinoid bao gồm các alcaloid có cấu trúc vanillylamid.
Hai capsaicinoid chính tạo nên vị cay của Ớt là capsaicin (trans-8-methyl-N-vanillyl6-nonenamid) và dihydrocapsaicin (8-methyl-N-vanillylnonanamid), hai chất này
chiếm khoảng 77 – 98% capsaicinoid trong quả Ớt [28]. Bên cạnh hai capsaicinoid
chính, những capsaicinoid hàm lượng nhỏ hơn đã được tìm thấy trong Ớt bao gồm chủ
yếu nordihydrocapsaicin, homocapsaicin, homodihydrocapsaicin, nonivamid trong số
hơn hai mươi hợp chất được tìm thấy [26].
Capsaicinoid được tích lũy trong tất cả các thành phần của quả Ớt, tuy nhiên tập
trung hàm lượng cao nhất tại giá noãn [15], [21], [57]. Capsaicinoid được phát hiện
sau 10 ngày kể từ khi quả hình thành, sau đó tăng dần và đạt tối đa vào khoảng ngày
thứ 40, sau đó hàm lượng giảm đáng kể từ ngày thứ 50 trở đi. Mỗi capsaicinoid cũng
có sự thay đổi về hàm lượng cùng với sự phát triển của quả [8]. Hơn nữa, cùng một
loài Ớt khi được trồng ở điều kiện khác nhau (chế độ nước tưới, nhiệt độ, ánh sáng...)
thì cũng cho hàm lượng các capsaicinoid khác nhau [25], [27], [57]. Capsaicinoid tan
trong ether dầu hỏa, cồn và các dung môi hữu cơ như cloroform, aceton, methanol,
acetonitril, ethyl acetat…[36]. Capsaicinoid ít tan trong nước tinh khiết đun sôi, nhưng
lại tan trong các dung dịch kiềm loãng [1].

3


Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của 6 capsaicinoid chính trong quả Ớt

Ớt còn có một saponin là capsidin.
Các vitamin trong Ớt gồm β-caroten và cryptoxanthin, các vitamin B1 và B2,
vitamin C 0,1 – 0,4%. Hàm lượng vitamin C tăng lên khi quả chín, bắt đầu giảm đi khi
quả có màu đỏ [1].
1.1.3. Công dụng
Trong đời sống hàng ngày Ớt ngọt được dùng làm rau ăn, Ớt cay là gia vị và
làm thuốc. Theo Y học cổ truyền, quả Ớt có vị cay, tính nóng, có tác dụng ôn trung tán

hàn, kiện vị tiêu thực, gây xung huyết, kích thích chung, thông kinh lạc, giảm đau, sát
trùng. Rễ Ớt có tác dụng hoạt huyết, tán thũng. Lá Ớt có vị đắng, tính mát, có tác dụng
thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu [1].

4


Dùng ngoài, Ớt là một vị thuốc gây đỏ, kích thích tại chỗ, trong các trường hợp
đau do phong thấp, đau lưng, đau khớp [5]. Để chữa đau lưng, thấp khớp, đau dây thần
kinh, lấy Ớt giã nát, ngâm rượu với tỉ lệ 1/2 (1 phần Ớt tươi, 2 phần rượu) dùng xoa
bóp. Có thể lấy hạt Ớt phơi khô tán bột mịn làm cao dán (dùng riêng hoặc phối hợp
với các vị thuốc khác) [1].
Dùng trong, quả Ớt dùng trị ỉa chảy hoắc loạn, tích trệ, sốt rét. Trong Tây y, Ớt
thường được chỉ định để điều trị chứng khó tiêu do mất trương lực, lên men ruột, tiêu
chảy, kiết lỵ, nôn mửa không cầm được, xuất huyết tử cung, thấp khớp, viêm thanh
quản [2].
1.1.4. Tác dụng dược lý và ứng dụng của capsaicin
Capsaicin có nhiều tác dụng dược lý nhưng đáng chú ý nhất là các tác dụng
giảm đau, tác dụng kiểm soát cân nặng và tác dụng chống ung thư.
Tác dụng giảm đau
Capsaicin được chứng minh có tác dụng giảm đau trong các trường hợp như
đau khớp gối [45], thấp khớp [13], đau dây thần kinh [58], [64], đau sau phẫu thuật
[58], đau dây thần kinh ngoại vi ở người mắc tiểu đường [30]. Ngoài tác dụng giảm
đau, capsaicin cùng các hợp chất thuộc nhóm vanilloid còn có khả năng giảm viêm
thông qua việc gắn với một thụ thể thần kinh màng TRPV1 (Transient Receptor
Potential V1) [61].
Cơ chế tác dụng của capsaicin: TRPV1 là kênh ion có tính chọn lọc hạn chế với
ion Ca2+. TRPV1 có mặt chủ yếu trong cấu trúc của hệ thần kinh, đặc biệt là hệ thần
kinh cảm giác. Ở da, thụ thể TRPV1 có trong các sợi thần kinh cảm giác ở da, thượng
bì, tế bào Mast, mạch máu da, nang tóc, tuyến mồ hôi [31], [59]. TRPV1 được kích

thích bởi capsaicin, điều khác biệt đó là capsaicin giảm đau thông qua 2 giai đoạn:
kích thích và gây tê. Ở giai đoạn kích thích, capsaicin kích hoạt thụ thể TRPV1 làm
giải phóng ra các peptid dẫn truyền thần kinh như chất P và CRGP (Calcitonin generelated peptide), các chất này sẽ truyền đến hệ thần kinh gây ra cảm giác nóng. Đến
giai đoạn gây tê, các chất dẫn truyền trên đã ngừng giải phóng, các sợi thần kinh cảm
giác đau bị tê liệt, kéo dài trạng thái giảm nhạy cảm dai dẳng dẫn tới sự giảm chức
năng của các thụ thể, cơn đau giảm rõ rệt [13], [43].
5


Ứng dụng của capsaicin: Trên lâm sàng đã có những sản phẩm có thành phần
chứa capsaicin bao gồm kem capsaicin 0,025%, 0,075%; miếng dán capsaicin 8% với
một số tên thương mại như Zostrix® (Tập đoàn Dược phẩm Scottsdale, AZ),
Qutenza® (NeuoguesX, Inc., San Francisco, CA), Capzasin-P® (Phòng thí nghiệm
Hayem, Chattanooga, TN) và Zostrix-HP® [29], [35]. Kem capsaicin 0,025% được
chứng minh cải thiện 38% cơn đau trong các bệnh đau cơ xương khớp sau 4 - 8 tuần
sử dụng [47]; đối với đau dây thần kinh, đau sau phẫu thuật và đau ngoại vi ở bệnh
nhân tiểu đường, cảm giác đau được cải thiện 57% khi sử dụng kem 0,075% trong
vòng 6 - 12 tuần hoặc sử dụng một lần duy nhất với miếng dán capsaicin 8% [22],
[23].
Tác dụng kiểm soát cân nặng
Cơ chế chủ yếu giúp kiểm soát cân nặng của capsaicin là do khả năng làm tăng
nhiệt độ cơ thể, tăng tiêu thụ calo thông qua kích thích các dây thần kinh sinh nhiệt
[53], [55]. Ngoài ra, thân nhiệt tăng còn do bài tiết catecholamin từ tuyến thượng thận
[39]. Một cơ chế khác được đưa ra đó là khả năng kích thích UCP1, là một protein có
nhiều trong tế bào mỡ nâu, cần thiết cho hoạt động của ti thể để sản sinh năng lượng
và nhiệt lượng. UCP1 tham gia vào quá trình oxy hóa chất béo trong mỡ nâu, tăng huy
động lipid, từ đó dẫn đến hiệu quả giảm cân. Nghiên cứu trên hai nhóm chuột có chế
độ ăn giàu chất béo, trọng lượng nhóm sử dụng capsaicin giảm 8% so với nhóm không
sử dụng capsaicin, đồng thời ở nhóm có sử dụng capsaicin, kích thước hạt lipid giảm
đáng kể so với nhóm còn lại [34]. Hơn nữa, capsaicin khi kết hợp cùng trà xanh còn

giúp ngăn chặn cơn đói, cảm giác no được kéo dài lâu hơn [55], [63].
Tác dụng chống ung thư
Capsaicin được chứng minh có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng chống ung thư
và đột biến tế bào [37]. Thông qua cơ chế apoptosis - thúc đẩy tế bào ung thư tự chết,
capsaicin khi vào cơ thể sẽ làm giảm Bcl – 2, một chất ức chế quá trình apoptosis,
trong khi đó không ảnh hưởng đến các chất kích thích apoptosis như Bax. Cơ chế này
đã giải thích được tác dụng của capsaicin trên ung thư gan và bàng quang [37], [42].
Một cơ chế khác của capsaicin được đưa ra đó là ức chế sự phát triển của tế bào Hela –
một loại tế bào ung thư bằng cách ức chế enzym NADH oxidase, enzym cần thiết cho
6


tổng hợp năng lượng cho tế bào, nhờ đó đã mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư
buồng trứng, ung thư biểu mô tuyến vú [49], [50].

1.2.

Tổng quan về chiết xuất
Khái niệm về chiết xuất: Chiết xuất là quá trình dùng dung môi thích hợp để

hòa tan các chất khỏi phần không tan trong dược liệu. Sản phẩm của quá trình chiết
xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi, được gọi là dịch chiết [3].
1.2.1. Các phương pháp chiết xuất capsaicinoid từ quả Ớt
Có rất nhiều phương pháp khác nhau được áp dụng để chiết xuất capsaicinoid
từ quả Ớt, có thể kể đến như chiết Soxhlet và hồi lưu [12], [41], chiết siêu âm [5], [38],
[39], [46], chiết dưới áp suất cao [10], chiết xuất bằng vi sóng [9], [65], chiết xuất
bằng dung môi siêu tới hạn [19].
Bảng 1.1. So sánh các phương pháp chiết

Ưu điểm

Phương

Nhược điểm

Hiệu suất

Ứng dụng

pháp
Chiết hồi
lưu

Đơn giản, dễ thao tác.

Tốn nhiều dung 92% [12]

Phòng thí

Có thể tái sử dụng dung

môi,

nghiệm và

môi thu hồi [3].

lượng [3].

năng

công
nghiệp

Chiết siêu
âm

Cải thiện độ tan của dược Thiết
liệu.

bị

tốn 4,48 mg/g

kém.

[5]

nghiệm và
công

Rút ngắn thời gian chiết Nhiệt độ tăng
[3].

Phòng thí

nghiệp

ảnh hưởng đến
độ bền của chất.

Chiết vi
sóng

Chất được hòa tan trực tiếp Thiết
vào dung môi nhờ vi sóng.

bị

tốn 4,516 mg/g Phòng thí

kém.

Rút ngắn thời gian chiết Nhiệt độ tăng
ảnh hưởng đến
7

[9]

nghiệm


[3].

độ bền của chất
[3].

Chiết dưới

Có thể dùng dung môi Thiết

áp suất cao truyền thống.

bị

tốn 4,484 mg/g Phòng thí

kém.

[10]

nghiệm

Rút ngắn thời gian chiết Nhiệt độ tăng
[3].

ảnh hưởng đến
độ bền của chất
[3].

Chiết bằng Chất ít bị tác động bởi Thiết
dung môi

nhiệt.

bị

tốn 6,403 mg/g Phòng thí

kém.

siêu tới

Tăng khả năng hòa tan và Làm việc ở điều

hạn

tính chọn lọc của dung kiện áp suất cao
môi.

[19]

nghiệm

[3].

Rút ngắn thời gian chiết.
Dễ tách dung môi khỏi sản
phẩm.
Dung môi rẻ tiền, không
độc [3].
Nói chung trong thực tế sản xuất vẫn ưu tiên sử dụng các phương pháp có trang
thiết bị rẻ tiền và có quy mô lớn như chiết siêu âm, chiết hồi lưu. Tuy nhiên phương
pháp chiết vi sóng cũng đang được phát triển có thể áp dụng được trong thực tế.
1.2.2. Các dung môi chiết xuất capsaicinoid từ quả Ớt
Bản chất của dung môi ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất chiết và hàm lượng
capsaicinoid. Dung môi phân cực hòa tan tốt các chất phân cực và ngược lại, dung môi
kém phân cực hòa tan các chất kém phân cực. Thành phần chủ yếu trong quả Ớt là
capsaicinoid là những chất kém phân cực. Khảo sát hàm lượng capsaicinoid khi chiết
bằng 3 dung môi có độ phân cực khác nhau: methanol, ethanol, nước thu được kết quả:

8


-

Chiết bằng methanol thu được hàm lượng capsaicinoid cao nhất trong 3 dung

môi. Trong các nồng độ khác nhau, methanol 100% cho hàm lượng cao nhất [11], [7].
-

Chiết bằng ethanol cũng thu được hàm lượng đáng kể capsaicinoid, không có

sự khác biệt về hàm lượng so với khi chiết bằng methanol [11], [7].
-

Chiết bằng nước hầu như không thu được sản phẩm [7].
Khảo sát chiết trên dược liệu khô bằng các dung môi kém phân cực, chiết bằng

ethanol cho hàm lượng thấp hơn không đáng kể so với aceton [16], cao hơn so với
acetonitril và ethyl acetat [9], chiết với acetonitril chỉ đạt 80% hàm lượng so với
ethanol [16].

1.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất.
1.3.1. Phương pháp thay đổi một yếu tố
Phương pháp thay đổi một yếu tố (One factor at a time – OFAT) dựa trên
nguyên tắc thay đổi giá trị của một thông số cần khảo sát trong khi giữ nguyên các
thông số khác ở điều kiện tối ưu đã được xác định từ các thí nghiệm trước đó. Việc so
sánh kết quả giữa các thí nghiệm có thể xác định trực tiếp liệu yếu tố khảo sát có thực
sự ảnh hưởng và ảnh hưởng như thế nào tới quy trình chiết xuất [24].

OFAT là phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
với nhiều ưu điểm như đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi đến các thuật toán thống
kê, đặc biệt rất hữu ích trong các trường hợp các biến khảo sát là độc lập, không có
tương tác với những biến còn lại [48].
Bên cạnh đó, OFAT cũng có một số nhược điểm. Thứ nhất, phương pháp này
đòi hỏi số lượng lớn thí nghiệm, đặc biệt là khi tăng số lượng các yếu tố khảo sát, đồng
thời thời gian và nguyên vật liệu cho quá trình khảo sát cũng lớn theo, điều này có ảnh
hưởng rất lớn khi nâng cấp quy mô công nghiệp, khi mà việc thực hiện thí nghiệm có
thể rất tốn kém và hạn chế thời gian.
Thứ hai, các thí nghiệm theo OFAT chỉ quan sát được từng yếu tố trong từng
thí nghiệm, rất khó để ước tính chính xác sự tương tác lẫn nhau giữa các yếu tố.
Thứ ba, điều kiện tối ưu bị giới hạn trong khoảng khảo sát. Đối với những yếu
tố có khoảng khảo sát rộng như nhiệt độ, thời gian, rất khó để chọn được khoảng tối
9


ưu nếu sử dụng OFAT. Ngược lại, nếu chọn khoảng khảo sát hẹp sẽ ảnh hưởng đến độ
biến thiên của các biến cũng như khả năng dự đoán điểm tối ưu [18].
1.3.2. Phương pháp bề mặt đáp ứng
Để khắc phục nhược điểm của phương pháp OFAT, một loạt phương pháp thiết
kế thí nghiệm dựa trên nguyên lý thống kê đã ra đời. Một trong số đó, phương pháp bề
mặt đáp ứng (Response surface methodology: RSM) được sử dụng nhiều nhất.
Phương pháp đáp ứng bề mặt (Response surface methodology: RSM) bao gồm
tập hợp một nhóm các kĩ thuật thống kê và toán học dựa trên sự phù hợp của mô hình
thực nghiệm để các dữ liệu thực nghiệm thu được liên quan đến thiết kế thí nghiệm,
nhằm cải thiện, tối ưu hóa một công thức hay quy trình [44], [51].
1.3.2.1. Một số thuật ngữ:
Biến đầu ra (output) còn gọi là biến phụ thuộc hay đáp ứng: là các kết quả của
thí nghiệm mà người làm thí nghiệm cần phải đo đạc và đánh giá.
Biến đầu vào (input) còn gọi là biến độc lập hay yếu tố: là những biến mà

người làm thí nghiệm có thể thay đổi giá trị của nó khi tiến hành thí nghiệm và sự thay
đổi này sẽ kéo theo sự thay đổi giá trị của biến đầu ra.
Mức yếu tố: mỗi mức yếu tố là một giá trị khảo sát của biến đầu vào.
Mô hình: là phương trình biểu diễn sự phụ thuộc của biến đầu ra vào một hoặc
nhiều biến đầu vào. Trong RSM thường sử dụng 3 loại mô hình chính: mô hình tuyến
tính, mô hình tương tác bậc 2 và mô hình bậc 2. Mô hình bậc 2 thường được sử dụng
phổ biến hơn cả. Trường hợp tổng quát của mô hình này có dạng:
𝑛

𝑌 = 𝛽0 + ∑ 𝛽𝑖 𝑋𝑖 +
𝑖=1

Trong đó:

𝑛

𝑛−1

∑ 𝛽𝑖𝑖 𝑋𝑖2
𝑖=1

+ ∑ ∑ 𝛽𝑖𝑗 𝑋𝑖 𝑋𝑗

Y là biến đầu ra
Xi, Xj là các biến đầu vào
βi, βj là các hệ số tương ứng

10

𝑛

𝑖=1 𝑗=𝑖+1


Hàm mục tiêu: Là một hàm số được lập ra trên cơ sở tiêu chuẩn tối ưu đã được
lựa chọn. Hàm mục tiêu thể hiện kết quả mà người thực hiện phải đạt được.
Tối ưu hóa: Tối ưu hoá một công thức hay quy trình là việc tìm công thức,
thông số (hay điều kiện tiến hành) của quy trình để sản phẩm làm ra đạt chất lượng tốt
nhất trong giới hạn mong muốn của người làm thí nghiệm [44], [51].
1.3.2.2. Các bước tối ưu hóa quy trình bằng RSM
Xác lập thông số: biến đầu vào
(input) và biến đầu ra (output)

Thiết kế thí nghiệm

Phân tích mô hình

Sàng lọc các biến số

Đánh giá mô hình

Mô hình có
tốt không?
Tốt

Tối ưu hóa

Xác minh tính khả thi

Hình 1.2. Sơ đồ phương pháp RSM để thiết kế thí nghiệm tối ưu [14]

Bước 1. Xác lập thông số: biến đầu vào (input) và biến đầu ra (output)
11


Giai đoạn này còn gọi là sàng lọc các biến số. Mục đích của giai đoạn này nhằm
phân tích ảnh hưởng của các biến đầu vào lên các biến đầu ra để loại bỏ các biến đầu
vào không hoặc ít ảnh hưởng, giữ lại các biến có ảnh hưởng lớn đến biến đầu ra nhằm
giảm bớt số lượng thí nghiệm.
Việc sàng lọc, lựa chọn biến đầu vào có thể căn cứ vào cơ sở lý thuyết, dữ liệu
đã phân tích, kinh nghiệm của người làm.
Bước 2. Thiết kế thí nghiệm
Thiết kế thí nghiệm là phương pháp lập kế hoạch và tiến hành thực nghiệm để
thu nhận được thông tin tối đa từ tập hợp các dữ liệu thí nghiệm trong sự có mặt của
nhiều yếu tố có thể làm biến đổi kết quả thí nghiệm với số thí nghiệm tối thiểu [44],
[60].
Phương pháp thiết kế thí nghiệm được Fisher đưa ra lần đầu tiên vào năm 1926,
sau đó được Box, Hunter, Scheffé, Tagushi và các tác giả khác phát triển và hoàn
thiện. Tính cho tới thời điểm hiện tại, đã có nhiều phương pháp thiết kế thí nghiệm
được đưa ra như mô hình phức hợp trung tâm (Central composite design - CCD),
Doehlert (DD), mô hình đầy đủ, mô hình đơn hình…[51]. Trong số đó, Box–Behnken
(BBD) là một trong những mô hình khá thông dụng và thường gặp.
BBD là kiểu thiết kế thí nghiệm thiết kế bằng cách chọn từng cặp yếu tố và đảo
lộn các mức với nhau. Mô hình BBD gồm 2 loại điểm: điểm thí nghiệm toàn phần và
điểm tâm:
-

Điểm thí nghiệm toàn phần: là các điểm của một thiết kế toàn phần hai mức,

được mã hóa -1 và 1. Các điểm này có vai trò đáng kể trong việc ước tính các thuật

ngữ tuyến tính và tương tác giữa hai yếu tố.
-

Điểm tâm: là điểm mà giá trị của tất cả các yếu tố được thiết lập ở mức không

(trung bình cộng của mức cao và mức thấp). Nó cung cấp thông tin về sự tồn tại của
độ cong trong mô hình, cho phép ước tính sai số và ước lượng thông số bậc hai trong
mô hình.
Thiết kế thí nghiệm theo mô hình BBD cho phép đánh giá đầy đủ và chính xác
vai trò của một yếu tố tới biến đầu ra với số lượng thí nghiệm phải thực hiện giảm đi
đáng kể so với các phương pháp khác. Trong mô hình BBD có k biến độc lập, số
12


lượng thí nghiệm phải thực hiện là N = 2k(k-1) + C0, với k là số thí nghiệm tiến hành
theo mô hình đầy đủ 2 mức (các biến đầu vào lần lượt nhận giá trị -1 hoặc 1), và C0 là
số thí nghiệm tại tâm (tất cả các biến đều bằng 0, C0 thường dao động từ 3 - 5) [44].
Bước 3. Phân tích và đánh giá mô hình
Sau khi có kết quả thực nghiệm, để tối ưu hóa cần phải xây dựng mối quan hệ
giữa các biến đầu ra và các biến đầu vào. Những mối quan hệ này cho phép dự đoán
giá trị của các biến đầu ra khi biết giá trị của các biến đầu vào mà không cần làm thêm
thí nghiệm. Công việc này khá phức tạp bởi vì không chỉ có những biến đầu vào được
đưa vào nghiên cứu mới ảnh hưởng đến giá trị của biến đầu ra mà còn nhiều yếu tố
khác ảnh hưởng mà người làm thí nghiệm không thể kiểm soát hết được.
Phương pháp hay được sử dụng nhất hiện nay đó là phương trình hồi quy đa
biến (dựa trên phương pháp bình phương tối thiểu từng phần). Sau khi mô tả được các
biến thông qua phương trình hồi quy, mô hình sẽ được đánh giá, kiểm tra dựa trên độ
phù hợp và khả năng dự đoán, được đặc trưng bằng các hệ số R2, R2hiệu chỉnh, R2dự đoán,
mức độ không tương thích.
Bước 4. Tối ưu hóa

Từ mô hình hồi quy đã xác định, sử dụng các phương pháp tối ưu hóa để xây
dựng nên hàm mục tiêu. Có rất nhiều phương pháp tối ưu hóa như phương pháp phân
tích mặt đáp, phương pháp thực nghiệm theo đường dốc nhất, tối ưu hóa quy trình
bằng thuật toán tiến hóa … [51]. Căn cứ vào mục đích thí nghiệm, các nghiên cứu
tương tự, khảo sát đã có để lựa chọn ra phương pháp tối ưu phù hợp nhất.
Sau khi đã có kết quả tối ưu, tiến hành đánh giá và phân tích kết quả. Nếu kết
quả phù hợp với mô hình, tiếp tục làm thí nghiệm theo giá trị tối ưu đã tìm được để
kiểm tra tính khả thi, có thể điều chỉnh nếu cần. Ngược lại, khi kết quả tối ưu không
phù hợp với mô hình, cần quay lại sàng lọc biến cũng như đặt lại vấn đề đã nêu.

13


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là mẫu Ớt Capsicum frutescens được lưu tại Sở Nông
nghiệp và Phát triển Nông thôn tại Quỳnh Phụ, Thái Bình. Thu mẫu vào tháng 1/2019.
Xử lý mẫu sau thu hái: quả Ớt (bao gồm phần quả và cuống) sau khi thu hái
được làm sạch, hong khô, sấy ở 50oC cho đến khi hàm ẩm <11% (Theo tiêu chuẩn
Dược điển Châu Âu [17]). Độ ẩm của dược liệu được xác định bằng phương pháp mất
khối lượng khi làm khô theo phụ lục 9.6 – Dược điển Việt Nam V [4] (Sấy bột dược
liệu ở 105oC trong 2 giờ). Xác định hàm lượng capsaicinoid toàn phần của dược liệu là
0,50%.
Xử lý dược liệu trước khi chiết: dược liệu được làm nhỏ bằng máy xay sinh tố,
rây qua rây 1000 µm, đồng nhất mẫu, bảo quản trong túi polyethylen, hút ẩm, để nơi
khô ráo, tránh ánh sáng.
2.1.2. Thuốc thử, dung môi, hóa chất
Chất chuẩn: Capsaicin (C18H27NO3) do hãng Sigma – Aldrich sản xuất, số kiểm
soát PHR1450, số lô LRAA9221, hàm lượng 61,1%.

Dung môi, hóa chất:
-

Acetonitril (99,9% CH3CN, Fisher scientific Korea Ltd., Hàn Quốc), methanol
(99,9% CH3OH, Merck, Đức) đạt tiêu chuẩn sử dụng cho HPLC.

-

Methanol, ethanol, acid phosphoric đạt tiêu chuẩn phân tích.

2.1.3. Phương tiện và máy móc
Cân kỹ thuật Sartorius độ chính xác 0,01 g
Cân phân tích 10_4 AND, GR200, độ chính xác 0,1 mg
Tủ sấy Memmert
Bể siêu âm Daihan Scientific WUC – A10H

14


Bộ cất quay chân không R200 Butchi
Máy cất quay Butchi
Cân xác định hàm ẩm Ohaus MB – 25
Bếp cách thủy Memmert
Dụng cụ thủy tinh: bình nón, bình định mức (25, 50, 100 ml), cốc có mỏ, pipet
(1, 5, 10, 25 ml)...
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
-

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản) bao gồm bơm LC-20AD,

detector DAD SPD-M20A, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20C, bộ phận điều nhiệt
CTO-20A.
-

Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao: cột XBridgeTM phenysilyl silica gel (250 mm x

4,6 mm; 5 µm).

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng
Các bước tiến hành nghiên cứu tuân theo trật tự như sau:
2.2.1.1. Lựa chọn dung môi chiết và nồng độ ethanol
Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu chọn ethanol làm dung môi chiết do
hàm lượng capsaicinoid thu được thấp hơn không đáng kể so với methanol [11], đồng
thời đây còn là dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, ít độc hơn so với các dung môi khác, có thể
sử dụng ở phòng thí nghiệm cũng như trong quy mô công nghiệp [3]. Do đó, khảo sát
chiết ở các nồng độ ethanol khác nhau được lựa chọn trong nghiên cứu này.
Khảo sát chiết bằng ethanol ở các nồng độ 80%, 90%, 100%, nồng độ 90% cho
hàm lượng capsaicinoid cao nhất [10], [11]. Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn chiết tại
ethanol 95% cho các thí nghiệm khảo sát và chọn khoảng nồng độ 75%, 85%, 95% để
đưa vào mô hình RSM.

15


2.2.1.2. Lựa chọn phương pháp chiết
Như đã phân tích ở trên, có rất nhiều phương pháp để chiết xuất capsaicinoid từ
quả Ớt từ các phương pháp cổ điển cho đến các phương pháp hiện đại. Tùy thuộc vào
mục đích nghiên cứu, đặc điểm của dược liệu, điều kiện trang thiết bị sẵn có mà lựa
chọn các phương pháp chiết phù hợp. Kế thừa kết quả nghiên cứu của Boonkird và các

cộng sự cho thấy chiết hồi lưu ở 78oC trong 5 giờ, tỉ lệ dung môi: dược liệu là 8:1 cho
hiệu suất chiết cao nhất đạt 92%, cao hơn so với chiết ngâm và chiết siêu âm [12]. Do
đó, trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết hồi lưu, do
thao tác đơn giản, chi phí đầu tư thấp, dự đoán hiệu suất thu được cao.
2.2.1.3. Lựa chọn kích thước dược liệu
Đối với yếu tố kích thước dược liệu: dược liệu càng được chia nhỏ càng làm
tăng diện tích tiếp xúc pha, tăng tỉ lệ tế bào bị phá vỡ, giúp giảm thời gian chiết xuất.
Tuy nhiên, kích thước dược liệu quá nhỏ trong quá trình chiết dễ tạo ra nhiều tạp khó
lọc, khó tinh chế dịch chiết, dễ thất thoát dược liệu. Theo nghiên cứu của Boonkird
[12], dược liệu được xay nhỏ ở kích thước 3 mm để tránh tắc giấy lọc khi lọc. Tuy
nhiên, capsaicinoid chứa trong cả phần thịt và hạt của quả Ớt [16], trong khi kích
thước hạt Ớt từ 2 – 3 mm, do đó nhóm nghiên cứu lựa chọn kích thước dược liệu
khoảng 1 mm để đảm bảo hạt Ớt được làm nhỏ. Để tránh hiện tượng tắc giấy lọc, để
lắng dịch lọc 24 giờ giúp lắng các chất nhầy, giảm bớt thời gian lọc.
2.2.1.4. Khảo sát nhiệt độ chiết
Nhiệt độ tăng giúp làm giảm độ nhớt và sức căng bề mặt dung môi, tăng độ tan
và tốc độ khuếch tán hoạt chất, từ đó giúp quá trình chiết xuất diễn ra nhanh hơn, đồng
thời giúp tăng hiệu suất quá trình chiết. Tuy nhiên, nhiệt độ quá cao có thể ảnh hưởng
đến các chất kém bền với nhiệt, hoặc tăng độ tan của tạp chất. Khảo sát nhiệt độ từ 10
– 80oC khi chiết với methanol, hàm lượng capsaicinoid toàn phần tăng dần từ 30 –
60oC, từ 60 – 80oC hầu như không thay đổi hàm lượng [7], [12], [40]. Do vậy nhóm
nghiên cứu lựa chọn khảo sát nhiệt độ chiết tại 80oC cho các thí nghiệm tiếp theo và
chọn khoảng nhiệt độ khảo sát là 40oC, 60oC, 80oC, 96oC (96oC là mức nhiệt độ cao
nhất của bếp cách thủy).

16


Cách tiến hành: cân khoảng 10 g dược liệu, chiết bằng 40 ml ethanol 95% trong
2 giờ, chiết 2 lần ở các mức nhiệt độ 40, 60, 80, 96oC.

2.2.1.5. Khảo sát thời gian chiết
Thời gian chiết ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất chiết cũng như chất lượng
dịch chiết. Hoạt chất thường có khối lượng phân tử nhỏ hơn tạp chất, khuếch tán và
đạt cân bằng chiết sớm hơn tạp chất, do đó nếu chiết trong thời gian dài, tỉ lệ hoạt chất
không tăng mà tỉ lệ tạp sẽ tăng. Capsaicin là một chất kém bền với nhiệt, do đó thời
gian chiết không nên kéo dài quá lâu. Nhóm nghiên cứu lựa chọn khảo sát thời gian
chiết tại 2 giờ cho các thí nghiệm tiếp theo và chọn khoảng thời gian khảo sát là 1 giờ,
2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ.
Cách tiến hành: cân khoảng 10 g dược liệu, chiết bằng 40 ml ethanol 95% ở
80oC, chiết 1 lần ở các khoảng thời gian 1, 2, 3, 4, 5 giờ.
2.2.1.6. Khảo sát tỉ lệ dung môi: dược liệu
Dùng ít dung môi sẽ chiết được ít hoạt chất, tăng lượng dung môi giúp tăng
hiệu suất chiết. Tuy nhiên, dùng quá nhiều dung môi có thể dẫn đến dịch chiết loãng,
lẫn nhiều tạp chất, hao phí dung môi, tốn thời gian thu hồi. Khảo sát tỉ lệ dung môi:
dược liệu cho thấy, tỉ lệ 8:1 khi chiết Soxhlet 5giờ ở 78oC cho hiệu suất cao nhất. Khi
chiết siêu âm 3 giờ ở các tỉ lệ 4:1, 6:1, 8:1, tỉ lệ 4:1 và 6:1 không có sự khác biệt về
hiệu suất, tỉ lệ 8:1 cho hiệu suất chiết cao nhất [7]. Do đó để tiết kiệm dung môi, nhóm
nghiên cứu lựa chọn khảo sát tỉ lệ dung môi: dược liệu là 4:1 cho các thí nghiệm tiếp
theo và chọn khoảng tỉ lệ khảo sát là 4:1, 6:1, 8:1, 10:1.
Cách tiến hành: cân khoảng 10 g dược liệu, chiết bằng ethanol 95% ở 80oC,
chiết 2 lần ở các mức tỉ lệ dung môi: dược liệu là 4:1, 6:1, 8:1, 10:1.
2.2.1.7. Khảo sát số lần chiết
Theo nghiên cứu của Barbero, hàm lượng capsaicinoid thu được khi chiết 3 lần
nhiều hơn không đáng kể so với chiết 1 lần và 2 lần do capsaicin chủ yếu thu được ở
dịch chiết đầu tiên [10]. Nhóm nghiên cứu lựa chọn số lần chiết là 2 cho các thí
nghiệm tiếp theo và chọn khoảng khảo sát số lần chiết là 1 lần, 2 lần, 3 lần.

17