Khảo sát điều chế và một số chỉ tiêu chất lượng cao khô Hà thủ ô đỏ chế bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
--------

SENGKHAM CHOUMLIVONG

KHẢO SÁT ĐIỀU CHẾ VÀ MỘT SỐ CHỈ
TIÊU CHẤT LƯỢNG CAO KHÔ HÀ THỦ
Ô ĐỎ CHẾ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC
Ký LỚP MỎNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
--------

SENGKHAM CHOULIVONG
MÃ SINH VIÊN: 1401062

KHẢO SÁT ĐIỀU CHẾ VÀ MỘT SỐ CHỈ
TIÊU CHẤT LƯỢNG CAO KHÔ HÀ THỦ
Ô ĐỎ CHẾ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC
Ký LỚP MỎNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Phạm Thái Hà Văn
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược học cổ truyền –

Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình làm khóa luận tốt nghiệp em đã nhận được nhiều sự
giúp đỡ từ gia đình thầy cô, bạn bè .Đầu tiên, em xin dành lời cảm ơn sâu sắc
tới Đảng và Chính phủ nước Cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào và Cộng hòa
xã hội chủ nghĩa Việt Nam đã tạo điều kiện cho em được học tập và có điều
kiện tham gia nghiên cứu khoa học, thực hiện đề tài này trong suốt thời gian
vừa qua.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Phạm Thái Hà Văn, người
thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất và trực tiếp giúp đỡ em trong
suốt thời gian làm khóa luận này.
Em cũng xin gửi đến Bộ môn Dược học cổ truyền sự biết ơn vì đã cho em
cơ hội được học dược thực tập và hoàn thành khóa luận tại bộ môn.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thân yêu nhất trong gia
đình như Bố Mẹ, cảm ơn bạn bè – những người luôn sát cánh, động viên, giúp
đỡ trong thời gian học tập cũng như làm khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Sengkham CHOUMLIVONG


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 3
1.1. Hà thủ ô đỏ .................................................................................................. 3
1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật cây Hà thủ ô đỏ ......................... 3
1.1.2. Bộ phận dùng và cách chế biến ............................................................ 5
1.1.3. Thành phần hóa học .............................................................................. 6
1.1.4. Tác dụng dược lý và công dụng ............................................................ 8
1.2. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng kết hợp quét hình ảnh (TLC-videoscan)........... 9
1.2.1. Nguyên tắc ............................................................................................ 9
1.2.2. Các đại lượng đặc trưng ........................................................................ 9
1.2.3. Ứng dụng trong phân tích thành phần hóa học trong cao chiết Hà thủ ô
đỏ ................................................................................................................... 10
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 12
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu ......................................................... 12
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ...................................................................... 12
2.1.2. Thiết bị và hóa chất ............................................................................. 12
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 13
2.3. Phương pháp nghiên cứu........................................................................... 13
2.3.1. Phương pháp điều chế cao khô Hà thủ ô đỏ ....................................... 13
2.3.2. Phương pháp định tính ........................................................................ 14
2.3.3. Phương pháp bán định lượng emodin trong cao khô Hà thủ ô đỏ ..... 16
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................... 20
3.1. Hiệu suất và một số chỉ tiêu cảm quan cao khô Hà thủ ô đỏ .................... 20
3.1.1. Các chỉ tiêu về cảm quan: ................................................................... 20


3.1.2. Hiệu suất điều chế cao khô Hà thủ ô đỏ. ............................................ 20
3.2. Kết quả định tính các chất có trong dược liệu Hà thủ ô đỏ ở các điều kiện

chiết xuất khác nhau ......................................................................................... 23
3.3. Thẩm định phương pháp định lượng......................................................... 25
3.3.1. Kết quả khảo sát độ thích hợp hệ thống.............................................. 25
3.3.2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của emodin ................................ 26
3.3.3. Độ lặp lại ............................................................................................. 28
3.4. Kết quả định lượng emodin trong cao Hà thủ ô đỏ................................... 29
3.5. Kết quả tách các chất có trong mẫu cao .................................................... 29
BÀN LUẬN ........................................................................................................ 32
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................................ 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 1


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DL: Dược liệu
DM: Dung môi
EtOH: Ethanol
HPTLC: High Performance Thin Layer Chromatography
MeOH: Methanol
MS: Mẫu sống
NH3: Amoniac
SKLM: Sắc ký lớp mỏng
TLC: Thin Layer Chromatography


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần hóa học đã được xác định trong dược liệu Hà thủ ô đỏ......... 6
Bảng 2.1. Hoá chất, dung môi .................................................................................. 12
Bảng 2.2. Thiết kế thí nghiệm khảo sát ở quy trình chiết xuất ................................ 14
Bảng 2.3. Thể tích các vết chấm mẫu định tính ....................................................... 15

Bảng 2.4. Thể tích các vết chấm mẫu bán định lượng ............................................ 16
Bảng 3.1. Kết quả chỉ tiêu cảm quan của các mẫu cao khô Hà thủ ô đỏ ................. 20
Bảng 3.2. Hiệu suất quy trình điều chế cao khô Hà thủ ô đỏ với các điều kiện
chiết xuất khác nhau (%) .......................................................................................... 21
Bảng 3.3. Chỉ tiêu hàm ẩm cao Hà thủ ô đỏ ............................................................ 22
Bảng 3.4. Thứ tự các vết trên bản mỏng định tính................................................... 23
Bảng 3.5. Kết quả định tính các pic sắc ký trong 10 mẫu cao chiết ........................ 24
Bảng 3.6. Nồng độ emodin chuẩn và diện tích pic đáp ứng .................................... 26
Bảng 3.7.Kết quả bán định lượng emodin trong các mẫu cao Hà thủ đỏ ................ 29


DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Đặc điểm thực vật loài Hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunb) .............. 4
Hình 3.1. Cao khô Hà thủ ô đỏ sau khi điều chế...................................................... 20
Đồ thị 3.1.Hiệu suất điều chế cao khô Hà thủ ô đỏ ở các điều kiện khác nhau. ...... 21
Hình 3.2. Sắc ký đồ định tính các mẫu cao chiết Hà thủ ô đỏ ở bước sóng 366
nm ............................................................................................................................. 23
Hình 3.3. Sắc ký đồ khảo sát độ thích hợp hệ thống................................................ 25
Hình 3.4 Kết quả xây dựng đường chuẩn từ dãy nồng độ khảo sát ......................... 26
Hình 3.5.. Hình ảnh sắc ký đồ khảo sát nồng độ tuyến tính của emodin ................. 27
Hình 3.6 Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại…………………………………………28
Hình 3.7. Sắc ký đồ tách các chất trong mẫu M4 trên bản mỏng ở 254 nm ............ 30
Hình 3.8. Sắc ký đồ tách các chất trong mẫu M4 trên bản mỏng ở 366 nm ............ 30


ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ thời xa xưa, ông cha ta đã có câu:
“Muốn cho xanh tóc, đỏ da
Rủ nhau lên núi, hái hà thủ ô”

Câu ca dao này đã nói lên được một phần nào đó công dụng tuyệt vời của hà
thủ ô trong việc điều hoà khí huyết, bổ thần kinh, giúp đen tóc đẹp da, duy trì nét
thanh xuân cho con người. Hà thủ ô đỏ được xem như là một trong những thảo
dược quý giá của Đông y với nhiều tên gọi khác nhau như dạ hợp, dạ giao đằng,...
Bộ phận dùng của cây là phần rễ củ, có tác dụng bổ máu, trị di tinh, đới hạ, thần
kinh suy nhược, sốt rét, bổ gan thận, đen râu tóc,... Bộ phận trên mặt đất có tác
dụng dưỡng tâm an thần, dưỡng huyết hoạt lạc,....
Trong dân gian, người ta thường sử dụng Hà thủ ô đỏ dưới dạng chế, phương
pháp truyền thống và cũng được ghi trong nhiều tài liệu cổ truyền chính thống như
Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Cây cỏ Việt Nam,... Vị thuốc Hà thủ ô đỏ
có thể được chế biến bằng cách ngâm với nước vo gạo rồi nấu với nước đậu đen.
Ngoài ra, còn nhiều phương pháp chế biến khác nhau cũng đã được nghiên cứu. Để
đánh giá chất lượng sản phẩm cao khô Hà thủ ô đỏ sau chế biến, cần thiết phải thực
hiện chiết xuất và định lượng các thành phần quan trọng của sản phẩm sau khi chế
biến.
Sắc ký lớp mỏng là một trong những phương pháp phân tích khá đơn giản và
hiệu quả, nhất là trong phân tích dược liệu. Ngày nay, nhờ các thiết bị máy móc
hiện đại, phương pháp sắc ký lớp mỏng ngày càng hiệu quả khi điều kiện chạy sắc
ký được chuẩn hóa. Trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu
“Khảo sát điều chế và một số chỉ tiêu chất lượng cao khô hà thủ ô đỏ chế bằng
phương pháp sắc ký lớp mỏng ” với 2 mục tiêu chính như sau:
(i). Điều chế được cao khô Hà thủ ô đỏ chế
1


(ii). Khảo sát định tính và bán định lượng emodin trong cao khô Hà thủ ô đỏ chế
với các phương pháp sử dụng dung môi chiết khác nhau bằng phương pháp sắc
ký lớp mỏng.

2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Hà thủ ô đỏ
1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật cây Hà thủ ô đỏ

1.1.1.1. Vị trí phân loại
Cây Hà thủ ô đỏ hay còn gọi là thủ ô, giao đằng, dạ hợp, địa tinh, khua lình
(Thái), mãn đăng tua lình (Lào – Sầm Nưa), mần đăng ón (Thổ) [15].
Tên khoa học là Fallopia multiflora Thunb.
Tên đồng nghĩa: Reynoutria multiflora (Thunb.) Moldenke., Polygonum
multiflorum (Thunb.) Haraldson, Fallopia multiflora (Thunb.) Czerep [26].
Hà thủ ô đỏ được phân loại thực vật học như sau:
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Ngọc lan (Magnoliidae)
Họ Rau răm (Polygonaceae)
Chi Fallopia
Loài Fallopia multiflora (Thunberg) Haraldson
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật
Dây leo bằng thân quấn, sống lâu năm. Thân mềm, nhẵn, mọc xoắn vào nhau;
dài 2 - 4 m, gốc hóa gỗ; phân nhánh nhiều, nhánh vuông hoặc tròn. Rễ phình to
thành củ, vỏ màu nâu đen, củ nguyên có hình giống củ khoai lang. Mặt ngoài thân
có màu xanh tía, có những vân hoặc bì khổng, mặt thân nhẵn, không có lông. Lá
mọc cách, so le, có cuống dài, phủ lông, bẹ chìa mỏng màu nâu nhạt, dài 3-5 mm.
Phiến lá hình tim hẹp dài 4-8 cm, rộng 2,5 - 5 cm [7], hoặc hình trứng cỡ
3-7 x 2-5 cm [4], mũi nhọn ở đỉnh, đầu lá hình tim, hoặc hình mũi tên, mép nguyên
hoặc hơi lượn sóng, cả hai mặt đều nhẵn và không có lông. Lá kèm mỏng, màu nâu
nhạt ôm lấy thân.

3


Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùy phân nhánh, dài hơn lá; lá bắc
ngắn;hoa nhỏ nhiều, màu trắng, nhị 8 với 3 nhị hơi dài hơn, thường dính vào gốc
của bao hoa.Mùa hoa: Tháng 9 – 11 [3].
Quả bế, màu nâu đen, hình chop có 3 góc nhẵn bóng nằm trong bao hoa mà 3
mảnh ngoài còn lại phát triển thành cánh rộng. Mùa quả: Tháng12 – 2 [3], [4], [7]
[8].

Hình 1.1. Đặc điểm thực vật loài Hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora
(Thunb)
1.1.1.3. Phân bố
Hà thủ ô đỏ phân bố rộng rãi ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới. Trên thế giới,
Hà thủ ô đỏ có ở Trung Quốc, miền Bắc của Lào ( Sầm Nưa), Nhật Bản và Ấn Độ.
Ở Việt Nam,Hà thủ ô đỏ chỉ có ở một số tỉnh vùng núi cao (trên 1000 m) phía bắc.
Cây mọc nhiềuở Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La. Các tỉnh khác ít gặp hơn
như Hòa Bình(Mai Châu, Đà Bắc); Thanh Hóa (Son Bá Mười); Nghệ An (Kỳ Sơn);
Lạng Sơn(núi Mẫu Sơn); Cao Bằng (Bảo Lạc); Yên Bái (Mù Cang Chải).. Cây
thường gặp dưới tán cây bụi, trong các rừng thưa ven suối hay ven đường râm mát
ở chân núi, khe đá. Một số nơi cũng trồng nhỏ lẻ phục vụ nhu cầu nhân dân ở một

4


số tỉnh Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Phú Yên, Bình Định,...[3], [4],
[7].
Năm 2017, Phạm Thanh Huyền và Nguyễn Thị Hà Ly tiến hành nghiên cứu
Điều tra phân bố và đánh giá chất lượng nguồn gen hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora
(Thunb.) Haraldson) tại 8 tỉnh và thành phố ở Việt Nam đã xác định được một số

điểm tập trung của Hà thủ ô đỏ là các xã thuộc 3 tỉnh Lào Cai (xã Bản Xèo, huyện
Bát Xát; xã Sa Pả, xã Tả Phìn, huyện Sa Pa); tỉnh Hà Giang (xã Phó Bảng huyện
Đồng Văn, huyện Xín Mần, xã Quyết Tiến huyện Quản Bạ); tỉnh Sơn La (xã Loong
Hẹ, xã Co Mạ, huyện Thuận Châu) [13].
Sách đỏ Việt Nam (2007) đã phân hạng loài Hà thủ ô đỏ (F. multiflora
(Thunb.) Haraldson) vào phân hạng VU A1c,d với mức đánh giá là “sẽ nguy cấp”
(V) [4]
1.1.2. Bộ phận dùng và cách chế biến

1.1.2.1. Bộ phận dùng
Bộ phận dùng là rễ củ phơi khô của cây Hà thủ ô đỏ.Dược liệu là rễ củ phơi
hay sấy khô của cây Hà thủ ô đỏ (F. multiflora (Thunb.) Haraldson Syn.
Polygonum multiflorum (Thunb.)), họ Rau răm (Polygonaceae), được mô tả như
sau: rễ củ tròn hoặc hình thoi, không đều, củ nhỏ để nguyên, dài 6 cm đến 15 cm,
đường kính 4 cm đến 12 cm; củ to bổ đôi theo chiều dọc, hay chặt thành từng
miếng to. Mặt ngoài màu nâu đỏ, có những chỗ lồi lõm do các nếp nhăn ăn sâu tạo
thành. Chất chắc, khó bẻ. Mặt cắt ngang có lớp bần mỏng màu nâu sẫm, mô mềm
vỏ màu đỏ hồng, có nhiều bột, ở giữa có ít lõi gỗ. Mùi nhẹ,vị hơi ngọt, hơi đắng và
chát [6].
1.1.2.2. Chế biến
Rễ củ to, đường kính trên 6 cm, vỏ nâu sẫm, cứng chắc, nhiều bột, ít xơ. Mùa
thu hoạch vào tháng 8. Đào củ về, rửa sạch, cắt bỏ rễ con, củ nhỏ để nguyên, củ to
bổ đôi, phơi hay sấy khô tới độ ẩm dưới 13%. Hà thủ ô được chế như sau: rửa sạch
củ, ngâm nước vo gạo 1 ngày 1 đêm, sau đó rửa lại. Đổ nước đậu đen cho ngập (cứ
5


1 kg Hà thủ ô cần 100 g đậu đen, 2 lít nước, nấu đến khi đậu đen nhừ nát), nấu đến
khi gần cạn, cần đảo luôn cho chín đều. Khi củ đã mềm, lấy ra, bỏ lõi (nếu có).
Thái hoặc cạo mỏng rồi phơi khô. Nếu còn nước đậu đen thì tẩm phơi cho hết. Nếu

đồ, phơi 9 lần (cửu chưng cửu sái) thì càng tốt. Khi đun nên đặt vỉ ở đáy nồi cho
khỏi cháy dược liệu. [7].
1.1.3. Thành phần hóa học

Về thành phần hóa học, các nhóm hoạt chất chính đã được xác định có trong
Hà thủ ô đỏ bao gồm: anthranoid, flavonoid, stilben, protid, lipid, tinh bột, các chất
vô cơ, các chất tan trong nước khác và lexithin. Trong đó các thành phần chính là
anthranoid chiếm 1,7%, trong đó có emodin, chrysophanol, rhein, physcion , protid
chiếm 1,1%, tinh bột 45,2%, lipid 3,1%, 4,5% chất vô cơ, và 26,4% các chất tan
trong nước.Trong đó, nhiều hoạt chất đã được phân lập và xác định cấu trúc thuộc
các nhóm stilben, anthranoid (cụ thể là các anthraquinon), và các flavonoid [19],
[21], [16], [24]. Các nghiên cứu về Hà thủ ô đỏ Nhật Bản ghi chép bởi Đỗ Tất Lợi
chỉ ra trong rễ củ có các hoạt chất bao gồm: anthranoid (1,7%) trong đó chủ yếu là
chrysophanol, emodin và rhein. Ngoài ra, còn có chất đạm (1,1%), tinh bột
(45,2%), chất béo (3,10%), chất vô cơ (4,5%), các chất tan trong nước (26,4%),
lexitin. Nhóm anthranoid có tác dụng bổ máu,điều trị tóc bạc sớm,kích thích nhu
động ruột, trị đau lưng, mỏi gối,chống lại tế bào ung thư…[3],[7].
Nghiên cứu của Lin 2015 thống kê các hoạt chất đã được phân lập và xác
định cấu trúc trong Hà thủ ô đỏ, các hợp chất được thống kê trong Bảng 1.1[21]
Bảng 1.1. Thành phần hóa học đã được xác định trong dược liệu Hà thủ ô đỏ

STT

1

Nhóm hoạt
chất
Stilbene

Số lượng

chất đã xác

Một số hoạt chất điển hình

định được
21

2,3,5,40-tetrahydroxystilbene - 2 - O - β D

6

glucopyranosid,

Polydatin,


Resveratrol, Rhaponticoside, Cis - 2, 3, 5,
4 - tetrahydroxystilbene - 2- O - β - D glucoyranoside, Polygonumosides A, B,
C, D...
2

Quinon

20

Emodin,

Aloe-emodin,

Physcion,

Chrysophanol,

Rhein,

Citreorosein,

Citreorosein - 8 - methyl ether, Fallacinol,
2 - acetylemodin, Physcion - 8 - O - β - D
- glucopyranoside, Chrysophanol - 8 - O β - D - glucopyranoside, 6-methoxyl - 2 acetyl

–

3

-

methyl

-

1,4

–

naphthoquinone – 8 -O – β – D glucopyranoside, 2 – Methoxy – 6 acethyl – 7 – methyliuglone
3

Flavonoid

10

Tricin,

Rutin,

Kaempferol,
Hyperoside,

Luteolin,

Quercetin,

Isoorientin,

Apigenin,

Vitexin,

Quercetin-3-O-

arabinoside, Polygonflavanol A
4

Phospholipid

14

Phosphatidyl

ethanolamine,

Copaene,

Eicosane, Hexanoic, Hexadecanoic acid
methyl ester, Hexadecanoic acid ethyl
ester, Octadecanoic acid methyl ester ,
Octadecanoic acid ethyl, Ethyl oleate,
Squalen…
5

Các hợp chất
khác

34

Catechin,

Epicatechin,

Acid

gallic,

Methyl galate, Daucosterol, β-sitosterol,
…
7


1.1.4. Tác dụng dược lý và công dụng

Hà thủ ô đỏ có những tác dụng dược lý như: hiệu quả chống lão hóa, hiệu ứng
miễn dịch, do có chứa lecithin, nên có thể dùng trong điều trị suy nhược thần kinh
và bệnh về thần kinh, giúp sinh huyết dịch, bổ tim, giúp cải thiện chuyển hóa
chung, do có chứa anthraglycosid nên kích thích co bóp ruột, kích thích tiêu hóa,
cải thiện dinh dưỡng tác dụng chống tăng mỡ máu, tác dụng bảo vệ gan, tác dụng
chống lại tế bào ung thư , tác dụng chống viêm chống co thắt phế quản, sống lâu,
làm đen râu tóc và nhiều tác dụng khác [3], [10], [15], [21], [23], [25] .
Về công dụng, Trong y học cổ truyền Trung Quốc Hà thủ ô đỏ sống tươi và
khô có tác dụng thông tiểu, giải độc, tiêu ung thũng, chữa táo bón cho phụ nữ sau
khi đẻ hoặc người già, mụn nhọt, ghẻ lở, eczema. Có thể phối hợp với Hạ khô thảo,
Kim ngân hoa,Hà thủ ô đỏ chế có tác dụng bổ gan thận, ích tinh huyết, dùng làm
thuốc an thần, bổ và táng lực trong các chứng thân thể suy yếu, hoa mắt, chóng
mặt, tim hồi hộp, nhức đầu, mất ngủ, suy nhược thần kinh, còi xương, bệnh tạng rỉ
dịch và để hồi phục sức khỏe cho người già sau khi bị bệnh (phối hợp với Sinh địa,
Bạch thược, Cúc hoa), kích thích tạo hồng cầu và bạch cầu trong các bệnh về máu
và thiếu máu. Còn dùng chữa đau mỏi chân tay, di tinh (phối hợp với Đương quy,
Ngưu tất, Kỷ tử, Thỏ ty tử), chữa sốt rét lâu ngày, khí huyết suy nhược (phối hợp
với Nhân sâm, Đương quy, Trần bì), giải nhiệt và lợi tiểu và làm chất sàn trong
điều trị phối hợp chữa ỉa chảy [3].
Ở Ấn Độ, rễ Hà thủ ô đỏ được dùng làm thuốc bổ, chống bệnh scorbut và làm
đen tóc. Nó còn có tác dụng với bệnh tăng đường máu [3].
Đỗ Tất Lợi viết về vị thuốc Hà thủ ô với các công dụng chính làm thuốc bổ, trị
thần kinh suy nhược, các bệnh về thần kinh, ích huyết khỏe gân cốt, sống lâu, làm
đen râu tóc [7].
Phạm Hoàng Hộ trong Cây cỏ Việt Nam có ghi công dụng Hà thủ ô đỏ như
sau: Củ ăn được, bổ, trị liệt dương, làm giảm cholesterol và glucose/máu;
8

trấn thống, an thần, giúp ngủ; trị sốt; trị huyết bạch, có kinh khó, giảm đau, trị
đau đầu gối, trị bướu, chống vi khuẩn thủy bào chẩn [12].
1.2. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng kết hợp quét hình ảnh (TLC-videoscan)
1.2.1. Nguyên tắc

Quá trình tách hỗn hợp các chất bằng TLC xảy ra khi pha động chuyển động
qua pha tĩnh. Trong TLC pha tĩnh được rửa một lớp mỏng lên giá đỡ phẳng . Dưới
tác dụng của lực mao quan, pha động thấm theo lớp mỏng đi qua điểm xuất phátnơi hỗn hợp các chất cần phân tích đã được đưa lên bản mỏng .trong quá trình di
chuyển của pha động qua lóp mỏng chất hấp phụ (pha tĩnh) nhờ các quá trình hấp
phụ và giải hấp phụ được lặp đi lặp lại và do hệ số phân bố khác nhau mà những
chất khác nhau di chuyển theo hướng chuyển động của pha động với các tốc độ
khác nhau. Kết quả là mỗi chất trong hỗn hợp phân tích có thể sẽ được tách riêng
ra ở các vị trí khác nhau trên bảng mỏng. Tách bằng sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật
tách các chất được tiến hành trên một lớp mỏng bao gồm các hạt có kích thước
đồng nhất, một được kết dính trên giá đỡ bằng thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo. Lớp
mỏng kết dính là pha tĩnh. Các hạt trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ
chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion,… Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích
được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi lực mao
dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong
dung dịch [1] .
1.2.2. Các đại lượng đặc trưng

- Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ
số lưu giữ Rf. Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất
phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:
Rf = 𝑑𝑅⁄𝑑𝑀
Trong đó:
dR: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm).
9

dM: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên
cùng đường đi của vết, tính bằng cm).
Rf có giá trị dao động từ 0 đến 1.
- Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10 – 30 µm, được rải đều và kết dính
thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ hình vuông. Bản mỏng
có sẵn trên thị trường có kích thước khác nhau thường 5 – 20 cm, nhiều khi có
thêm các chất phát huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất phân
tích [1]. Chất hấp phụ thường dùng nhất là các loại silica gel (>90%) rồi đến nhôm
oxyd (<5%). Các loại khác (than hoạt, Polyamid, Florisil, Celite, Kieselguhr)…ít
được sử dụng [6].
- Pha động cho TLC rất thay đổi, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký. Để tăng cường
rửa giải, thường kết hợp 2 dung môi. Nguyên lý chia tách dựa vào hệ số phân bố
giữa 2 pha. Tuy nhiên, lựa chọn tối ưu hóa sắc ký thường chủ yếu dựa vào kinh
nghiệm. Sức rửa giải của dung môi trong sắc ký lỏng hấp phụ hoàn toàn có thể sử
dụng cho TLC với pha tĩnh là silica hoặc alumina.
1.2.3. Ứng dụng trong phân tích thành phần hóa học trong cao chiết Hà thủ ô đỏ

1.2.3.1. Định tính
Dựa vào sự xuất hiện hay không của các vết chất trên sắc ký đồ, người ta có thể
xác định được sự có mặt hay không của một chất trong mẫu sắc ký (mẫu sắc ký có
thể là dịch chiết toàn bộ hay bộ phận cây nào đó), từ đó kết luận sự có mặt hay
không có mặt chất đó trong cây. Mẫu đối chiếu có thể là chất chuẩn hay dược liệu
chuẩn. Với chất chuẩn, điều kiện xác định là trong mẫu thử phải xuất hiện vết trên
sắc ký đồ có cùng Rf và màu sắc với chất chuẩn. Với dược liệu chuẩn, điều kiện
xác định là mẫu thử phải xuất hiện các vết có cùng Rf và màu sắc với các vết trong
mẫu dược liệu chuẩn.
1.2.3.2. Thiết lập dấu vân tay sắc ký
Trong cùng một chi hay một loài, dựa vào TLC/HPTLC, người ta có thể tìm ra
các vết đặc trưng của chi hay loài đó bằng cách phân tích các mẫu khác nhau

10


của các loài trong chi trên cùng một bản mỏng ở cùng điều kiện để tìm ra các
vết đặc trưng chung của chi đó và đặc trưng riêng của từng loài. Vân tay sắc ký của
một loài là tập hợp các vết luôn luôn có mặt trong sắc ký đồ của loài đó ở điều kiện
sắc ký xác định, nó đặc trưng cho loài và được dùng để xác định loài.
1.2.3.3. Bán định lượng
Bằng cách phân tích các mẫu cần nghiên cứu và các mẫu chất chuẩn/chất đối
chiếu đã biết trước hàm lượng trên cùng một bản mỏng, sau đó khai triển trong
cùng điều kiện, người ta có thể bán định lượng được hàm lượng một chất có trong
mẫu nghiên cứu nhờ hệ thống phân tích chính xác và phần mềm xử lý dữ liệu
videoscan.

11


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu

Rễ củ Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson), họ Rau răm
(Polygonacceae) đạt tiêu chuẩn DĐVN V.
2.1.2. Thiết bị và hóa chất

2.1.2.1. Thiết bị máy móc và dụng cụ thí nghiệm
bao gồm: Bộ máy phun mẫu bán tự động (dùng cho hệ thống sắc ký bản mỏng)
Camag Linomat 5; máy chụp ảnh bản mỏng và phân tích dữ liệu Camag TLC
Visualizer, 2 phần mềm winCATS và VideoScan.
-

Bể siêu âm WISD

- Bình triển khai sắc ký.
- Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 (Merck) .
- Tủ sấy WiseVen (R) WOF.
- Cân kỹ thuật .
- Cân phân tích.
. thuyền tán .
- Cồn kế .
- Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ 200ml và 500 ml; bình nón nút mài 25ml;
bình định mức 25ml, 50ml và 100ml; pipet 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml; đũa thủy
tinh; phễu thủy tinh.
2.1.2.2. Hóa chất
Bảng 2.1. Hoá chất, dung môi
STT

Hóa chất

Xuất xứ

1

Acid acetic

Trung Quốc

2

Ethanol

Trung Quốc

3

Chất đối chiếu emodin

Chất chuẩn đối chiếu emodin được phân lập,
12


tinh chế từ dược liệu làm chất đối chiếu sử
dụng trong kiểm nghiệm và nghiên cứu
(được cung cấp bởi Viện Dược liệu Việt
Nam)
Chất đối chiếu stilbene

4

Được cung cấp bởi Viện Dược liệu Việt
Nam

5

Nước cất

Trường Đại học Dược Hà Nội,Việt Nam

6

Toluen

Việt Nam

2.2. Nội dung nghiên cứu

-

Điều chế được cao khô Hà thủ ô đỏ .

-

Xác định các chỉ tiêu chất lượng cao khô Hà thủ ô đỏ về cảm quan.
- Xác định các chỉ tiêu chất lượng cao khô Hà thủ ô đỏ .
-

Khảo sát định tính và bán định lượng emodin trong cao khô Hà thủ ô đỏ chiết
với các phương pháp sử dụng dung môi chiết khác nhau bằng phương pháp
sắc ký lớp mỏng.

2.2.1. Phương pháp điều chế cao khô Hà thủ ô đỏ

2.2.1.1. Phương pháp chế biến Hà thủ ô đỏ
Hà thủ ô đỏ được rửa sạch, ngâm nước lã 2-3 đêm. Sau đó đem nấu với đậu đen
theo tỷ lệ 1kg hà thủ ô đỏ : 0,2kg đậu đen : 2 lít nước, thái mỏng, sau đó đem sấy ở
nhiệt độ 640C. Sấy và tẩm cho hết dịch.
2.2.1.2. Phương pháp chiết xuất dược liệu
Dược liệu được chiết bằng phương pháp siêu âm. Bột dược liệu được cân chính
xác vào bình nón, sau đó thêm dung môi và đem siêu âm ba lần, mỗi lần 45 phút, ở
nhiệt độ thuờng. Các dung môi được khảo sát bao gồm: nước, cồn 50 độ và cồn 80

độ.
- Tỷ lệ dung môi/dược liệu được khảo sát gồm 3 tỷ lệ sau: 3/1; 6/1 và 9/1
(ml/g).
- Khối lượng dược liệu/mẫu là 150g/mẫu
13


- Các mẫu khác nhau với các điều kiện chiết xuất khác nhau được ký hiệu
trong Bảng 2.2
Bảng 2.2. Thiết kế thí nghiệm khảo sát ở quy trình chiết xuất
Tỷ lệ DM/DL

DM/DL

DM/DL

DM/DL

3:1

6:1

9:1

Nước (EtOH 00)

M1

M2

M3

EtOH 500

M4

M5

M6

EtOH 800

M7

M8

M9

Dung môi

- Mẫu sống (MS): Hà thủ ô đỏ được rửa sạch, ngâm nước lã 2-3 đêm rồi thái
mỏng,đem đi sấy khô, sau đó nghiền thành bột, cân 150 g bột chiết siêu âm
với EtOH 960 với tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/3 (g/ml). Chiết ba lần, sau đó
gộp lại thu được dịch chiết tổng.
- Các mẫu M1-M9 sau khi chiết ba lần đc gộp lại thu được dịch chiết tổng
- Các mẫu MS và M1-M9 cô thành cao đặc. Đem sấy khô dưới 500C tới khối
lượng không đổi thu được cao khô.
2.2.2. Phương pháp định tính

2.2.2.1. Phương pháp chuẩn bị mẫu

Bước 1. Mẫu thử
- Cân chính xác khoảng 0,25 g cao khô cho vào bình nón nút mài 25ml, thêm
khoảng 8 ml EtOH, siêu âm 30 phút ở nhiệt độ thường. Sau đó, lọc sang bình
định mức 10ml; bổ sung dung môi tới vạch. Lấy dịch đem đi chấm sắc ký.
Bước 2. Mẫu đối chiếu
- Chuẩn bị mẫu emodin dối chiếu: Cân chính xác khoảng 0,0010 g emodin đối
chiếu vào bình định mức 10 ml. Bổ sung dung môi EtOH tới vạch, được dung dịch
gốc đối chiếu có nồng độ 0.1mg/ml.

14


2.2.2.2. tiến hành định tính các chất trong cao chiết Hà thủ ô đỏ
Tiến hành:
Chấm mẫu emodin đối chiếu và mẫu thử (MS và M1-M9) trên cùng bản mỏng
so sánh sắc ký đồ
- Bản mỏng: Bản mỏng TLC silica gel 60 F254 (Merck) hoạt hóa ở 110oC trong
30 phút. Kích thước bản mỏng: 20 x 10 cm.
- Đưa mẫu lên bản mỏng: Mẫu đối chiếu và thử được phun lên bản mỏng bằng
máy chấm mẫu Linomat 5. Vị trí chấm mẫu cách mép dưới bản mỏng 1,0 cm, cách
mép dung môi từ 0,8 - 1 cm. Khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản
mỏng là 1,5 cm. Độ dài băng chấm 6 mm.
- Hệ dung môi khai triển: Toluen : EtOH : Acid acetic (8 : 2 : 0,5)
- Thể tích các vết chấm như Bảng 2.3
Bảng 2.3. Thể tích các vết chấm mẫu định tính
Mẫu

Emo- MS

M1

M2

m3

M4

M5

M6

M7

M8

M9

din

(0,4

(0,4

(0,4

(0.4

(0,4

(0,4

(0,4

(0,4

(0,4

(0,4

đối

mg/

mg/

mg/

mg/

mg/

mg/

mg/

mg/

mg/

mg/

chiếu ml)

ml)

ml)

ml)

ml)

ml)

ml)

ml)

ml)

ml)

10

10

10

10

10

10

10

10

10

0,1
mg/
ml
Thể
tích
chấm

10

10

(µl)
Bản mỏng sau khi khai triển được hiện màu bằng NH3 khoảng 1 – 2 phút , đem đi
quan sát ở bước sóng 366nm , thu được sắc ký đồ và Xử lý kết quả.

15


2.2.3. Phương pháp bán định lượng emodin trong cao khô Hà thủ ô đỏ

2.2.3.1. Phương pháp chuẩn bị mẫu

Bước 1. Mẫu thử (MS và M1-M9)
Cân chính xác khoảng 0,25 g cao khô cho vào bình nón nút mài 25ml, thêm
khoảng 8 ml EtOH, siêu âm 30 phút ở nhiệt độ thường. Sau đó, lọc sang bình định
mức 10ml; bổ sung dung môi tới vạch. Lấy dịch đem đi chấm sắc ký
Bước 2. Mẫu đối chiếu
- Chuẩn bị mẫu emodin dối chiếu: Cân chính xác khoảng 0,0010 g emodin đối
chiếu vào bình định mức 10 ml. Bổ sung dung môi EtOH tới vạch, được dung
dịch gốc đối chiếu có nồng độ 0.1mg/ml Sau đó hút chính xác cùng một lượng
và pha loãng khác nhau dung dịch gốc đối chiếu để thu được dãy nồng độ lần
lượt là 50 25 12,5 6,25 3,125 ( µg/ml ) từ dung dịch chuẩn gốc trên để xây
dựng đường chuẩn.
Điều kiện sắc ký
-

Bản mỏng: Bản mỏng TLC silica gel 60 F254 (Merck) hoạt hóa ở 110oC trong

30 phút. Kích thước bản mỏng: 20 x 10 cm.
-

Đưa mẫu lên bản mỏng: Mẫu đối chiếu và mẫu thử (MS và M1-M9) được

phun lên bản mỏng bằng máy chấm mẫu Linomat 5. Vị trí chấm mẫu cách mép
dưới bản mỏng 1,0 cm, cách mép dung môi từ 0,8 - 1 cm. Khoảng cách giữa vết
ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng là 1,5 cm. Độ dài băng chấm 6 mm.
-

Hệ dung môi khai triển: Toluen : Ethanol : Acid acetic (8 : 2 : 0,5)

-

Thể tích các vết chấm như bảng 2.4

16


Bảng 2.4. Thể tích các vết chấm mẫu bán định lượng.
Mẫu

Emo-

MS

M1

M2

M3

M4

M5

M6

M7

M8

M9

(nồng

din

(0,40 (0,40 (0,40 (0.40 (0,40 (0,40 (0,40 (0,40 (0,40 (0,40

độ)

đối

mg/

0mg/

mg/

mg/

mg/

mg/

mg/

mg/

mg/

mg/

chiếu

ml)

ml)

ml)

ml)

ml)

ml)

ml)

ml)

ml)

ml)

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

0,01
mg/
ml
Thể
tích
chấm

10

(µl)
Bản mỏng sắc ký sau khi khai triển được hiện màu bằng NH3 khoảng 1 – 2 phút,
đem đi quan sát ở ánh sáng khả kiến , thu được sắc ký đồ và xử lý kết quả.
2.2.3.2. Thẩm định phương pháp
a) Độ thích hợp của hệ thống:
Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu dung dịch emodin đối chiếu có nồng độ 0,01
mg/ml. Chấm sắc ký 6 lần dung dịch emodin, triển khai TLC [1].
Đánh giá: Tính RSD của diện tích pic, chiều cao pic, Rf. Giá trị RSD của diện tích
(chiều cao, Rf) pic giữa các lần chấm mẫu (n > 5) nên nhỏ hơn 2,0% [36].

b) Tính tuyến tính:
Cách tiến hành: Chuẩn bị chấm sắc ký TLC dãy dung dịch mẫu để xây dựng
đường chuẩn với nồng độ: 3,125; 6,25; 12,5; 25,0; 50,0 (µg/ml) tương ứng với thể
tích chấm mẫu lần lượt là 2, 4, 6, 8, 10 µl dung dịch emodin đối chiếu nồng độ
3,125 µg/µl. Tiến hành triển khai TLC với dãy dung dịch đường chuẩn trên. Xây
dựng phương trình đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ
chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên các sắc ký đồ bằng phương
17