Khảo sát một số phương pháp chế biến Hà thủ ô đỏ

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

KHAMLOY KEOMONGSA

KHẢO SÁT MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP
CHẾ BIẾN HÀ THỦ Ô ĐỎ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

KHAMLOY KEOMONGSA
Mã sinh viên: 1401325

KHẢO SÁT MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP
CHẾ BIẾN HÀ THỦ Ô ĐỎ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn
ThS. Phạm Thái Hà Văn
Nơi thực hiện
Bộ môn Dƣợc học cổ truyền
Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội

HÀ NỘI - 2019

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đƣợc khóa luận tốt nghiệp này, lời đầu tiên em xin dành lời
cảm ơn sâu sắc tới Đảng và Chính phủ nƣớc Cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào
và Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam đã tạo điều kiện cho em đƣợc học tập
và có điều kiện tham gia nghiên cứu khoa học, thực hiện đề tài này trong suốt
thời gian vừa qua.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô trong Bộ môn Dược
học cổ truyền, ThS. Phạm Thái Hà Văn đã tận tình trực tiếp chỉ bảo và hƣớng
dẫn em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các chị kĩ thuật viên trong
Bộ môn Dƣợc học cổ truyền đã giúp đỡ, chỉ bảo luôn đồng hành cùng tôi trong
suốt thời gian tôi làm khóa luận tại bộ môn.
Và cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn
ở bên cạnh giúp đỡ, ủng hộ tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng, đặc biệt là
thời gian làm khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Khamloy KEOMONGSA


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................ 2
1.1. Vị thuốc Hà thủ ô đỏ................................................................................ 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố ........................................................... 2
1.1.2. Bộ phận dùng và công dụng .............................................................. 3
1.1.3. Thành phần hóa học trong rễ củ của cây ........................................... 3
1.2. Một số bài thuốc có vị thuốc Hà thủ ô đỏ................................................. 4

1.2.1. Chữa tóc rụng và bạc sớm, chóng mặt, ù tai, hoa mắt, đau mỏi lƣng
khớp, táo bón. ............................................................................................. 4
1.2.2. Chữa phong thấp đau lƣng, viêm dây thần kinh hông, vận động khó
khăn............................................................................................................ 4
1.2.3. Thuốc bổ dùng cho ngƣời già yếu, thần kinh suy nhƣợc, tiêu hóa kém
................................................................................................................... 4
1.2.4. Thuốc bổ khí huyết, mạnh gân cốt .................................................... 4
1.2.5. Thất bảo mỹ nhiệm đơn .................................................................... 5
1.2.6. Hà nhân ẩm....................................................................................... 5
1.3. Chế biến Hà thủ ô đỏ ............................................................................... 6
1.3.1. Mục đích........................................................................................... 6
1.3.2. Phƣơng pháp chế biến ....................................................................... 6
1.3.3. Một số phụ liệu dùng trong chế biến ................................................. 7
1.4. Hoạt chất 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside .................. 7
1.5. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao ............................................................... 8
1.5.1. Sắc ký lớp mỏng ............................................................................... 8
1.5.2. Ƣu điểm của các thiết bị sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) 11
1.5.3. Ứng dụng của TLC trong nghiên cứu dƣợc liệu .............................. 12


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 14
2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu ........................................................ 14
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu .................................................................. 14
2.1.2. Hóa chất và dụng cụ ....................................................................... 14
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 15
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 16
2.3.1. Chế biến dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ ....................................................... 16
2.3.2. Định tính và bán định lƣợng thành phần THSG trong các mẫu Hà thủ
ô đỏ đã chế biến bằng phƣơng pháp TLC-videoscan................................. 17
2.3.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu .............................................................. 20

CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................... 21
3.1. Hiệu suất và một số chỉ tiêu cao khô Hà thủ ô đỏ .................................. 21
3.1.1 Các chỉ tiêu về cảm quan và định tính hóa học ................................ 21
3.1.2. Hiệu suất bào chế cao Hà thủ ô ....................................................... 22
3.2. Kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng ................................................ 23
3.3. Kết quả định lƣợng ................................................................................ 25
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 1


DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ADP

Adenosine-5'-diphosphat

DL

Dƣợc liệu

DM

Dung môi

DPPH

α, α-diphenyl-β-picrylhydrazyl

GOT

Glutamic oxaloacetic transaminase

GPT

Glutamic pyruvic transaminase

HPTLC

High Performance Thin Layer Chromatography

HSCC

High-speed countamrent chromatography

HTOĐ

Hà thủ ô đỏ

NADPH

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

THSG

2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β -D-glucosid

TLC

Thin Layer Chromatography

UV

Utra Violet


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thông tin bài thuốc Thất bảo mỹ nhiệm đơn ................................ 5
Bảng 2.1. Các mẫu và thể tích chấm trên bản mỏng định tính của THSG, mẫu
chế Hà thủ ô đỏ và mẫu sống ...................................................................... 18
Bảng 2.2. Các mẫu và thể tích chấm trên bản mỏng định tính, định lƣợng của
THSG, mẫu chế Hà thủ ô đỏ Và mẫu sống ................................................. 19
Bảng 3.1. Độ ẩm của các mẫu cao Hà thủ ô đỏ chế .................................... 22
Bảng 3.2. Hiệu suất của các mẫu cao khô Hà thủ ô đỏ chế theo quy trình điều
chế ở điều kiện khác nhau (%).................................................................... 22
Bảng 3.3. Giá trị Rf trên bản mỏng định tính ở 366 nm ............................. 23
Bảng 3.4: Nồng độ THSG chuẩn và diện tích Pic đáp ứng ......................... 27
Bảng 3.5. Kết quả bán định lƣợng .............................................................. 28


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây Hà thủ ô đỏ ............................................................................ 2
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-Dglucoside ...................................................................................................... 8
Hình 2.1. Nguyên liệu chế Hà thủ ô đỏ chƣa chế ........................................ 14
Hình 2.2. Máy cất quay thu hồi dung môi IKA ........................................... 15
Hình 2.3. Hình ảnh hệ thống máy sắc ký HPTLC ....................................... 15
Hình 3.1. Dƣợc liệu Hà Thủ Ô chế ............................................................. 21
Hình 3.2. Hình ảnh cao khô sau khi chế biến lần lƣợt với đậu đen 2 lần (1), 4 lần

(2), 6 lần (3) ............................................................................................... 21
Hình 3.3. Sắc ký đồ của các mẫu quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại ở .......... 24
Hình 3.4.a. Sắc ký đồ của các mẫu quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng
λ= 254 nm (A), λ= 366 nm (B) ................................................................... 25
Hình 3.4.b. Sắc ký đồ của các mẫu quan sát dƣới ánh sáng trắng (C) ......... 26
Hình 3.5. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn của THSG (Stilben) từ chiều cao pic
sắc ký của dãy nồng độ khảo sát ................................................................. 27
Hình 3.6. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn của THSG (Stilben) từ diện tích pic
sắc ký của dãy nồng độ khảo sát ................................................................. 28


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hà thủ ô đỏ là dƣợc liệu quý đã đƣợc nhân dân các nƣớc châu Á sử dụng
với nhiều tên gọi khác nhau nhƣ dạ hợp, dạ giao đằng,… Bộ phận rễ củ có tác
dụng bổ máu, trị di tinh, đới bạ (khí hƣ), thần kinh suy nhƣợc, sốt rét kinh niên,
đi ngoài ra máu, bổ gan thận, làm đen râu tóc. Bộ phận trên mặt đất có tác dụng
dƣỡng tâm an thần, dƣỡng huyết hoạt lạc,… [5]. Hà thủ ô đỏ cũng có mặt trong
nhiều bài thuốc cổ phƣơng [2].
Trong đông y các vị thuốc nói chung trƣớc khi dùng để uống đều phải trải
qua chế biến theo một hoặc nhiều phƣơng pháp cổ truyền khác nhau để đạt đƣợc
những mục đích của việc chữa bệnh: tăng quy kinh, giảm độc tính, tăng tác
dụng,… của vị thuốc. Do đó, với từng dƣợc liệu cần chọn phƣơng pháp chế biến
thích hợp để có hiệu quả tốt nhất, phù hợp với tình trạng bệnh. Theo dƣợc điển
Việt Nam IV, Hà thủ ô đỏ chế biến với 2 phụ liệu là đậu đen và nƣớc vo gạo,
dùng phƣơng pháp cửu chƣng cửu sái. Tuy nhiên, nhiều thông số kỹ thuật trong
quá trình chế biến Hà thủ ô đỏ chƣa đƣợc làm rõ, cần có nghiên cứu sâu hơn để
xây dựng quy trình chuẩn để chế biến Hà thủ ô đỏ đạt hiệu quả trị bệnh tốt. Đặc
biệt là số lần đồ với đỗ đen trong quy trình chuẩn [3], rất ít cơ sở sản xuất hiện
nay tuân thủ đủ số lần chế biến (9 lần chƣng, 9 lần sái) mà thƣờng rút ngắn số
lần chƣng - sái. Việc giải quyết bài toán kinh tế với vấn đề chất lƣợng sản phẩm

Hà thủ ô đỏ đƣợc đặt ra cho các nhà khoa học.
Với mục tiêu nghiên cứu, tiến tới tiêu chuẩn hóa phƣơng pháp chế biến vị
thuốc cổ truyền này, đề tài “Cải tiến quy trình chế biến Hà thủ ô đỏ” đƣợc
tiến hành với mục tiêu:
- Khảo sát số lần chƣng – sái dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ.
- Định tính và bán định lƣợng hoạt chất 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2O-β-D-glucosid trong dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ chế bằng sắc ký lớp mỏng, so sánh
với mẫu dƣợc liệu sống.

1


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Vị thuốc Hà thủ ô đỏ
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thumb.) Haradlson, họ Rau răm
(Polygonaceae). Tên gọi khác: Polygonum multiflorum (Thumb.) Haradlson. Hà
thủ ô đỏ theo dân gian đƣợc hay đƣợc gọi là Dạ dao đằng vì ban đêm hai cây
quấn thân vào nhau [6], [9].
Đây là loại dây leo, sống nhiều năm. Mặt ngoài thân màu xanh tía, có vân,
nhẵn, không có lông. Lá mọc so le, có cuống dài, phiến lá hình tim hẹp dài 4-8
cm, rộng 2,5- 5 cm, đầu nhọn, gốc lá hình tim hoặc hình mũi tên, mép nguyên
hoặc hơi lƣợn sóng, cả 2 mặt đều nhẵn và không có lông. Lá kèm mỏng, màu
nâu nhạt, ôm lấy thân. Hoa mọc thành chùm, nhiều nhánh, cánh hoa màu trắng.
Hoa nhỏ, đƣờng kính 2mm, có cuống ngắn 1- 3 mm. Bầu nhụy hình 3 cạnh, vòi
nhụy 3 rời, ngắn. Quả đóng hình thấu kính [9] (Hình 1.1).

Hình 1.1. Cây Hà thủ ô đỏ(nguồn hình cây thuốc và động vật làm thuốc
Việt Nam)
Hà thủ ô phân bố rộng khắp ở các quốc gia Trung Quốc, Nhật Bản, Việt
Nam. Ở Việt Nam, cây mọc hoang từ Lai Châu, Lào Cai, Sơn La, Hà Giang vào

Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Tây Nguyên. Thƣờng gặp dƣới tán tràng cây
bụi, trong các rừng thƣa ven suối hay ven đƣờng râm mát ở chân núi hoặc khe
2


đá. Cây cũng đƣợc trồng nhỏ lẻ phục vụ nhu cầu nhân dân từ Bắc tới Nam nhƣ
Vĩnh Phúc, Phú Thọ,… đến Lâm Đồng, Đắk Lắk, Phú Yên, Bình Định,… [6].
1.1.2. Bộ phận dùng và công dụng
Bộ phận dùng là rễ củ phơi khô của cây Hà thủ ô đỏ [4]. Rễ củ tròn hoặc
hình thoi không nhất định, thƣờng có những sống lồi dọc theo củ. Mặt ngoài nâu
đỏ, mặt cắt màu hồng, có bột. Vị hơi đắng chát [11].
Vị đắng, chát, tính ấm.
Quy kinh: can, thận [10]
Tác dụng: Bổ can thận, mạnh gân cốt, dƣỡng huyết [5], [9].
Công dụng [10]:
- Bổ huyết, dùng trong các trƣờng hợp khí huyết đều hƣ, cơ thể mệt nhọc,
thở ngắn hơi, da xanh gầy khô sáp, râu tóc bạc sớm, tim loạn nhịp, mất ngủ.
- Nhuận tràng thông tiện: dùng trong trƣờng hợp thiếu máu vô lực mà dẫn
đến đại bí táo. Ngoài ra còn dùng chữa trĩ, đi ngoài ra máu.
- Giải độc chống viêm: dùng trong các trƣờng hợp mụn nhọt, thấp chẩn lở
ngứa, còn dùng để trị bệnh tràng nhạc (loa lịch) và viêm gan mạn tính.
Liều dùng: 20-40 g [10].
Tƣơng kị: hành, tỏi, củ cải, đồ bằng sắt [5], [9].
Tuy nhiên, phần thân leo của hà thủ ô đỏ cũng đƣợc sử dụng với tác dụng
dƣỡng tâm an thần, dƣỡng huyết hoạt lạc, dùng trị chứng thần kinh suy nhƣợc,
thiếu máu, đau mỏi toàn thân [5].
1.1.3. Thành phần hóa học trong rễ củ của cây
Thành phần hóa học trong rễ củ Hà thủ ô bao gồm:
- Anthranoid tỷ lệ 1,7% chủ yếu chrysophanol, emodin và rhein có tác
dụng làm tăng nhu động ruột, kích thích tiêu hóa và cải thiện dinh dƣỡng [9].

- Chất đạm 1,1%, tinh bột 45,2%, chất béo 3,1%, chất vô cơ 4,5%, chất
tan trong nƣớc 26,4% và lecithin. Lecithin bản chất là phospholipid đƣợc cấu tạo
từ acid glycerophosphoric với một phân tử choline và hai phân tử acid béo, đƣợc
dùng trong trƣờng hợp thiếu dinh dƣỡng, thần kinh suy nhƣợc [9].
3


Ngoài ra, Hà thủ ô đỏ có nhiều tanin nhƣ 3,3’-di-O-galloyprocyanidin-B2, 3-O-galloyl-l-catechin, 3-O-galloyl-l-epicatechin, 3-O- galloyprocyanidin-B1, d-catechin, d-epichatechin và acid gallic [11].
1.2. Một số bài thuốc có vị thuốc Hà thủ ô đỏ
1.2.1. Chữa tóc rụng và bạc sớm, chóng mặt, ù tai, hoa mắt, đau mỏi
lưng khớp, táo bón.
Bài thuốc sử dụng nhƣ sau:
Hà thủ ô chế

20g

Sinh địa

20g

Huyền sâm

20g

Cách dùng: Sắc uống [11].
1.2.2. Chữa phong thấp đau lưng, viêm dây thần kinh hông, vận động
khó khăn
Bài thuốc sử dụng nhƣ sau:
Hà thủ ô đỏ

30g

Huyết giác

12g

Ngƣu tất

30g

Thiên niên kiện

12g

Cẩu tích

16g

Bạch chỉ

6g

Cách dùng: Sắc uống [11].
1.2.3. Thuốc bổ dùng cho người già yếu, thần kinh suy nhược, tiêu hóa
kém
Bài thuốc sử dụng nhƣ sau:
Hà thủ ô đỏ

10g

Trần bì

3g

Đại táo

5g

Sinh khƣơng

3g

Thanh bì

2g

Cam thảo

2g

Nƣớc 600ml, sắc còn 200ml, chia 3-4 lần uống trong ngày [2].
1.2.4. Thuốc bổ khí huyết, mạnh gân cốt
Hà thủ ô trắng và hà thủ ô đỏ với lƣợng bằng nhau, ngâm nƣớc vo gạo 3
đêm, sao khô tán nhỏ, luyện với mật làm viên to bằng hạt đậu xanh. Uống mỗi
ngày 50 viên với rƣợu vào lúc đói [2].
4


1.2.5. Thất bảo mỹ nhiệm đơn
Bài thuốc sử dụng nhƣ sau:

Bảng 1.1. Thông tin bài thuốc Thất bảo mỹ nhiệm đơn
Hà thủ ô đỏ

600g

Đã chế biến

Hà thủ ô trắng

600g

Đã chế biến

Xích phục linh

600g

Cạo bỏ vỏ, tán bột, khuấy với nƣớc trong, lọc lấy

Bạch phục linh

600g

bột lắng ở dƣới, nắm lại, phơi khô.

Ngƣu tất

320g

Tẩm rƣợu để một ngày, trộn với hà thủ ô và đổ với

đỗ đen vào lần thứ 7,8,9 rồi phơi khô

Đƣơng quy

320g

Tẩm rƣợu phơi khô

Câu kì tử

320g

Tẩm rƣợu phơi khô

Thỏ ty tử

320g

Tẩm rƣợu cho nứt ra, giã nát phơi khô

Bổ cốt chi

100g

Trộn với vừng đen, sao cho bốc mùi thơm

Tất cả giã nhỏ, trộn đều, thêm mật vào làm thành viên 0,5g. Ngày uống 3
lần, mỗi lần 50 viên. Sáng dùng rƣợu chiêu thuốc, trƣa dùng nƣớc gừng, tối
dùng nƣớc muối.
Công dụng: Làm râu tóc trắng hóa đen, khỏe gân xƣơng, bền tinh khí,

sống lâu [2].
1.2.6. Hà nhân ẩm
Hà thủ ô

20g

Nhân sâm

4g

Đƣơng quy

8g

Trần bì

8g

Sinh khƣơng

3 lát

Cách dùng: Sắc uống, trƣớc khi lên cơn sốt rét 2 giờ
Công dụng: Trị bệnh sốt rét đã kéo dài, hay tái phát. Khí huyết lƣỡng hƣ,
sắc mặt xanh nhợt, chất lƣỡi nhợt, mạch hoãn đại mà hƣ [8].

5


1.3. Chế biến Hà thủ ô đỏ

1.3.1. Mục đích
Hà thủ ô đƣợc dùng làm thuốc bổ huyết, có tính ráo, sáp. Vì vậy chế biến
Hà thủ ô nhằm mục đích [10]:
- Giảm tính ráo, sáp: Tính ráo, sáp là do Hà thủ ô có chứa Tanin. Tanin có
tác dụng làm săn se niêm mạc. Nếu uống kéo dài có thể gây táo bón. Chế biến
làm giảm lƣợng tanin bằng cách ngâm vị thuốc với nƣớc vo gạo. Loại bỏ dịch
ngâm thì tanin giảm đi.
- Giảm tác dụng nhuận tràng do anthranoid bằng phƣơng pháp ngâm.
- Tăng tác dụng dẫn thuốc vào kinh thận bằng cách chế với dịch nƣớc đậu
đen.
1.3.2. Phương pháp chế biến
1.3.2.1. Phương pháp chế theo dược điển Việt Nam V
Rửa sạch củ, ngâm nƣớc vo gạo 1 ngày 1 đêm, sau đó rửa lại. Đổ nƣớc
đậu đen cho ngập (cứ 1kg Hà thủ ô cần 100g Đậu đen, 2L nƣớc, nấu đến khi đậu
đen nhừ nát), nấu đến khi gần cạn, cần đảo luôn cho chín đều. Khi củ đã mềm,
lấy ra, bỏ lõi (nếu có). Nếu còn nƣớc đậu đen thì tẩm phơi cho hết. Làm sạch
vụn nát. Thái hoặc cạo mỏng rồi phơi khô. Nếu đồ thì đồ 9 lần rồi phơi 9 lần
(cửu chƣng cửu sái) thì càng tốt.
Khi đun nên đặt vỉ ở đáy nồi cho khỏi cháy dƣợc liệu [4].
1.3.2.2. Chế biến theo phương pháp đồ
Ngâm: Hà thủ ô ngâm với nƣớc vo gạo 4 ngày đêm, mỗi ngày thay nƣớc 1
lần. Vớt ra, rửa sạch.
Đồ: ra đậu đen và hà thủ ô vào chõ. Cứ 1 lƣợt đậu đen lại 1 lƣợt hà thủ ô
đỏ. Đồ đến khi đậu đen chín nhừ. Loại bỏ hạt đậu đen. Phơi hà thủ ô đến khi
khô. Làm nhƣ vậy nhiều lần. Thái phiến, phơi sấy đến khi khô kiệt.
Tiêu chuẩn thành phẩm: phiến dày 1-2 mm, màu nâu đen, khô cứng, ít
chát [10].

6

1.3.3. Một số phụ liệu dùng trong chế biến
1.3.3.1. Đậu đen
Đặc điểm: Đậu đen có vị ngọt, tính bình. Công năng: trừ phong, thanh
thấp nhiệt, giải độc. Vỏ hạt chứa anthocyan có màu tím đen. Hạt chứa chủ yếu là
protid (24,2%) gồm nhiều acid amin quý nhƣ lysin, methionin, leuxin,
tryptophan, phenylalanin, alanin, valin,… Ngoài ra còn có lipid, muối khoáng,
vitamin.
Ứng dụng: Hạt đậu đen có màu đen, chế thuốc nhằm tăng tác dụng dẫn
thuốc vào kinh thận, tăng tác dụng bổ, giảm độc tính của một số vị thuốc nhƣ
mã tiền, phụ tử. Lƣợng đậu đen dùng chế khoảng 10- 20% so với thuốc. Nấu lấy
dịch nƣớc, dùng dịch nƣớc này tẩm hay nấu với thuốc [10].
1.3.3.2. Nước vo gạo
Dùng nƣớc gạo nếp hoặc gạo tẻ. Ngâm thuốc, thƣờng dùng với nƣớc vo
gạo loãng (1kg gạo lấy 2-3 L dịch nƣớc). Tẩm vào thuốc, thƣờng dùng nƣớc vo
gạo đặc (1kg gạo lấy 100- 200 ml dịch nƣớc).
Phƣơng pháp tẩm thuốc với dịch nƣớc vo gạo gọi là mễ cam chế.
Ứng dụng: Thuốc chế với dịch nƣớc vo gạo làm tăng tác dụng kiện tỳ, hòa
vị, làm giảm tính táo của vị thuốc, tăng thêm tính nhu nhuận.
Dịch nƣớc vo gạo để lâu sẽ bị lên men có mùi chua, pH dịch thay đổi từ
trung tính sang acid, ảnh hƣởng đến độ tan của một số thành phần hóa học trong
dịch ngâm nhƣ alcaloid, coumarin. Men còn là yếu tố gây phản ứng thủy phân
các glycosid thành aglycol và đƣờng, làm thay đổi tác dụng của thuốc [10].
1.4. Hoạt chất 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside
2, 3, 5, 4' - tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside (THSG) là một
polyphenol có trong Hà thủ ô đỏ thuộc dẫn chất của stilben với cấu trúc nhƣ
Hình 1.2 [15], đƣợc phân lập từ năm 1998 bằng phƣơng pháp HSCC [12].
Công thức phân tử: C20H22O9.
Khối lƣợng phân tử: 406 [14].

7


HO

O D Glucose
CH CH

OH

HO

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-Dglucoside
Piceid và 2,3,5,4'-tetrahydroxy stilbene-2-O-D-glucosid có tác dụng hạ
GOT và GPT trong huyết thanh của chuột bị tổn thƣơng gan. Ngoài ra
resveratrol (3,4,5-trihydroxystilbene), piceid và 2,3,5,4' -tetrahydroxy stilbene-2O-D-glucoside ức chế quá trình peroxy hóa lipid do ADP và NADPH gây ra ở
gan chuột [15].
(E)- 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-0-β-D-glucopyranoside còn có tác
dụng ức chế gốc tự do DPPH [16], hạ huyết áp, bảo vệ tim mạch, chống viêm
[17], [18], [19]. THSG còn là hợp chất đầy hứa hẹn trong điều trị giai đoạn đầu
của ung thƣ đại trực tràng [14].
Theo Dƣợc điển Trung Quốc, hàm lƣợng 2,3,5,4'-tetrahydroxy stilbene-2O-D-glucosid định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC trong Hà thủ ô đỏ không
đƣợc dƣới 1% tính theo dƣợc liệu khô [13].
1.5. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
1.5.1. Sắc ký lớp mỏng
1.5.1.1. Nguyên tắc
Tách bằng sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất đƣợc tiến hành trên
một lớp mỏng bao gồm các hạt có kích thƣớc đồng nhất, đƣợc kết dính trên một
giá đỡ bằng thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo. Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh. Các
hạt trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao

đổi ion,.. Pha động bao gồm các dung dịch cần phân tích đƣợc hòa tan trong một
dung môi thích hợp và đƣợc hút lên bản sắc ký bởi lực mao dẫn, tách dung dịch
thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch [1].

8


Rf là đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích.
Trị số này đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích
và khoảng cách di chuyển của pha động:
Rf

=

Trong đó:
dR: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)
dM: khoảng cách từ điểm xuất phát đếm mức dung môi pha động (đo trên
cùng đƣờng đi của vết, tính bằng cm)
Rf có giá trị dao động từ 0 đến 1.
- Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thƣớc 10- 30 μm, đƣợc rải đều và
kết dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 μm trên giá đỡ hình vuông.
Bản mỏng có sẵn trên thi trƣờng có kích thƣớc khác nhau thƣờng 5- 20 cm,
nhiều khi có thêm các chất phát huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để phát
hiện chất phân tích [1]. Chất hấp phụ thƣờng dùng nhất là loại silicagel (>90%)
rồi đến nhôm oxyd (<5%). Các loại khác (than hoạt, Polyamid, Florisil,
Celite,…) ít đƣợc sử dụng [3].
- Pha động cho TLC rất thay đổi, thùy thuộc vào cơ chế sắc ký. Để tăng
cƣờng rửa giải, thƣờng kết hợp 2 dung môi. Nguyên lý chia tách dựa vào hệ số
phân bố giữa 2 pha. Tuy nhiên, lựa chọn tối ƣu hóa sắc ký thƣờng dựa vào kinh
nghiệm. Một số gợi ý chung nhất cho pha động TLC [1]:

+ Dung môi cần có độ tinh khiết cao
+ Cần điều chỉnh sức rửa giải giữa pha động để trị số Rf nằm trong
khoảng 0,2 – 0,8 đạt độ phân giải cực trị.
+ Chất phân tích dạng ion hay phân cực rửa giải tốt bằng dung môi phân
cực nhƣ hỗn hợp n-butanol – nƣớc. Thêm một ít acid acetic hoặc amoniac làm
tăng độ tan của base hoặc acid tƣơng ứng.
+ Khi dùng silica hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của
pha động sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và Rf của chúng.
9


Nếu thêm một ít dung môi phân cực nhƣ ethyl ethylic vào dung môi không phân
cực nhƣ methyl benzen sẽ làm tăng đáng kể trị số Rf.
+ Sức rửa giải của dung môi trong sắc ký lỏng hấp phụ hoàn toàn có thể
sử dụng cho TLC với pha tĩnh là silica hoặc alumina.
1.4.1.2. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng
Đầu tiên là lựa chọn bản mỏng sắc ký có kích thƣớc phù hợp, hoạt hóa
trong thời gian và nhiệt độ thích hợp. Sau đó, thực hành sắc ký lớp mỏng có 4
bƣớc sau:
Bƣớc 1: Đƣa chất phân tích lên bản mỏng
- Lượng và thể tích mẫu chấm: Lƣợng mãu đƣa lên bản mỏng có ý nghĩa
rất quan trọng đối với hiệu quả tách sắc ký, ảnh hƣởng đến trị số Rf. Nếu lƣợng
chất quá lớn, vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó các vết có trị số Rf gần nhau sẽ
chồng lên nhau và không tách riêng đƣợc. Nếu lƣợng chất quá nhỏ có thể khó
phát hiện vết. Lƣợng mẫu đƣa lên bản mỏng khoảng 0,1- 0,5μg. Tùy theo kiểu
đƣa mẫu lên bản mỏng mà thể tích mẫu cũng khác nhau. Trƣờng hợp mẫu dƣới
dạng thể tích, thể tích mẫu khoảng 0,1- 0,2 μl [1], [3].
- Vị trí đưa mẫu lên bản mỏng: Đƣờng xuất phát cách mép dƣới bản mỏng
và mép của dung môi pha động đủ lớn để tốc độ di chuyển của dung môi từ khi
bắt đầu đến điểm đƣa mẫu lên bản mỏng đã khá ổn định. Tốt nhất là cách mép

dƣới bản mỏng 1,5 cm và cách mép dung môi từ 0,8- 1cm để tránh hiệu ứng bờ
[1], [3].
Bƣớc 2: Khai triển sắc ký
- Thiết bị triển khai sắc ký thƣờng là bình thủy tinh có nắp đậy kín, kích
thƣớc phù hợp với bản mỏng. Để tăng độ bão hòa dung môi pha động trong bình
(nhất là đối với dung môi có độ nhớt cao, khó bay hơi), ngƣời ta đặt giấy lọc áp
sát thành bình.
- Sau khi chấm mẫu sắc ký, bản đã khô đƣợc cho vào bình sắc ký bão hòa
pha động. Mép dƣới bản mỏng đƣợc nhúng vào pha động nhƣng vết chấm vẫn
cách bề mặt pha động khoảng 1cm [3].
10


Bƣớc 3: Hiện sắc ký đồ, dựa vào tính chất lý hóa khác nhau của chất cần
phân tích để lựa chọn cách phát hiện thích hợp vết sắc ký
- Sử dụng thuốc thử hiện màu [3]: Sau khi khai triển, muốn quan sát đầy
đủ nhất tất cả các vết, thƣờng phải phun thuốc thử lên bề mặt bản mỏng hoặc
nhúng cả bản mỏng vào thuốc thử. Đôi khi phải làm nóng bản mỏng để làm tăng
tốc độ phản ứng tạo màu và cƣờng độ vết màu.
- Soi dưới ánh sáng đèn UV [1]: Nhiều chất hƣu cơ trên sắc ký đồ trở nên
tối hoặc phát quang sáng khi soi dƣới đèn UV ở bƣớc sóng 254 hoặc 366 nm.
Một số bản mỏng tráng sẵn có chất phát quang không tan đƣa vào pha tĩnh nên
phát huỳnh quang.
- Dùng densitometer [1]: Thiết bị này đo cƣờng độ tia phản xạ từ bề mặt
bản mỏng khi soi dƣới đèn UV- VIS. Chất phân tích bức xạ đƣợc ghi lại thành
pic sắc ký.
Bƣớc 4: Thu nhận và xử lý số liệu thực nghiệm [1].
1.5.2. Ưu điểm của các thiết bị sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là hình thức phát triển nhất của
kỹ thuật SKLM. Thuật ngữ HPTLC bao gồm hệ thống triển khai sắc ký bán tự

động nhƣ: máy chấm mẫu tự động (Linomat 5, Nanomat 4, ATS 4), thiết bị triển
khai sắc ký (ADC2), thiết bị soi và chụp ảnh bản mỏng (TLC Visualizer), máy
quét vết (TLC Scanner) và bản mỏng hiệu năng cao TLC [20]. Các thiết bị có
thể sử dụng trong kỹ thuật TLC thông thƣờng để cải thiện độ lặp lại của các lần
triển khai sắc ký là: máy chấm mẫu tự động (Linomat 5, Nanomat 4, ATS 4),
thiết bị triển khai sắc ký (ADC2), thiết bị soi và chụp ảnh bản mỏng (TLC
Visualizer).
Ƣu điểm của phƣơng pháp này so với SKLM thông thƣờng là [7]:
- Khả năng phân tách tốt hơn. Ƣu điểm này chủ yếu nhờ bản mỏng hiệu
năng cao có kích thƣớc hạt nhỏ hơn, hạt đồng đều hơn, do đó khả năng hấp phụ
của bản mỏng cũng tốt hơn.

11


- Lƣợng chất đƣa lên bản mỏng ít hơn: với thiết bị tiêm mẫu chính xác và
bản mỏng có khả năng hấp phụ tốt, lƣợng chất cần cho phân tích là nhỏ hơn.
- Thời gian triển khai ngắn hơn.
- Độ lặp lại tốt hơn do gắn với hệ thống chấm máy sắc ký tự động, buồng
triển khai sắc ký, máy quét, chụp ảnh và phần mềm xử lý hình ảnh, số liệu. Các
yếu tố về môi trƣờng, nguyên nhân ảnh hƣởng tới kết quả phân tích, đƣợc kiểm
soát và hạn chết tối đa các thay đổi.
1.5.3. Ứng dụng của TLC trong nghiên cứu dược liệu
1.5.3.1. Định tính
Chứng thực độ tinh khiết của một hợp chất phân lập đƣợc: Chấm tƣơng
đối đậm mẫu thử trên ít nhất 3 bản mỏng khác nhau, khai triển ít nhất với 3 hệ
dung môi khác nhau. Nếu cả 3 sắc ký đồ đều cho một vết gọn trong một vùng Rf
= 0,3- 0,75 thì có thể sơ bộ kết luận rằng mẫu thử là một chất tinh khiết. Việc
khẳng định sự tinh khiết của mẫu thử sẽ đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp phổ
học khác (UV, IR, NMR, MS) [3].

So sánh với một chất chuẩn: Thực hiện ít nhất trên 3 bản mỏng khác nhau,
khai triển với ít nhất 3 hệ dung môi khác nhau. Trên mỗi bản mỏng chấm ít nhất
3 vết: vết I (mẫu thử), vết II (mẫu thử + mẫu chuẩn), vết III (mẫu chuẩn). Nếu
trên cả 3 sắc ký đồ mẫu thử với mẫu chuẩn đều đồng nhất (về trị số Rf, về hình
dạng, màu sắc vết trƣớc và sau khi hiện màu) thì có thể sơ bộ kết thúc mẫu thử
và mẫu chuẩn là đồng nhất [3].
Kiểm nghiệm dƣợc liệu: Cùng với một quy trình chiết xuất nhƣ nhau, dịch
chiết của mẫu thử dƣợc liệu đƣợc chấm song song với dịch chiết của mẫu dƣợc
liệu chuẩn (thực hiện trên 3 bản mỏng về số vết, Rf của các vết, hình dạng các
vết, màu sắc các vết, tỷ lệ tƣơng đối giữa các vết…. của mẫu dƣợc liệu thử và
dƣợc liệu chuẩn [3].
Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dƣợc liệu: Bằng một chiết xuất nhất
định, trong điều kiện sắc ký nhất định, sắc ký đồ của dịch chiết dƣợc liệu là
không đổi về số vết, về trị số Rf của các vết, hình dạng các vết, màu sắc các vết,
12


tỷ lệ tƣơng đối giữa các vết…. Sắc ký đồ đƣợc coi là tài liệu không thể thiếu
trong công tác xây dƣng tiêu chuẩn kiểm nghiệm các dƣợc liệu [3].
1.5.3.2. Bán định lượng
Dựa trên diện tích hoặc dựa trên cƣờng dộ màu (khi phun thuốc thử hoặc
khi soi UV) của các vết xuất hiện trên bản mỏng (đặc biệt là bản mỏng hiệu
năng cao), nếu có mẫu chuẩn tƣơng ứng, có thể bán định lƣợng một chất (hay
một nhóm chất) có trong mẫu thử. HPTLC đƣợc ứng dụng trong bán định lƣợng
bằng phƣơng pháp so sánh. Một số dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng độ khác
nhau đƣợc pha sẵn. Dựa vào mối liên hệ giữa nồng độ chất chuẩn đã biết và diện
tích pic đáp ứng của chất đó trên sắc ký đồ để từ đó xây dựng đƣờng chuẩn định
lƣợng. Đo tín hiệu đáp ứng diện tích pic của chất cần phân tích trong mẫu thử và
nội suy nồng độ từ đƣờng chuẩn đã đƣợc xây dựng ở trên [3].

13


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
Nguyên liệu nghiên cứu là dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora
(Thunb.) Haraldson) đƣợc mua từ chợ Ninh Hiệp, Gia Lâm, Hà Nội.

Hình 2.1. Nguyên liệu chế Hà thủ ô đỏ chƣa chế
2.1.2. Hóa chất và dụng cụ
2.1.2.1. Máy móc và dụng cụ thí nghiệm
- Máy cất quay thu hồi dung môi
- Máy chấm sắc ký Linomat 5, Máy chụp ảnh TLC Visualizer, phần mềm
WINCATS, phần mềm VideoScan.

14


Hình 2.2. Máy cất quay thu hồi dung môi IKA

Hình 2.3. Hình ảnh hệ thống máy sắc ký HPTLC
- Bản mỏng TLC Silicagel 60 GF254 (Merck)
- Bể siêu âm WISD
- Thuyền tán.
- Cân kỹ thuật
- Bình triển khai sắc ký
- Tủ sấy Wise Ven (R) WOF
- Cồn kế.
- Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ 200ml và 500 ml; bình định mức

25ml, 50ml và 100ml; pipet 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml; đũa thủy tinh; phễu thủy
tinh
- Cân phân tích
- Giấy lọc
- Nồi đun, dao
2.1.2.2. Hóa chất
- Nƣớc cất, cồn Ethanol 96%, Toluen, Acid acetic.
- Chất đối chiếu: THSG (Trung Quốc) pha ở nồng độ 0,5 mg/ml trong
methanol.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Tiến hành bào chế dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ với số lần chƣng – sái khác
nhau.
15


- Kiểm tra các chỉ tiêu chất lƣợng cao khô Hà thủ ô đỏ
- Định tính và so sánh thành phần hóa học của các mẫu dƣợc liệu Hà thủ
ô đỏ đƣợc chế biến với các điều kiện khác nhau, và chiết xuất ở cùng điều kiện
bằng phƣơng pháp TLC-videoscan.
- Định lƣợng THSG (Stilben) trong cao khô hà thủ ô đỏ thu đƣợc nhằm
nghiên cứu sự ảnh hƣởng của các điều kiện chế biến đến quá trình bào chế cao
khô Hà thủ ô đỏ
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Chế biến dược liệu Hà thủ ô đỏ
Dƣợc liệu sau khi mua đƣợc chế biến dựa trên phƣơng pháp chế của Dƣợc
điển Việt Nam IV [3], tiến hành khảo sát số lần chƣng – sái (hay chế biến) với
phụ liệu là nƣớc đậu đen nhƣ sau:
Bước 1: Chế Hà thủ ô
Ngâm rửa sạch Hà thủ ô đỏ. Ngâm với nƣớc lã 5 ngày đêm, mỗi ngày
thay nƣớc một lần. Vớt ra rửa sạch.

Nấu: nấu với dịch nƣớc đậu đen. 1kg Hà thủ ô đỏ, chế mỗi lần 200g đậu
đen với số lần khác nhau. Lấy theo số thứ tự:
Mẫu 1: 1kg HTOĐ 200g đậu đen làm 2 lần, mỗi lần 200g.
Mẫu 2: 1kg HTOĐ 200g đậu đen làm 4 lần, mỗi lần 200g.
Mẫu 3: 1kg HTOĐ 200g đậu đen làm 6 lần, mỗi lần 200g.
Cách chế dịch nƣớc đậu đen: lấy 200g đậu đen nấu với khoảng 2 lít nƣớc.
Nấu hạt đậu đen với nƣớc, gạn lấy dịch, thêm nƣớc vào bã đun tiếp đến khi nhìn
thấy dịch nƣớc đậu đen nhạt màu thì dừng lấy dịch nƣớc đậu đen. Gộp dịch
nƣớc đậu đen lại dùng để chế với hà thủ ô đỏ.
Sau đó nấu Hà thủ ô đỏ với dịch đậu đen đến khi chín lấy ra thái phiến dày
1-2 mm, tẩm dịch đậu đen sau đó sấy không quá 62
đến khô kiệt. Nghiền thành bột.
Bước 2: Chiết bột Hà thủ ô

16

trong khoảng 20 – 21 giờ


Lấy cồn 96% pha loãng với nƣớc cất đến 50%, đo bằng cồn kế, chiết xuất
mẫu với tỷ lệ dung môi dƣợc liệu là 3:1, cho dung môi chiết vào dƣợc liệu trong
bình nón, lắc đều, để yên 15 phút, rồi siêu âm trong thời gian 60 phút, gạn lấy
dịch chiết, lọc qua giấy lọc, làm nhƣ vậy 3 lần. Sau mỗi lần chiết, gộp các dịch
chiết lại thu đƣợc dịch chiết tổng.
Mẫu 1: 600g dƣợc liệu, chiết 3 lần, mỗi lần 1800ml ethanol 50%.
Mẫu 2: 620g dƣợc liệu, chiết 3 lần, mỗi lần 1860ml ethanol 50%.
Mẫu 3: 660g dƣợc liệu, chiết 3 lần, mỗi lần 1980ml ethanol 50%.
Sau đó dịch chiết 3 mẫu đƣợc cô cất quay thu hồi dung môi ở nhiệt độ
không quá 60 , cô tiếp đến khi đƣợc cao khô.
2.3.2. Định tính và bán định lượng thành phần THSG trong các mẫu

Hà thủ ô đỏ đã chế biến bằng phương pháp TLC-videoscan
2.3.2.1. Phương pháp chuẩn bị mẫu
Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử:
Cân chính xác khoảng 2,50 g cao khô Hà thủ ô đỏ, cho vào bình nón, cho
thêm 15 ml Ethanol tuyệt đối, siêu âm, trong 45 phút ở nhiệt độ thƣờng, gạn lấy
dịch chiết, làm nhƣ vậy 2 lần, lần sau chiết với 10ml Ethanol tuyệt đối, gộp dịch
chiết cho vào bình định mức 25ml, thêm ethanol tuyệt đối vừa đủ 25ml, sau đó
lọc dịch chiết bằng giấy lọc, dịch lọc dùng để chấm sắc ký.
Bước 2. Mẫu đối chiếu:
Pha dung dịch đối chiếu gốc THSG: Cân chính xác khoảng 0,0050g
THSG, hòa tan trong 5ml Ethanol, cho vào bình định mức 10 ml. Bồ sung dung
môi Ethanol tới vạch thu đƣợc dung dịch gốc có nồng độ 0,5 mg ml tƣơng ứng
với 0,5 µg/µl.
Chuẩn bị dãy dung dịch đối chiếu gốc THSG: Từ dung dịch đối chiếu gốc,
chấm sắc ký với các thể tích lần lƣợt là 5, 10, 15, 20, 25 µl . Làm nhƣ vậy ta
đƣợc dãy dung dịch chuẩn có nồng độ tƣơng ứng 2,5 µg/µl; 5,0 µg/µl; 7,5 µg/µl;
10,0 µg/µl; 12,5 µg/µl.
2.3.2.2. Định tính các chất trong cao khô Hà thủ ô đỏ
17