XÁC ĐỊNH các NHÓM ESCHERICHIA COLI gây TIÊU CHẢY ở TRẺ EM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH học PHÂN tử tại hà nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG

-----------------*-------------------

HOÀNG THỊ BÍCH NGỌC

XÁC ĐỊNH CÁC NHÓM ESCHERICHIA COLI GÂY
TIÊU CHẢY Ở TRẺ EM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SINH HỌC PHÂN TỬ TẠI HÀ NỘI

Chuyên ngành: Vi khuẩn học
Mã số
: 68 72 68 01

ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU SINH

Người hướng dẫn khoa học:
1. TS Hoàng Thu Hà
2. GS. TS Phùng Đắc Cam

HÀ NỘI – 2012


CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AA

: Aggregative adherence

ADN

: Acid Deoxyribo nucleic

A/E

: Attaching/effacing

AAF

: Aggregative adherence Fimbriae

BHI

: Broth Heart Infusion

CDC

: Centers for Disease Control and Prevention

CFA

: Colonization factor antigen

DEC

: Diarrhea Escherichia coli

EAEC

: Enteroaggregative E.coli

EHEC

: Enterohemorrhagic E.coli

EIEC

: Enteroinvasive E.coli

EPEC

: Enteropathogenic E.coli

ETEC

: Enterotoxigenic E.coli

DAEC

: Diffusely adherent E.coli

ELISA

: Enzyme Linked Immunosorbent Assay

KIA

: Kliger iron agar

LDC

: Lysine decarboxylase

LT

: Heat-Labile-Toxin

LTa

: Heat-Labile-Toxin a

LTb

: Heat-Labile-Toxin b

MLVA

: Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis

PCR

: Polymerase chain reaction

PFG

: Pulse-field gel electrophoresis

ST

: Heat-Stable-Toxin

VT

:Verocytotoxin

XLD

: Xylose lysine desoxycholate


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................1
PHẦN I.............................................................................................3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................3
1.1. Tiêu chảy và E.coli......................................................................................................3
1.1.1. Bệnh tiêu chảy......................................................................................................3
1.1.2. Escherichia coli....................................................................................................5
1.2. Các phương pháp chẩn đoán E.coli.............................................................................6

PHẦN II..........................................................................................14
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
.........................................................................................................14
2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu............................................................15
2.2. Vật liệu......................................................................................................................15
2.2.1. Vật liệu cho vận chuyển, nuôi cấy và xác định vi khuẩn...................................15
2.2.2. Vật liệu cho PCR đa mồi chẩn đoán E.coli........................................................16
2.3 Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu.........................................................................18
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................18
2.3.2. Kỹ thuật nghiên cứu...........................................................................................19
2.4. Xử lý số liệu..............................................................................................................24

2.5. Y đức.........................................................................................................................24

PHẦN III........................................................................................25
DỰ KIẾN KẾT QUẢ.....................................................................25
3.1. Xác định tỷ lệ các loại E.coli ở trẻ tiêu chảy và không tiêu chảy.............................25
3.2. Đánh giá mối liên quan giữa các gien độc lực của E.coli ở nhóm trẻ tiêu chảy và
không tiêu chảy......................................................................................................26
3.3. Đánh giá mối liên quan giữa các loại E.coli gây tiêu chảy và triệu chứng lâm sàng27

PHẦN IV........................................................................................29
DỰ KIẾN BÀN LUẬN..................................................................29
PHẦN V..........................................................................................30
DỰ KIẾN KẾT LUẬN..................................................................30
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tiêu chảy là bệnh phổ biến trên toàn cầu đặc biệt ở các nước đang
phát triển trong đó có Việt Nam. Theo tổ chức y tế thế giới bệnh tiêu chảy
chiếm khoảng 30% các trường hợp tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi. Tại Việt Nam
theo một số nghiên cứu mỗi trẻ tiêu chảy trung bình 3,2 lần/năm. Bệnh tiêu
chảy là gánh nặng về y tế, kinh tế cho xã hội, cho gia đình bệnh nhân [1].
Escherichia coli (E.coli) là căn nguyên phổ biến của viêm dạ dày ruột,
chiếm tới 20-30% các căn nguyên xác định gây tiêu chảy [5].
E.coli có 2 loại: E.coli gây bệnh tiêu chảy (Diarrhea Escherichia coli:
DEC) và E.coli không gây tiêu chảy. Việc xác định các loại E.coli gây tiêu
chảy dựa vào ngưng kết với kháng huyết thanh, thử nghiệm trên động vật thí

nghiệm, nuôi cấy trên tế bào, các kỹ thuật này thường mất thời gian, phức tạp
nhưng độ nhạy và độ đặc hiệu không cao.
Phương pháp sinh học phân tử như khuếch đại gien PCR (polymerase
chain reaction), điện di trong trường xung điện (pulse-field gel electrophoresis
- PFGE) hay phương pháp phân tích trình tự lặp locus đa hình (MLVAmultiple-locus variable-number tandem repeat analysis) trở thành kỹ thuật
phổ biến và đáng tin cậy để xác định nguồn gốc dịch, mối liên quan dịch tễ
học phân tử. Hiện tại, các kỹ thuật này đã được áp dụng ở những nước phát
triển. Tuy nhiên, tại Việt Nam nhóm kỹ thuật này chưa phát triển rộng rãi,
đồng thời chưa có một nghiên cứu nào sử dụng phương pháp sinh học phân tử
để đánh giá mức độ khác nhau giữa các gen của các chủng E.coli gây bệnh và
không gây bệnh. Do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này với mục
đích nghiên cứu các chủng DEC ở trẻ em Việt Nam bằng phương pháp sinh
học phân tử để:


2
- Xác định tỷ lệ từng loại E.coli ở nhóm trẻ tiêu chảy và không tiêu
chảy dưới 5 tuổi tại Hà Nội.
- Đánh giá mối liên quan giữa các gien độc lực của E.coli ở nhóm trẻ
tiêu chảy và không tiêu chảy dưới 5 tuổi bằng kỹ thuật PFGE và MLVA.
- Đánh giá mối liên quan giữa các loại E.coli gây tiêu chảy và triệu
chứng lâm sàng.


3

PHẦN I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tiêu chảy và E.coli

1.1.1. Bệnh tiêu chảy
Tiêu chảy là vấn đề y tế toàn cầu, là nguyên hàng đầu gây bệnh tật và
tử vong cho trẻ em các nước đang phát triển, ước tính trẻ dưới 5 tuổi tiêu chảy
3,2 lần/năm và trong 5 năm đầu đời có 4,9/1000 trẻ tử vong do tiêu chảy [42].
Tiêu chảy là tình trạng trẻ đi ngoài từ 3 lần trở lên trong 24 giờ,
phân lỏng, hoặc thay đổi tính chất bình thường của phân, kèm theo các
triệu chứng như sốt, nôn, đau bụng [11]. Tiêu chảy cấp là tiêu chảy dưới
14 ngày, tiêu chảy trên 14 ngày là tiêu chảy kéo dài, tiêu chảy trên 30
ngày là tiêu chảy mãn [1], [27].
Căn nguyên gây tiêu chảy chủ yếu là do virus, vi khuẩn, ký sinh trùng,
khoảng 60% các trường hợp tiêu chảy cấp xác định được căn nguyên gây tiêu
chảy [7], [33]. Các tác nhân gây tiêu chảy thường lây truyền qua thức ăn và
nước uống nhiễm tác nhân gây bệnh, qua đường phân - miệng, bàn tay bẩn
hoặc tiếp xúc trực tiếp với phân có chứa tác nhân gây bệnh. Do vậy hạn chế
tình trạng lây nhiễm bằng rửa tay trước khi ăn, sau khi đi vệ sinh, ăn chin,
uống sôi giảm đáng kể tình trạng lây nhiễm này. Những yếu tố làm tăng nguy
cơ tiêu chảy ở trẻ như trẻ nuôi hoàn toàn bằng sữa bột, trẻ suy dinh dưỡng…
Việc thực hiện chương trình kiểm soát và khống chế tiêu chảy của tổ chức y tế
thế giới (WHO) bao gồm tăng cường cho trẻ bú sữa mẹ, điều trị tiêu chảy cho
trẻ bằng bù nước và điện giải, giai đoạn sớm cho trẻ uống ORESOL, truyền
thông giáo dục sức khỏe đã làm giảm tỷ lệ mắc tiêu chảy.
Điều trị tiêu chảy tùy thuộc căn nguyên gây bệnh. Tiêu chảy do E.coli
ngoài bồi phụ nước và điện giải (uống ORESOL, truyền dịch) còn dùng
kháng sinh diệt vi khuẩn [6].


4
Tiêu chảy do E.coli chiếm khoảng 20%-30% các trường hợp tiêu chảy
[5], [47], [3]. Dựa vào tính chất gây bệnh chia E.coli gây tiêu chảy thành các
nhóm chính:

Enteropathogenic E.coli (EPEC): E.coli gây bệnh đường ruột
Enterotoxigenic E.coli (ETEC): E.coli sinh độc tố ruột
Enterohemorrhagic E.coli (EHEC): E.coli gây xuất huyết ruột
Enteroinvasive E.coli (EIEC): E.coli xâm nhập ruột
Enteroaggregative E.coli (EAEC): E.coli bám dính kết tập ruột
Diffusely adherent E.coli (DAEC): E.coli gây bám dính phân tán

Hình 1: Các loại E.coli gây tiêu chảy
Nguồn tài liệu />

5
Tại Tanzania DEC là căn nguyên phổ biến nhất gây tiêu chảy chiếm
22,9% ở trẻ dưới 5 tuổi [48]. Tương tự, tỉ lệ này ở Iraq là 25,9% [8]. Đặc biệt
tại Ấn Độ chiếm tới 43%, trong đó ETEC chiếm 37,21% [36]. Nghiên cứu tại
Thụy Sĩ cho thấy, bệnh tiêu chảy do DEC, EHEC chiếm tới 60% ở trẻ dưới
16 tuổi [59]. Tại Brazil thì tiêu chảy cấp do EPEC điển hình chiếm 6%, EPEC
không điển hình 6%, EAEC 4,7%, EIEC 2% [10]. Tại Tây Ban Nha nghiên
cứu được tiến hành ở người đi du lịch bị tiêu chảy thì ETEC chiếm tới 15.7%,
EAEC chiếm 13.4% và DAEC chiếm 9.14% [62].Theo Đỗ Thu Hương và
cộng sự, tại Việt Nam, trẻ dưới 5 tuổi tiêu chảy do DEC chiếm 24,9% [3].
Tương tự, Nguyễn Vũ Trung và cộng sự chỉ ra tỉ lệ DEC chiếm 29,04%,
trong đó EAEC chiếm 18,71%, EPEC 5,8%, EHEC chiếm 1,94%, và EIEC
1,94%, ETEC 0,62% [5].
1.1.2. Escherichia coli
Escherichia do Escherich phát hiện vào năm 1885. Giống Escherichia
gồm nhiều loài , trong đó E. coli là loại điển hình và có vai trò quan trọng [2].
E.coli là trực khuẩn Gram âm, di động, một số có vỏ, lên men đường Glucose,
Lactose và sinh hơi (trừ một số chủng EIEC), lên men đường Sorbitol (trừ đa số
EHEC), sinh Indol, không sinh H2S, không có enzyme Urease, không sử dụng
citrat trong môi trường simmons, khử Cacboxyl trong môi trường Lysine

decacboxylase … [30]. Nuôi cấy dễ dàng trên môi trường nuôi cấy thông thường,
hiếu kỵ khí tùy tiện, nhiệt độ thích hợp là 370C [1], [2].
Sau 24 giờ nuôi cấy khuẩn lạc dạng S (Smooth), có thể gặp dạng M
(Mucous) hoặc R (Rough).
Tại đường tiêu hóa E.coli có 2 loại E.coli gây tiêu chảy (DEC) và
E.coli thuộc hệ vi khuẩn bình thường của đường tiêu hóa. E.coli có thể gây
bệnh ở nhiều nơi trong cơ thể như nhiễm khuẩn tiết niệu, viêm màng não,
nhiễm khuẩn huyết…


6
1.2. Các phương pháp chẩn đoán E.coli
Thử nghiệm tính chất sinh vật hóa học
Dựa vào các tính chất để xác định E.coli, nhưng phương pháp này không
phân biệt được E.coli gây bệnh và E.coli của hệ vi sinh vật bình thường.
Chẩn đoán DEC bằng định typ huyết thanh
Vào năm 1944 Kauffman đề xuất phân loại E.coli dựa 3 loại kháng
nguyên. Kháng nguyên thân O (Somatic), kháng nguyên lông H (Flagellar),
kháng nguyên vỏ K (Capsular). Có 170 kháng nguyên O, mỗi loại xác định
một nhóm kháng nguyên, có 60 kháng nguyên H và 80 kháng nguyên K [57],
[63], [26]. Sự kết hợp giữa kháng nguyên O và H tạo các typ huyết thanh đặc
hiệu [30]. Các typ huyết thanh có mối liên hệ với DEC tuy nhiên 1 loại DEC
có thể có nhiều nhóm huyết thanh, 1 nhóm huyết thanh có thể có nhiều loại
DEC [40]. EPEC là nhóm đầu tiên được chẩn đoán bằng huyết thanh học,
theo tổ chức y tế thế giới (1987) đã thống nhất có 12 nhóm huyết thanh của
EPEC gây bệnh ở người: O26, O55, O86, O111, O114, O119, O124, O125, O126, O127,
O128, O142. [26], [40], [19]. ETEC gồm các nhóm chủ yếu: O6, O8, O15, O25, O27,
O63, O78, O115, O148, O153, O159, o167. EIEC gồm các nhóm phổ biến O28ac,
O112ac, O124, O136, O143, O144, O152, O164 [26]. Nhóm EHEC gây bệnh chủ yếu là
O157H7 [32].

Chẩn đoán DEC dựa vào kháng huyết thanh thực hiện đơn giản, tuy
nhiên giá thành đắt do vậy ít phòng thí nghiệm có đủ các týp huyết thanh để
chẩn đoán và độ nhạy, độ đặc hiệu không cao.
Chẩn đoán DEC dựa vào các phản ứng miễn dịch
Phản ứng ELISA, latex, miễn dịch huỳnh quang để phát hiện kháng
nguyên O, kháng nguyên H của EHEC O 157H7.. Phát hiện độc tố ruột ST của
ETEC qua miễn dịch phóng xạ [24], ELISA [56].


7
Chẩn đoán DEC dựa đặc điểm về độc lực
ETEC được phát hiện dựa trên yếu tố độc tố ruột LT (heat-labile), ST
(heat-stable) [41] và thử nghiệm trên thỏ [21]. Phát hiện được độc tố LT khi
nuôi cấy vào chuột Hamster [15]. LT gồm LT1, LT2 và 2 loại này không có
phản ứng chéo. LT1 gây bệnh cả trên người và động vật, LT2 gây bệnh hầu
hết trên động vật.
Phát hiện EAEC bằng nuôi cấy trên tế bào HEp-2 được coi là tiêu
chuẩn vàng chẩn đoán EAEC [1], [58], kỹ thuật này được mô tả lần đầu tiên
vào năm 1979 bởi Cravioto và cộng sự. EAEC có khả năng bám vào tế bào
HEp-2 bằng yếu tố bám dính AA(Aggregative Adherence) [49], [50].
EIEC: Phát hiện bằng thử nghiệm Sereny gây viêm kết giác mạc của
chuột lang, xâm nhập vào trong tế bào biểu mô và lan tràn từ tế bào này sang
tế bào khác [50].
Phương pháp chẩn đoán DEC dựa vào độc lực đòi hỏi nhân viên phòng
thí nghiệm có kinh nghiệm nhưng cũng không đặc hiệu 100%.
Phát hiện bằng sinh học phân tử
Phương pháp này phân biệt được DEC và E.coli thuộc hệ vi khuẩn bình
thường. DEC là một trong những vi khuẩn đầu tiên được phát hiện bằng
phương pháp này.
DNA đầu dò như phát hiện độc tố chịu nhiệt (ST) và không chịu nhiệt (LT)

của ETEC [28].
PCR phát hiện EPEC
EPEC bám dính vào bề mặt tế bào ruột và hủy hoại tổ chức tại chỗ.
EPEC có yếu tố A (attaching) và yếu tố E (effacing) tác dụng làm cho
vi khuẩn bám dính và phá hủy nhung mao ruột, yếu tố này được phát hiện khi
nuôi cấy vào tế bào thực nghiệm và khi vi khuẩn phát triển trên cơ thể người
cũng gây tổn thương tương tự [45], [22].


8
Cơ chế bám dính được chia làm 3 giai đoạn [1]:
- Sự bám dính khu trú: Do bfp (bundl forming pilus) thực hiện, bám
dính dưới dạng tua (Fimbriae), có khuynh hướng kết thành bó, yếu tố này
được mã hóa bởi gen bfpA nằm trên plasmid EAF, đặc hiệu cho EPEC và
không có ở hệ vi khuẩn bình thường [1], [25].
- Xâm nhập vào tế bào chủ: Bằng các protein tiết của EPEC (EPECsecreted proteins: Esps) gồm espA, espB, espD [39], các protein này được mã
hóa bởi các gen espA, espB, espD nằm trên vùng chromosome kí hiệu LEE
(locus of enterocyte effacement), vùng này cũng có gen mã hóa cho hệ thống
tiết sep, esc [49], LEE không có ở hệ vi khuẩn bình thường và ETEC, có chủ
yếu của EPEC và EHEC [1].
- Sự dính mật thiết: vi khuẩn dính vào biểu mô ruột qua trung gian là một
protein màng ngoài gọi intimin, yếu tố này được mã hóa bởi gen eaeA, cùng với
cụm gen LEE tạo ra tổn thương A/E [1], [31]. Intimin có cả EPEC và EHEC.

Hình 2: Cơ chế gây bệnh của EPEC.
Nguồn tài liệu theo />

9
Mồi được chọn cho EPEC là eae và bfpA. Nếu dùng PCR phát hiện có
gen eae là EPEC điển hình và/hoặc không điển hình, nếu có bfpA xác định đó

là EPEC điển hình [10].
PCR phát hiện EHEC
EHEC còn gọi E.coli sinh độc tố Shiga. Độc lực chính của EHEC là
độc tố Stx (Shiga toxin) hay độc tố gây độc với tế bào Vero (Verocytotocin) vì
vậy thuộc nhóm VTEC (Verocytotocin E.coli). EHEC gây bệnh theo 2 cơ chế
chính:
- Tổn thương (A/E): Gồm một protein màng ngoài intimin và cụm gen
độc lập (LEE) gồm: eaeA, espA, espB, espD, sep, esp.
- Tiết ra độc tố Stx (Shigalike-toxin): Là ngoại độc tố gây độc cho cơ
thể. Stx gồm 2 typ chính Stx1 và Stx2, không có phản ứng chéo do vậy mỗi
chủng có thể bộc lộ Stx1 hoặc Stx2 hay cả 2 loại Stx1 và Stx2 [34], [43]. Mỗi
Stx có tiểu đơn vị A có tính chất của enzyme, tiểu đơn vị B gắn thụ thể đặc
hiệu Gb3, thụ thể này có ở tế bào biểu mô ruột, thận, mạch máu do vậy gây
chảy máu đường ruột, shock. E.coli O157H7 thường thuộc nhóm này [64].
PCR sử dụng 2 cặp mồi riêng biệt để phát hiện gen mã hóa cho Stx1 và Stx2.
Do các gen Stx thường mất đi trong quá trình cấy chuyển, nên trong ADN dò
và PCR thì gen eae được phát hiện kết hợp xác định Stx để xác định các
chủng EHEC [54]. EHEC là phân nhóm của verocytotoxin (VT) sản phẩm
của E.coli (VTEC), có 2 typ chính của VT là VT1 và VT2. Xác định VT1 và
VT2 qua ADN dò phát hiện EHEC [66].
PCR phát hiện ETEC
ETEC là một trong những vi khuẩn đầu tiên được phát hiện bằng PCR
vào năm 1982 [46]. ETEC được coi là nguyên nhân chủ yếu gây tiêu chảy của
khách du lịch và trẻ em ở các nước phát triển. Tiêu chảy do ETEC thường


10
khởi phát đột ngột, phân toàn nước, không có nhày, mủ, máu, đôi khi bệnh
nhân có sốt, buồn nôn, nôn, đau bụng.
Độc tố ruột là yếu tố quyết định khả năng gây tiêu chảy. Có 2 loại độc tố:

độc tố chịu nhiệt ST (heat stable toxin) và độc tố không chịu nhiệt LT (heat
labile toxin). Có chủng ETEC chỉ có ST hoặc LT nhưng có những chủng có cả
ST và LT [65], [55].
- Độc tố ST gồm STa (STI) và STb (STII) được sản xuất bởi ETEC và một
số vi khuẩn Gram âm khác. Độc tố ST được mã hóa bởi 2 gen estA và st1.
EAST lúc đầu được tìm thấy ở EAEC, sau đó được tìm thấy ở nhiều chủng
EHEC. Một số chủng ETEC có STa, STb và EAST [65].
- Độc tố LT là ngoại độc tố, gồm 2 loại: LT-I gây bệnh cho người và động
vật, LT-II chủ yếu ở động vật hiếm khi ở người [16]. LT được mã hóa bởi 2
gen là elt hoặc etx, các gen này nằm trên plasmid và nó cũng chứa gen mã hóa
cho ST [30].
Kỹ thuật PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để phát hiện đoạn gen mã
hóa cho ST và LT [55], [18]. Hiện đã sử dụng một số mồi kết hợp để phát hiện
các tác nhân gây bệnh đường ruột khác [35], [61], [52].
PCR phát hiện EIEC
Vi khuẩn bám rồi xâm nhập vào niêm mạc ruột, nhân lên nhanh chóng
trong niêm mạc ruột, vi khuẩn lan từ tế bào này sang tế bào khác, khi vi
khuẩn chết giải phóng độc tố làm hủy hoại niêm mạc ruột. Các gen mã hóa
cho quá trình xâm nhập nằm trên cả plasmid và chromosome.
Để xác định EIEC xác định gen ial hoặc gen IpaH [60]. EIEC có thể
mất 1 phần hoặc toàn bộ plasmid pInv do vậy phản ứng cần thực hiện sớm.
PCR phát hiện EAEC
EAEC là tác nhân gây tiêu chảy thường gặp ở người đi du lịch, gặp
nhiều ở cả các nước đang phát triển và phát triển. EAEC thường gây tiêu chảy


11
kéo dài hoặc mãn tính. EAEC ngày càng đóng vai trò quan trọng gây tiêu
chảy ở trẻ em, chiếm tới 15% ở các nước đang phát triển và khoảng 4% ở các
nước phát triển [29]. Cơ chế gây bệnh của EAEC liên quan đến:

- Diềm bám dính kết tập AAF (Aggregative adherence fimbriae) là yếu
tố độc lực quan trọng nhất. AAF gồm: AAF/I và AAF/II có cấu trúc bó,
AAF/III có dạng sợi riêng biệt. Các AAF tạo kiểu bám dính hình chồng gạch
trên tế bào Hep-2.
- Yếu tố aggR điều hòa sự biểu hiện bám dính kết tập AAF
- Protein Pet được tiết qua màng ngoài vi khuẩn, gây tích tụ dịch và gây
độc cho tế bào biểu mô đường tiêu hóa.
- Độc tố EAST-1(enteroaggregative heat- stable toxin- 1) có khả năng
phá hủy tế bào biểu mô ruột.
- Ngoài ra EAEC còn tiết protein gây tan máu và mất thăng bằng vận
chuyển ion qua màng tế bào ruột.
Các yếu tố độc lực được mã hóa bởi các gen nằm chủ yếu trên plasmid. Bao
gồm các gen điều hòa chi phối yếu tố bám dính kết tập aggR, protein tiết aap,
độc tố astA….EAEC Khi gây bệnh trên người gồm 3 bước [50]:
- EAEC xâm nhập lên bề mặt tế bào biểu mô ruột bằng yếu tố AAF.
- EAEC tăng tiết chất nhày tạo màng nhày, dày của vi khuẩn trên bề mặt tế
bào biểu mô.
- EAEC tiết độc tố lên bề mặt niêm mạc ruột.
EAEC làm nhung mao ruột ngắn dần do hoại tử, chảy máu do vậy bệnh
nhân đi ngoài phân thường có máu [14], có đáp ứng viêm nhẹ với sự tăng sinh
bạch cầu đơn nhân. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử không có sự bám dính
và xâm nhập như EPEC.


12
Giả thiết về gen độc lực của EAEC và các yếu tố độc lực [17], [51]
Gen
Gen điều hòa
aggR

Fimbriae
aggA
aafA
agg3
Enterotoxins
astA
pet
OMPs
OMP
Dispersin
transporter
aatA
Protein tiết
Aap
pic
Yersiniabactin
system
Irp2
Lectin
Lectin

Yếu tố độc lực
Kiểm soát hoạt động của 1 nhóm gen độc lực nằm trên
plasmid: gen mã hóa yếu tố AAF (AAF/I và AAF/II),
protein phân tán và 1 cụm gen lớn chèn vào locus PheU
Mã hóa AAF/I và sự kết dính của hồng cầu
Mã hóa AAF/II (yếu tố bám dính vào tế bào tiết nhày)
Mã hóa AAF/III
Mã hóa độc tố chịu nhiệt, tương tự độc tố STa.
Mã hóa enterotoxin và cytotoxin

Hỗ trợ yếu tố bám dính của EAEC và yếu tố ngưng kết
hồng cầu.
Mã hóa protein ABC, chịu trách nhiệm vận chuyển, phân
tán
Mã hóa protein phân tán
Mã hóa cho serine protease autotransporter protein
Mã hóa hệ thống hấp thu sắt

Phức hợp carbohydrate

PCR phát hiện DAEC
DAEC lần đầu được phát hiện khi xác định được các chủng E.coli bám
dính vào tế bào HEp-2 nhưng không phải EPEC. Tuy nhiên, sự hiểu biết về
DAEC chưa nhiều. Một số nghiên cứu chứng minh DAEC là căn nguyên gây
tiêu chảy [44], [13]. DAEC được phát hiện dựa trên đặc điểm bám dính


13
(Diffuse adherence: DA) khi nuôi cấy trên tế bào HEp-2 và tế bào HeLa. Các
chủng DAEC có yếu tố bám dính vỏ (Afimbrial adhesive sheaths: Afas), yếu
tố này được mã hóa bởi gen afa bao gồm các gen: afaA, afaB, afaC, afaD,
afaE [38].
Phương pháp điện di trong trường xung điện (PFGE: pulse field gel
electrophoresis)
Phương pháp này được Schwartz và Cantor giới thiệu lần đầu tiên năm
1984, nguyên tắc của phương pháp này là s ử dụng enzym giới hạn để cắt
phân tử ADN của vi khuẩn tại những vị trí đặc hiệu, tạo ra mẫu ADN đặc
trưng, gồm các đoạn ADN có kích thước lớn khoảng 10 - 500 kb và được
phân tách rời nhau sau khi điện di trên trường điện thay đổi. Kết quả phân tích
thể hiện bởi các band khác nhau trên thạch điện di, những chủng có chung

nguồn gốc sẽ cho các mẫu ADN giới hạn với tất cả số band giống hệt nhau,
những chủng có liên quan với nhau, hay có thể liên quan với nhau sẽ khác
nhau 2-3 band hay 4-6 band, những chủng hoàn toàn không có liên quan với
nhau khi khác nhau trên 6 band [20], [23].
Các bước cho phương pháp này:
- Chuẩn bị ADN cho PFGE
- Xử lý ADN với enzyme giới hạn loại có ít điểm cắt
- Tách trong trường xung điện.
Dựa vào phương pháp PFGE có thể xác định được nguồn dịch, xác định
các yếu tố dịch tễ học trong điều tra dịch, nhanh chóng xác định nguồn dịch.
Phương pháp phân tích trình tự lặp của locus đa hình (MLVA: Multiplelocus variable-number tandem repeat analysis)


14
Dựa trình tự các đoạn lặp của locus, xác định sự khác nhau của các
locus đa hình. Các bước phản ứng:
- Tách chiết ADN từ các mẫu thử nghiệm
- PCR để nhân đoạn có tính chất đa hình với các mồi đặc hiệu
- Điện di phân tích độ dài của các sản phẩm PCR thu được đối từng
locus đa hình.
- Phân tích thống kê dựa tần số xuất hiện các trình tự lặp để tính được
xác suất chính xác [12], [9].

PHẦN II
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


15

2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đối tượng
- Trẻ dưới 60 tháng tuổi bị tiêu chảy (theo định nghĩa WHO) đến khám
và điều trị tại Bệnh viện nhi Trung ương, bệnh viện Saintpaul, bệnh viện đa
khoa Ba Vì.
Mỗi bệnh nhân được lấy 1 mẫu phân ngay khi bệnh nhân mới đến viện.
Các yếu tố liên quan đến tình trạng bệnh của trẻ, được khai thác qua
bảng câu hỏi.
- Trẻ dưới 60 tháng tuổi không bị tiêu chảy (thời gian trên 2 tuần tính
đến thời điểm lấy mẫu) tại một số điểm tiêm chủng, nhà trẻ, mẫu giáo trên địa
bàn Hà Nội.
Địa điểm nghiên cứu
Bệnh viện nhi Trung ương.
Bệnh viện Saintpaul.
Bệnh viện đa khoa Ba Vì.
Một số trạm xá, nhà trẻ, mẫu giáo của một số xã, phường trên địa bàn
Hà Nội.
Thời gian nghiên cứu
Từ 2011- 2014
2.2. Vật liệu
2.2.1. Vật liệu cho vận chuyển, nuôi cấy và xác định vi khuẩn.
- Môi trường sinh phẩm:
Môi trường vận chuyển Cary-Blair
Môi trường nuôi cấy: Mac-Conkey, XLD, SMAC
Test sinh vật hóa học: KIA, thạch mềm, Ure-Indol, Citrat-simmon
Môi trường giữ chủng BHI 30% (Broth Heart Infusion)


16
- Máy móc và dụng cụ:
Cân điện tử 4 số

Máy đun, máy khuấy từ
Tủ hốt vô trùng
Tủ ấm 370C
Tủ lạnh thường
Tủ lạnh âm 720
Que cấy 1µl, 10µl (bằng nhựa, vô trùng, dùng 1 lần), hộp lồng 90mm,
ống nghiệm, bình cầu, hộp nhựa vô trùng đựng phân…
2.2.2. Vật liệu cho PCR đa mồi chẩn đoán E.coli.
Hóa chất sinh phẩm
- Các chứng cho nghiên cứu [53], [37]
Loại E.coli
EPEC
EHEC
EHEC
ETEC
EAEC
EIEC
DAEC
E.coli chứng âm

Chủng
ATCC 43887
ATCC 43890
ATCC 43889
ATCC 35401
97Ra
ATCC 43893
KS52
ATCC 11775

- Tiêu chuẩn xác định loại E.coli gây tiêu chảy [53]
EPEC có gen bfpA và eaeA
ETEC có gen eltB và/hoặc estA
EHEC có gen vt1 và/hoặc vt2
có gen eaeA chẩn đoán EHEC điển hình
EIEC có gen ial
EAEC có gen pCVD

Gen đích
eaeA, bfpA
vt1, eaeA
vt2, eaeA
eltB,estA
pCVD
ial
afaBC
Không có gen độc lực


17
DAEC có gen afaBC
- Các cặp mồi sử dụng [38], [53].
Môi
bfpA

Gen
đích
bfpA

LT

eltB

ST

estA

VT1

vt1

VT2

vt2

eae

eaeA

SHIG

ial

EA

pCVD

afa

afaBC

Cỡ sản
Trình tự nucleotid (5’–3’)

phẩm PCR
(bp)

TTCTTGGTGCTTGCGTGTCTTTT
TTTTGTTTGTTGTATCTTTGTAA
TCTCTATGTGCATACGGAGC
CCATACTGATTGCCGCAAT
GCTAAACCAGTAGAGGTCTTCAAAA
CCCGGTACAGA GCAGGATTACAACA
GAAGAGTCCGTGGGATTACG
AGCGATGCAGCTATTAATAA
ACCGTTTTTCAGATTTTGA CÂCTA
TACACAGGAGCAGTTTCAGACAGT
CACACGAATAAACTGACTAAAATG
AAAAACGCTGACCCGCACCTAAAT
CTGGTAGGTATGGTGAGG
CCAGGCCAACAATTATTTCC
CTGGCGAAAGACTGTATCAT
CAATGTATAGAAATCCGCTGTT
GCT GGG CAG CAA ACT GAT AAC TCTC
CAT CAA GCT GTT TGT TCG TCC GCCG

Kit tách chiết ADN (QIAamp- Đức)
Dung dịch đệm PBS 10X
- Hóa chất sinh phẩm cho phản ứng PCR
Taq PCR master mix (QIAamp – Đức)

100bp ADN Ladder (invitrogen)
Đệm TBE 10X (UtraPure™ 10X TBE)

367
322
147
130
298
376
320
630
750


18
Thạch điện di (MBI Fermentas- Đức)
Nước tinh sạch.
Máy móc, dụng cụ
Máy khuếch đại gen (MyCycler- Bio-Rad).
Máy điện di power-pac 300 (Bio-Rad).
Máy ly tâm (Eppendorf Centrifuge 5415R– Đức).
Máy ủ nhiệt (Thermomixer comfort)
Máy votex (Fisher Brand)
Máy chụp gel (Bio-Rad)
Bộ micropipettes (Bio-Rad)
Máy đo nồng độ ADN (eppendorf)
Máy đo pH
Tủ ấm 370C, tủ lạnh -200C, -800C, lò vi sóng
Tube 0.2ml, 2ml
Đầu côn các loại

2.3 Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả có phân tích

Cỡ mẫu
Số trẻ cần đưa vào nghiên cứu cho mỗi nhóm được tính theo công thức sau:
n=

Trong đó:
n: cỡ mẫu

Z12− α/2 × p × (1 − p)
d2


19
Z: hệ số tin cậy
α: độ tin cậy (α =95% thì Z=1,96)
d: giá trị tương đối ( chọn d = 0,05)
p: tỷ lệ nghiên cứu tính từ một nghiên cứu khác
Lấy p = 0,25 [3], tính được cỡ mẫu n = 289. Làm tròn cỡ mẫu n=290.
Với 290 trẻ mỗi nhóm, dự kiến chia 2 nhóm:
Từ 0 đến 24 tháng: 145 trẻ
Từ 25 đến 60 tháng: 145 trẻ
2.3.2. Kỹ thuật nghiên cứu
- Phương pháp thu thập mẫu phân từ bệnh nhân
- Phương pháp xác định E.coli từ phân của bệnh nhân tiêu chảy
+ Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn
+ Phương pháp xác định vi khuẩn bằng tính chất sinh vật hóa học

- Phương pháp PCR xác định từng loại E.coli gây tiêu chảy
+ Phương
của khám,
E.coli nhập viện không do tiêu
Trẻ khám, nhập
viện dopháp
tiêu tách
chảychiết ADN Trẻ
(n=290)
chảy (n=290)
+ Xác định các loại DEC bằng PCR đa mồi

- Phương pháp điện trường xung (PFGE: pulse field gel
electrophoresis) và MLVA (multiple-locus variable-number tandem repeat
analysis) để so sánh các gien độc lực của các chủng DEC giữa trẻ tiêu chảy
và không tiêu chảy.
-Dương
Xử lý kết
tínhquả
với DEC
(n=73)
(25%)

Sơ đồ nghiên cứu

Dương tính với DEC
(n=26)
(9%)

So sánh gen độc lực của DEC

giữa trẻ tiêu chảy và không tiêu chảy
(PFGE, MLVA)


20
Mẫu phân

Các bước tiến hành:
Phương pháp thu thập mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy
Dùng que tăm bông vô trùng lấy phân từ bô (bô khô, sạch, không có
chất sát khuẩn) hoặc từ tã của trẻ, lấy khoảng 5g phân (hoặc 5 ml phân), chọn
chỗ phân có nghi ngờ như nhày, máu, mũi... cho vào lọ vô trùng.
Dùng tăm bông vô trùng (tẩm ẩm bằng nước muối sinh lý) lấy phân từ
trực tràng bệnh nhân.
Bệnh phẩm lấy xong chuyển ngay về phòng xét nghiệm Vi sinh. Thời gian
vận chuyển quá 2 giờ cho phân vào môi trường vận chuyển Cary-Blair [4].
Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn E.coli
Chọn môi trường nuôi cấy Mac-Conkey, SMAC và XLD: Bệnh phẩm
sau khi được cấy vào môi trường, ủ 370 C trong 18-24 giờ. Chọn khuẩn lạc
dạng S, lên men đường lactoza trên Mac-Conkey và XLD, khuẩn lạc không


21
lên men đường Sorbitol trên môi trường SMAC để thử tính chất sinh vật hóa
học của E.coli [4]
KIA
TCSVHH

Glucoza Lactoza

E.coli

+

+/-

MIU
H2S

Sinh

Di

hơi

động

+

+/-

-

Indole

Ureaza

+

-

Giữ chủng E.coli trong môi trường giữ chủng, bảo quản ở -700C đến
khi làm các kỹ thuật tiếp theo.
Phương pháp PCR đa mồi chẩn đoán E.coli gây tiêu chảy
- Tách chiết ADN của E.coli [53]
Lấy khuẩn lạc sau khi nuôi cấy, hòa vào 5 ml dung dịch đệm PBS để
tạo huyền dịch vi khuẩn, tương đương 4 MacFarland (10 9- 5.109 vi khuẩn/ml).
Đun 2000 C trong 20 phút để phá vỡ màng tế bào vi khuẩn, ADN được giải
phóng.
Ly tâm 4800 vòng trong 10 phút, thu dịch nổi để làm PCR.
- Sử dụng PCR đa mồi với các cặp mồi đặc hiệu, tìm các đoạn gen quy
định EPEC, ETEC, EHEC, EIEC, EAEC, DAEC. Trình tự mồi lấy từ nguồn
của Genbank.
- PCR đa mồi xác định E.coli tiêu chảy [53]
Thành phần bao gồm :
ADN :

2µl

Taq PCR master mix:

12,5µl

Các mồi xuôi:

0.2 µM

Các mồi ngược:

0,2 µM

Trừ VT1 0,4 µM (INTERACTIVA Biotechnologie GmbH, Ulm,
Germany)
Tổng thể tích

25 µl


22
Phản ứng được thực hiện trên máy gene MyCycler- Bio-Rad. Điều kiện
như sau:
30 chu kỳ bao gồm: 96oC trong 5 phút, 94oC trong 30 giây, 55oC trong
30 giây và 72oC trong 1 phút.
72oC trong 7 phút.
Sản phẩm PCR sẽ được điện di trên gel agarose 1,5% để tách biệt các đoạn
ADN. Nhuộm gel bằng Ethidium bromide, sau đó nhìn dưới tia cực tím để thấy
các đoạn ADN. Đồng thời chạy Marker với các chủng chứng nghiên cứu.
Kết quả:
Tiêu chuẩn xác định loại E.coli gây tiêu chảy [53]
EPEC có gen bfpA và eaeA
ETEC có gen eltB và/hoặc estA
EHEC có gen vt1 và/hoặc vt2
có gen eaeA
EIEC có gen ial
EAEC có gen pCVD
DEAC có gen afaBC
Nếu PCR đa mồi âm tính thì mẫu được coi là âm tính với E.coli gây
tiêu chảy.
Nếu PCR dương tính thì dựa kích thước các band trên gel so sánh với
Marker để xác nhận loại E.coli gây tiêu chảy có trong phân và kiểm chứng lại

bằng PCR đơn mồi.
Phương pháp điện di trong trường xung điện (PFGE – pulse field gel
electrophoresis) theo thường qui của trung tâm kiểm soát dịch bệnh Hoa kỳ
(CDC) Theo />