CHUYÊN ĐỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG

Chuyên đề:
SẮC KÝ LỚP MỎNG

A.

TỔNG QUÁT SKLM

I. Phương pháp sắc ký
- Năm 1906, nhà bác học người NgaMikhail Tswett (1872-1919) đã cho

dung dịch các sắc tổ thực vật (Clorophyl và Xanthophyl ) trong ete dầu
hỏa lên cột nhồi bột mịn Calci carbonat, ông thấy các sắc tố bị hấp phụ
trên đầu cột
- Khi cho dung môi nguyên chất (ete dầu hỏa) lên cột, các sắc tố di
chuyển trong cột từ trên xuống dưới, mỗi sắc tố có một tốc độ riêng, tách
thành những vùng hay vòng màu xếp chồng lên nhau, hình thành một hệ
mà Tsvet gọi sắc đồ. Ông đặt tên cho phương pháptách này là sắc ký
(chromato-graphy).

- KN : Sắc ký(Chromatography) là phương
pháp tách, phân ly, phân tích các chất dựa
vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa
hai pha động và pha tĩnh.

II. Sắc ký lớp mỏng
1.Lịch sử hình thành








1938,Izmailov và Schraiber:(bản thủy tinh để phân tách
dịch chiết alcaloid thực vật).
1958, Stahl đã hoàn thiện và chuẩn hóa phương pháp
SKLM (silicagel, CaS,0.25mm).
1965, hãng Merck chuẩn hoá bảng mỏng sắc ký

2.Khái niệm
Sắc ký lớp mỏng ( TLC: Thin Layer
Chromatography) là một kỹ thuật tách các chất
được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua
pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần
tách

3. Nguyên tắc
Dựa vào cơ chế hấp phụ là chính trong đó:
- Pha động là dung môi (hỗn hợp các dung môi).
- Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền
phẳng như tấm kính, nhựa hay kim loại.
a) Pha động
Hệ dung môi gồm 2 hay 3 thành phần.
- Dung môi xếp theo thứ tự mạnh dần :
“Kém phân cực – Phân cực TB – Phân cực mạnh”
VD: Chloroform : Methanol : Nước (65:35:7)


b) Pha tĩnh
Yếu tố quyết định đến quá trình tách sắc ký

- Khả năng phân tách của pha tĩnh phụ thuộc nhiều vào mức độ
tiếp xúc của pha tĩnh với mẫu thử của pha động
-Yếu tố này liên quan nhiều tới diện tích bề mặt riêng và mật độ
của pha tĩnh. Mật độ của pha tĩnh cao, khả năng tạo cân bằng
pha càng lớn, hệ càng phân tách tốt.
- Pha tĩnh Thông dụng nhất dùng trong sắc ký hấp phụ hiện nay
là Silica gel.

Pha tĩnh
Silicagel G

Cơ chế sắc ký

Phân tích

Hấp phụ

A.amin, vitamin

Dẫn chất siloxan Phân bố

Chất ít phân cực

Cellulose

Phân bố

A.amin, carbohydrat

Alumina

Hấp phụ

Hydrocarbon, lipid

Cát biển

Phân bố

Đường, acid béo

Cellulose trao đổi Trao đổi ion
ion

Ion KL, halogenid

Gel sephadex

Protein, polymer

Loại cỡ

Vd: để phân tách a.amin trong mẫu dd ta cần lựa chọn pha tĩnh là Silica
gel G, để tách hydrocacbon cần dùng Alumina


Bình triển khai

Tủ hút

Bộ sắc ký

Những dụng cụ
cần thiết

Tủ sấy
Đèn tử ngoại


B. CÁC BƯỚC CHUẨN BI
CHUẨN BỊ BẢN MỎNG

01

ĐIỀU CHẾ VỮA

02

CHUẨN BI BÌNH KHAI TRIỂN

03

CHẤM CHẤT PHÂN TÍCH
04
TRIỂN KHAI SẮC KÝ
05

1. Chuẩn bị bản mỏng
- Bản mỏng dính chắc: chất hấp phụ được
trộn thêm 5 – 15% chất kết dính (thạch

cao, tinh bột, dextrin)
- Bản mỏng không dính chắc.
2. Điều chế vữa của chất hấp phụ
Chất hấp phụ được chọn lọc sao cho phù hợp với
yêu cầu phân tích như: Silicagel, cellulose, nhôm
oxyd… (silicagel được dùng thông dụng nhất).
Hoạt hóa:


Cho các bản mỏng đã khô mặt vào tủ sấy ở 105 –
110/30 phút. Ðể nguội rồi bảo quản trong bình hút
ẩm.
3. Chuẩn bị bình khai triển
- Các bình khai triển thường là bình thủy tinh, hình
hộp hay hình trụ, có nắp đậy kín
- Lưu ý: chọn bình phù hợp với lượng dung môi
pha động theo nhu cầu và lượng dung môi trong
bình không vượt quá vạch dưới bảng mỏng ( vạch
chấm chất phân tích)

4. Chấm chất phân tích lên bản mỏng
- Dùng pipet hoặc ống nhỏ giọt đưa mẫu lên
bản.
- Lượng mẫu đưa lên bản phải phù hợp.
- Đối với dung dịch phân tích quá loãng, có thể
thêm mẫu.
5. Triển khai sắc ký
 Là quá trình tách cấu tử trên bản mỏng

Thông số đặc trưng của pp

Hệ số lưu giữ Rf
-

Thông số này thể hiện cho khả năng di chuyển của những
chất cần tách

0:chất tan hoàn toàn không di chuyển, nằm tại điểm xuất
phát.
1: chất tan di chuyển cùng với vận tốc dung môi.
: khoảng cách di chuyển được của chất cần tách.
: khoảng cách di chuyển được của dung môi.
v: vận tốc di chuyển của chất cần tách.
: vận tốc di chuyển dung môi.

Các yếu tố ảnh hưởng đến Rf







Chất lượng và hoạt tính của chất hấp phụ
Chiều dài của lớp mỏng, quãng đường của sắc ký,
lượng chất chấm
Vị trí và số lượng chất cần tách trên bảng mỏng
Thành phần và độ tinh khiết của pha động
Phương pháp triển khai sắc ký






Ảnh hưởng của các cấu tử khác trong phần hỗn hợp cần
tách
Độ ẩm , nhiệt độ, pH
Độ bão hòa của dung môi ( hiện tượng “bờ” )

D. ỨNG DỤNG VÀ CÔNG DỤNG
SKLM
1. Định tính và thử độ tinh khiết:
- Để nhận biết sự có mặt của chất cần tách trong dd mẫu, ngoài ra còn
nhận biết được 1 số tạp trong dd mẫu để đánh giá độ tinh khiết dd mẫu

� Ưu điểm
- Nhanh
- Tách riêng từng chất
- Dễ thực hiện
� Nhược điểm
- Thành phần pha động dễ thay đổi
- Các vết sau khi khai triển thường bị kéo
đuôi
- Chỉ sử dụng khi hỗn hợp cần tách số
lượng ít

vết bị kéo đuôi

2. Bán định lượng – định lượng
2 pp: tách chiết bằng dung môi và định lương trực tiếp trên bảng
mỏng
-

-

Tách chiết chất phân tích trong sắc ký bằng dung môi :
(làm sạch dịch chiết định lượng)
---) mất nhiều thời gian nên ít sử dụng
Định lương trên bảng mỏng : đo điện tích hay cường độ vết
sắc ký
có 2 kĩ thuật
+ Dùng máy đo mật độ quang Densitometer : chiếu chùm
tia vào vết sắc ký và đo cường độ hấp phụ hoặc huỳnh
quang
+ Xử lý ảnh với camera kĩ thuật số độ phân giải cao: quét
bảng mỏng với hệ thống phân tích thu nhận hình ảnh của
vết sắc ký. Xử lý dữ liệu ảnh bằng máy tính


Xác định sắc tố trong tế bào thực vật
Xét nghiệm độ tinh khiết của chất phóng xạ

Giám sát Phản ứng hữu cơ
Nhận biết những hợp chất trong 1 chất có sẵn

Xác định sắc tố trong TBTV

E. CÁC HIỆN TƯỢNG NGOÀI Ý VÀ
CÁCH KHẮC PHỤC
Hiện tượng

Nguyên nhân

Khắc phục

Vết di chuyển không
hoàn toàn

Mẫu còn nhiều tạp phân cực

Loại tạp kĩ hơn trước khi chấm
lên bản

Vết hình móng ngựa

Vết chấm hình tròn quá lớn

Chấm nhỏ hơn với nồng độ cao
hơn hoặc chấm vạch

Các vết lân cận trùng
vào nhau

Chấm các vết quá gần

Chấm khoảng cách vết theo
đúng quy định

Vết hình ngọn lửa nhiều Chấm vết không trùng nhau Chấm kỹ lại trên bản mỏng khác
đầu

Bản mỏng bị mẻ ở hai bờ,
Thay bản mỏng khác hoặc thay
Tuyến dung môi bị lệch thành bản mỏng tiếp xúc dung
nắp bình, thay bình SK
môi, hở bình sắc ký


Vết trải dài không tách

Chọn DM sắc ký chưa tốt Thăm dò lại hệ DM SK hoặc chọn
hoặc DM chiết không chuyên DM chiết xuất mẫu riêng biệt
biệt

Vết di chuyển xéo

Bản mỏng bị mẻ ở hai bờ, Thay bản mỏng khác, thay bình
thành bản mỏng tiếp xúc DM
SK khác

Vết loang

Vết khuếch tán do bay hơi vì Vẽ chụp hình ngay khi hiện màu
để lâu hoặc nhúng thuốc thử xong hoặc nhúng nhanh, loại bỏ
quá lâu

thuốc thử dư

Bản mỏng bị loang màu
ở dưới

vd
vd

Bản mỏng đặt sát nền

Kê bản mỏng cách xa nền (dùng
que thủy tinh hoặc kẹp treo)


Ưu và nhược điểm của TLC
Ưu điểm
- Đơn giản, dễ thực hiện
- Tiết kiệm thời gian
- Có thể phát hiện tất cả các

chất kể cả những chất
không di chuyển theo pha
động
- Tách dễ dàng các mẫu có
nhiều thành phần
- Phạm vi ứng dụng rộng rãi

Nhược điểm
- Chỉ

số Rf có độ lặp lại thấp do

thành phần pha động thay đổi
trong lúc triển khai sắc ký
- Tăng giãn rộng vết do khuết tán
vì tốc độ dòng pha động thấp