Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ Berberine hydrochloride của vật liệu cellulose tạo ra từ vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus trong một số môi trường nuôi cấy

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

HOÀNG THU THẢO

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
BERBERINE HYDROCHLORIDE CỦA VẬT LIỆU
CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER
XYLINUS TRONG MỘT SỐ MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Hà Nội, tháng 5 năm 2019


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

HOÀNG THU THẢO

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
BERBERINE HYDROCHLORIDE CỦA VẬT LIỆU
CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER
XYLINUS TRONG MỘT SỐ MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Xuân Thành

Hà Nội, tháng 5 năm 2019


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn
Xuân Thành – giảng viên khoa Sinh – KTNN trường Đại học sư phạm Hà Nội 2
đã tận tình chỉ dạy, dẫn dắt và giúp đỡ tôi trong quá trình học hỏi, nghiên cứu và
hoàn thiện thành công khóa luận này.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong khoa Sinh – KTNN
cùng các thầy cô tại Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng trường Đại học sư
phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
làm khóa luận vừa qua.
Mặc dù đã rất cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn thiện nhất nhưng
do mới làm quen với công việc nghiên cứu khoa học nên đề tài của tôi còn nhiều
thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn để đề tài
được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Hoàng Thu Thảo


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin khẳng định kết quả khóa luận “ Nghiên cứu so sánh khả năng
hấp thụ Berberine hydrochloride của vật liệu cellulose tạo ra từ vi khuẩn
Gluconacetobacter xylinus trong một số môi trường nuôi cấy” là công trình
nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự chỉ dẫn trực tiếp của TS. Nguyễn Xuân

Thành – giảng viên khoa Sinh – KTNN Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2. Đề
tài này không hề sao chép hay trùng lặp với bất kì tài liệu nào và chưa từng được
công bố trong bất kì công trình nào khác.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Hoàng Thu Thảo


BẢNG KÍ HIỆU TỪ VIẾT TẮT

Tên đầy đủ

Từ viết tắt
C

Nồng độ

Cs

Cộng sự

E. Coli
Et al
h

Escherichia coli
An other
Giờ

MT 1

Môi trường 1

MT 2

Môi trường 2

MT 3

Môi trường 3

OD

Optical Density

TS

Tiến sĩ

UV - vis

Ultraviolet visible

VLC

Vật liệu cellulose

DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ
Hình 1. 1. Cấu trúc hóa học của VLC .................................................................. 4
Hình 1. 2. Công thức cấu trúc phân tử Berberine hydrochloride .......................... 6
Hình 2. 1. Sơ đồ quy trình thu nhận VLC tinh khiết…………………………… 12
Hình 2. 2. Phương trình đường chuẩn của dung dịch Berberine hydrochloride
.…………………………………………………………………………...14
Hình 3.1. Màng VLC nuôi cấy trong môi trường chuẩn .................................... 16
Hình 3.2. Màng VLC nuôi cấy trong môi trường nước dừa già ......................... 17
Hình 3. 3. Màng VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo ......................... 17
Hình 3. 4. Màng VLC từ môi trường nước vo gạo sau khi tinh chế ................... 18
Hình 3. 5. Màng VLC từ môi trường chuẩn sau khi tinh chế ............................. 19
Hình 3. 6. Màng VLC từ môi trường nước dừa già sau khi tinh chế .................. 19
Hình 3. 7. Màng VLC đang hấp thụ thuốc Berberine hydrochloride .................. 20
Hình 3. 8. Biểu đồ so sánh khối lượng Berberine hydrochloride ........................ 23
Hình 3. 9. Hiệu suất hấp thụ vào các loại màng VLC khác nhau ....................... 24


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2. 1. Môi trường lên men tạo màng VLC .................................................. 10
Bảng 2. 2. Mật độ quang OD của dung dịch Berberine hydrochloride ở các nồng
độ (mg/ml) khác nhau (n = 3) ............................................................................ 13
Bảng 3. 1. Mật độ quang OD hấp thụ thốc Berberine hydrochloride của màng
VLC trong một số môi trường nuôi cấy (n = 3) ................................................. 21
Bảng 3. 2. Lượng thuốc Berberine hydrochloride hấp thụ qua màng VLC trong
các môi trường nuôi cấy (n = 3) ........................................................................ 22


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
1. Lí do chọn đề tài .......................................................................................... 1

2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ..................................................................... 3
4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................. 3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................... 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4
1.1. Tổng quan về màng vật liệu cellulose ....................................................... 4
1.2. Tổng quan về thuốc Berberine hydrochloride ........................................... 5
1.3. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới .................................. 7
1.3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc Berberine hydrochloride tại Việt Nam và
trên thế giới ................................................................................................. 7
1.3.2. Tình hình nghiên cứu màng VLC tại Việt Nam và trên thế giới .......... 8
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ................................................................................................................. 10
2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................. 10
2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian ............................................. 10
2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 10
2.3.1. Phương pháp lên men thu màng VLC từ một số môi trường............. 10
2.3.2. Phương pháp xử lý màng VLC trước khi hấp thụ thuốc ................... 11


2.3.3. Phương pháp dựng đường chuẩn của Berberine hydrochloride ....... 12
2.3.4. Xác định khối lượng hấp thụ thuốc vào màng VLC .......................... 14
2.3.5. Phương pháp xử lý thống kê ............................................................ 15
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 16
3.1. Thu màng VLC thô và tạo màng VLC tinh khiết .................................... 16
3.2. Tinh chế màng VLC ............................................................................... 18
3.3. So sánh khối lượng thuốc hấp thu được vào màng VLC lên men trong các
môi trường khác nhau .................................................................................... 20
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................... 26

4.1. Kết luận .................................................................................................. 26
4.2. Kiến nghị ................................................................................................ 26
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Tài liệu tiếng Anh


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Berberine hydrochloride là một trong những loại biệt dược nằm trong
nhóm thuốc chứa hoạt chất kháng sinh [2]. Berberine hydrochloride là loại thuốc
thường được sử dụng để điều trị các bệnh về tiêu hóa bằng đường uống hoặc bôi
lên da. Nó khó bị hòa tan trong ethanol và nước đồng thời không tan trong ether
[3]. Hơn nữa, Berberine hydrochloride còn có tác dụng chống lại nhiều chủng vi
khuẩn hay các loại ký sinh trùng đường ruột gây nguy hiểm cho cơ thể mà không
ảnh hưởng tới hoạt động của các vi sinh vật có lợi cho đường tiêu hóa. Berberine
hydrochloride được bào chế thành thuốc nhỏ mắt sử dụng trong điều trị các bệnh
về mắt do các yếu tố kích ứng từ môi trường hoặc do đau mắt hột gây nên. Ngoài
ra, Berberine hydrochloride còn có khả năng ngăn chặn sự lan rộng của một số
loại nấm và bột nhiễm nấm, ngăn cản tác hại của vi khuẩn tả và vi khuẩn E.coli.
Tuy nhiên, Berberin hydrochloride có tác dụng phụ gây táo bón khi người sử
dụng thuốc bị dị ứng nhẹ với thuốc. Khi sử dụng Berberine hydrochloride với
liều cao, khoảng trên 500mg có thể xảy ra những triệu chứng như đau bụng, nôn
mửa, mệt mỏi, trầm cảm, hô hấp khó khăn, suy giảm chức năng của tim, tụt
huyết áp, co giật, tê liệt, co thắt sau đó dẫn đến tử vong [2,3].
Tuy nhiên, Berberine hydrochloride phần lớn được dùng bằng đường uống
và bôi lên da với tốc độ và mức độ hấp thu thấp. Vì vậy, cần tăng cường quá
trình hấp thu của thuốc với mục đích duy trì nồng độ dược chất trong máu trong
vùng điều trị, giảm thiểu số lần dùng thuốc cho người bệnh, giảm thiểu những
tác dụng phụ không mong muốn và nâng cao hiệu quả điều trị của thuốc [1].

Vật liệu cellulose (VLC) được tạo thành từ vi khuẩn Gluconacetobacter
xylinus có cấu trúc hóa học rất giống với cellulose của thực vật nhưng mang một
số tính chất lý hóa đặc biệt như: độ bền cơ học cao, khả năng thấm hút nước cao,
đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa cao, có khả năng phục hồi
độ ẩm ban đầu,… . Vì vậy, VLC đang được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực
như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt may, công nghiệp sản xuất giấy,
1


mỹ phẩm, y học,… [8,9]. Nhưng trong các lĩnh vực kể trên, đáng chú ý nhất của
lĩnh vực ứng dụng màng VLC là ứng dụng trong sự kiểm soát các hệ thống vận
chuyển và phân phối thuốc. VLC đã được sử dụng như trong một vài hệ thống để
phân phối thuốc. Amin và Cs đã báo cáo về việc nghiên cứu sử dụng màng VLC
làm màng bọc cho paracetamol bằng cách dùng kĩ thuật phun phủ [15]. Kết quả
nghiên cứu cho thấy rằng màng VLC giúp cho thuốc được giải phóng một cách
kéo dài làm tăng cao hiệu quả sử dụng của thuốc. Gần đây hơn, Huang và Cs đã
nghiên cứu về việc sử dụng màng VLC trong việc kiểm soát invitro của
Berberine hydrochloride [16]. Ngoài nghiên cứu thuốc thẩm thấu qua da, thí
nghiệm kiểm soát sự giải phóng thuốc qua màng VLC còn được thử nghiệm mô
phỏng trong dạ dày và ruột. Các kết quả nghiên cứu thu được cho thấy rằng
thuốc đã được giải phóng với một tốc độ chậm.
Dựa vào những đặc tính đặc biệt trên mà VLC có thể giúp Berberine
hydrochloride duy trì hiệu quả chữa bệnh, tăng cường khả năng phân phối thuốc
có kiểm soát và kéo dài thời gian tồn tại của thuốc. Với cách tiếp cận này có thể
sử dụng màng VLC để tăng cường sinh khả dụng của thuốc. Với mục đích thiết
kế hệ thống hấp thu thuốc Berberine hydrochloride dựa trên màng VLC nhằm
tăng lượng hấp thu vào cơ thể và giảm thiểu tác dụng phụ của thuốc trong điều
trị bệnh, tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc
Berberine hydrochloride của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter
xylinus trong một số môi trƣờng nuôi cấy”.

2. Mục đích nghiên cứu
So sánh khả năng hấp thụ thuốc Berberine hydrochloride từ các loại môi
trường nuôi cấy với mục đích tìm ra môi trường nuôi cấy hấp thụ nhiều thuốc
Berberine hydrochloride nhất.
3. Nội dung nghiên cứu
Nuôi cấy tạo màng và xử lý màng VLC từ Gluconacetobacter xylinus
trong một số môi trường nuôi cấy.

2


Đưa thuốc Berberine hydrochloride hấp thụ vào màng trong khoảng thời
gian và điều kiện nhất định từ đó xác định lượng thuốc hấp thụ ở các loại môi
trường nuôi cấy đó.
So sánh lượng thuốc Berberine hydrochloride hấp thụ vào màng được xử
lí trong một số môi trường nuôi cấy.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Tìm hiểu khả năng hấp thụ thuốc để có được những hiểu biết về tiềm năng
hấp thụ của màng VLC với thuốc Berberine hydrochloride.
Bổ sung hiểu biết về ứng dụng của màng VLC với thuốc Berberine
hydrochloride trong một số môi trường nuôi cấy.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Xây dựng được quá trình tạo màng VLC từ chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter xylinus.
Khảo sát được lượng thuốc Berberine hydrochloride hấp thụ vào màng
VLC trong các loại môi trường nuôi cấy. Lựa chọn ra được trường hợp hấp thụ
tốt nhất để có thể cải thiện được nhược điểm của thuốc.

3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về màng vật liệu cellulose
Vật liệu cellulose được cấu tạo bởi chuỗi β – 1,4 glucopyranose mạch
thẳng được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn trong tự nhiên, đặc biệt là
Gluconacetobacter xylinus. Khi nuôi cấy Gluconacetobacter xylinus trong môi
trường lỏng và điều kiện tĩnh sẽ hình thành nên một lớp màng, lớp màng này có
bản chất là cellulose được liên kết với các tế bào vi khuẩn.
Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của VLC giống
với cellulose của thực vật. Tuy nhiên, chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [17],
đồng thời có khả năng kết tinh cao (khoảng 61%) và độ polymer hóa lớn nên
màng VLC có độ bền cơ học cao cùng với khả năng thấm hút lớn. Theo AJ.
Brown (1886), VLC gồm nhiều sợi nhỏ có bản chất là hemicellulose và có
đường kính 1,5nm kết hợp với nhau. Các sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó,
nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 – 8 nm [4].
Cấu trúc hóa học của VLC được thể hiện tại hình 1.1.

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của VLC
Những đặc tính độc đáo và ưu việt hơn hẳn so với cellulose thực vật của
VLC là: Độ chịu lực, tính đàn hồi, độ bền cơ học… được so sánh tương đương
với của nhôm. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử thấy rằng đường kính của sợi
cellulose vi khuẩn chỉ bằng 1/100 so với sợi cellulose của tế bào thực vật.
Vì vậy, VLC được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau
như: Công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghệ mỹ phẩm, công nghệ

4


giấy, công nghệ pin, đặc biệt là trong lĩnh vực y học. Nghiên cứu cho thấy rằng

có thể sử dụng cellulose tổng hợp từ vi khuẩn Acetobacter xylinum để chế tạo vật
liệu nhựa composite sinh học trên nền nhựa polyvinyl alcohol. Trong y học, vật
liệu VLC thu được từ quá trình nuôi cấy tĩnh được nghiên cứu và sử dụng làm da
nhân tạo. Ở Brazil, màng VLC ướt tinh sạch được sản xuất và bán ra thị trường
được người tiêu dùng sử dụng như một loại da nhân tạo dùng để chữa trị vết
thương [7]. Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu
sử dụng màng VLC có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng và đã được thực nghiệm
ở thỏ. Kết quả cho thấy rằng màng VLC giúp vết thương mau lành và ngăn
không cho vết thương nhiễm trùng [5]. Ngoài ra, sản phẩm VLC còn được ứng
dụng làm màng băng vết thương, trong phẫu thuật, ghép mô và cơ quan [7]. VLC
hiện nay đang được hy vọng là vật liệu hóa sinh mới với những ứng dụng rộng
rãi và đang tiếp tục nghiên cứu, phát triển hàng loạt trong nhiều lĩnh vực như:
- Sản phẩm rừng: Gỗ nhân tạo, giấy, giấy đặc biệt để lưu trữ hồ sơ, thùng
hàng có độ bền cao [24].
- Thực phẩm: Tráng miệng, ăn kiêng, thịt nhân tạo [15].
- Môi trường: Miếng xốp làm sạch vết dầu tràn, hấp thu chất độc, quần áo,
giày dép tự phân hủy [16].
1.2. Tổng quan về thuốc Berberine hydrochloride
Công thức: C20H18ClNO4
Phân tử lượng: 371,5 đvC
Công thức cấu trúc phân tử theo hình 1.2.

5


Hình 1.2. Công thức cấu trúc phân tử Berberine hydrochloride
* Tính chất lý tính: Berberine hydrochloride tồn tại dưới dạng bột kết tinh
màu vàng hoặc tinh thể. Nó không mùi và có vị rất đắng. Độ tan dạng base tan
chậm trong nước, khó bị hòa tan trong ethanol và không tan trong ether [6].
Dạng muối clorid tan ở tỷ lệ 1/400 trong nước, dễ tan trong nước sôi, tan trong

ethanol, thực tế không tan trong cloroform và ether [2].
* Tính chất hóa tính: Berberine hydrochoride có tính chất như một base
bậc 4, tạo muối bằng cách thay thế nhóm – OH (hình 1.2), việc tạo muối của
Berberine hydrochloride không giống như các alcaloid khác mà muối tạo thành
giống muối của hydroxyd kim loại.
Berberine hydrochloride là hoạt chất sinh học được chiết từ cây hoàng
đằng (hay còn gọi là vàng đắng) tên khoa học là Coptis teeta [10]. Trong cây
hoàng đằng có chứa nhiều alkaloid là dẫn xuất của izoquinolein, chủ yếu là
Berberin hydrochloride tỷ lệ từ 1,5 đến 2 – 3% [2].
Các tác dụng chủ yếu của Berberine hydrochloride là chống tiêu chảy do
vi khuẩn hoặc ký sinh trùng đường ruột [2, 3]. Berberine hydrochloride còn được
bào chế thành thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do các tác nhân
bên ngoài môi trường như gió, lạnh, bụi, khói,… và điều trị bệnh mắt hột. Ngoài
ra, Berberine hydrochloride còn được nghiên cứu để bào chế thành viên nén giải
phóng tại đích đại tràng [13].
6


Ưu điểm khi dùng Berberine hydrochloride điều trị các nhiễm trùng đường
ruột là sẽ không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có lợi
trong đường ruột. Các nhà khoa học đã chứng minh khi dùng một số thuốc kháng
sinh nếu phối hợp với Berberine hydrochloride sẽ hạn chế được tác dụng không
mong muốn gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột.
Hiện nay, trên cả nước có rất nhiều hãng dược phẩm sản xuất Berberine
hydrochloride với tên khác nhau như: Berberine sulfate hoặc chlohydrate với các
biệt dược là thuốc có hoạt tính kháng sinh, chống viêm với dạng viên nén 10mg
và 50mg [3].
Berberine hydrochloride an toàn cho hầu hết người lớn sử dụng ngắn hạn
khi dùng bằng đường uống hoặc bôi lên da [2]. Khi sử dụng liều cao Berberine
hydrochloride trên 500mg (tương ứng với 8 – 100g rễ cây vàng đắng khô) có thể

gây ra đau bụng, nôn mửa, căng thẳng, trầm cảm, hô hấp khó khăn, nhịp tim
chậm, suy tim, huyết áp thấp, co giật, tê liệt và dẫn đến tử vong [3].
1.3. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới
1.3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc Berberine hydrochloride tại Việt
Nam và trên thế giới
* Ở Việt Nam
Việc nghiên cứu thuốc Berberine hydrochloride ở Việt Nam có một số
công trình nghiên cứu như sau:
- Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm – góp phần nghiên cứu cải tiến quy trình
sản xuất berberine chiết xuất từ cây vàng đắng [4].
- Hồ Đắc Trinh – chiết berberine hydrochloride trong cây vàng đắng bằng
dung dịch acid sunfuric loãng [6].
- Nguyễn Hoài Nam, Võ Phùng Nguyên, Trần Hùng đã nghiên cứu tác
động của berberine và palmatin trên trí nhớ hình ảnh và không gian của chuột
nhắt [11].

7


- Hồ Cảnh Hậu và cộng sự đã nghiên cứu định lượng berberine
hydrochloride trong “viên nén đại tràng 105” bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao [12].
* Trên thế giới
Đã có những công trình nghiên cứu về thuốc Berberine hydrochloride trên
thế giới như:
- Huilixing và Jianping Ye đã xác định hiệu quả và tính an toàn của
berberine hydrochloride trong điều trị bệnh nhân tiểu đường tuyp 2 [17].
- Ryan Bradley đã nghiên cứu về berberine trong bệnh tiểu đường [18].
- Jianping Ye, Weiping Jia đã tìm hiểu về tác dụng và cơ chế của
berberine trong điều trị bệnh tiểu đường [19].

1.3.2. Tình hình nghiên cứu màng VLC tại Việt Nam và trên thế giới
* Ở Việt Nam
- Nguyễn Xuân Thành và Cs đã nghiên cứu khả năng tối ưu hóa hiệu suất
nạp thuốc famotidin của vật liệu cellulose vi khuẩn lên men từ dịch trà xanh theo
phương pháp đáp ứng bề mặt và mô hình Box – Behnken [9].
- Nguyễn Xuân Thành đã nghiên cứu về sự giải phóng curcumin của vật
liệu cellulose vi khuẩn nạp curcumin định hướng dùng qua đường uống [14].
- Phan Thị Thu Hồng và Cs đã tìm hiểu về sử dụng cellulose tổng hợp từ
vi khuẩn Acetobacter xylinum để chế tạo vật liệu nhựa composite sinh học trên
nền nhựa polyvinyl alcohol [8].
- Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh đã
nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinumm tạo màng bacterial cellulose ứng
dụng trong điều trị bỏng [5].
* Trên thế giới

8


- Lin Huang và cộng sự đã nghiên cứu về sự hấp thụ và giải phóng khi
mang thuốc của vật liệu nano – cellulose 3D [16].
- Hanif Ullah và cộng sự đã tìm hiểu về cách chế tạo, mô tả và đánh giá vỏ
viên nang của vật liệu cellulose vi khuẩn dùng để phân phối thuốc [19].
- Mona Moniri và cộng sự đã nghiên cứu về sản xuất và thực trạng của vật
liệu cellulose vi khuẩn trong kĩ thuật y sinh [23].
- Hanif Ullah, Helder A. Santos, Taous Khan đã nghiên cứu về ứng dụng
của cellulose vi khuẩn trong thực phẩm, mỹ phẩm và phân phối thuốc [20].

9

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Khả năng hấp thu thuốc Berberine hydrochloride
của màng VLC lên men từ các loại môi trường nuôi cấy: Môi trường chuẩn, môi
trường nước dừa già và môi trường nước vo gạo.
2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian
Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm.
Địa điểm nghiên cứu: Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng – Trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 7 năm 2018 đến tháng 5 năm 2019.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lên men thu màng VLC từ một số môi trường
Bước 1: Chuẩn bị các hóa chất và nguyên liệu tạo môi trường nuôi cấy.
Nuôi cấy màng VLC có cải biến từ môi trường chuẩn Hestrin – schramm
[7] và được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2. 1. Môi trƣờng lên men tạo màng VLC

Môi trƣờng
Thành phần
MT 1

MT 2

MT 3

Gluocose

20g

20g

20g

Pepton

5g

10g

10g

0,5g

0,5g

Diamoni phophat

2,7g

Amoni sulfat
Cao nấm men

5g

10


Acid citric
Nước dừa già

1000ml

Nước vo gạo
Nước cất 2 lần

1000ml
1000ml

Bước 2: Dùng máy khuấy từ để khuấy đều các loại môi trường nuôi cấy
cho đến khi bão hòa.
Bước 3: Cho dung dịch đã khuấy vào nồi hấp khử trùng ở 1130C trong 15
phút để tiêu diệt vi khuẩn và nấm mốc.
Bước 4: Đưa môi trường tạo màng VLC vào buồng cấy vô trùng, để dưới
đèn UV 30 phút cho đến khi môi trường đã nguội hoặc ở nhiệt độ khoảng 30 –
350C.
Bước 5: Bổ sung dịch giống vào môi trường nuôi cấy.
Bước 6: Cho dung dịch vào khay đựng hoặc bình tam giác và đậy kín lại
bằng vải xô. Sau đó bắt đầu thực hiện quá trình nuôi cấy tĩnh trong phòng kín.
Bước 7: Để khay đựng môi trường tạo màng vào nơi thoáng khí, có nhiệt
độ ổn định và không di chuyển dung dịch trong khay từ 6 – 14 ngày.
Bước 8: Tiến hành thu màng và xả sạch chúng dưới vòi nước.
2.3.2. Phương pháp xử lý màng VLC trước khi hấp thụ thuốc
Màng VLC sau khi thu được có màu trắng sữa, chứa nhiều nước, một
lượng lớn môi trường lên men và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất. Để
loại bỏ các tạp chất trong môi trường nuôi cấy và độc tố của vi khuẩn thì trước
khi hấp thụ thuốc cần xử lý màng.
Các bước tiến hành theo sơ đồ hình 2.1.

11

Tách màng VLC
thô
Rửa bằng nước cất
Bình 1000ml NaOH 0,3M
(10 – 20 màng d = 1,5cm)

Hấp trong 1130C, 15 phút

Xả nước 24 giờ

Thu VLC tinh khiết
Hình 2. 1. Sơ đồ quy trình thu nhận VLC tinh khiết

+ Trong màng VLC khi thu chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy hấp vật
liệu trong NaOH 3% nhiệt độ 1130C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử
trùng HV – 110/HIRAIAMA để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội
độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1 giờ.
+ Sau khi ngâm trong NaOH, lấy vật liệu đặt dưới vòi nước xả đến khi vật
liệu chuyển sang màu trắng trong. Thử quỳ tím kiểm tra môi trường bề mặt màng
VLC cần đạt là trung tính, ta thu được màng VLC tinh khiết.
2.3.3. Phương pháp dựng đường chuẩn của Berberine hydrochloride
Nguyên tắc: Sử dụng máy đo quang phổ UV – Vis 2450 xác định lượng
thuốc Berberine hydrochloride trong màng VLC đã nạp thuốc.

12


Dùng máy đo quang phổ UV – 2450 để đo vùng phổ tử ngoại và khả kiến.

Sử dụng hai cuvet được làm từ thạch anh đo dùng cho dung dịch thử và dung
dịch đối chiếu. Cuvet dùng để đo phải được làm sạch và thao tác cẩn thận.
Pha loãng dung dịch Berberine hydrochloride trong dung dịch cồn 96% ở
các nồng độ khác nhau: 5, 10, 20, 30, 40, 50 (mg/ml). Quét phổ dung dịch
Berberine hydrochloride có nồng độ 10 ml trong khoảng bước sóng từ 200 đến
800 nm. Sau đó, lựa chọn được bước sóng 345nm tại đó Berberine hydrochloride
được hấp thụ cực đại.
Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV- Vis 2450 để đo mật độ quang phổ
(OD) của dung dịch đã pha như trên ở bước sóng 345nm.
Thực hiện đo lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc
Berberine để xây dựng đường chuẩn.
Mật độ quang OD của dung dịch thuốc ở nồng độ khác nhau được thể hiện
ở bảng 2.2.
Bảng 2. 2. Mật độ quang OD của dung dịch Berberine hydrochloride ở các nồng độ
(mg/ml) khác nhau (n = 3)

Mật độ quang OD

Nồng độ

Giá trị trung

(Abs 345nm)

STT

bình

(mg/ml)
Lần 1

Lần 2

Lần 3

1

5

0,353

0,351

0,353

0,353 ± 0,002

2

10

0,691

0,720

0,719

0,710 ± 0,016

3

20

1,552

1,520

1,500

1,524 ± 0,2623

4

30

2,185

2,210

2,220

2,205 ± 0,018

5

40

3,017

2,980

3,015

3,004 ± 0,020

6

50

3,590

3,650

3,608

3,616 ± 0,030

13


Sử dụng phần mềm Excel 2010 để xây dựng phương trình đường chuẩn và
dựng đồ thị biểu diễn. Kết quả lập được đồ thị như hình 2.2.

OD345nm
y = 0.0734x + 0.0056
R² = 0.9986

Giá trị OD trung bình

4

3.5
3
2.5
2

OD345nm

1.5

Linear (OD345nm)

1
0.5
0

0

20

40

60

Nồng độ thuốc Berberine hydrochloride (mg/ml)

Hình 2. 2. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của dung dịch Berberine hydrochloride

Phương trình đường chuẩn:
Y = 0,0734x + 0,0056 (R2 = 0,9986)
Trong đó:

x: Nồng độ Berberine hydrochloride (mg/ml)
y: Mật độ quang OD tương ứng với nồng độ x
R2: Hệ số tương quan
2.3.4. Xác định khối lượng hấp thu thuốc vào màng VLC
Màng VLC được tạo ra từ ba loại môi trường nuôi cấy khác nhau: môi
trường chuẩn, môi trường nước dừa già và môi trường nước vo gạo. Sau khi tinh
chế, màng thu được sẽ được dập thành các viên dạng viên thuốc hình tròn với
đường kính d = 1,5cm và độ dày là 0,3cm và 0,5cm tương đối đều nhau. Đem
màng hấp thu thuốc Berberine hydrochloride theo các chỉ số thiết kế thí nghiệm:

14


Hòa thuốc Berberine hydrochloride dạng tinh khiết vào dung dịch cồn
96%, sau đó cho màng VLC vào. Sau khoảng thời gian nhất định, lấy màng VLC
ra và xác định lượng thuốc được hấp thụ qua màng.
Lượng thuốc được hấp thụ qua màng VLC được xác định theo công thức:
mVLC = mVLC(1) – mVLC(2)
Trong đó:
mVLC là khối lượng thuốc hấp thụ qua màng VLC.
MVLC(1) là khối lượng của màng VLC ban đầu.
MVLC(2) là khối lượng của màng VLC sau khi hấp thụ thuốc.
Hiệu quả hấp thụ thuốc vào màng được tính theo công thức:
EE (%) =

x 100% (3)

Trong đó:
EE: Phần trăm nạp thuốc vào màng.
mht (mg/cm3): Khối lượng thuốc hấp thụ trong 1 đơn vị thể tích màng.

m0 (mg/cm3): Khối lượng thuốc trong 1 đơn vị thể tích ban đầu.
2.3.5. Phương pháp xử lý thống kê
Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần để lấy trung bình mẫu và phân tích thống kê
số liệu qua phần mềm Excel để phân tích phương sai và xác định khoảng tin cậy.
Tất cả các dữ liệu được trình bày theo giả định trung bình và độ lệch chuẩn
“MEAN + SD” [19].
Kiểm định giả thiết về giá trị trung bình của hai mẫu bằng cách sử dụng
hàm: t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variences với ý nghĩa α = 0,05.
Những khác biệt được coi là ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05.

15


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thu màng VLC thô và tạo màng VLC tinh khiết
Sau khoảng 10 - 14 ngày, thu màng VLC thô có độ dày 0,3cm – 0,5cm từ
dịch nuôi cấy tĩnh lên men từ các môi trường khác nhau.
Kết quả cho thấy rằng màng VLC thu được từ các môi trường nuôi cấy có
màu trắng sữa, dễ tách ra khỏi môi trường nuôi cấy và chứa nhiều nước. Bề mặt
màng của các loại môi trường chuẩn và môi trường nước dừa già mịn hơn màng
của môi trường nước vo gạo.
Màng VLC khi nuôi cấy tĩnh trong các môi trường: Môi trường chuẩn,
môi trường nước dừa già và môi trường nước vo gạo được thể hiện trong hình
3.1, 3.2 và 3.3.

Hình 3.1. Màng VLC nuôi cấy trong môi trƣờng chuẩn

16