Nghiên cứu sự hấp thụ thuốc diclofenac natri của vật liệu cenlulose tạo ra từ gluconacetoacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH –KTNN
======

NGUYỄN VÕ HÀ THU

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
TẠO RA TỪ GLUCONACETOACTER XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI, 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH –KTNN
======

NGUYỄN VÕ HÀ THU

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
TẠO RA TỪ GLUCONACETOACTER XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học

ThS. Phạm Thị Kim Dung

HÀ NỘI, 2019


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học
Sư phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa, các thầy, cô giáo trong Sinh –
KTNN, các thầy cô giáo ở Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng trường Đại
học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong quá trình hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Th.S Phạm Thị Kim Dung
là người đã theo sát và hướng dẫn em trong quá trình hoàn hoàn thành khóa
luận tốt nghiệp.
Do lần đầu tiên làm nghiên cứu khoa học về mặt kiến thức em vẫn còn
nhiều hạn chế, nên việc thiếu sót là không thể tránh khỏi. Vì vậy em rất mong
sự góp ý của quý thầy, cô cũng như các bạn sinh viên để khóa luận cuả em
hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Võ Hà Thu


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi được
hướng dẫn bởi Th.S Phạm Thị Kim Dung. Những số liệu kết quả này là hoàn
toàn trung thực không trùng lặp với đề tài khác. Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn

trách nhiệm.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Võ Hà Thu


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài.......................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu..................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Tổng quan về chủng vi khuẩn .................................................................... 3
1.1.1. Vị trí, phân loại của Gluconacetoacter xylinus ....................................... 3
1.1.2. Đặc điểm của Gluconacetoacter xylinus................................................. 3
1.1.3. Môi trường nuôi cấy Gluconacetoacter xylinus ..................................... 3
1.1.4. Đặc điểm cấu trúc màng tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus ................. 4
1.1.5. Tính độc đáo của màng cellulose vi khuẩn ............................................. 4
1.1.6. Ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn .................................................. 5
1.2. Tổng quan về thuốc Diclofenac natri......................................................... 5
1.2.1. Sơ lược về thuốc Diclofenac natri........................................................... 5
1.2.1.1. Công thức ............................................................................................. 5
1.2.1.2. Nguồn gốc và tính chất ........................................................................ 6
1.2.1.3. Dược động học và tác dụng.................................................................. 6
1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri................. 7
1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri trên thế
giới..................................................................................................................... 7
1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri tại Việt

Nam ................................................................................................................... 7
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
........................................................................................................................... 9
2.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................. 9
2.1.1 Chủng vi khuẩn ........................................................................................ 9
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................. 9
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ.................................................................................. 9
2.2. Phạm vi, nội dung nghiên cứu, địa điểm, thời gian nghiên cứu .............. 10


2.2.1. Phạm vi nghiên cứu............................................................................... 10
2.2.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................. 10
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 10
2.2.4. Thời gian nghiên cứu ............................................................................ 10
2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 10
2.3.1. Phương pháp chế tạo vật liệu cellulose................................................. 10
2.3.1.1. Lên men thu vật liệu cenlulose từ môi trường nước vo gạo ............. 11
2.3.1.2. Xử lý vật liệu cenllulose trước khi hấp thụ thuốc.............................. 11
2.3.1.3. Đo độ dày màng ................................................................................. 12
2.3.1.4. Đánh giá độ tinh khiết của vật liệu màng cellulose ........................... 12
2.3.2. Xây dựng đường chuẩn. ........................................................................ 13
2.3.3. Xác định lượng thuốc được hấp thụ vào vật liệu cellulose................... 14
2.3.4. Phương pháp xử lý thống kê ................................................................. 15
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................ 16
3.1. Kết quả tạo các loại vật liệu cellulose...................................................... 16
3.2. Phương trình đường chuẩn của thuốc Diclofenac natri ........................... 18
3.3. Khối lượng thuốc Diclofenac natri hấp thu vào màng............................. 21
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 23
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 24

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của thuốc Diclofenac natri .................................. 6
Hình 3.1. Màng dày 0,5 cm............................................................................. 16
Hình 3.2. Màng nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo ............................... 17
Hình 3.3. Màng dày 0,5 cm............................................................................. 17
Hình 3.4. Màng tinh chế.................................................................................. 18
Hình 3.5. Màng gạo tinh khiết 0, 5 cm; d = 1,5 cm ........................................ 18
Hình 3.6. Phương trình đường chuẩn Diclofenac natri OD = 283.................. 19
Hình 3.7. Rút mẫu đo 1 giờ............................................................................. 20


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo vật liệu cenlulose ..................................... 11
Bảng 3.1. Giá trị OD của màng sau các khoảng thời gian.............................. 20
Bảng 3.2. Lượng thuốc Diclofenac natri hấp thụ vào màng gạo sau 2 giờ .... 21
Bảng 3.3. Hiệu suất hấp thụ thuốc Diclofenac natri vào màng gạo sau 2 giờ..
......................................................................................................................... 22


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

1


Màng cellulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus là một loại màng sinh
học đặc biệt có cấu trúc và đặc tính giống với cellulose ở thực vật. Tuy nhiên
màng cellulose vi khuẩn khác với màng cellulose thực vật ở: màng cellulose
vi khuẩn có đặc tính dẻo dai, bền chắc hơn màng cellulose thực vật do màng

cellulose vi khuẩn không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, peptin, sáp
nến, [9]. … Cellulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus có một số tính chất
hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ học, khả năng thấm hút nước cao, đường kính
sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm
ban đầu, ...Vì vậy, nó được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: thực phẩm,
công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, mỹ phẩm, y học, ... đáng chú ý nhất trong
sự kiểm soát các hệ thống vận chuyển thuốc [2]
Dùng màng cenlulose vi khuẩn làm môi trường phân tách cho quá trình
xử lí nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế
bào, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực
phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy [2]....
Trong lĩnh vực y học, màng cenlulose vi khuẩn đã được ứng dụng làm
da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, làm mạch máu nhân tạo,
điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người. Ngoài ra
màng cenlulose vi khuẩn đã được sử dụng như trong một vài hệ thống để
phân phối thuốc, các sợi cellulose vi khuẩn có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống
vận chuyển và phân phối thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc, nó có thể
giúp thuốc không bị phá hủy trong môi trường acid.
Trên thế giới đã có nhiều nghiên về màng cellulose vi khuẩn. Amin và
cộng sự đã nghiên cứu sử dụng màng cellulose vi khuẩn làm màng bọc cho
paracetamol bằng cách phun phủ. Kết quả cho thấy màng cellulose vi khuẩn
có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc chậm lại, làm tăng hiệu quả sử
dụng của thuốc[3]. Ở nước ta việc nghiên cứu và ứng dụng của màng
cellulose vi khuẩn đang được quan tâm trong những năm gần đây. Năm 2006,
Nguyễn Văn Thanh đã nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose

2


trị bỏng từ vi khuẩn”. Kết quả cho thấy có thể chế tạo màng với quy mô công

nghiệp từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm.
Diclofenac, dẫn xuất của acid phenylacetic là thuốc chống viêm không
steroid. Diclofenac được dùng chủ yếu dưới dạng muối natri. Thuốc có tác
dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh. [7]. Natri diclofenac có hoạt
tính chống viêm, giảm đau và hạ sốt do khả năng ức chế đặc hiệu enzym
cyclo- oxygenase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp prostaglandin,
prostacyclin, thromboxane... là các chất trung gian gây đau,sốt. Hoạt tính
chống viêm của nó mạnh hơn aspirin, nhưng tương đương
với indomethacin. Chủ yếu được sử dụng trong các bệnh xương khớp như:
viêm khớp dạng thấp, viêm bao hoạt dịch, viêm gân, viêm khớp vi tinh thể.
Thuốc dễ dàng được hấp thụ qua đường tiêu hóa khi uống, khi uống lúc đói
thuốc được hấp thụ nhanh hơn [7].
Với mục đích đánh giá được khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri
của vật liệu cenlulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus chúng tôi thực hiện
đề tài “Nghiên cứu sự hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu cenlulose
tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo
gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu
Đánh giá được khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu
cellulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước
vo gạo.
3. Nội dung nghiên cứu
 Chế tạo được vật liệu màng, xử lý vật liệu màng trước khi cho hấp thụ
thuốc, xác định lượng màng tạo thành.
 Đánh giá khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu
cellulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy trong môi trường
nước vo gạo.

3

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về chủng vi khuẩn
1.1.1. Vị trí, phân loại của Gluconacetoacter xylinus
Gluconacetoacter xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, là loại vi khuẩn
hiếu khí, có khả năng sản xuất cellulose ngoại bào[7].
1.1.2. Đặc điểm của Gluconacetoacter xylinus
- Hình thái: có dạng que, hơi cong hoặc thẳng, là nhóm vi khuẩn gram
âm, không sinh bào tử, không di chuyển, sắp xếp riêng rẽ có khi xếp thành
chuỗi [7].
- Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: Có khả năng oxy hóa ethanol thành
acidacetic, có khả năng tổng hợp cellulose, chuyển hóa đường thành axit, có
phản ứng với catalase dương tính. Chủng vi khuẩn phát triển tối ưu ở 25 – 30

0

C, tăng trưởng trong khoảng pH từ 3 – 8, ở pH bằng 5,5 là mức pH tối ưu để
sản xuất cellulose.
1.1.3. Môi trường nuôi cấy Gluconacetoacter xylinus
- Gluconacetoacter xylinus được nuôi cấy trong môi trường tổng hợp từ
các nguồn dinh dưỡng như: cacbon, nitơ, photpho, các yếu tố vi lượng và các
yếu tố tăng trưởng. Gluconacetoacter xylinus là loài có khả năng tổng hợp
cellulose từ cacbonhydrat. Glucse, fructose, maninol,… là nguồn cacbohydrat
chủ yếu mà màng cellulose vi khuẩn này sử dụng. Khi sử dụng Glycerol,
galactose, lactose,… thì màng cellulose vi khuẩn này tổng hợp cellulose cho
hiệu suất thấp hơn và không nên dùng mannose, cellobiose, acetate,…làm
nguồn cacbonhydrat[2]. Tùy thuộc vào các màng cellulose vi khuẩn khác
nhau mà người ta sử dụng các loại đường cũng như nồng độ các loại đường
sao cho hợp lý.

- Các sản phẩm khác: Rỉ đường, chất thải trong công nghiệp sản xuất
phomat, khoai tây, nước mía, nước dừa già,… cũng là nguồn nguyên liệu để
nuôi cấy Gluconacetoacter xylinus

4


1.1.4. Đặc điểm cấu trúc màng tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus
- Màng cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer không phân nhánh

5


gồm các gốc glucopyranose nối với nhau bởi liên kết  1,4  glucan [3].
Các
chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp nối lại với nhau thành các thớ sợi thứ
cấp. Khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong thượng tầng ở một loài thực
vật thì người ta thấy sợi thứ cấp là loại sợi tự nhiên mảnh nhất. Các sợi thứ
cấp kết lại với nhau tạo thành vi sợi, các vi sợi tạo thành các bó sợi, các bó sợi
tạo thành dải sợi. Một dải sợi có chiều dài khoảng 130 – 177 nm và dày
khoảng từ 3 – 4 nm.
- Tính đến thời điểm hiện tại Gluconacetoacter xylinus được đánh giá
là loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp cellulose hiệu quả nhất trong tự nhiên
Cấu trúc hóa học cơ bản của màng cellulose vi khuẩn giống với
cellulose có nguồn gốc tự nhiên, tuy vậy cấu trúc đại thể của chúng vẫn có sự
khác nhau. Ở màng cellulose vi khuẩn các sợi mới sinh ra kết lại với nhau tạo
thành sợi sơ cấp, các sợi sơ cấp kết lại tạo thành vi sợi (vi sợi nằm trong bó),
cuối cùng các dải sợi được hình thành. [3]. Cấu trúc của màng cellulose vi
khuẩn phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy... Cụ thể cấu trúc hóa học
được trình bày trong hình:

1.1.5. Tính độc đáo của màng cellulose vi khuẩn
- Là loại màng trong suốt, có cấu trúc mạng tinh thể [3].
- Có sức căng, độ bền sinh học cao, kích thước ổn định [3].

6


- Có khả năng hấp thụ nước và giữ nước tốt, có độ xốp chọn lọc. So với
các loại cellulose khác thì màng cellulose vi khuẩn có độ tinh sạch cao hơn
[3].
- Dễ dàng bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật [3].
- Có khả năng kết sợi và tạo tinh thể tốt, khả năng chịu nhiệt và tính
bền cơ học cao [3].
- Màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy, các sản
phẩm từ cellulose vi khuẩn được sản xuất trực tiếp mà không cần qua các
bước trung gian [3].
- Đặc biệt có thể tổng hợp cellulose dưới dạng màng mỏng hay sợi cực
nhỏ nhờ vi khuẩn [3].
1.1.6. Ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn
Màng cenlulose vi khuẩn được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực công
nghệ khác nhau như:
- Dùng màng cenlulose vi khuẩn làm môi trường phân tách cho quá
trình xử lí nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho
tế bào, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực
phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy [2] ...
- Trong lĩnh vực y học, màng cenlulose đã được ứng dụng làm da tạm
thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, làm mạch máu nhân tạo, điều trị
các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người. Ngoài ra, màng
cenlulose đã được sử dụng như trong một vài hệ thống để phân phối thuốc,

các sợi cellulose có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống vận chuyển và phân phối
thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc, nó có thể giúp thuốc không bị phá
hủy trong môi trường acid [2].
1.2. Tổng quan về thuốc Diclofenac natri
1.2.1. Sơ lược về thuốc Diclofenac natri
1.2.1.1. Công thức
Diclofenac natri:


- Tên khoa học: Natri 2-[(2,6-diclorophenyl)amino]phenyl] acetat,
- Công thức phân tử: C14H10Cl2NNaO2
- Công thức cấu tạo: [7].

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của thuốc Diclofenac natri
- Khối lượng phân tử: 318,10 đvC [7].
- Nhiệt độ nóng chảy: 283 - 285oC [7].
1.2.1.2. Nguồn gốc và tính chất
- Nguồn gốc: Có nguồn gốc thảo dược
- Tính chất:
Natri diclofenac là một acid yếu. Tồn tại ở dạng kết tinh hoặc tinh thể
trắng[7].
Độ tan: dễ tan trong ethanol 96%, methanol, hơi tan trong nước và
acid acetic băng, thực tế không tan trong ether. Độ tan trong nước phụ thuộc
vào pH, nhiệt độ, và các chất có mặt trong môi trường hoà tan [7].
1.2.1.3. Dược động học và tác dụng
- Thuốc dễ dàng được hấp thụ qua đường tiêu hóa khi uống, khi uống
lúc đói thuốc được hấp thụ nhanh hơn [7].


- Natri diclofenac có hoạt tính chống viêm, giảm đau và hạ sốt do khả

năng ức chế đặc hiệu enzym cyclo- oxygenase tham gia vào quá trình sinh
tổng hợp prostaglandin, prostacyclin, thromboxane... là các chất trung gian
gây đau, sốt [7].
Hoạt tính chống viêm của nó mạnh hơn aspirin, nhưng tương đương
với indomethacin [7].
Chủ yếu được sử dụng trong các bệnh xương khớp như: viêm khớp
dạng thấp, viêm bao hoạt dịch, viêm gân, viêm khớp vi tinh thể.
1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri
1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri trên
thế giới
Nghiên cứu về màng cellulose vi khuẩn từ Gluconacetoacter xylinus và
ứng dụng của nó đã được nghiên cứu ở nhiều nơi trên thế giới.
- Năm 1989 Brown và cộng sự đã sử dụng màng như một chất để biến
đổi độ nhớt, để sản xuất ra các sợi truyền quang, làm môi trường trong cơ chất
sinh học, thực phẩm.
- Năm 1998 Jonas, Farad, năm 2006 Czafa và cộng sự đã nghiên cứu
dùng màng cellulose vi khuẩn để làm mặt nạ dưỡng da và da nhân tạo
Diclofenac natri là thuốc nằm trong danh mục thuốc thiết yếu của 74
nước, phần lớn được nghiên cứu và sử dụng để chữa các bệnh viêm khớp
dạng thấp, viêm bao dịch, viêm gân,…
1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri tại
Việt Nam
Ở nước ta việc nghiên cứu và sử dụng màng cellulose vi khuẩn vẫn
dừng lại ở mức khiêm tốn, hầu hết các nghiên cứu đang chỉ dừng lại ở bước
đầu và ở quy mô phòng thí nghiệm
Hiện nay, ở Việt Nam tình hình điều trị các bệnh viêm khớp ngày càng
được cải tiến. Việc sử dụng màng cellulose vi khuẩn làm tác nhân vận chuyển
thuốc vẫn đang được nghiên cứu và đang là một hướng đi mới.

Ở nước ta, Diclofenac natri được sử dụng là một loại thuốc chữa các
bệnh viêm khớp dạng thấp, viêm bao dịch, viêm gân,…


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của màng celllulose vi khuẩn
nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo.
2.1.1. Chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn Gluconacetoacter xylinus dùng lên men thu nhận vật
liệu celulose được mua tại Nhật Bản.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
Nguyên liệu:
Nước vo gạo, gạc vô trùng
Các loại hóa chất:
+ Diclofenac natri dạng tinh khiết (Việt Nam)
+ Đường glucose (Việt Nam)
+ Pepton (Việt Nam)
+ Nước cất (Việt Nam)
+ NaOH, HCl, (NH4)2SO4 (Việt Nam)
+ Acid acetic (Việt Nam)
+ Metanol (Việt Nam)
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
* Thiết bị:
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản)
- Cân phân tích (Sartorius - Thụy Sỹ)
- Cân kỹ thuật - Sartorius TE 3102 S
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus)

- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức)
- Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức)
- Máy nước cất 2 lần (Hamilton - Anh)


- Bể ổn nhiệt (Đức)
- Máy lắc
- Tủ lạnh, tủ lạnh sâu và các dụng cụ hóa sinh khác
*
cụ:

Dụng

- Bình định mức 10 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000
ml
- Pipet 1ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml
- Micropipet 20-200 µl
- Hộp nhựa và đĩa 24 giếng để lên men tạo vật liệu cenlulose vi khuẩn có
các kích thước: 10 x 15 cm, 3 x 5 cm, 1,5 x 1,5 cm, bình tam giác, ống
nghiệm và các dụng cụ hóa sinh khác.
2.2. Phạm vi, nội dung nghiên cứu, địa điểm, thời gian nghiên cứu
2.2.1. Phạm vi nghiên cứu
Đánh giá khả năng hấp thụ Diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra
từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo.
2.2.2. Nội dung nghiên cứu
- Tạo và thu màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo


gạo.
- Nạp Diclofenac natri vào màng.

- Thử nghiệm khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri vào màng.
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu
- Phòng Sinh lý người và động vật, Trường ĐHSP Hà Nội 2.
- Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường ĐHSP Hà Nội 2.
2.2.4. Thời gian nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: 15 tuần
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp chế tạo vật liệu cellulose


2.3.1.1. Lên men thu vật liệu cenlulose vi khuẩn từ môi trường nước vo gạo
Bước 1: Chuẩn bị môi trường theo bảng 1.
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo vật liệu cenlulose
Thành phần

Hàm lượng

Glucose

30 g

Pepton

10 g

Diamoni photphat

0,3 g

Amoni sulfat

0,5 g

Acid acetic

2%

Nước vo gạo

1000 ml

Dịch giống

10 %

Lưu ý: pH của môi trường được đo và hiệu chỉnh bằng HCl hoặc NaOH;
pH của môi trường được đo và hiệu chỉnh = 4-6,pH thấp sẽ tránh bị nhiễm
những vi khuẩn khác.
0

Bước 2: Hấp khử trùng các môi trường ở 113 C trong 15 phút.
Bước 3: Lấy môi trường ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi để
nguội môi trường.
Bước 4: Bổ sung 10% dịch giống, lắc đều tay cho giống phân bố đều
trong dung dịch.
Bước 5: Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy theo kích thước nghiên cứu,
dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ, đặt tĩnh trong khoảng 4 – 14 ngày ở
0

28 C.

Bước 6: Thu vật liệu cellulose thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước.
2.3.1.2. Xử lý vật liệu cenllulose vi khuẩn trước khi hấp thụ thuốc
 Mục đích: loại bỏ được các tạp chất trong môi trường nuôi cấy, đồng
thời phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn.


Phương pháp: Trong nuôi cấy tĩnh, cellulose tạo thành vật liệu dày ở
mặt môi trường nuôi cấy, ép vật liệu loại bỏ môi trường.
Để thu được màng tinh chế ta cần thực hiện các bước sau:
+ Tách màng: Trong nuôi cấy tĩnh, cellulose tạo thành vật liệu dày ở mặt
môi trường nuôi cấy, ép vật liệu loại bỏ môi trường.
+ Ngâm trong NaOH: Trong vật liệu chứa một lượng lớn vi khuẩn, vì vậy,
0

hấp vật liệu trong NaOH nóng 3%, nhiệt độ 113 C trong thời gian 15 phút
bằng nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn
và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1 giờ.
+ Ngâm trong HCl: Màng sau khi được ngâm trong NaOH, rửa sạch bằng
nước rồi ép màng. Ngâm màng trong HCl 3% trong 48 giờ.
+ Ngâm nước: Vớt vật liệu đặt dưới vòi nước chảy đến khi vật liệu trắng
trong. Thử quỳ tím kiểm tra môi trường bề mặt vật liệu cenllulose vi khuẩn
cần đạt là trung tính, ta thu được cenllulose vi khuẩn tinh khiết
2.3.1.3. Đo độ dày màng
Độ dày màng được đo bằng thước kẹp panme, cần đo ở các vị trí khác
nhau. Sau đó tính toán các lần đo ta được độ dày màng cần lấy.
2.3.1.4. Đánh giá độ tinh khiết của vật liệu màng cellulose
Mục đích: Nhằm đảm bảo vật liệu màng cellulose vi khuẩn sau khi xử lý
đã loại được các tạp chất có thể gây độc hại. Chất được khảo sát là đường
glucose và protein của vi khuẩn.
* Tìm sự hiện diện của glucose trong vật liệu màng cellulose tinh chế

Nguyên tắc: Dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện diện
của đường D - glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
Tiến hành:
+ Bước 1. Lấy dịch thử của màng sau khi đã xử lý hóa học. Mẫu đối
chứng là: nước cất và dung dịch đường glucose.


+ Bước 2. Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1 ml
thuốc thử Fehling, đun dưới ngọn lửa đèn cồn từ 10 – 15 phút.
+ Bước 3. Quan sát kết tủa trong ống nghiệm.
*Tìm sự hiện diện của protein trong vật liệu màng cellulose tinh chế
Nguyên tắc: Định tính protein còn lại trong vật liệu bằng phản ứng tạo kết
tủa của protein với acid triclor acetic.
Tiến hành: Vật liệu màng cellulose tinh chế được cắt nhỏ, cho vào 50ml
nước cất, lắc kỹ với máy rung siêu âm trong 10 phút. Dùng dung dịch acid
triclor acetic 1% để phát hiện sự hiện diện của protein trong dịch chiết vật
liệu. Mẫu chứng âm là nước cất và mẫu chứng dương là dung dịch pepton 1%
(pepton đã sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn). Phản ứng dương tính khi cho kết
tủa đục. So sánh với mẫu chứng âm không chứa protein [3].
Vật liệu màng cellulose tinh chế dùng để tạo vật liệu nạp thuốc
Diclofenac natri phải đạt được những tính chất sau:
+ Cảm quan: mềm mại, dẻo dai, mỏng, có khả năng áp sát vào da, có
tính che phủ tốt.
+ Độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nước và dịch mô [4].
2.3.2. Xây dựng đường chuẩn.
Phương pháp: Dùng máy quét quang phổ
Sử dụng máy đo quang phổ UV- 2450 (Shimadru - Nhật Bản) để đo phổ
vùng tử ngoại và khả kiến. Máy bao gồm hệ thống quang học có khả năng
cung cấp ánh sáng đơn sắc trong dải từ 200 – 800nm. Chúng tôi sử dụng hai
cuvet đo dùng cho dung dịch thử và dung dịch đối chiếu được làm từ chất liệu

thạch anh, dung sai về độ dài quang trình của cốc đo là ±0,005cm. Các cuvet
đo được làm sạch và thao tác thận [1], [4].
* Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng: là HCl 0,1N.
* Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân chính xác 300 mg diclofenac natri
chuẩn được chuyển sang bình định mức 100 ml. 20-30 ml 0,1N HCl đã được
thêm vào để hòa tan diclofenac natri. Thể tích được làm thành 100 ml với


dung môi tương tự (A). 10 ml dung dịch (A) đã được thu hồi và thể tích được
điều chỉnh đến 300 ml (B). Lấy 10 ml từ dung dịch (B) đã được thu hồi và
pha loãng thành 100ml để lấy 10 (µg/ml) trong dung dịch HCl 0,1 N [2], [5].
Pha dãy dung dịch chuẩn chứa thuốc Diclofenac natri trong dung môi
HCl 0,1 N ở các nồng độ (µg/ml) khác nhau. Quét phổ dung dịch Diclofenac
natri có nồng độ 10 (µg/ml) trong khoảng bước sóng từ 200 đến 800nm, lựa
chọn bước sóng tại đó đạt cực đại (λmax) hấp thụ [4]
Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn tại bước sóng đã lựa chọn với
mẫu trắng là dung dịch HCl 0,1N và xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối
tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ Diclofenac natri.
Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV – 2450 để đo mật độ quang phổ
(OD) của các dung dịch đã pha như trên ở hấp thu cực đại (λmax) [4].
Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc
Diclofenac natri để xây dựng đường chuẩn của thuốc. Phương trình tuyến tính
biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ Diclofenac natri và độ hấp thụ.
Phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ có