Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc neomycin sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước dừa già

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

HOÀNG THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ
THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA
VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI - 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

HOÀNG THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ
THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA
VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn khoa học

TS. CAO BÁ CƯỜNG

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy
giáo Cao Bá Cường, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt
quá trình thực hiện khóa luận này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong khoa Sinh KTNN cùng các thầy cô trong Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng đã
tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ cho em trong quá trình làm thực nghiệm
để em hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình,
bạn bè luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và
hoàn thành khóa luận này.
Do lần đầu em tham gia nghiên cứu khoa học, kiến thức còn hạn chế
nên không tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của
thầy cô và các bạn để khóa luận tốt nghiệp của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Hoàng Thị Quỳnh

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đề tài do chính tôi thực hiện dưới sự hướng
dẫn của TS. Cao Bá Cường. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực
nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không
trùng với kết quả đã công bố. Những trích dẫn trong khóa luận lấy từ các công
bố chính thức và có ghi chú rõ ràng.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Hoàng Thị Quỳnh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu..................................................................................... 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Tổng quan về vật liệu cellulose (VLC)...................................................... 3
1.1.1. Vi khuẩn tổng hợp lên VLC.................................................................... 3
1.1.2. Môi trường nuôi cấy G. Xylinus.............................................................. 3
1.1.3. Cấu trúc của VLC.................................................................................... 4
1.1.4. Tính chất của VLC .................................................................................. 6
1.1.5. Ứng dụng của VLC ................................................................................. 6
1.2. Tình hình nghiên cứu VLC ........................................................................ 7
1.2.1. Trên thế giới ............................................................................................ 7
1.2.2. Tại Việt Nam........................................................................................... 7

1.3. Tổng quan về NS........................................................................................ 8
1.3.1. Công thức cấu tạo.................................................................................... 8
1.3.2. Tính chất lí hóa........................................................................................ 9
1.3.3. Dược lý học và dược động học .............................................................. 9
1.3.4. Chỉ định và chống chỉ định ..................................................................... 9
1.4. Tình hình nghiên cứu về NS .................................................................... 10
1.4.1. Trên thế giới .......................................................................................... 10
1.4.2. Tại Việt Nam......................................................................................... 10
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 11
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 11
2.1.1.Chủng vi khuẩn ...................................................................................... 11
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất........................................................................ 11
2.1.3. Trang thiết bị ......................................................................................... 11
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 11


2.2.1. Chuẩn bị VLC ....................................................................................... 11
2.2.2. Chế tạo VLC nạp NS............................................................................. 13
2.2.3. Phương pháp xử lí thống kê .................................................................. 15
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 16
3.1. Thu VLC và tinh chế màng...................................................................... 16
3.1.1. Thu VLC từ các môi trường lên men.................................................... 16
3.1.2. Tạo VLC tinh khiết ............................................................................... 16
3.1.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết củaVLC....................................... 17
3.2. Phương trình đường chuẩn NS trong PBS (pH = 7,4) ............................. 18
3.3. Xác định lượng thuốc NS nạp vào VLC .................................................. 19
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 24
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 25

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

1

VLC

Vật liệu cellulose

2

G.xylinus

Gluconacetobacter xylinus

3

NS

Neomycin sulfate

4

OD

5

PBS

Mật độ quang phổ
Phosphate buffered saline

6

S.fradiae

Streptomyces fradiae


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Giá trị dinh dưỡng của nước dừa già trong 100g [9]........................ 4
Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men thu VLC ..................................... 12
Bảng 2.2. Môi trường đệm PBS với pH = 7,4 ................................................ 13
Bảng 3.1. Mật độ quang của dung dịch Neomycin sufate ở các nồng độ
(n = 3).............................................................................................. 18
Bảng 3.2. Giá trị OD hấp thụ thuốc NS của VLC (n = 3)............................... 19
Bảng 3.3. Khối lượng, hiệu suất hấp thụ thuốc NS vào VLC(n=3)................ 20


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của VLC .................................................... 5
Hình 1.2. Cấu trúc của VLC (Yamanaka et al, 2000)....................................... 5
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Neomycin sunfate [27]................................. 8
Hình 3.1. VLC nuôi cấy trong 8 ngày............................................................. 16
Hình 3.2.VLC thô sau khi thu ......................................................................... 16
Hình 3.3. VLC 0,5 cm đã được tinh chế ......................................................... 17
Hình 3.4. Thí nghiệm kiểm tra độ tinh khiết của VLC ................................... 17
Hình 3.5. Phương trình đường chuẩn của thuốc NS ....................................... 18
Hình 3.6. VLC đang hấp thụ thuốc NS ........................................................... 19
Hình 3.7. Khối lượng thuốc NS hấp thụ vào VLC( 0,3cm) và VLC(0,5cm)

trong 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ ............................................................... 21
Hình 3.8. Hiệu suất hấp thụ thuốc NS của VLC(0,3cm) và VLC(0,5cm)
trong 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ ............................................................... 21


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

1


Ngày nay việc sử dụng các vật liệu sinh học để ứng dụng trong các lĩnh
vực như: y học, mỹ phẩm, thực phẩm,…đang được các nhà nghiên cứu khoa
học trong nước và trên thế giới đặc biệt quan tâm. Một trong những vật liệu
sinh học được các nhà khoa học đặc biệt chú ý đến đó là vật liệu cellulose
(VLC).
VLC được tổng hợp bởi rất nhiều vi khuẩn, trong đó phải kể đến đó là
vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus ( G.xylinus) – loại vi khuẩn có khả năng
tạo ra VLC tốt nhất.
VLC là hợp chất tương hợp sinh học, không độc hại, với cấu trúc siêu
mịn, đặc tính cơ học bền, dai, khả năng giữ ẩm cao nên có rất nhiều ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực như: công nghệ giấy, thực phẩm, y học, …[4].
Trong y học, VLC đã được ứng dụng làm màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng
da, mạch máu nhân tạo... [4]. Không chỉ vậy, VLC còn có khả năng hấp thu
thuốc, tăng tác dụng của thuốc, hạn chế được tác dụng phụ của thuốc.
Để tạo ra VLC, G.xylinus có thể nuôi cấy trong các môi trường như:
nước dừa già, rỉ đường, dịch ép hoa quả, …Trong đề tài này tôi chọn nước
dừa già là môi trường nuôi cấy G.xylinus vì nước dừa già chứa nhiều chất
dinh dưỡng cần thiết để nuôi cấy vi khuẩn G.xylinus.
Neomycin sunfate (NS) là loại thuốc kháng sinh nhóm aminoglycoside.

Được sử dụng để điều trị các nhiễm khuẩn ngoài da, ức chế vi khuẩn đường
ruột trước khi phẫu thuật, điều trị trong hôn mê gan, nhiễm trùng ống tai
ngoài, …
NS hấp thụ qua đường tiêu hóa rất kém, khoảng 97% lượng thuốc uống
vào cơ thể bị bài tiết dưới dạng không đổi qua phân. Kem NS điều trị bệnh
viêm da có khả năng thẩm thấu qua da không cao đạt 45%, nhanh bị khô trên
bề mặt da,…[1].
Chính vì vậy cần phải nghiên cứu hệ thống hấp thụ thuốc NS để giúp
thuốc được hấp thụ một cách tốt nhất.

2


Với mục đích tạo ra màng cellulose được tổng hợp từ vi khuẩn G.
xylinus, để khảo sát khả năng hấp thụ thuốc NS nhằm hạn chế tác dụng phụ
của thuốc, tăng khả năng thẩm thấu thuốc qua da để thuốc hấp thụ vào cơ thể
tốt nhất, rút ngắn thời gian điều trị bệnh.
Đó là lí do mà tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc
Neomycin sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter
xylinus nuôi cấy trong môi trường nước dừa già”.
2. Mục đích nghiên cứu
Tạo VLC từ môi trường nước dừa già để hấp thụ thuốc NS, nhằm tăng
khả năng hấp thụ thuốc vào VLC tối đa, từ đó khắc phục được nhược điểm
của thuốc ở dạng thông thường khi điều trị bệnh viêm da.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Khả năng hấp thụ thuốc NS của VLC tạo ra từ
G. xylinus lên men từ môi trường nước dừa già.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
4.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học:
Nghiên cứu tiềm năng của VLC trong việc hấp thu thuốc định hướng sử
dụng trên da.
Nghiên cứu khả năng hấp thụ các thuốc khác nhau của VLC nhằm tăng
hiệu quả điều trị của các loại thuốc đó.
Ý nghĩa thực tiễn:
Sử dụng VLC làm vật liệu để hấp thụ thuốc NS có thể làm tăng hiệu
quả của thuốc, khắc phục được tác dụng phụ không mong muốn trong việc
điều trị các bệnh viêm da bằng thuốc NS.

3


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về vật liệu cellulose (VLC)
Cellulose là một hợp chất hóa học, là thành phần chính của sinh khối
thực vật. Cellulose ngoài được tổng hợp từ thực vật nó còn được tổng hợp từ
vi khuẩn gọi là VLC.
1.1.1. Vi khuẩn tổng hợp lên VLC
VLC được tổng hợp bởi các loài khác nhau của vi khuẩn, chẳng hạn
như Acetobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Pseudomonas, Rhizobium
và Sarcina [31]. Đặc biệt phải kể đến đó là vi khuẩn G. Xylinus – có khả năng
tổng hợp VLC tốt nhất.
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey (2005) Acetobacter
xylinum được đổi tên thành G. Xylinus và xếp vào chi Gluconacetobacter
thuộc họ vi khuẩn Acetobacteraceae.
G. Xylinus là vi khuẩn gram âm, thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc
có khả năng tổng hợp sinh màng cellulose trong môi trường nuôi cấy tĩnh.
Chúng có dạng trực khuẩn, hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước khoảng

2 µm. Tế bào đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, có thể di động hoặc không
và không sinh bào tử.
G. xylinus có khuẩn lạc nhỏ, tròn, bề mặt nhầy, trơn bóng, phần giữa
khuẩn lạc lồi lên, dày hơn, sẫm màu hơn các phần chung quanh, rìa mép
khuẩn lạc nhẵn. Trong môi trường lỏng, sau 24 giờ nuôi cấy xuất hiện một lớp
đục mỏng trên bề mặt dưới có những sợi tơ. Sau 36 – 48 giờ, lớp màng đó dày
dần lên, không còn đục như trước mà trong hơn [9].
1.1.2. Môi trường nuôi cấy G. Xylinus
Môi trường nuôi cấy G. xylinus là môi trường có bổ sung các chất dinh
dưỡng cần thiết cho vi khuẩn sinh trưởng và phát triển như nguồn cacbon,
nito, nguồn sulfur và phosphor, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng.
Để tạo VLC G. xylinum có nhu cầu sử dụng đường rất lớn chính vì vậy rất

4


nhiều nhà khoa học đã sử dụng rỉ đường, nước dừa già, nước mía,... làm
nguyên liệu nuôi cấy G. xylinum.
Ở đề tài này, tôi chọn nước dừa già là nguyên liệu nuôi cấy G.xylinus
để tạo VLC bởi:
- Nước dừa già không khó tìm, có thể mua tại các cơ sở sản xuất mứt
dừa, dừa sấy hay cơ sở sản xuất dầu dừa tại các nhà máy sản xuất dầu
dừa với giá thành rẻ.
- Trong nước dừa chứa rất nhiều chất dinh dưỡng được trình bày ở bảng
1.1, chất kích thích tăng trưởng như 1,3 – diphenyllurea, hexitol,
cytolunin, myoinositol, sorbitol,… Đó là môi trường dinh dưỡng thích
hợp để cho G.xylinus sinh trưởng và phát triển để tổng hợp VLC
Bảng 1.1: Giá trị dinh dưỡng của nước dừa già trong 100g [9]
Nước

94,99% Zn

0,1 mg

Protein

0,72% Cu

0,04 mg

Chất béo toàn phần
Carbonhydrat

0,2% Mangan
3,17% Selenium

Đường

2.16% Vitamin C

2,4 mg

Ca

24 mg Vitamin B1

0,03 mg

Fe

0,29 mg Vitamin B2

0,057 mg

Mg

25 mg Vitamin B3

0,08 mg

P

20 mg Vitamin B5

0,043 mg

K

250 mg Vitamin B6

0,032 mg

Na

105 mg Vitamnin B9

0,142 mg
1 µg

3 µg

1.1.3. Cấu trúc của VLC
VLC là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng
liên kết β-1,4-glucan

5


Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của VLC
VLC có cấu trúc hóa học cơ bản giống cellulose của thực vật, nhưng lại khác
nhau về cấu trúc đại thể [14],[16].
Theo AJ. Brown (1886) [18], VLC gồm nhiều sợi thứ cấp có bản chất là
hemicellulose, bề rộng 1,5 nm. Các sợi thứ cấp này kết hợp với nhau tạo
thành vi sợi có kích thước lớn hơn. Các vi sợi này lại kết hợp với nhau thành
bó. Nhiều bó hợp thành dải, mỗi dải có chiều dày 3-4nm, chiều dài khoảng
130- 177nm.

Hình 1.2. Cấu trúc của VLC (Yamanaka et al, 2000)

Đặc tính cấu trúc của VLC phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy:
Khi nuôi cấy theo phương pháp tĩnh (S - BC: Static - Cellulose vi
khuẩn), trong môi trường lỏng G.xylinus tổng hợp tạo thành lớp màng dày
trên bề mặt môi trường. VLC thu được dẻo dai, dày, độ tinh sạch, độ bền cơ

6


học cao, khả năng chịu nhiệt tốt, có thể bị phân hủy sinh học, không độc hại,
không gây dị ứng, đặc biệt là khả năng cản khuẩn [4].
Khi nuôi cấy động (A - BC: Agitated - Cellulose vi khuẩn), cellulose

hình thành thành dưới dạng huyền phù với kích thước không đều nhau phân
tán trong môi trường dinh dưỡng. VLC được hình thành trong nuôi cấy động
có hình thái đặc điểm khác hẳn so với VLC được nuôi cấy theo phương pháp
tĩnh.
1.1.4. Tính chất của VLC
- VLC có tính chất độc đáo với cấu trúc mạng tinh thể ổn định, siêu
mịn, thành phần tỉ lệ Iα cao.
- Khả năng giữ nước và hút nước cực tốt. VLC có thể hút khoảng 200
lần trọng lượng của nó nhưng vẫn giữ được độ thông thoáng cao
- Độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và
hemicellulose.
- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài
nguyên có thể phục hồi.
- Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có
độ bền cao, trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao,... [5], [10].
- VLC không chứa lignin hay hemicellulose nên VLC dễ dàng bị vi
khuẩn phân hủy. Dựa vào điểm này người ta có thể ứng dụng trong việc thay
bao bì ni lông bằng VLC để giúp bảo vệ môi trường. VLC còn có khả năng tái
chế.
1.1.5. Ứng dụng của VLC
Với các tính chất độc đáo của VLC, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử
dụng VLC vào các mục đích sử dụng khác nhau trong các lĩnh vực như: y
học, mỹ phẩm, thực phẩm, công nghiệp giấy, …. [2], [4], [10], [12].
Thực phẩm: Thạch dừa, thuốc rượu Kombucha, màng bao xúc xích,
màng bảo quản dừa tươi, thịt tươi.
Y tế: VLC được sử dụng để chữa lành các vết thương cho da bị tổn
thương nghiêm trọng, màng bao sụn, ống dẫn niệu, vỏ bọc viên nang, tác
7

nhân vận chuyển thuốc,…
Mỹ phẩm: Làm chất ổn định trong kem dưỡng da, gel vuốt tóc, làm mặt
lạ dưỡng da,…
Môi trường: Sử dụng VLC để loại bỏ thủy ngân trong nước, nước thải.
Hút vết dầu tràn trên sông, biển ngăn ngừa ô nhiễm môi trường nước.
Phòng thí nghiệm: Màng cố định protein, cố định enzim, vi khuẩn,…
Ngành công nghiệp khác: VLC được sử dụng làm màng loa âm thanh
của tai nghe.
1.2. Tình hình nghiên cứu VLC
1.2.1. Trên thế giới
Với tính chất vô cùng độc đáo của VLC, VLC được các nhà khoa học
đặc biệt quan tâm tới việc nghiên cứu ứng dụng của nó vào trong nhiều lĩnh
vực. Trong đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu ứng dụng của VLC làm vật
liệu hấp thụ thuốc qua da.
Fontana và cộng sự (1990) [22] đã chỉ ra VLC có khả năng băng kín
vết thương, duy trì dịch tiết, làm giảm đau vết thương, tăng tốc tái tạo tế bào,
làm giảm tỷ lệ nhiễm trùng vết thương, giảm sẹo và dễ dàng tháo gỡ, kiểm
tra.
Czaja và cộng sự (2007) [21] sử dụng VLC đắp lên vết bỏng đã thu
được kết quả tốt.
1.2.2. Tại Việt Nam
Ngày nay, việc nghiên cứu ứng dụng VLC ngày càng được các nhà
khoa học chú trọng. Một số sản phẩm từ VLC đã được thương mại hóa trên
thị trường như: thạch dừa, màng trị bỏng Acetul, mặt lạ dưỡng da, màng bao
xúc xích,...
Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2006) [9] đã tiến hành thử nghiệm in
vivo ứng dụng VLC để điều trị bỏng với hai loại. Một loại VLC cho thêm
hoạt chất tái sinh mô và một loại cho thêm hoạt chất kháng khuẩn. Kết quả
cho thấy tác dụng của màng có thêm hoạt chất tái sinh mô tốt hơn hẳn dạng
màng thông thường.

8


Nhóm tác giả Nguyễn Thị Kim Ngoan, Đinh Thị Kim Nhung nghiên
cứu ở quy mô phòng thí nghiệm chế tạo VLC làm mặt nạ dưỡng da.
Tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cs (2012) [4], [5] đã nghiên cứu và
chế tạo thành công chế phẩm VLC trị bỏng có tẩm dung dịch berberin clorid
0,1% có tác dụng kháng khuẩn và tái sinh mô tốt, không gây đau.
Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy VLC có khả năng hấp thụ một
số loại thuốc rất tốt. Đây cũng là một hướng đi khả quan trong việc nghiên
cứu phát triển ứng dụng VLC trong việc hấp thụ thuốc NS.
1.3. Tổng quan về NS
NS là dạng chế phẩm của neomycin, kháng sinh nhóm aminoglycoid
được sản xuất bằng cách nuôi cấy một số chủng S.fradiae [2]. Neomycin ở
dạng thường có tỉ lệ gây dị ứng cao hơn neomycin dạng chế phẩm. Trong
những dạng chế phẩm của neomycin thì dạng muối sulfate là dạng dễ hấp thụ
nhất và ít gây dị ứng cho người dùng. Bởi vậy, tôi chọn NS để nghiên cứu
trong đề tài này.
1.3.1. Công thức cấu tạo
- Công thức phân tử: C23H46N6O13.3( H2SO4)
- Phân tử khối : 908.866 g/mol
- Công thức cấu tạo thuốc neomycin sunfate thể hiện ở hình:

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Neomycin sunfate [27]

9


1.3.2. Tính chất lí hóa

NS có dạng bột tinh thể màu trắng đến hơi vàng. Rất dễ tan trong nước,
khó tan trong ethanol 96%, không tan trong aceton [2]. Quang phổ hấp thụ ở
bước sóng 277 nm. Định tính NS trong các chế phẩm (thuốc tiêm, thuốc mỡ,
viên nén, dung dịch nhỏ mắt, ...)
1.3.3. Dược lý học và dược động học
NS là kháng sinh nhóm aminoglycoside có cơ chế và phổ tác dụng
tương tự gentamicin sulfat. Khi phối hợp với bacitracin, thuốc có tác dụng với
phần lớn các vi khuẩn Gram âm và Gram dương gây nên các nhiễm khuẩn
ngoài da. Những vi khuẩn nhạy cảm với NS như: Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Heamophilus influ- enzae, Klebsiella, Enterobacter,
Neisseria.
NS được hấp thu kém qua đường tiêu hóa, khoảng 97% lượng thuốc
uống vào cơ thể được bài tiết dưới dạng không đổi qua phân. Khi được hấp
thu, thuốc sẽ thải trừ nhanh qua thận dưới dạng hoạt tính. Điều này gây hại
cho thận.
1.3.4. Chỉ định và chống chỉ định
NS được dùng tại chỗ để điều trị các nhiễm khuẩn ngoài da, tai và mắt
do tụ cầu và các vi khuẩn khác nhạy cảm [1].
NS không được dùng trong đường tiêm hoặc toàn thân vì độc tính của
thuốc. Không dùng NS tại chỗ lâu với liều lượng cao vì có thể gây mẫn cảm
trên da và dễ mẫn cảm chéo với các kháng sinh aminoglycosid khác [15].
Bên cạnh đó thì NS có những tác dụng phụ như: mụn, làm khô da,
nhiễm trùng da, không có khả năng cản khuẩn. NS có khả năng thẩm thấu
qua da không cao đạt 45%, nhanh bị khô bề mặt trên da,…[1]. Để khắc phục
được tác dụng phụ của thuốc cần phải sử dụng một loại vật liệu có khả năng
giữ ẩm, cản khuẩn. Chính vì vậy mà tôi chọn VLC nạp NS để hạn chế tác
dụng phụ của thuốc.

10

1.4. Tình hình nghiên cứu về NS
1.4.1. Trên thế giới
Năm 1949 Selman A., Waksman phát hiện NS được sản xuất từ môi
trường nuôi cấy nấm Streptomyces fradiae [33]. Các nhà khoa học trên đã tìm
ra quá trình sinh tổng hợp và đánh giá khả năng kháng khuẩn của NS.
Pedersoli W.M. và cộng sự (1994) [25] nghiên cứu sự hấp thụ của NS
trên bê con Hà Lan qua đường tiêm. Kết quả cho thấy NS hấp thụ đạt tỷ lệ
không cao, và lượng NS đào thải qua thận lớn gây hại cho thận.
Nhóm nghiên cứu của Blanchard C. (2015) [17] cũng chỉ ra rằng NS
kháng khuẩn tốt hơn neomycin, do NS ở dạng muối ít gây dị ứng với cơ thể.
1.4.2. Tại Việt Nam
NS có trong danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam ban hành lần thứ 4
năm 1999 [2]. NS được bào chế dạng kem, dung dịch pha chế với một số hoạt
chất khác. Tuy nhiên hướng nghiên cứu sử dụng VLC nạp thuốc NS thì chưa
có công trình nào nghiên cứu.

11


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU

12


2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1.Chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn G.xylinus dùng lên men thu nhận VLC mua từ Nhật
Bản.

2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất
- Neomycin sulfate mua từ Trung Quốc
- Dung môi và chất phản ứng khác được mua từ Đức.
- VLC được sản xuất bằng cách sử dụng vi khuẩn G. xylinum lên men
trong môi trường nước dừa già.
- Nguyên liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo VLC: đường
glucose, peptone, diamoni photphat, amoni sulfat, nước dừa già.
2.1.3. Trang thiết bị
Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản); cân phân tích
(Sartorius – Thụy sỹ); cân kỹ thuật (Sartorius - TE612); nồi hấp khử trùng
HV-110/HIRAIAMA; kính hiển vi điện tử quét; buồng cấy vô trùng
(Haraeus); tủ sấy; tủ ấm (Binder - Đức); khuấy từ gia nhiệt (IKA – Đức););
máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh); tủ lạnh Daewoo
và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuẩn bị VLC
2.2.1.1. Lên men thu VLC thô

13


Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men thu VLC
Thành phần

Khối lượng

Glucose

20 g

Pepton

10 g

Diamoni photphat

0,3 g

Amoni sunfat

0,5 g

Nước dừa già

1000 ml

Quá trình lên men thu VLC thực hiện theo các bước sau:
0

Bước 1: Sấy bình ở nhiệt độ 200 C, để nguội
Bước 2: Chuẩn bị môi trường theo bảng 2.1.
0

Bước 3: Hấp khử trùng môi trường đó ở 113 C trong 15 phút.
Bước 4: Lấy môi trường ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi để
nguội môi trường.
Bước 5: Bổ sung 20% dịch giống, lắc đều tay cho giống phân bố đều
trong dung dịch.
Bước 6: Dùng gạc vô trùng bịt miệng lọ, ủ tĩnh trong khoảng 6– 8 ngày
0

ở 26 C.
Bước 7: Thu VLC thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước. Dựa trên một số
kết quả nghiên cứu của một số tác giả [7] , [9] tôi chọn VLC có độ dày từ
0,3 - 0,5cm làm hệ thống hấp thu thuốc định hướng sử dụng qua da. Sau khi
nuôi cấy tĩnh G. xylinum sau 6 - 8 ngày tiến hành thu VLC, VLC lúc này có
độ dày 0,3 cm – 0,5 cm
2.2.1.2. Tạo VLC tinh khiết
0

Sau khi ủ tĩnh trong 6 - 8 ngày ở 26 C, VLC được tách ra. Để tạo được
VLC tinh chế thì phải trải qua các bước sau:
Bước 1: Tách VLC thô ra khỏi môi trường nuôi cấy, ép bỏ bớt nước.
Bước 2: Ngâm VLC 48 giờ trong NaOH 3%, sau đó bỏ ra rửa và ép.

14


Bước 3: Ngâm tiếp trong HCl 3% trong 48 giờ, sau đó bỏ ra rửa và ép
loại bỏ nước.
Bước 4: Ngâm VLC 48 giờ trong nước, sau đó bỏ ra kiểm tra tạp chất
Bước 5: Thu VLC tinh chế
2.2.1.3. Phương pháp đánh giá độ tinh sạch củaVLC.
Để kiểm tra VLC đã tinh khiết hay chưa ta thực hiện các bước sau: Bước
1: VLC (0,3 cm), VLC (0,5 cm) sau khi tinh chế, lấy dịch thử,
chia vào 2 ống: ống thử 1 (VLC 0,3 cm), ống thử 2 (VLC 0,5 cm).
Bước 2: Chuẩn bị mẫu đối chứng: D – Glucose và nước cất 2 lần. Nhỏ
thuốc thử Fehling vào 2 ống đối chứng mỗi ống 1 ml. Ống chứa D – Glucose
sẽ có kết tủa đỏ nâu, còn ống chứa nước cất 2 lần sẽ không có hiện tượng gì.
Bước 3: Cho vào các ống thử mỗi ống nghiệm 1 ml thuốc thử Fehling

mới pha, đun dưới ngọn lửa đèn cồn 10 phút.
Bước 4: Nếu ống thử không bị đục như ống đối chứng chứa nước cất
thì màng đã tinh khiết. Còn nếu có kết tủa đỏ nâu, chứng tỏ VLC vẫn chưa
tinh khiết, vẫn còn glucose ta tiếp tục xả nước.
2.2.2. Chế tạo VLC nạp NS
2.2.2.1. Chuẩn bị bộ đệm
Môi trường đệm Phosphate buffered saline (PBS) [8] được chuẩn bị với
các thành phần và cách pha được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Môi trường đệm PBS với pH = 7,4
Hóa chất
Thành phần

Cách pha
Khối lượng Cho hóa chất vào cốc đong.

NaCl

0,8g

Thêm đến mức 800ml bằng nước cất.

KCl

0,2g

Điều chỉnh pH tới 7,4 bằng HCl.

Na2HPO4.12H2O

1,44g

Bổ sung nước tới 1000 ml.

Na2HPO4

0,22g

Khử trùng.

15


2.2.2.2. Xây dựng đường chuẩn NS
Sử dụng hệ thống quang phổ tử ngoại UV để ghi mật độ quang hấp thụ
của thuốc NS.
Chuẩn bị dung dịch NS ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau: 0,05; 0,1;
0,15; 0,2; 0,25; 0,3.
Sử dụng dung môi là PBS (pH = 7,4). Dùng máy đo quang phổ tử ngoại
(OD) UV – 2450 để đo UV ở bước sóng 277 nm (bước sóng hấp thụ cực đại
của NS). Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc NS để
xây dựng đường chuẩn của thuốc.
2.2.2.3. Chuẩn bị môi trường cho VLC nạp thuốc
Bước 1: VLC sau khi tinh chế ta lấy giấy thấm bỏ 60% nước
Bước 2: Chuẩn bị 3 bình 250 ml, mỗi bình cho NS (2 mg/ml) sau đó
cho dung dịch đệm PBS (pH= 7,4) đến vạch 100 ml.
Bước 3: Cho màng vào dung dịch vừa pha, rung động ở 180 vòng và
0

40 C trong 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ đảm bảo cho màng hấp thụ tối đa. Sau đó lấy
0

ra và cho vào bao nilon, hấp tiệt trùng ở 120 C trong 20 phút, hàn bao bì và
đặt trong ngăn mát tủ lạnh.
2.2.2.4. Xác định lượng NS nạp vào VLC
Dùng máy đo quang phổ UV – 2450 xác định lượng thuốc có trong
dung dịch sau các khoảng thời gian khác nhau, từ đó xác định lượng thuốc
nạp vào màng theo công thức:
mht = m1 – m2 (mg)
(1)
Trong đó:
mht: Khối lượng thuốc đã được hấp thu vào màng.
m1: Khối lượng thuốc ban đầu trong dung dịch.
m2: Khối lượng thuốc có trong dung dịch sau khoảng thời gian nhất định
màng hấp thu thuốc.
Đánh giá hiệu suất thuốc nạp vào màng được tính theo công thức:

16