Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc neomycin sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

NGUYỄN THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG CHUẨN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Hà Nội, tháng 5 năm 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

NGUYỄN THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG CHUẨN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn: TS. CAO BÁ CƯỜNG

Hà Nội, tháng 5 năm 2019


LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp với đề tài
“Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc neomycin sulfate của vật liệu
cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường
chuẩn” tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô,
gia đình và bạn bè tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng - Trường Đại
học Sư phạm Hà Nội 2.
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới
TS. Cao Bá Cường, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, đã hướng dẫn tôi tận
tình trong việc lựa chọn đề tài nghiên cứu, chỉ bảo, giúp đỡ, động viên tôi
trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và chỉnh sửa những thiếu sót trong
quá trình nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô giáo trong
Khoa Sinh - KTNN cùng các thầy, cô tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng
dụng - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và
tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận.
Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, quan tâm động viên
của gia đình, bạn bè trong suốt quá trình hoàn thành khoá luận.
Tuy bản thân đã có nhiều cố gắng nhưng do lần đầu tham gia nghiên
cứu khoa học, kiến thức và kinh nghiệm còn hạn chế nên khóa luận này
không thể tránh được những thiếu sót. Vì vậy, tôi rất mong nhận được sự góp
ý của quý thầy cô để khóa luận được hoàn chỉnh hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Thị Hương


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: khóa luận tốt nghiệp với đề tài “Nghiên cứu khả
năng hấp thụ thuốc neomycin sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ
Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn” là công trình
nghiên cứu của chính tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Cao Bá
Cường. Các kết quả và số liệu được trình bày trong khóa luận này là trung
thực, khách quan và chưa được công bố trong bất kì công trình nghiên cứu
của tác giả nào khác.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Thị Hương


DANH LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

VLC

Vật liệu cellulose

G. xylinus

Gluconacetobacter xylinus

HS

Môi trường chuẩn

OD

Mật độ quang phổ

PBS

Phosphate buffered saline


DANH LỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của VLC .............................................................. 5
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của neomycin sulfate ..................................... 10
Hình 2.1 Quy trình thu nhận màng VLC tinh khiết ...................................... 16
Hình 3.1. Màng VLC khi nuôi cấy tĩnh trong HS ở phòng thí nghiệm ........ 20
Hình 3.2. Quy trình tạo màng VLC tinh khiết .............................................. 21
Hình 3.3. Màng VLC tinh khiết sau khi đục nhỏ.......................................... 22
Hình 3.4. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của màng VLC .............................. 22
Hình 3.5. Phương trình đường chuẩn NS trong PBS (pH = 7,4) .................. 23
Hình 3.6. Màng VLC đang hấp thụ thuốc neomycin sulfate ........................ 24
Hình 3.7. Hiệu suất hấp thụ neomycin sulfate ở 2 độ dày màng ở 1 h; 1,5
h; 2 h.............................................................................................................. 26



DANH LỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần của môi trường chuẩn lên men thu màng VLC ............ 9
Bảng 2.1. Thành phần của HS lên men thu màng VLC.................................. 14
Bảng 2.2. Môi trường đệm PBS với pH = 7,4 ................................................ 17
Bảng 3.1. Kết quả độ dày màng VLC thô (n = 3)........................................... 19
Bảng 3.2. Mật độ quang của dung dịch neomycin sulfate và giá trị OD277 nm
(n = 3) .............................................................................................................. 23
Bảng 3.3. Giá trị OD trung bình của dung dịch neomycin sulfate khi ngâm
màng VLC tại 1 h, 1,5 h, 2 h (n = 3)............................................................... 25
Bảng 3.4. Lượng thuốc Neomycin sulfate hấp thụ qua màng VLC ở 1 h; 1,5 h;
2 h (n = 3) ........................................................................................................ 26


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài......................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu.................................................................................. 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 3
4. Nội dung nghiên cứu.................................................................................. 3
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ...................................................... 3
NỘI DUNG....................................................................................................... 5
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 5
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng và lĩnh vực nghiên cứu ................. 5
1.1.1. Vật liệu cellulose lên men từ môi trường chuẩn ........................... 5
1.1.1.1. Cấu trúc VLC .......................................................................... 5
1.1.1.2. Một vài đặc điểm của vật liệu cellulose .................................. 6
1.1.1.3. Đặc tính của vật liệu cellulose ............................................... 6
1.1.1.4. Vi sinh vật tổng hợp cellulose................................................. 7
1.1.1.5. Môi trường nuôi cấy G. xylinus nhằm thu màng VLC ........... 8
1.1.2 Tổng quan về neomycin sulfate...................................................... 9
1.1.2.1. Công thức ................................................................................ 9

1.1.2.2. Tính chất lí hóa...................................................................... 10
1.1.2.3. Dược lí và dược động học ..................................................... 10
1.1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định ................................................... 11
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước........................................ 11
1.2.1. Tình hình nghiên cứu vật liệu cellulose ...................................... 11
1.2.2. Tình hình nghiên cứu neomycin sulfate ...................................... 12
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 13


2.1. Vật liệu nghiên cứu............................................................................ 13
2.1.1. Giống vi khuẩn ............................................................................ 13
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất .............................................................. 13
2.1.3. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu ..................................... 13
2.1.4. Dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu .................................... 14
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 14
2.2.1. Chuẩn bị màng vật liệu celulose.................................................. 14
2.2.1.1. Tạo màng VLC thô từ môi trường chuẩn.............................. 14
2.2.1.2. Tạo màng VLC tinh khiết...................................................... 15
2.2.2. Chế tạo màng VLC nạp thuốc neomycin sulfate......................... 16
2.2.2.1. Chuẩn bị hệ đệm.................................................................... 16
2.2.2.2. Xây dựng đường chuẩn thuốc neomycin sulfate................... 17
2.2.2.3. Nạp thuốc neomycin sulfate vào màng VLC ........................ 17
2.2.3. Phương pháp xử lý thống kê........................................................ 18
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 19
3.1. Thu màng VLC từ môi trường chuẩn ................................................ 19
3.2. Tạo màng VLC tinh khiết từ màng VLC thô..................................... 20
3.3. Đường chuẩn hấp thụ thuốc neomycin sulfate trong PBS (pH = 7,4)
................................................................................................................... 23
3.4. Khả năng hấp thụ thuốc neomycin sulfate vào màng VLC nuôi cấy
trong môi trường chuẩn............................................................................. 24

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 29
1. Kết luận .................................................................................................... 29
2. Kiến nghị.................................................................................................. 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 30


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Vật liệu cellulose (VLC) là sản phẩm được tạo ra từ một loại vi khuẩn,
trong đó có chủng Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus). Vật liệu cellulose
có những đặc điểm giống cellulose thực vật như các phân tử glucose liên kết
với nhau bằng liên kết β-4 glucorit tuy nhiên VLC khác với cellulose thực vật
ở những đặc điểm như không chứa hợp chất cao phân tử: hemicelluloses,
ligin, peptin và sáp nến. Nhờ vậy mà VLC có độ bền chắc và dẻo dai hơn hẳn
cellulose thực vật, đây cũng chính là những đặc tính vượt trội của VLC. Nhờ
những đặc tính nổi bật như vậy mà VLC đã được rất nhiều nước trên toàn thế
giới ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau: trong quá trình xử lí
nước người ta sử dụng màng VLC làm môi trường phân tách, dùng làm chất
màng đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, trong sinh học làm môi
trường cơ chất, thay thế thực phẩm, thiết kế hệ thống vận tải phân phối thuốc
và nhiều ứng dụng khác [18].
Màng VLC cũng được ứng dụng rất nhiều trong lĩnh vực y học như:
trong điều trị bỏng hay bệnh loét da người ta dùng VLC làm da tạm thời, sử
dụng VLC làm mạch máu nhân tạo, điều trị các bệnh về tim mạch, làm mặt nạ
dưỡng da cho con người [6, 18]. Amin et al. [10] đã báo cáo về việc sử dụng
màng VLC làm màng bọc paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ.
Kết quả cho thấy rằng màng VLC có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc
chậm lại, do đó giúp tăng hiệu quả sử dụng của thuốc. Ở Việt Nam, VLC là
chủ đề vẫn còn rất mới, VLC mới được quan tâm gần đây nhưng việc nghiên
cứu và ứng dụng chúng đã có những kết quả bước đầu. Đề tài của tác giả

Nguyễn Văn Thanh – Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh 2006 [6] đã “Nghiên
cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Gluconacetobacter xylinus”. Theo kết
quả nghiên cứu cho thấy có thể tạo ra số lượng lớn màng VLC nhờ việc sản
xuất chúng trên quy mô công nghiệp và được tạo nên từ các nguồn nguyên
liệu rẻ tiền, dễ kiếm. Về mặt tính chất, khác với các loại cellulose khác, VLC
có độ tinh sạch rất cao, do vậy có thể được phân hủy sinh học, tái chế hay
phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra, VLC còn có độ bền tinh thể cao, trọng lượng
thấp, sức căng lớn, khả năng thấm hút lớn, đường kính sợi nhỏ,... Đồng thời là
1


một bức tường ngăn cản oxi và các loài sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy
các cơ chất ở bên trong tế bào và ngăn cản ảnh hưởng xấu của tia UV, ổn định
về kích thước và hướng, đặc biệt VLC còn có ý nghĩa giữ thuốc và giải phóng
thuốc kéo dài [9, 14]…
Bên cạnh đó, cellulose gồm các sợi có cấu trúc mạng polymer sẽ là
một hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc giúp tăng sinh khả dụng của
thuốc và trong môi trường acid nó có thể ngăn cản sự phá hủy thuốc.
Neomycin sulfate là loại thuốc kháng sinh nhóm aminoglycoside.
Neomycin sulfate và tiểu đơn vị 30S ribosome liên kết trực tiếp với nhau, do
đó có thể ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn. Phổ hoạt động của neomycin
sulfate bao gồm nhiều sinh vật gram âm hiếu khí và một số sinh vật gram
dương hiếu khí. Trong đường tiêu hóa neomycin sulfate ức chế vi khuẩn tạo
ammoniac và cải thiện tình trạng thần kinh của bệnh nhân bị bệnh não gan.
Đồng thời, trong điều trị vết thương neomycin sulfate có khả năng kháng
khuẩn rất tốt. Tuy nhiên, khi sử dụng neomycin sulfate có thể không tránh
khỏi một số tác dụng phụ không mong muốn: buồn nôn, nôn mửa, hội chứng
kém hấp thu, tiêu chảy và viêm đại tràng…
Có rất nhiều môi trường khác nhau như: nước dừa già, nước vo
gạo,…mà màng VLC có thể lên men được. Tuy nhiên, môi trường chuẩn

(HS) (2 wt% glucose, 0,5 wt% nấm men chiết xuất, 0,5 wt% peptone,
0,15wt% acid citric và 0,27 wt% disodium phosphate) [18] là môi trường
được sử dụng nhiều nhất và được coi là môi trường tối ưu nhất trong lên men
màng VLC.
Nhằm tăng hiệu quả hấp thụ thuốc, đồng thời khắc phục được những
tác dụng phụ không mong muốn từ thuốc Neomycin sunlfate và tiết kiệm chi
phí trong quá trình thực nghiệm và sản xuất, nên chúng tôi quyết định chọn đề
tài: “Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc neomycin sulfate của vật liệu
cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường
chuẩn”.
2. Mục đích nghiên cứu
Tạo ra được màng VLC từ chủng Gluconacetobacter xylinus trong môi


trường chuẩn.
Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc neomycin sulfate của vật liệu
cellulose nuôi cấy trong môi trường chuẩn.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: hệ thống hấp thụ thuốc Neomycin sulfate của
vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi
trường chuẩn.
Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
Vật liệu nghiên cứu: vật liệu cellulose, thuốc neomycin sulfate,…
Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Sinh lý học người và động vật, Viện
Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2,
Khoa Sinh - KTNN - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
4. Nội dung nghiên cứu
Chế tạo ra màng VLC từ chủng vi khuẩn G. xylinus trên môi trường
chuẩn.

Xử lý màng VLC thô, thu được màng VLC tinh chế.
Nạp thuốc neomycin sulfate vào màng VLC.
Kiểm tra hiệu quả hấp thụ thuốc neomycin sulfate qua màng VLC.
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
* Ý nghĩa khoa học:
Giúp mở rộng và nâng cao hiểu biết của bản thân về ứng dụng của vật
liệu cellulose, đồng thời thông qua việc thiết kế một hệ thống vận tải và phân
phối thuốc hợp lí giúp hạn chế được các tác dụng phụ của thuốc neomycin
sulfate gây ra.
Ngoài ra, màng VLC lên men từ các môi trường khác nhau có những
ưu, nhược điểm khác nhau, chúng ta có thể tìm ra được những ưu và nhược
điểm này để từ đó có những hướng nghiên cứu mới làm tăng các đặc tính của


màng VLC, hạn chế các yếu điểm của màng để ứng dụng màng trên nhiều
lĩnh vực khác nhau.
* Ý nghĩa thực tiễn:
Giảm giá thành sản phẩm, giá rẻ, dễ dàng nghiên cứu.
Thiết kế được quy trình tạo màng VLC từ chủng Gluconacetobacter
xylinus.
Khảo sát được hàm lượng thuốc neomycin sulfate hấp thụ qua VLC. Từ
đó chọn ra được trường hợp thuốc hấp thụ tốt nhất nhằm cải thiện nhược điểm
của neomycin sulfate.


NỘI DUNG
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng và lĩnh vực nghiên cứu
1.1.1. Vật liệu cellulose lên men từ môi trường chuẩn
1.1.1.1. Cấu trúc VLC

VLC có cấu trúc hóa học cơ bản giống với cellulose của thực vật,
nhưng khác nhau về cấu trúc đại thể.
Điều kiện nuôi cấy là yếu tố quan trọng để quyết định cấu trúc của
màng VLC. Khi nuôi cấy tĩnh, G. xylinus tạo ra số lượng cellulose nhiều hơn
và tạo thành lớp màng dày trên bề mặt môi trường. Khi đó thu được màng
VLC dày, có độ dẻo dai và màng có màu trắng trong hơi ngả màu vàng.
Còn khi nuôi cấy động G. xylinus tạo ra một lượng cellulose nhỏ hình
thành dưới dạng huyền phù.
Do đó, lượng VLC được tạo ra ở hai phương pháp nuôi cấy động và
nuôi cấy tĩnh này cũng khác nhau: khối lượng màng thô của phương pháp
nuôi cấy tĩnh lớn hơn so với nuôi cấy động [6, 13].
Cấu trúc hóa học của VLC được trình bày trên hình 1.1.

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của VLC
Cấu trúc kết tinh của vật liệu cellulose:
Cấu trúc của vật liệu cellulose được xác định nhờ công nghệ và kỹ
thuật hiện đại. Những kỹ thuật hiện đại như phổ Raman, phổ hồng ngoại, phổ


cộng hưởng từ hạt nhân,... giúp xác định vật liệu cellulose ở dạng kết tinh
nào.
Cellulose Iα và Iβ là hai loại cấu trúc tinh thể tạo thành màng VLC.
Cellulose Iα và Iβ đều có mặt trong các vi sợi cellulose. Ở màng cellulose thực
vật thu được hầu hết tinh thể Iβ tinh khiết nhưng tinh thể Iα tinh khiết vẫn chưa
tìm được cách nào thu được. Cấu trúc màng VLC chứa số lượng tinh thể Iα
nhiều hơn cellulose thực vật. Tỉ lệ này nằm trong khoảng 64% đến 71% tuỳ
vào nhiệt độ môi trường và chủng vi sinh vật. Ở cellulose thực vật, Iα chỉ
chiếm khoảng 20% [16].
Nhìn chung, trong việc xác định các tính chất của cellulose thì cấu trúc
tinh thể được coi là một yếu tố quan trọng mặc dù đến nay số lượng các

nghiên cứu về sự tương quan giữa cấu trúc tinh thể và những đặc tính riêng
biệt của cellulose còn hạn chế.
1.1.1.2. Một vài đặc điểm của vật liệu cellulose
Vật liệu cellulose là sản phẩm được tạo ra từ một loài vi khuẩn, trong
đó có chủng Gluconacetobacter xylius. Màng VLC là một chuỗi polymer
không phân nhánh gồm các gốc glucopyranose nối với nhau bởi liên kết β - 1,
4 - glucan. Những chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp nối lại với nhau
thành thớ sợi thứ cấp, có bề rộng 1,5 nm [2, 20]. Theo kết quả nghiên cứu cho
thấy, so với các thớ sợi cellulose sơ cấp ở một vài loài thực vật thì thớ sợi thứ
cấp này là những thớ sợi tự nhiên và rất mảnh. Các sợi thứ cấp tập trung và
kết lại với nhau tạo thành những vi sợi, nhiều vi sợi kết hợp hình thành bó sợi,
tập trung các bó sợi lại tạo thành dải. Mỗi dải có độ dày 3 – 4 nm và chiều dài
130 - 177 nm (Yamanaka et al., 2000). Các dải của cellulose vi khuẩn siêu
mịn có chiều dài từ 1 - 9 µm tạo thành cấu trúc mắt lưới dày đặc, được ổn
định nhờ các liên kết hydro, đó là lớp màng film (Bielecki et al., 2001) [6,
13].
1.1.1.3. Đặc tính của vật liệu cellulose
Khi nuôi cấy tĩnh, trong bình môi trường nuôi cấy lỏng VLC tích lũy
lại thành một lớp màng mỏng như da trên bề mặt, sau khi tinh chế và làm khô


tạo thành sản phẩm tương tự giấy da với độ dày khoảng 0,01 nm đến 0,5 nm.
Màng VLC là sản phẩm đặc biệt với những tính chất vượt trội như: độ tinh
sạch cao, độ bền cơ học và kết tinh cao, có khả năng đàn hồi tốt, chúng có thể
xảy ra hiện tượng phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ thường,
không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt là khả
năng cản khuẩn. Nhờ có các tính chất vượt trội này VLC được ứng dụng rất
nhiều trong các ngành công nghiệp khác nhau đặc biệt là y học [5, 6].
Độ tinh sạch cao: Màng VLC là màng cellulose sinh học đầu tiên được
tổng hợp không chứa lignin và hemiecellulose. Do đó màng VLC có thể bị vi

khuẩn phân hủy hoàn toàn và được coi là nguồn nguyên liệu tái sinh.
Độ bền cơ học cao: độ bền dai của VLC rất tốt và VLC chịu được lực
kéo cao, trọng lượng thấp.
Ở trạng thái ẩm màng VLC có khả năng hút nước cực cao: độ giữ nước
khá tốt, lực ẩm cao. Màng VLC có khả năng giữ nước rất lớn. Chúng có thể
hút đến 60 - 700 lần trọng lượng nước của chúng.
Màng VLC có thể bị phân hủy sinh học, không gây độc và không gây
dị ứng, chúng có khả năng chịu được nhiệt tốt và đặc biệt có khả năng ngăn
cản khuẩn. Với những đặc tính này màng VLC được sử dụng làm màng lọc
vô khuẩn.
Vì vậy, màng VLC được xem là một nguồn nguyên liệu mới, VLC có
tiềm năng ứng dụng trong rất nhiều các lĩnh vực khác nhau như công nghệ
giấy, công nghiệp thực phẩm, sản xuất pin,… Đặc biệt trong lĩnh vực y học,
màng VLC đã được rất nhiều nước trên thế giới nghiên cứu và ứng dụng làm
màng trị bỏng, mạch máu nhân tạo, mặt nạ dưỡng da,... điểm đáng chú ý nhất
là sự kiểm soát các hệ thống vận chuyển thuốc.
1.1.1.4. Vi sinh vật tổng hợp cellulose
* Đặc điểm hình thái của G. xylinus
G. xylinus là trực khuẩn dạng hình que, dạng thẳng, kích thước ngang
khoảng 0,6 - 0,8 µm, chiều dài khoảng 2 – 3 µm. G. xylinus chính là những vi


khuẩn gram âm có kiểu sống hiếu khí bắt buộc, không sinh bào tử, có hoặc
không di động, có thể xếp riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi.
Hình thái G. xylinus sẽ bị biến đổi nếu trong môi trường nuôi cấy thiếu
chất dinh dưỡng: dạng tế bào phình to, dài, phân nhánh hoặc không phân
nhánh và gây thoái hóa giống.
Khuẩn lạc của G. xylinus có kích thước nhỏ, bề mặt nhầy và trơn, phần
giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa
mép khuẩn lạc nhẵn [5, 6].

* Đặc điểm sinh lý và sinh hóa
G. xylinus thường sống chung với nấm chè trong loại nước giải khát
dân gian làm từ nguyên liệu là chè loãng.
G. xylinus là vi khuẩn hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát
triển là từ 25 - 30ºC. Nếu nhiệt độ thấp, sẽ làm chậm quá trình lên men, nếu ở
nhiệt độ cao sẽ gây ức chế hoạt động thậm chí đình chỉ sự sản sinh của tế bào.
Để đảm bảo vi khuẩn G. xylinus phát triển thuận lợi thì pH phải trong khoảng
từ 3 - 8, pH tối ưu trong sản xuất cellulose là 5,5 [5].
Có rất nguồn cacbon khác nhau, G. xylinus có thể sử dụng nhiều nguồn
cacbon và mỗi chủng vi khuẩn khác nhau lại sử dụng mỗi nguồn đường khác
nhau.
G. xylinus có thể chuyển hóa glucose thành acid gluconic, đây chính là
nguyên nhân làm pH của môi trường nuôi cấy giảm từ 1 - 2 đơn vị trong quá
trình nuôi cấy.
G. xylinus có khả năng chịu được pH thấp, vì vậy người ta có thể bổ
sung thêm acid acetic hoặc acid citric vào môi trường nuôi cấy nhằm hạn chế
thấp nhất sự nhiễm khuẩn lạ và giúp tăng hiệu suất tổng hợp cellulose [7].
1.1.1.5. Môi trường nuôi cấy G. xylinus nhằm thu màng VLC
Môi trường nuôi cấy G. xylinus là môi trường được tổng hợp từ nhiều
nguồn dinh dưỡng cần thiết khác nhau như: nguồn cacbon, nguồn sulfur và
phospho, các yếu tố vi lượng và tăng trưởng.


Dù nuôi cấy tĩnh hay nuôi cấy động thì môi trường nuôi cấy thường
được sử dụng nhiều nhất để sản xuất VLC vẫn là môi trường chuẩn (HS). Môi
trường chuẩn lần đầu tiên được tìm ra vào năm 1954 do hai nhà khoa học
Hestrin và Schramm tìm ra với công thức: 2 wt% glucose; 0,5 wt% nấm men
chiết xuất; 0,5 wt% peptone; 0,27 wt% disodium phosphate và 0,15 wt% acid
citric [21]. Với thời gian nuôi cấy tạo màng VLC ngắn nhất, tạo ra màng dẻo
dai, nhẵn mịn,... hơn các loại môi trường nuôi cấy khác nên môi trường chuẩn

được coi là môi trường nuôi cấy G. xylinus tốt nhất hiện nay.
Các thí nghiệm trong nghiên cứu đều sử dụng môi trường chuẩn bao
gồm thành phần được thể hiện như trong bảng 1.1 (Schramm et al, 1954) [15]:
Bảng 1.1. Thành phần của môi trường chuẩn lên men thu màng VLC

Môi trường
Thành phần

Môi trường
chuẩn

Glucose

20g

Pepton

5g

Dinatri photphat(khan)

2.7g

Cao nấm men

5g

Acid acitric

1,15%

Nước cất 2 lần

1000ml

1.1.2. Tổng quan về neomycin sulfate
1.1.2.1. Công thức
Công thức phân tử: C23H46N6O13xH2SO4


Công thức cấu tạo:

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của neomycin sulfate
1.1.2.2. Tính chất lí hóa
Ở dạng tinh khiết, neomycin sulfate có màu trắng hoặc trắng hơi ngả
ngà, tương đối dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol 96%, đặc biệt không
tan trong aceton [10, 13]. Neomycin sulfate có quang phổ hấp thụ tốt ở bước
sóng 277 nm. Định tính neomycin sulfate trong các chế phẩm (thuốc tiêm,
thuốc mỡ, viên nén, dung dịch nhỏ mắt,...) sử dụng phương pháp quang phổ
hấp thu hồng ngoại, sắc kí mỏng [16].
1.1.2.3. Dược lí và dược động học
Neomycin sulfate là thuốc kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid, nó
có thể tác dụng với các loại vi khuẩn Gram âm và Gram dương hiếu khí gây
nên các bệnh nhiễm khuẩn ngoài da. Một số vi khuẩn nhạy cảm với thuốc
neomycin sulfate như: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella,
Enterobacter,…
Neomycin sulfate là một chất ưa nước, tan trong nước. Cơ chế tác dụng
của nó là ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn, bằng việc liên kết với tiểu
đơn vị 30S của Ribosome của vi khuẩn, làm xảy ra hiện tượng đọc sai thông
tin của t-ARN, làm cho vi khuẩn không thể tổng hợp được các protein quan

trọng đối với sự phát triển của nó. Ngoài ra, nó còn làm tách các polyme
thành các monome phi chức năng.


1.1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định
Neomycin sulfate được dùng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn về da,
tai và mắt do nhạy cảm, tụ cầu và các khuẩn khác [1]. Ngoài ra, trước khi
phẫu thuật neomycin sulfate còn được chỉ định dùng để sát khuẩn đường ruột
và làm giảm vi khuẩn tạo NH3 trong ruột khi bị hôn mê gan.
Neomycin sulfate không hấp thụ qua đường tiêu hóa (sinh khả dụng
thấp đạt 3 – 10% do bị gan phá hủy). Do thuốc có độc tính cao nên không
được dùng thuốc bằng đường tiêm hoặc dùng toàn thân. Không nên sử dụng
neomycin sulfate để tưới các vết thương hoặc các thanh mạc như màng bụng.
Đồng thời, do độc tính cao neomycin sulfate cũng được khuyến cáo không
được dùng tại chỗ lâu với liều lượng cao vì có thể gây mẫn cảm trên da và dễ
mẫn cảm chéo với các kháng sinh aminoglycosid khác [19].
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.2.1. Tình hình nghiên cứu vật liệu cellulose
Trên thế giới: Hiện nay, VLC được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực
khác nhau và có tiềm năng rất lớn trong tương lai. Một số lĩnh vực đã ứng
dụng màng VLC như: công nghiệp thực phẩm, sử dụng để phân tách cho quá
trình xử lí nước, được dùng làm chất màng đặc biệt cho các pin và năng lượng
cho tế bào [5, 13].
Đặc biệt trong lĩnh vực y học, vật liệu cellulose đã ứng dụng vào tạo
ruột giả, làm màng trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo trong điều trị các
bệnh tim mạch, mặt nạ dưỡng da.
Ngoài ra, vật liệu vận tải và chất bọc ngoài thuốc cũng là ứng dụng của
màng vật liệu cellulose.
Tại Việt Nam: Hiện nay, ở Việt Nam việc nghiên cứu màng VLC từ
G. xylinus đã và đang nhận được sự quan tâm của các nhà khoa học. Màng

VLC được ứng dụng tạo màng trị bỏng [2, 17], cố định bạc nano làm màng
lọc nước uống nhiễm khuẩn từ màng VLC.
Trong y học, vật liệu cellulose đã được các nhà khoa học nghiên cứu
ứng dụng trong việc điều trị bỏng ở người như đề tài của Nguyễn Văn Thanh


[8] và cộng sự (2006) đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế và thu màng VLC từ G.
xylinus đạt hiệu cao
Việc nghiên cứu, tìm hiểu về hệ thống vận tải thuốc từ VLC ở nước ta
hiện nay vẫn đang là một hướng đi mới và chúng cần được tiếp tục tiến hành
nghiên cứu để ngày càng phát triển.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu neomycin sulfate
Trên thế giới: Vào năm 1949 neomycin sulfate được Selman A.
Waksman phát hiện ra và sản xuất từ môi trường nuôi cấy nấm Streptomyces
fradiae [12]. Từ đó các nhà khoa học này đã tìm ra quá trình sinh tổng hợp và
đánh giá khả năng kháng khuẩn của neomycin sulfate. Pedersoli W. M. và
cộng sự (1994) [12] đã nghiên cứu về khả năng hấp thụ của neomycin sulfate
trên bê con Hà Lan qua đường tiêm. Kết quả của công trình nghiên cứu cho
thấy tỷ lệ neomycin sulfate hấp thụ thấp và trong gan thuốc bị đào thải lớn,
việc này gây đầu độc cho thận.
Ngoài ra, nhóm nghiên cứu của Blanchard C. (2015) [18] cũng cho thấy
rằng hoạt động kháng khuẩn của neomycin sulfate đơn thuần cải thiện được
nhờ neomycin sulfate ở dạng muối ít gây dị ứng với cơ thể hơn.
Tại Việt Nam: Neomycin sulfate nằm trong danh mục thuốc thiết yếu
Việt Nam ban hành lần thứ 4 năm 1999 [1]. Tuy nhiên hướng nghiên cứu sử
dụng VLC để hấp thụ thuốc neomycin sulfate thì chưa có công trình nào
nghiên cứu.


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus mua từ Nhật Bản.
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất
- Thuốc neomycin sulfate được mua từ Trung Quốc.
- Dung môi và các chất phản ứng khác mua từ Đức.
- VLC được tạo ra từ vi khuẩn G. xylinus nuôi cấy trong môi trường
chuẩn tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng – Trường Đại học Sư
phạm Hà Nội 2
- Vật liệu làm môi trường nuôi cấy G. xylinus tạo màng VLC: glucose,
peptone, Dinatri phosphat (khan) (Na2HPO4), acid citric, cao nấm men, acid
acetic, NaOH, HCl,… đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.1.3 Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
-

Cân phân tích (Sartorius - Thụy Sĩ)

-

Cân kỹ thuật - Sartorius TE 3102 S

-

Máy nước cất 2 lần (Hamilton - Anh)

-

Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức)

-

Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu

-

Buồng cấy vô trùng (Haraeus)

-

Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA

-

Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản)

-

Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức)

-

Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh)

-

Bể rửa siêu âm TCP 280


2.1.4. Dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu
- Bình thủy tinh, khay nhựa để nuôi cấy màng VLC.

- Ống nghiệm, bình tam giác có nút xoáy, đũa thủy tinh, cốc đong
thủy tinh.
- Bình thủy tinh định mức 10 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000
ml.
- Micropipet 20 – 200 µl.
- Pipet 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml.
- Penicilin, kẹp gỗ, đèn cồn, bình hút ẩm, giấy bạc, giấy thấm, giấy lọc,
giấy quỳ tím,... và nhiều dụng cụ cần thiết khác trong phòng thí nghiệm.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuẩn bị màng vật liệu celulose
2.2.1.1. Tạo màng VLC thô từ môi trường chuẩn
Quá trình lên men tạo màng VLC thô được thực hiện theo các bước
sau:
- Bước 1: Chuẩn bị môi trường như bảng 2.1
Bảng 2.1. Thành phần của HS lên men thu màng VLC

Thành phần

Khối lượng

Glucose

20 g

Pepton

5g

Dinatri phosphate (khan) (Na2HPO4)
Cao nấm men

Acid citric
Nước cất 2 lần

2,7 g
5g
1,15 g
1000 ml


o

- Bước 2: Đem môi trường đã pha trên hấp khử trùng ở 113 C trong
thời gian 15 phút.
- Bước 3: Lấy môi trường trên ra rồi khử trùng bằng tia cực tím trong
buồng UV trong thời gian 15 phút rồi để nguội.
- Bước 4: Bổ sung thêm 10% dịch giống G. xylinus và 2% acid acetic
rồi lắc đều tay nhằm cho dịch giống phân bố đều trong dung dịch.
- Bước 5: Sử dụng gạc vô trùng để bịt miệng bình, đặt tĩnh trong
o

khoảng 4 – 8 ngày ở 26 C
- Bước 6: Thu màng VLC thô, rửa chúng dưới vòi nước.
Dựa trên kết quả nghiên cứu của một số tác giả chúng tôi chọn VLC có
độ dày từ 0,3 - 0,5 cm phù hợp để làm hệ thống hấp thu thuốc neomycin
sulfate. Do đó, chúng tôi tiến hành thu màng từ dịch nuôi cấy tĩnh G. xylinus
sau 5 - 8 ngày để VLC có độ dày từ 0,3 - 0,5 cm.
2.2.1.2. Tạo màng VLC tinh khiết
VLC thô thu được chứa một lượng lớn các tạp chất trong môi trường
nuôi cấy. Do đó, VLC cần được xử lý nhằm loại bỏ các tạp chất, đồng thời
giúp phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn.

Quy trình:
Khi nuôi cấy tĩnh, VLC tạo thành lớp màng dày trên mặt môi trường
nuôi cấy, tiến hành tách màng VLC thô và ép màng để loại bỏ môi trường.
- Lúc này, trong màng VLC chứa một số lượng lớn vi khuẩn. Để phá vỡ
thành tế bào và giải phóng nội độc tố vi khuẩn cần hấp màng VLC trong
o

NaOH nóng 3%, nhiệt độ 113 C bằng nồi hấp khử trùng HV110/HIRAIAMA trong thời gian 1 h.
- Ngâm trong NaOH xong, vớt màng vào khay đựng rồi đặt chúng dưới
vòi nước chảy cho đến khi màng VLC có màu trắng trong. Màng VLC được
rửa sạch và ép loại nước sẽ thu được màng VLC tinh khiết.
Quy trình xử lí màng VLC thô để thu màng VLC tinh khiết được tóm
tắt theo hình 2.1 như sau: