Nghiên cứu thành phần hóa học của cây sân vũ diệp (panax bipinnatifidius seem) thu hái ở sa pa, lào cai

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
ĐỖ VĂN HÀO

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA
HỌC CỦA CÂY SÂM VŨ DIỆP
(PANAX BIPINNATIFIDIUS SEEM)
THU HÁI Ở SA PA, LÀO CAI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

ĐỖ VĂN HÀO

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA
HỌC CỦA CÂY SÂM VŨ DIỆP
(PANAX BIPINNATIFIDIUS SEEM)
THU HÁI Ở SA PA, LÀO CAI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

KHÓA: QH.2012
NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN HỮU TÙNG

Hà Nội – 2017


LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp, em đã nhận được nhiều sự giúp
đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo tâm huyết, nhiệt tình của thầy cô, gia đình và bạn bè.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến TS. Nguyễn Hữu Tùng, giảng
viên Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, người đã luôn tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Y Dược nói chung và Bộ
môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc nói riêng đã truyền đạt cho em nền tảng kiến
thức chuyên môn và tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân đã
luôn quan tâm, động viên giúp em hoàn thành khóa luận này.Dù đã rất cố gắng, nhưng
lần đầu làm nghiên cứu em khó tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được ý
kiến đóng góp của các thầy cô để khoá luận thêm hoàn thiện.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 8 tháng 6 năm 2017
Sinh viên
Đỗ Văn Hào

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ
NMR
13C-NMR

PĐ

1H-NMR

SKLM

C

SVD

DĐVN IV

T

ĐT

TT

HPLC

UV

IR

VIS

MS

VIẾT TẮT


: High Performance Liquid Chromatography
: Carbon (13)
Nuclear magnetic
resonance
: Proton nuclear
magnetic
resonance

: Infrared
: Mass spectrum
: Nuclear magetic resonance
: phân đoạn
: sắc ký lớp mỏng

: Chuẩn

: Sâm vũ diệp

: Dược điển Việt
Nam IV

: Thử

: Định tính

: thứ tự
: Ultra violete
: visible


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình vẽ, đồ thị
Hình 1.

Hợp chất saponin khung oleanane từ rễ của

Hình 2.

Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc tr

Hình 3. Mẫu sâm vũ diệp (Panaxbipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sapa, Lào
dvv

Cai

Hình 4.

Sắc ký đồ pha đảo của cao tổng (T), phân đ
D

MeOH-H2O (1:1) và MeOH-H2O (2:1)

Hình 5. Sắc ký đồ pha thường của cao tổng (T), phân đoạn butanol (Bu) với
f

hệ CHCl3-MeOH-H2O (70:30:0,4) và CHCl3-MeOH-H2O (60:30:0,5)

Hình 6.

Sơ đồ chiết xuất Sâm vũ diệp

Hình 7.

Sơ đồ phân lập sắc ký 3 hợp chất từ

Hình 8.

Cấu trúc hóa học của 3 hợp chất ph

Hình 9.

Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Oleano

Hình 10.

Sắc ký đồ dung dịch mẫu cao tổng


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng
Bảng 1.

Phân bố của các loài thuộc chi Panax L

Bảng 2.

Một số Saponin dẫn chất acid oleanolic

Bảng 3.

Saponin khung dammaran

Bảng 4. kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong rễ ffff
H

thân Sâm vũ diệp bằng phản ứng hóa học

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................................................................1
CHƯƠNG I - TỔNG QUAN................................................................................................................3

1.1. Tổng quan về chi Panax L.................................................................................3
1.1.1.

Vị trí phân loại và phân bố của chi Panax L......................................................................3

1.1.2.

Đặc điểm họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) (Araliaceae).............................................................4

1.1.3.

Đặc điểm thực vật của chi Panax L....................................................................................4

1.1.4.

Đối tượng nghiên cứu-Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem)....................................5

1.2. Tổng quan các phương pháp nghiên cứu.........................................................9
1.2.1.

Phương pháp định tính thành phần hóa học........................................................................9

1.2.2.

Các phương pháp sắc kí..................................................................................................... 12

1.2.3.

Các phương pháp xác định cấu trúc.................................................................................. 18

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................ 21

2.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................... 21
2.2. Phương tiện nghiên cứu................................................................................... 21
2.2.1.

Thiết bị dụng cụ................................................................................................................. 21

2.2.2.

Dung môi, hóa chất............................................................................................................ 22

2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 22
2.3.1.

Phương pháp phân tích định tính....................................................................................... 22

2.3.2.

Phương pháp xử lý và chiết mẫu....................................................................................... 23

2.3.3.

Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất hóa học.................................................23

2.3.4.

Phương pháp định cấu trúc hóa học các hợp chất.............................................................23

2.3.5.
Phương pháp phân tích định tính và dấu vân tay sắc ký các hợp chất bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao HPLC.......................................................................................................................... 23
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN.......................................................... 24

3.1. Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong Sâm vũ diệp...................24
3.1.1.

Kết quả phân tích định tính các nhóm chất........................................................................24


3.1.2.

Phân tích định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng.................................................. 25

3.2. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn etyl acetat............26
3.2.1.

Chiết xuất và tinh chế các hợp chất.................................................................................. 26

3.2.2.

Tính chất vật lý và số liệu phổ của các hợp chất phân lập..............................................28

3.2.3.

Biện giải cấu trúc 3 chất phân lập.................................................................................... 29

3.3. Phương pháp phân tích định tính và dấu vân tay sắc ký các hợp chất bằng
sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC........................................................................... 30
3.4. Bàn luận............................................................................................................ 33
3.4.1.

Về phân tích định tính....................................................................................................... 33

3.4.2.

Về xử lý và chiết mẫu và phân lập chất tinh khiết............................................................33

3.4.3.

Về xác định hợp chất phân lập.......................................................................................... 33

3.4.4.
Về định tính và dấu vân tay sắc ký Oleanolic acid bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
HPLC................................................................................................................................................. 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................................................. 35

KẾT LUẬN............................................................................................................... 35
KIẾN NGHỊ.............................................................................................................. 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................................. 37
PHỤ LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay xu hướng điều trị bằng thuốc có nguồn gốc thiên nhiên đặc biết là từ
cây cỏ đang ngày càng tăng. Trước xu hướng đó, con người ngày càng chú trọng vào
việc nghiên cứu, tìm kiếm, khai thác nguồn tài nguyên này.
Việt Nam là vùng đất của nhiều loài thảo dược quý, trong đó có những cây
thuốc được dân gian sử dụng từ hàng ngàn năm nay như các loại nhân sâm, tam thất...
Tuy nhiên, các thảo dược này từ bao đời nay vẫn chỉ được sử dụng trực tiếp hoặc chế
biến thành nguyên liệu thô, do vậy chưa phát huy được hết công dụng. Một trong số đó
phải kể đến cây sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem, họ Nhân sâm-Araliaceae),
thuộc chi Panax L.
Trong tự nhiên, sâm vũ diệp phân bố ở Trung Quốc và dãy núi Hoàng Liên Sơn
Tây Bắc nước ta. Gần đây sâm vũ diệp đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử
nghiệm ở một số địa phương ở Hà Giang và Lào Cai. Theo kinh nghiệm dân gian, sâm
vũ diệp là loài sâm quý có nhiều tác dụng sinh học, tuy nhiên đến nay vẫn chưa có
nhiều tài liệu cụ thể nghiên cứu thành phần hóa học cũng như cơ chế tác dụng sinh học
của sâm vũ diệp. Việc xây dựng bộ dữ liệu thành phần hóa học có vai trò quan trọng
làm cơ sở cho các nghiên cứu liên quan như phân loại thực vật học, tiêu chuẩn hóa
dược liệu, tác dụng sinh học....Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên
cứu thành phần hóa học của cây sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem) thu hái
ở Tây Bắc”. Đề tài này là một phần trong đề tài cấp bộ “Ứng dụng các giải pháp
khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài
cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax
stipuleanatus H.Tsai et K.M.)” của Khoa Y Dược Đại Học Quốc Gia Hà Nội [6,14].
Mục tiêu của đề tài: Chiết tách và xác định một số thành phần hóa học thân rễ
sâm vũ diệp. Để đạt được mục tiêu trên, đề tài được thực hiện với các nội dung sau:
1.
Định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong mẫu nghiên cứu
bằng phản ứng hóa học, và sắc ký lớp mỏng.

2.
Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập
được.
1


3. Xây dựng dấu vân tay sắc ký Sâm vũ diệp bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
HPLC

2


CHƯƠNG I - TỔNG QUAN
1.1 . Tổng quan về chi Panax L
1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố của chi Panax L
Vị trí của chi Panax L. Trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987) [7]:
Giới Thực vật (Planta)
Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
Bộ Hoa tán (Apiales)
Họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) (Araliaceae)
Chi Panax L.
Chi Panax L có khoảng 12 loài cây lâu năm và phát triển rất chậm, như sâm
Triều Tiên (Panax ginseng), sâm Mỹ (Panax quinquefolius), sâm Nhật Bản (Panax
japonicus),…[33]. Phân bố một số loài được tổng kết trong bảng sau:
Bảng 1. Phân bố của các loài thuộc chi Panax L
STT
1

2

3

4

Loài

Panax bipinnatifidus Seem
Panax ginseng C.A.Mey
Panax japonicus (T.Nees)
C.A.Mey
Panax notoginseng (Burkill)
F.H.Chen

5

Panax pseudoginseng Wall.

6

Panax quinquefolius L

7

Panax sokpayensis Shiva
K.Sharma & Pandit


8

9

Panax stipuleanatus Tsai &
Feng
Panax trifolius L


10

Panax vietnamensis Ha
Grushv

11 Panax wangianus S.C.Sun
12

Panax zingiberensis C.Y.Wu &
Feng

Ở
Việt Nam, thuộc chi Panax L có các loài như Sâm vũ diệp (Panax
bipinnatifidus Seem.); Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.); Tam thất
hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng); Tam thất (Panax noto-ginseng
Burk.)...[10].
1.1.2. Đặc điểm họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) (Araliaceae)
Nhận biết tại thực địa: Lá thường kép, lớn, mọc so le, có bẹ; cụm hoa chùm–tán;
bầu dưới; quả mọng [6,10].
Cây gỗ, bụi hay cây cỏ nhiều năm. Lá đơn hay kép, mọc so le, ít khi mọc đối
hay mọc vòng. Lá kèm nhỏ. Hoa thường nhỏ, mọc thành cụm hoa tán đơn. Các tán đơn
này lại tập hợp trong một cụm hoa kép kiểu chùm tán. Hoa đều, lưỡng tính, đôi khi đơn
tính, mẫu 5. Đài 5, phần dưới dính lại, phần trên có 4-5 răng nhỏ. Tràng 5, rời tiền khai

hoa vặn hay lợp. Nhị 5, dính với đĩa của bầu. Bộ nhụy có 5 noãn dính liền thành bầu
dưới, ít khi là nửa dưới, vòi nhụy rời, số ô bằng số lá noãn, mỗi ô chứa một noãn. Quả
mọng. Hạt có phôi nhỏ, nội nhũ nhiều .
Đa dạng và sử dụng: Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, có cả ở vùng ôn đớn.
Việt Nam có 22 chi, khoảng 120 loài, mọc hoang và được trồng làm cảnh, làm thuốc
(Đinh lăng, Chân chim).
Là họ có tầm quang trọng trong nền Y học cổ truyền cũng như trong nghành
Dược hiện đại. Có 12 loài thường được dùng làm thuốc với các tên là Cuồng, Đinh
lăng, Ngũ gia, Sâm, Tam thất, Thông thảo.
1.1.3. Đặc điểm thực vật của chi Panax L
Cây thân thảo, sống nhiều năm nhờ thân rễ. Lá kép chân vịt, mọc vòng 3-5 lá,
mép lá chét có răng cưa hoặc xẻ thùy lông chim. Cụm hoa tán đơn, hoa lưỡng tính có
bầu dưới. Hoa có 5 lá đài hàn liền ở dưới, tràng 5, nhị 5. Bầu 2-3 có khi đến 5 ô. Quả
mọng, hình cầu có khi hơi dẹt, hạt dẹt, có nội nhũ mịn [6].


4


1.1.4. Đối tượng nghiên cứu-Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem)
Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) vốn là một trong những dược liệu
quý được sử dụng từ lâu đời. Ở Việt Nam, hiện có năm loài cây thuốc thuộc chi Panax,
ba trong số đó là những loài bản địa mọc tự nhiên, gồm Sâm Việt Nam (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.), Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất
hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng). So với hai đối tượng sâm Việt
Nam (P. vietnamensis) và tam thất hoang (P. stipuleanatus) đã được nghiên cứu nhiều
một cách có hệ thống từ thực vật học, thành phần hóa học, tác dụng sinh học... thì Sâm
vũ diệp chưa có nhiều kết quả nghiên cứu về Sâm vũ diệp.
a. Phân bố
Trên thế giới, Sâm vũ diệp được tìm thấy ở Trung Quốc, bắc Myanma, đông bắc

Ấn Độ và Nepal. Ở nước ta, sâm vũ diệp phân bố hẹp ở vùng núi Hoàng Liên Sơn
(thuộc địa phận Sapa, Bát Xát, Lào Cai) và huyện Than Uyên (Lai Châu). Sapa chính
là điểm cực nam của bản đồ phân bố Sâm vũ diệp trên thế giới ( khoảng 23 độ vĩ Bắc)
[3].
b. Tác dụng dược lý
Khả năng bồi bổ sức khỏe và chữa bệnh độc đáo của loài dược liệu này đã khiến
trong một thời gian dài chúng bị khai thác mạnh mẽ và thiếu quy hoạch. Hiện nay, số
lượng và vùng phần bố loài dược liệu trên ở Việt Nam đã suy giảm nghiêm trọng.
Dược liệu từ sâm vũ diệp là thân rễ. Chưa có các nghiên cứu cụ thể tác dụng của
Sâm vũ diệp, nhưng các nghiên cứu về dược lý học của sâm Việt Nam (P.
vietnamensis) có tác dụng: ngăn chặn ung thư gây bởi các tác nhân hoá học; tác dụng
bảo vệ gan in vitro ở chuột; tác dụng giảm thời gian ngủ do thuốc pentobarbital và
giảm tổn thương dạ dày ở chuột nhắt chịu stress tâm lý, cũng như có khả năng chống
stress [3],…Vì vậy chúng ta có quyền kì vọng sâm vũ diệp sẽ mang lại nhiều tác dụng
tốt cho sức khỏe tương tự.
c. Thành phần hóa học
Theo các tài liệu đã nghiên cứu cho thấy Saponin được xem là thành phần hoạt
chất chính trong các loài thuộc thi Panax L.. Các nhà khoa học đã chiết tách và xác
định gần 300 saponin từ các loài thuộc chi này [31]. Sự phân loại dược trên cấu trúc
5


hóa học và chia làm các nhóm chính bao gồm: các saponin dẫn chất của 20(S)protopanaxadiol và 20(S)-protopanaxatriol, saponin khung dammaran khác, saponin
dẫn chất ocotillol, saponin dẫn chất của acid oleanolic.
Bảng 2. Một số Saponin dẫn chất acid oleanolic thuộc chi Panax L

R1= R2=H=oleanolic acid

STT
1

Tên
Zingibrosid R1

2

Stipuleanosid R1

3

Stipuleanosid R2

6


Bảng 3. Saponin khung dammaran
STT
1

Tên
Majonosid F4
Chikusetsusaponin

2

L9a
Chikusetsusaponin

3

L9bc

4

Ginsenosid M7cd
Chikusetsusaponin

5

LT8

Ghi chú:

Các loài sâm khác nhau có thành phần saponin khác nhau, ví dụ như Sâm Mỹ
(Panax quinquefolium L.) hay sâm Triều Tiên (Panax ginseng C.A. Meyer) có nhiều
thành phần khung dammaran.
7


Thành phần hóa học của lá và rễ cây sâm vũ diệp được phát hiện có nhiều
saponin khung dammaran và oleanan. Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc công
bố phân lập 13 saponins khung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao
gồm một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenoside F1, F2, F3, Rg 2, Rb, Rd, Re và
Rb3 [28]. Gần đây, năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc phân lập một
nhóm 10 saponin khung oleanan (1-10, hình 1.), trong đó có 3 chất mới bifinoside A-C
(1-3), là thành phần chính của rễ cây sâm vũ diệp được thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn,
Việt Nam [27].

Hình 1. Hợp chất saponin khung oleanane từ rễ của cây sâm vũ diệp [27]
Như vậy, tổng cộng có 23 hợp chất saponin đã được xác định từ các phần của

cây sâm vũ diệp. Liên quan đến tác dụng sinh học, một số hợp chất được xác định là
thành phần của sâm vũ diệp có tác dụng sinh học bao gồm kháng viêm, chống oxi hóa,
chống ung thư, bảo vệ tim mạch, chống tiểu đường, bảo vệ tế bào thần kinh,…có thể

8


phần nào giải thích cho lợi ích về mặt dược học trong việc sử dụng sâm vũ diệp trong y
học truyền thống [19].
Nhận xét chung: Một số nghiên cứu bước đầu chỉ ra rằng cây sâm vũ diệp chứa
nhiều saponin khung olean với hàm lượng tương đối cao. Cho tới nay chưa có kết quả
công bố một cách hệ thống thành phần các phân đoạn khác như phần dịch chiết hữu cơ
ít phân cực hay phân đoạn polysaccharide tan trong nước. Đặc biệt chưa có công bố
nào về hoạt tính sinh học, tác dụng dược lý của đối tượng này. Do đó việc nghiên cứu
một cách có hệ thống hóa thực vật và tác dụng sinh học để thu thập thêm bằng chứng
khoa học và nâng cao hiệu quả sử dung sâm vũ diệp hứa hẹn nhiều kết quả có giá trị
khoa học và thực tiễn.
1.2. Tổng quan các phương pháp nghiên cứu
1.2.1. Phương pháp định tính thành phần hóa học
- Tiến hành: Định tính các nhóm chất thường gặp trong dược liệu theo phương pháp
hóa học ghi trong sách Dược liệu và Thực tập dược liệu, nhà xuất bản y học [1,2] .
a. Phương pháp định tính flavonoid
-

Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda hay Willstater)

Đây là phản ứng khử hay được sử dụng để tìm sự có mặt của các dẫn chất nhóm
flavonoid. Cho vào ống nghiệm 2-3 ml dịch chiết ethanol, thêm một ít bột Magnesi
kim loại, nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-5 giọt). Sau 1 đến 2 phút sẽ có màu đỏ cam, đỏ
thẫm hoặc đỏ tươi với các dẫn chất flavon, flavonol, flavanonol, flavanon [8,9]. Phản

ứng này dựa trên khả năng chống oxi hóa của flavonoid. Màu sắc đôi có thể bị thay đổi
tùy theo loại, vị trí nhóm thế ví dụ các dẫn chất methoxy flavon thì âm tính [2,24].
-

Tác dụng với FeCl3

Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc
sẽ xuất hiện màu [8,9]. Tùy theo nhóm flavonoid và tùy theo số lượng nhóm OH trong
phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu. Đa số các phân tử flavonoid đều có nhóm OH
phenol, do đó nó có khả năng tạo phức màu với Fe

-

Tác dụng của kiềm

9

3+

[2,24].


Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 5%. Sẽ
thấy xuất hiện kết tủa màu vàng. Thêm 1 ml HCl, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch
sẽ tăng lên [24].
b. Phương pháp định tính Saponin
Dựa trên tính chất tạo bọt đây là tính chất đặc trưng nhất của saponin. Do phân
tử saponin có tính chất hoạt động bề mặt, đặc tính này được giải thích bởi tính chất vừa
thân dầu vừa thân nước của phân tử saponin. Phần aglycon có tính thân dầu còn phần
đường có tính thân nước nên saponin có đặc tính làm giảm sức căng bề mặt và tạo bọt.

Khả năng tạo bọt thay đổi theo cấu trúc của saponin: phần genin, số mạch đường, chiều
dài mạch đường... nhờ đặc tính này mà saponin tạo bọt nhiều khi lắc với nước [2].
Dược liệu được chiết bằng cồn 70%, dịch chiết được bốc hơi trong dung môi và
hòa tan lại trong một ít nước. Lấy dung dịch này cho vào ống nghiệm. Thêm nước cất,
dùng ngón tay bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều.
Dọc ống nghiệm trong 1 phút (=30 lần lắc). Quan sát lớp bọt trong 15 phút, nếu
ống nghiệm còn bọt trên bề mặt chứng tỏ có saponin [24].
c. Phương pháp định tính tanin
Phản ứng Braemer’s: đây là phản ứng kết tủa với kim loại, tanin cho tủa với các
muối kim loại nặng như chì, thủy ngân, kẽm, sắt, đồng. Với muối sắt, các tanin khác
nhau cho màu xanh lá hay xanh đen với độ đậm khác nhau. Có thể dựa vào tủa với
muối sắt để xác định tanin trên vi phẫu [2].
Cách tiến hành: Cân 100mg cao chiết sâm vũ diệp, thêm 10 ml ethanol, hòa tan.
Lấy 2ml dịch thử cho vào ống nghiệm, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% .
d. Phương pháp định tính Steroid
Phản ứng Libermann-Burchardt hay dùng để phân biệt 2 loại saponin
triterpenoid và saponin steroid. Lấy vài miligram sapogenin (phần aglycon của
saponin) hòa nóng vào 1ml anhydride acetic, cho thêm 1 giọt H 2SO4 đậm đặc, nếu là
dẫn chất steroid thì có màu lơ – xanh lá, còn dẫn chất triterpenoid thì có màu hồng đến
tía [1,2].
Cách tiến hành: Lấy 1ml dịch thử, thêm 1ml chloroform, thêm 2-3 ml anhydride
acetic và 1-2 giọt acid sunfuric đặc.
10


e. Phương pháp định tính volatile oil
Cách tiến hành: Lấy 2 ml dịch thử, thêm 0,1 ml dung dịch NaOH 5% và một
lượng nhỏ dung dịch HCl 5%. Xuất hiện kết tủa trắng chứng tỏ trong thành phần dược
liệu có chứa tinh dầu [24].
f. Phương pháp định tính Glycosid tim

Phản ứng Keller-Kiliani: Đây là phản ứng dùng để định tính nhóm chất
Glycosid tim, phản ứng dựa trên tính chất của phần đường. Mặt ngăn cách có màu đỏ
hoặc nâu đỏ và dần dần sẽ thấy lớp trên có màu xanh từ dưới khuếch tán lên. Cần chú ý
thuốc thử Keller-Kiliani và xanthydrol cũng dương tính với các digitanol glycosid
(glycosid có trong Digitalis không phải glycosid tim nhưng có phần đường 2,6-desoxy)
[2,24].
Tiến hành: cân 100 mg cao chiết sâm vũ diệp, thêm 10ml etanol, hòa tan. Lấy
2ml dịch thử cho vào ống nghiệm. Sau đó thêm 50 mg methanol trong 2 ml cloroform.
Thêm vài giọt H2SO4 đặc, xuất hiện màu xanh đen [9].
g. Phương pháp định tính đường khử
Phương pháp này dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm (glucose, fructose,
maltose…) có thể dễ dàng khử đồng (II) oxid thành đồng (I) oxid có màu đỏ gạch, qua
đó ta định tính được đường khử.
Định tính đường khử ta sử dụng thuốc thử Fehling 1 (chứa CuSO 4) và 2 ( là hỗn
dịch của NaOH với muối tartrate của Na và K có công thức NaOOC-CHOH-CHOHCOOK (trong đó -OOC-CHOH-CHOH-COO- là gốc tartrate).
h. Phản ứng Terpenoid
-

Phản ứng Liebermann-Burchardt

Cân 100mg cao chiết sâm vũ diệp, thêm 10 ml ethanol, lấy 2 ml dịch thử cho
vào ống nghiệm, hòa tan thêm 1ml chloroform, 2-3 ml của acetic anhydride, 1-2 giọt
axit sulfuric đậm đặc [24].
-

Phản ứng Salkowski

Cân 100 mg cao chiết sâm vũ diệp, thêm 10 ml etanol, hòa tan. Lấy 2 ml dịch
thử cho vào ống nghiệm. Thêm 2 ml cloroform và 3 ml sulfuric axit H2SO4 [9].
11

i. Phương pháp định tính thuốc thử Alkaloid
Định tính alkaloid bằng các phản ứng tủa với một số thuốc thử. Các alkaloid có
khả năng tạo tủa ít tan trong nước với một số thuốc thử chung của alkaloid. Tủa này
sinh ra hầu hết một cation lớn là alkaloid với một anion lớn thường là anion phức hợp
của thuốc thử [2,24].

-

- Thuốc thử Mayer (K2HgI4 - kalitetraodomercurat): cho tủa trắng hay màu vàng
nhạt.
Thuốc thử Bouchardat (Iodo - Iodid): cho tủa nâu.

k. Phương pháp định tính thuốc thử Anthraquinon
Các hợp chất anthraquinone khi tác dụng với kiềm (amoniac, natrihydroxyd
hoặc kaki hydroxyd) sẽ tạo các dẫn chất phenolat có màu đỏ sim tan trong nước. Dựa
vào tính chất này, định tính anthraquinone dựa trên phản ứng Borntrager.
Định tính dạng tự do: lấy 1 mL dịch chiết thêm 1 mL dd amoniac 10% và 2 ml
chloroform, sau đó lắc nhẹ, lớp nước sẽ có màu đỏ sim. Nếu lớp chloroform có màu
vàng chứng tỏ trong dược liệu chứa acid chrysophanic. Thêm tiếp từng giọt dung dịch
NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp dung môi hữu cơ có màu vàng, còn lớp nước đỏ thẫm hơn
lúc ban đầu.
Định tính anthraquinone toàn phần (cả dạng glycoside và dạng tự do): lấy 1 ml
dịch chiết, thêm 1 ml dung dịch amoniac, lắc nhẹ, lớp nước sẽ có màu đỏ sim. Nếu lớp
chloroform có màu vàng thì tiếp tục nhỏ từng giọt dung dịch NH 3 10%, lắc nhẹ, lớp
chloroform sẽ mất màu còn lớp nước thì có màu đỏ đậm hơn.
1.2.2. Các phương pháp sắc kí
Sắc kí là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần một
hỗn hợp. Sự tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau của các nhóm chất khác nhau

vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa tan vào nhau: một pha tĩnh và một pha động.
Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu. Khi các thành phần này
di chuyển qua hệ thống sắc kí với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo
thời gian. Mỗi thành phần sẽ đi qua hệ thống trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi
là thời gian lưu. Trong kỹ thuất sắc ký, hỗn hợp được chuyên chở trong chất lỏng hoặc
khí và các thành phần của nó được tách ra do sự phân bố khác nhau của các chất hòa
tàn khi chúng chảy qua pha tĩnh rắn hoặc lỏng. Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được dùng
12


để phân tích hợp chất phức tạp dựa trên ái tính khác nhau của các chất trong môi
trường động khí hoặc lỏng và đối với môi trường hấp thụ tĩnh mà chúng di chuyển qua
như giấy, gelatin hay gel magnesium silicate…[9,11,16].
Sắc ký là phương pháp để phân tách và tinh sạch các phân tử sinh học. Sắc ký là
phương pháp nhanh, dễ dàng và không ảnh hưởng đến protein, đây là phương pháp
được đề nghị trong nghiên cứu định lượng protein hay các phân tử.
Dựa trên mục tiêu và nội dung bài luận, các kỹ thuật sắc ký cụ thể được trình
bày sau đây:
a)
b)
c)

Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký cột

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC a. Sắc ký lớp mỏng [4,12,17,18]
Sắc ký lớp mỏng là hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa
chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung

môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ như: silicagel hay oxid
alumin). Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng như tấm
kiếng, tấm nhôm hay tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên
phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng.
Bình sắc ký: một chậu, hũ, lọ bằng thủy tinh hình đa dạng, có nắp đậy
Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một hợp chất hấp thu (silicagel,
alumin,…) được tráng thành lớp mỏng, đều phủ lên tấm kiếng, tấm nhôm, hay tấm
plactic. Chất hấp thu trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay một loại polymer
hữu cơ.
Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp hồm nhiều chất với độ phân cực khác
nhau. Nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh.
Pha động: dung môi hay hỗn hợp 2 dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo
tấm lớp mỏng, và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển càng cao nhờ tính
mao quản.

13


Mỗi thành phần chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của
dung môi. Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh
muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy thuộc vào độ hòa tan của mẫu chất
trong dung môi.
Ưu điểm:
- Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích.

- Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện
phân tích.

- Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định trên tấm SKLM.
Các đại lượng đặc trưng

a. Hệ số lưu giữ Rf:
Đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu
giữ Rf. Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân
tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:
Rf
Trong đó: dR là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)
dM là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động
(đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)
Rf có giá trị dao động giữa 0 và 1
b. Hệ số lưu giữ tương đối Rr:

Rr

(1.2)

R, x

R,c

Trong đó:

dR,x : là đường đi của chất phân tích (cm)
DR,c : là đường đi của chất chuẩn (cm)
(Giá trị Rr càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất)

14


b. Sắc ký cột [4,17].
Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh là những hạt

có kích thước tương đối lớn (50-150 µm), được nạp trong cột thủy tinh. Mẫu chất cần
phân tích được đặt lên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh che chở để lớp
mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt trên cao. Dung môi giải ly
ra khỏi cột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn ra của
cột. Phương pháp này làm cho quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng
cao áp (HPLC). Tuy nhiên, sắc ký cột có những ưu điểm là pha tĩnh và các dụng cụ rẻ,
dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng mẫu tương đối lớn.
Thường thì pha tĩnh là silicagel, hợp chất không phân cực được giải ly khỏi cột,
hợp chất phân cực được giải ly sau. Với hai phân tử phân cực, phân tử nào có trọng
lượng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân tử kia, nó sẽ bị giữ lại trong cột
nên chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với các phân tử nhỏ.
c. Sắc ký lỏng cao áp HPLC
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [4,5, 12,13,17,18]
Nguyên tắc
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp sắc ký tách các chất ra khỏi hỗn
hợp phân tích trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn
dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay một chất
mang đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ
chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ.

15