Lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen dây thường xuân (hedera nepalensis k koch) ở việt nam dựa trên chỉ thị GBSSI

VN
U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

an

dP
ha
rm

NGUYỄN THỊ THU THẢO

ac
y,

--------

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

LỰA CHỌN QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA
TỔNG SỐ VÀ BƯỚC ĐẦU PHÂN TÍCH ĐA DẠNG
DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN
(HEDERA NEPALENSIS K.KOCH) Ở VIỆT NAM
DỰA TRÊN CHỈ THỊ GBSSI

Co

py

rig

ht

@

Sc

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

VN
U

KHOA Y DƯỢC

dP
ha
rm

NGUYỄN THỊ THU THẢO

ac
y,

--------

an

LỰA CHỌN QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA

of

M

ed
ic

ine

TỔNG SỐ VÀ BƯỚC ĐẦU PHÂN TÍCH ĐA DẠNG
DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN
(HEDERA NEPALENSIS K.KOCH) Ở VIỆT NAM
DỰA TRÊN CHỈ THỊ GBSSI

ho

ol

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

@

Sc

NGÀNH DƯỢC HỌC

: QH2014.Y

Người hướng dẫn

: PGS.TS. Đinh Đoàn Long

rig

ht

Khóa

Lời cảm ơn

ThS. Phạm Thị Hồng Nhung

Co

py

Để hoàn thành khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu cả
về vật chất lẫn tinh thần, về những kinh nghiệm và kiến thức chuyên môn của các
thầy cô, bạn

Hà Nội - 2019


VN
U

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu cả
về vật chất lẫn tinh thần, về những kinh nghiệm và kiến thức chuyên môn của các
thầy cô, bạn bè và gia đình. Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn

ac
y,

sâu sắc tới PGS.TS. Đinh Đoàn Long và ThS. Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên
khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, những người tận tình chỉ bảo giúp tôi

dP
ha
rm

thực hiện đề tài khóa luận, tôi xin cảm ơn ThS. Đỗ Thị Lệ Hằng đã hướng dẫn và
giúp đỡ tôi về kỹ năng thực hành thí nghiệm. Các thầy, cô không chỉ trang bị cho tôi
kiến thức, mà còn truyền cho tôi niềm đam mê, lòng nhiệt huyết với nghề và luôn
sẵn sàng giúp đỡ mỗi khi tôi gặp khó khăn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Y dược học cơ sở đã hết

ine

an

lòng quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu và
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin cảm ơn những cán bộ tại Viện dược liệu (Bộ Y Tế) đã không

ed
ic

quản ngại khó khăn thu thập và cung cấp mẫu vật giúp đỡ tôi thực hiện đề tài một
cách thuận lợi nhất.

of

M

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, cùng toàn thể các thầy cô
giáo Khoa Y dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu
trong quá trình học tập tại nhà trường.

ho
ol

Chúng tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ kinh phí của Bộ Khoa học và Công
nghệ Việt Nam cho đề tài mã số NVQG-2018/02 do PGS.TS Đinh Đoàn Long chủ
trì để thực hiện nghiên cứu này.

Sc

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và sự yêu thương đến gia đình,
người thân và bạn bè, những người đã luôn ở bên cổ vũ, động viên và tạo mọi điều

Co

py

rig

ht

@

kiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài khóa luận này.
Hà Nội, ngày 06 tháng 05 năm 2019
Tác giả

Nguyễn Thị Thu Thảo


GBSSI

VN
U

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt (Granule-Bound Starch
Synthase)

Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch)

H.helix

Hedera helix L.

CTAB

Cetyl trimethyl ammonium bromide

Mini CTAB

Sanghai-Maroof và cộng sự, 1984

CTAB cải tiến

Elias và cộng sự, 2004

Kit Qiagen

DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức)

Kit Thermo

GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo
Scientific, Mỹ)

PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction)

DNA

Axit deoxyribo Nucleic (Deoxyribonucleic acid)

dNTP

Deoxyribonucleotit 5’ triphosphate

ITS

Vùng sao chép nội bộ (Internal transcribed spacer)

Genbank

Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế

bp

Cặp bazơ (base pair)

dP
ha
rm

an

ine

ed
ic

M

of

ho
ol

Mật độ quang học (Optical Density)

OD

Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (National
Center for Biotechnology Information)

py

rig

ht

@

Sc

NCBI

Co

ac
y,

H.nepalensis


DANH MỤC CÁC BẢNG

VN
U

Trang

Bảng 2.1. Thông tin mẫu thực vật dùng trong nghiên cứu ..................................... 18
Bảng 3.1. Nồng độ DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu ...................................... 26

ac
y,

Bảng 3.2. Chỉ số OD260/280 của các mẫu nghiên cứu ................................................. 27

dP
ha
rm

Bảng 3.3. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR ................................................. 29
Bảng 3.4. Các trình tự tham chiếu được sử dụng trong nghiên cứu ........................ 31
Bảng 3.5. Khoảng cách di truyền và số lượng nucleotit sai khác giữa trình tự GBSSI

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

của 9 mẫu nghiên cứu với H.nepalensis, H.sinensis và H.helix ............ 34


DANH MỤC CÁC HÌNH

VN
U

Trang

Hình 1.1. Cấu trúc một phần trình tự gen GBSSI cho Araliaceae .............................. 8

ac
y,

Hình 1.2. Hình ảnh cho mẫu lá Dây Thường Xuân..................................................... 9
Hình 1.3. Phân bố địa lý của Dây Thường Xuân tại phía Bắc Việt Nam. .................. 9

dP
ha
rm

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và
pulsatilla saponin A ................................................................................... 10
Hình 1.7. Giải trình tự theo phương pháp Sanger ...................................................... 15
Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu ........................................................................... 20
Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA theo bộ kit ........................................................ 22

an

Hình 2.3. Nguyên lí hoạt động màng silica ............................................................... 22

ine

Hình 2.4. Kết quả giải trình tự một đoạn gen trên phần mềm Bioedit ....................... 24

ed
ic

Hình 3.1. Kết quả DNA tổng điện di trên gel agarose 1,2% ..................................... 25
Hình 3.2. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi gen GBSSI. ......................................................... 28

M

Hình 3.3. Tối ưu nồng độ DNA gen GBSSI. ............................................................. 28

of

Hình 3.4. Tối ưu nồng độ mồi gen GBSSI ................................................................. 28
Hình 3.5. Kết quả PCR nhân dòng gen GBSSI trên gel agarose 1,5% .................... 30

ho
ol

Hình 3.6. So sánh trình tự vùng GBSSI của H.nepalensis với các loài có quan hệ
gần gũi thuộc chi Hedera........................................................................... 32

Sc

Hình 3.7. Cây quan hệ phát sinh theo phương pháp Maximum Likelihood ............. 35

Co

py

rig

ht

@

Hình 3.8. Cây quan hệ phát sinh theo phương pháp Maximum Parsimony .............. 35


MỤC LỤC

VN
U

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3

ac
y,

1.1. Đa dạng di truyền .............................................................................................. 3
1.1.1. Khái niệm ................................................................................................... 3

dP
ha
rm

1.1.2. Phân loại học sinh vật ................................................................................. 3
1.1.3. Thực trạng đa dạng sinh học tại Việt Nam................................................. 4
1.1.4. Mã vạch DNA ............................................................................................ 5
1.1.5. Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt ............................................................ 7
1.2. Tổng quan về loài Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) ............... 8

an

1.2.1 Đặc điểm hình thái chung của loài Dây Thường Xuân ............................... 8

ine

1.2.2. Đặc điểm phân bố địa lý ............................................................................. 9
1.2.3. Thành phần hóa học ................................................................................. 10
1.3.

ed
ic

1.2.4. Tác dụng dược lý ...................................................................................... 10
Tổng quan về phương pháp nghiên cứu ...................................................... 13

M

1.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số ...................................................... 13
1.3.2. Phương pháp khuếch đại đoạn gen đích bằng PCR ................................. 14

of

1.3.3. Giải trình tự gen ....................................................................................... 15

ho
ol

1.3.4. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại ..................................... 16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 18
2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 18

Sc

2.1.1. Đối tượng .................................................................................................. 18

@

2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu ......................................................................... 18
2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 18

ht

2.3. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu .............................................. 19

rig

2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 19
2.4.1. Tách chiết DNA tổng số ........................................................................... 19

Co

py

2.4.2. Khuếch đại đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR ......................................... 23
2.4.3. Tinh sạch và giải trình tự .......................................................................... 24


VN
U

2.4.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại phân tích sự đa dạng di truyền của
nguồn gen ........................................................................................................... 24
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................. 25
3.1. Tách chiết DNA tổng số ................................................................................. 25

ac
y,

3.2. Kết quả tối ưu hóa quy trình nhân dòng đoạn gen GBSSI bằng kỹ thuật PCR27
3.2.1. Tối ưu quy trình PCR ............................................................................... 27
3.2.2. So sánh khả năng nhân dòng đoạn gen GBSSI của 4 quy trình................ 29

dP
ha
rm

3.3. Độ tương đồng của trình tự gen GBSSI được khuếch đại............................... 31
3.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên chỉ thị GBSSI............................ 34
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 42

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

TÀI LIỆU THAM KHẢO


ĐẶT VẤN ĐỀ

dP

ha
rm

ac
y,

VN
U

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới với khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm,
địa hình núi chiếm phần lớn giúp hình thành thảm thực vật đa dạng và phong phú.
Từ xa xưa, y học cổ truyền Việt Nam đã biết sử dụng các nguồn dược liệu như là
một công cụ để chữa bệnh, chăm sóc sức khỏe và nâng cao chất lượng cuộc sống.
Do vậy, nguồn cây dược liệu quý là tài sản vô giá dùng để sản xuất thành các sản
phẩm thuốc, dược liệu có giá trị kinh tế cao [7].
Chi Hedera trong hệ thống phân loại thực vật thuộc họ Nhân sâm
(Araliaceae), được ghi nhận tổng cộng có 16 loài với đặc điểm hình thái chung dạng
dây leo. Loài Dây Thường Xuân có tên khoa học là Hedera nepalensis K.Koch
được báo cáo xuất hiện tại một số vùng núi cao Việt Nam, chứa hai hợp chất chính

ine

an

có tác dụng chống ung thư là hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và pulsatilla
saponin A [36]. Ngoài ra, H.nepalensis đã được nghiên cứu về tác dụng dược lý, cụ
thể có khả năng chống lại một số bệnh như: đái tháo đường, oxy hóa, nhiễm khuẩn,

ed
ic

ung thư,..[27, 50]. Với tiềm năng như vậy, song đến nay các nghiên cứu về
H.nepalensis tương đối ít. Chưa có nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền nguồn
gen Dây Thường Xuân ở Việt Nam nào được tiến hành, trong khi nhu cầu phát triển

Sc

ho
ol

of

M

thuốc có nguồn gốc dược liệu trên thế giới và ở Việt Nam nói chung đang ngày một
tăng cao.
Công tác thu thập, bảo tồn, đánh giá mức độ đa dạng di truyền nguồn gen
cây trồng là bước nghiên cứu quan trọng quyết định tới thành công trong chọn tạo
giống. Những hiểu biết đầy đủ về sự đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể của
nguồn gen Dây Thường Xuân thực sự cần thiết trong công tác bảo tồn và phát triển
nguồn dược liệu quý. Sự nghèo nàn trong mô tả đánh giá nguồn gen là cản trở chính
trong công tác chọn tạo giống. Hiện nay, những tiến bộ di truyền phân tử hỗ trợ đắc
lực cho công tác đánh giá tính đa dạng di truyền nguồn gen dược liệu, nhiều phương

Co

py

rig

ht

@

pháp phân tích đã được sử dụng trong các nghiên cứu đa dạng di truyền như: giải
trình tự, RFLP, RAPD để phân tích minisatellites và phân tích đa hình hệ gen ty thể,
hệ gen nhân,…[12].
Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt (Granule-bound starch synthase, GBSSI)
là chỉ thị DNA đã được sử dụng thành công để xây dựng cây phát sinh chủng loại
của họ Araliaceae ở châu Á [39]. Nhưng chỉ thị GBSSI có phải là chỉ thị tốt để đánh
giá đa dạng di truyền loài Dây Thường Xuân Việt Nam là một câu hỏi chưa có lời
giải. Để có thêm thông tin di truyền của loài này, bước đầu tiên và cũng rất quan

1


trọng là tách chiết được DNA tổng số từ tế bào một cách hiệu quả. Có nhiều phương

VN
U

pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu thực vật được công bố nhưng chưa có nghiên
cứu nào đánh giá được phương pháp nào là hiệu quả nhất đối với mẫu lá khô Dây
Thường Xuân. Vì vậy, vấn đề đặt ra hiện nay là cần nghiên cứu được quy trình tách
chiết DNA tổng số cho sản phẩm có chất lượng tốt làm nguyên liệu cho phản ứng

dP
ha
rm

ac
y,

PCR, cung cấp những thông tin và hiện trạng di truyền của loài này góp phần vào
chiến lược bảo tồn, khai thác bền vững nguồn dược liệu. Xuất phát từ ý nghĩa thực
tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số
và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân (Hedera
nepalensis K.Koch) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị GBSSI” với 2 mục tiêu như sau:
1. Xác định được quy trình tách chiết DNA tổng số có hiệu quả từ mẫu lá
khô của loài Dây Thường Xuân.

ine

an

2. Dựa vào giải trình tự gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt GBSSI để bước
đầu xác định được tính đa dạng di truyền của nguồn gen Dây Thường
Xuân thu nhập tại các tỉnh vùng núi phía Bắc Việt Nam nhằm phục vụ

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

cho việc khai thác, quản lý bền vững nguồn cây dược liệu.

2


VN
U

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đa dạng di truyền
1.1.1. Khái niệm

dP
ha
rm

ac
y,

Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên trái đất, là hàng triệu loài
thực vật, động vật và vi sinh vật, là sự giàu có về nguyên liệu di truyền trong các
loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trường. Do
vậy, đa dạng sinh học bao gồm 3 cấp độ: đa dạng gen, đa dạng loài và đa dạng hệ
sinh thái.
Đa dạng di truyền là đa dạng ở cấp độ phân tử, đề cập đến sự biến đổi các
đặc điểm di truyền giữa các cá thể trong loài và cả trong quần thể. Mỗi loài có chứa

an

những gen riêng biệt thể hiện đặc tính riêng của nó như một cách để các quần thể có
thể thích nghi được với môi trường sống thay đổi. Với các áp lực như: chọn lọc
nhân tạo, môi trường sống khắc nhiệt,… một số cá thể trong một quần thể sẽ có cơ

ed
ic

ine

hội cao hơn trong việc sở hữu những biến dị alen phù hợp với môi trường giúp duy
trì nòi giống có alen đó trong cơ thể. Quần thể đó sẽ tiếp tục có thêm nhiều thế hệ
nhờ sự thành công của những cá thể này.

Sc

ho
ol

of

M

Vì vậy, đa dạng di truyền là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học,
tạo nên sự khác biệt của các cá thể trong quần thể. Đa dạng sinh học dù trong phạm
vi một loài hay giữa các loài và các hệ sinh thái với nhau thì cũng đều xuất phát từ
đa dạng di truyền. Và nghiên cứu về đa dạng di truyền cũng là các nghiên cứu cơ
bản và chính xác nhất về sự khác biệt giữa các loài. Tuy nhiên, đa dạng di truyền
vẫn chưa được quan tâm đúng mức mặc dù các loại đa dạng này chính là nền tảng
cho sự đa dạng của sinh giới [4].
1.1.2. Phân loại học sinh vật

rig

ht

@

Phân loại học sinh vật là sự sắp xếp các sinh vật theo các đơn vị phân loại
(taxon) phù hợp dựa trên những đặc điểm giống nhau của chúng. Đồng thời, hệ
thống phân loại có thể giúp dự đoán được vị trí của sinh vật trong hệ thống phân
loại, giúp ta hiểu rõ được quá trình tiến hóa của sinh vật. Một ý nghĩa thực tiễn quan

Co

py

trọng khác là nhờ có hệ thống phân loại với hệ thống danh pháp khoa học đặt cho
sinh vật đã giúp tránh được nhầm lẫn vì nhiều sinh vật mang tên dân gian, được gọi
tên khác nhau ở các vùng đất khác nhau [11].

3


Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xác định

VN
U

loài ở động, thực vật và hầu hết các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc như
những loài có chung nguồn gốc, có những tính chất giống nhau, càng gần nhau thì
tính chất giống nhau càng nhiều. Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải
phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học. Đối với thực vật, đặc điểm hình thái học của

dP
ha
rm

ac
y,

các loài thực vật qua nhận biết hình thái lá, hoa, quả, cách thức phân cành…có ưu
điểm dễ quan sát trực tiếp bằng trực quan, nhưng chỉ dựa vào thống kê phân tích
một hoặc nhiều tính trạng được thể hiện ra bên ngoài nên hiệu quả thấp. Điều này
thật sự gặp nhiều khó khăn khi các mẫu vật cần giám định không còn nguyên vẹn,
mất hình thái bên ngoài. Do vậy, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh
nghiệm dân gian sẽ được hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng các kỹ thuật sinh học
phân tử hiện đại.

ed
ic

ine

an

Việc ứng dụng sinh học phân tử trong phân loại học là một phương pháp
mới: giúp xác định các loài dựa trên trình tự DNA nucleotit của một đoạn gen đặc
trưng được coi như dấu hiệu đặc trưng cho loài. Phương pháp này đặc biệt có ích
trong trường hợp giải quyết các vấn đề về loài đồng hình hay nghiên cứu các biến
dị. Các dữ liệu về trình tự DNA nucleotit của các loài được tạo thành hệ thống dữ
liệu mã vạch DNA.

M

Phân loại học phân tử có thể dựa trên sự nghiên cứu các gen trong hệ gen

nhân, hệ gen của các bào quan như ty thể, lục lạp hoặc các sản phẩm của gen như

of

protein, enzym. Mỗi loại gen, sản phẩm của gen lại phù hợp với từng đối tượng và

Sc

ho
ol

mục đích nghiên cứu khác nhau. Các kỹ thuật thường được sử dụng bao gồm: kỹ
thuật isozym (đồng enzym), giải trình tự DNA, đa hình chiều dài các đoạn cắt giới
hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism), đa hình các đoạn DNA nhân bản

ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNA), đa hình chiều dài các đoạn
DNA được nhân bản (Amplified Fragment Length Polymorphism),…[12] đã giúp

py

rig

ht

@

giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di
truyền, quan hệ chủng loại và tiến hoá của nhiều loài động, thực vật và vi sinh vật.
Thêm vào đó các kỹ thuật này cũng được sử dụng như những chỉ thị phân tử để xác
định những gen kiểm soát hoặc có liên quan đến tính trạng nào đó của các cá thể,
loài hay các nhóm loài.

Co

1.1.3. Thực trạng đa dạng sinh học tại Việt Nam
Việt Nam xếp thứ 16 về mức độ đa dạng sinh học, được biết đến như một
trung tâm đa dạng sinh học của thế giới với các hệ sinh thái tự nhiên phong phú và
4


đa dạng. Trong đó, đã xác định được khoảng 49.200 loài sinh vật bao gồm: khoảng

VN
U

7.500 chủng vi sinh vật; 20.000 loài thực vật trên cạn và dưới nước; 10.500 loài
động vật trên cạn; 2.000 loài động vật không xương sống và cá sống ở nước ngọt;
khoảng trên 11.000 loài sinh vật biển. Đặc biệt, một bộ phận lớn của các giống thực
vật, động vật này có các đặc tính quý chỉ có ở nước ta, nên tiềm năng phát triển và

ac
y,

đem lại giá trị kinh tế rất cao [6].

dP
ha
rm

Với số lượng 500 loài nguồn gen dược liệu, sở hữu nhiều loài dược liệu quý,
hiếm và là nơi có nguồn đa dạng sinh học phong phú, nhưng những sản phẩm từ
dược liệu quý của nước ta chưa trở thành hàng hóa có giá trị cao và chưa được sử
dụng rộng rãi trong cộng đồng. Điển hình trong số đó là chi Hedera, phân bố trên
thế giới trên 16 loài nhưng chỉ có 2 loài H.nepalensis (Dây Thường Xuân, xuất hiện
tại một số tỉnh miền núi phía Bắc) và H.helix (Thường Xuân) được chứng minh là

ine

an

có tác dụng dược lý trong phòng và điều trị bệnh. Mặc dù có những tiềm năng dược
lý song hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về H.nepalensis, đặc biệt là các nghiên
cứu đánh giá tiềm năng đa dạng sinh học phục vụ công tác bảo tồn, khai thác và

ed

ic

phát triển nguồn gen ở Việt Nam. Chưa kể đến, việc phân loại và định danh Dây
Thường Xuân dựa vào đặc điểm hình thái có thể dễ gây nhầm lẫn do đặc điểm xẻ
thùy của lá cây (phần hay được thu hái làm thuốc) có mức độ phân hóa lớn. Vậy

ho
ol

1.1.4. Mã vạch DNA

of

M

nên, phân tích đa dạng di truyền và xây dựng tiêu chuẩn chất lượng về nguồn gen
góp phần giải quyết nhu cầu khai thác hiệu quả và quản lý bền vững nguồn tài
nguyên dược liệu.

Sc

Mã vạch DNA là một khái niệm tương đối mới nhằm cung cấp nhận dạng
loài nhanh chóng, chính xác và tự động hóa, bằng cách sử dụng đoạn DNA ngắn
của hệ gen như một mã vạch đặc trưng để nhận diện. Mã vạch DNA có tiềm năng
trong phân loại học và trong các ngành khoa học khác như là khoa học pháp y, công

rig

ht

@

nghệ sinh học, công nghiệp thực phẩm,…giúp cung cấp cái nhìn sâu hơn để nhận
diện, phân định ranh giới giữa các loài và góp phần nhận diện các mẫu vật chưa xác
định được thuộc loài nào [28].

Co

py

Ước tính có khoảng 300.000 loài thực vật trên thế giới, việc phân loại và xác
định chính xác một số lượng lớn các loài như vậy vẫn đang còn là một thách thức
ngay cả với các chuyên gia phân loại. Hơn nữa, phân loại từng loài dựa trên chỉ thị
truyền thống (chỉ thị hình thái, giải phẫu) mất rất nhiều thời gian và công sức, lại
chỉ phù hợp ở từng giai đoạn sống, giới tính cụ thể của loài, nhiều cá thể sẽ không

5


nhận định được. Sự xuất hiện của mã vạch DNA đã có tác động tích cực đến phân
ngày càng trở nên phổ biến, có ý nghĩa trên quy mô toàn cầu [28].

VN
U

loại học giúp đáp ứng tốt những hạn chế của phương pháp truyền thống trước kia và
Đặc điểm quan trọng nhất của mã vạch DNA là tính đặc hiệu cao dễ sử dụng.
Một mã vạch DNA lý tưởng cần đáp ứng các tiêu chí sau: Một là, nó phải đủ độ đột

dP

ha
rm

ac
y,

biến phân biệt giữa các loài khác nhau và phải có vùng bảo tồn để nhận diện được
giữa những cá thể thuộc cùng một loài [34,15]. Hai là, phổ biến trong các loài để có
thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau. Ba là, đoạn DNA đủ ngắn
(khoảng 700 bp hoặc nhỏ hơn [19]) chứa đủ thông tin phát sinh gen để dễ dàng định
danh các loài cho nhóm phân loại của nó một cách nhanh chóng. Cuối cùng, các vị
trí mồi được bảo tồn cao, khuếch đại và giải trình tự DNA có độ tin cậy cao.
Năm 2004, hiệp hội mã vạch cho cuộc sống (barcode of life) được thành lập

ine

an

nhằm mục đích xác định một công cụ mã vạch chính xác, đáng tin cậy cho nghiên
cứu về phân loại thực vật và động vật. Năm 2006, Hebert và các cộng sự của ông đã
đề xuất sử dụng gen ti thể cytochrom oxyase tiểu đơn vị 1 (CO1) như là một trình tự

ed
ic

mã vạch chung cho động vật. Và kể từ đó, đã có hàng loạt ấn phẩm minh chứng sự
hữu ích của nó trong phân loại các loài động vật [32]. CO1 không chỉ chứa vùng

of

M

trình tự được bảo tồn cao trong một loài mà còn chứa đủ biến dị phục vụ nghiên cứu
phân biệt giữa các nhóm riêng biệt trong một loài. Ghi nhận về CO1 còn cho biết
khả năng phân biệt nhiều mẫu động vật cùng tổ tiên và thậm chí có hiệu suất cao
ngay cả với những mẫu đã lưu trữ qua thời gian dài.

Sc

ho
ol

Đối với mã vạch DNA ở thực vật, gen lục lạp được xem là mã vạch có độ tin
cậy cao trong xác định các loài thực vật do sự biến đổi rất chậm của hệ gen ty thể.
Có một số mã vạch thường được sử dụng cho thực vật như: matK, RbcL, TrnHpsbA. Gen matK có tốc độ tiến hóa cao, chiều dài phù hợp và sự khác biệt rõ ràng
giữa các vùng cũng như tỷ lệ chuyển đổi thấp [31]. Tuy nhiên, để thực hiện phản

Co

py

rig

ht

@

ứng PCR khuếch đại gen matK thì sử dụng một cặp mồi đơn thường không đem lại
hiệu quả cao. Các loài khác nhau yêu cầu cặp mồi khác nhau, hiệu suất nhân dòng
các loài cũng khác nhau. Gen matK có thể phân biệt được >90% trong các loài

phong lan, tuy nhiên lại chưa đến 49% trong họ hạt nhục đậu khấu [47]. Gen rbcL
được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phát sinh gen với hơn 50.000 trình tự
có sẵn trong Genbank. Những lợi thế của gen này là dễ dàng khuếch đại trình tự và
là một mã vạch DNA tốt trong phân loại thực vật ở cấp độ gia đình và chi, nhưng lại
không hiệu quả ở cấp độ loài [19]. trnH-psbA hiện đang là mã vạch được sử dụng

6


phổ biến, với những ưu điểm như thiết kề mồi đơn giản, chỉ sử dụng một cặp mồi

VN
U

đơn để khuếch đại gen, nằm giữa 2 vùng trình tự bảo tồn cao là đoạn trình tự không
mã hóa có tỷ lệ biến đổi cao [33]. Tuy nhiên độ dài chuỗi trình tự TrnH-psbA ngắn
trong chi Solidago có thể là nhược điểm của mã vạch này khi không cung cấp đủ
biến dị cho phân tích phân loại. Đối với thực vật, quá trình tìm kiếm một chỉ thị

dP
ha
rm

ac
y,

DNA chung cho các loài gặp nhiều khó khăn. Hệ gen ty thể ở thực vật thường quá
bảo thủ nên không được dùng cho chỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại mang
nhiều đặc điểm mong muốn đối với chỉ thị DNA như ở hệ gen ty thể ở động vật. Ở
hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi vùng sao chép nội bộ

(Internal Transcribed Spacer, ITS) và vùng gen nhân có số lượng bản sao thấp như
gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt GBSSI cũng được sử dụng trong việc phân loại
thực vật và cho hiệu quả cao. Hiện nay hệ thống mã vạch DNA cho thực vật vẫn

ine

an

chưa hoàn chỉnh. Tuy nhiên, với các trình tự mã vạch DNA này, các nhà khoa học
đã có những nghiên cứu, ứng dụng đầy hứa hẹn cho xác định loài ở thực vật, mở ra
một triển vọng mới cho cho công tác đánh giá, phân loại và bảo tồn đa dạng sinh
học [5].

ed
ic

1.1.5. Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt

of

M

Quan tâm đến việc sử dụng các gen nhân có số lượng bản sao thấp để phân
tích phát sinh thực vật đã phát triển nhanh chóng, đặc biệt khi mà các chỉ thị phổ
biến như DNA lục lạp và DNA ribosom không thể tạo ra các giả thuyết phát sinh
gen mạnh. Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt (Granule Bound Starch Synthase I,

Sc

ho

ol

GBSSI), hay gen waxy chỉ có một bản sao duy nhất trong tế bào. Những đoạn exon
của GBSSI có tốc độ thay thế nucleotit tương đối chậm nên có vai trò là vùng bảo
tồn, trong khi đó những đoạn không được mã hóa inton lại có tỷ lệ thay thế nucleotit
khá cao cung cấp các dấu hiệu phát sinh gen ở các bậc phân loại [45].
Hiện tại, dữ liệu về gen GBSSI vẫn chưa được hiểu đầy đủ, và còn cần

Co

py

rig

ht

@

nghiên cứu thêm. GBSSI là một chỉ thị còn mới trong nghiên cứu phân tử để nghiên
cứu phát sinh loài với kích thước gen khoảng 4 kb, bao gồm 13 intron trong
Solanum tuberosum và có khả năng là một nguồn thông tin hữu ích về thực vật học
[39, 21].

7


VN
U
trí cặp mồi nhân dòng [39]

ac
y,

Hình 1.1. Cấu trúc một phần trình tự gen GBSSI cho Araliaceae. Mũi tên chỉ vị

dP
ha
rm

1.2. Tổng quan về loài Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch)
1.2.1 Đặc điểm hình thái chung của loài Dây Thường Xuân
* Đặc điểm hình thái chung của chi Hedera

Vị trí của chi Hedera trong hệ thống phân loại thực vật như sau:

ine

Lớp Ngọc lan Magnoliopsida

an

Ngành Ngọc lan Magnoliophyta

ed
ic

Phân lớp Hoa hồng Rosidae
Bộ Hoa tán Apiales

M

Họ Nhân sâm Araliaceae
Chi Hedera

Sc

ho
ol

of

Cho đến ngày nay, chi Hedera đã ghi nhận tổng cộng 16 loài với đặc điểm
hình thái chung dây leo, mọc thành một lớp bao phủ mặt đất với chiều cao từ
6-10 cm, có thể leo cao tới 30 m [20]. Hedera có thể leo được là nhờ hệ thống rễ
mọc ký sinh có thể tạo ra chất bám dính. Lá cây thuộc loại lá đơn, không có lá kèm,
phiến lá phân thùy, dài 5-10 cm, rộng 3-8 cm, gân chân vịt. Cụm hoa chùy, gồm
nhiều tán, có lông sao. Hoa nhỏ, màu vàng trắng và lục trắng, lá bắc rất nhỏ, dài có

ht

@

5 răng nhỏ, tràng 5, gốc rộng, có một mào cuốn ở giữa, nhị 5, bầu 5. Quả hạch tròn,
mọng dài từ 5-9 mm, đường kính 6-9 mm, trọng lượng trung bình khoảng 281,5 mg,
trái của nó chứa từ 2-5 hạt, quả khi chín có màu đen [1, 17].

rig

* Đặc điểm hình thái loài Hedera nepalensis

Co

py

H.nepalnensis K.Koch là loài có dây leo có thể dài tới 20 m, có nhiều rễ mọc
ký sinh ở các mắt, lá đơn, cụm hoa mọc dấu ở cành thành tán tròn hoặc tán ngù,
mọc rải rác trong rừng thưa; phổ biến ở độ cao 1000-3000 m [3].

8


VN
U
ac
y,
dP
ha
rm

Hình 1.2. Cây Dây Thường Xuân [53]

an

1.2.2. Đặc điểm phân bố địa lý

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

Hedera nepalensis K. Koch thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), có nguồn gốc
từ Nepal, Bhutan cũng như ở Trung Quốc, Afganistan, Ấn Độ, Lào, Thái Lan,
Myanmar và Việt Nam ở độ cao khoảng 1000-3000 m [51]. Tại Việt Nam Dây
Thường Xuân được tìm thấy ở một số vùng núi cao phía Bắc như Lai Châu, Sơn La,
Hòa Bình, Hà Giang, Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn Hình 1.3 [2].

Co

py

Hình 1.3. Phân bố địa lý của Dây Thường Xuân tại phía Bắc Việt Nam [2]

9

1.2.3. Thành phần hóa học

VN
U

Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới, thành phần hóa học chủ yếu trong lá và
thân của H.nepalensis K. Koch là saponin. Trong đó, hai hợp chất chính có tác dụng
chống ung thư hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và pulsatilla saponin A đã
được T. Li và cộng sự phân lập bằng phương pháp sắc ký hóa học và phương pháp

dP
ha
rm

ac
y,

quang phổ vào năm 2015 [36]. Ngoài ra, các hợp chất phenolic và phenolic có khả
năng chống oxy hóa cũng được phát hiện trong H.nepalensis khi định tính bằng
phương pháp so màu với quercetin và axit gallic. Để định lượng các hợp chất trên
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được sử dụng. Hai hợp chất catechin và
caffeic cũng được tìm thấy trong phân đoạn etyl acetate của H.nepalensis. Các phân
tích hóa sinh đã chứng minh trong Dây Thường Xuân còn có chứa các nhóm chất
khác như: carbohydrate, protein, alkaloid, tanin, terpenoid và các hợp chất

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

phytosterol [22, 41, 30, 42].

Sc

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và
pulsatilla saponin A [26]
1.2.4. Tác dụng dược lý

@

1.2.4.1. Theo y học cổ truyền

ht

Bộ phận dùng: rễ, thân, lá và quả tươi hoặc phơi khô.

py

rig

Về tính vị quy kinh: Dây Thường Xuân có vị đắng, tính mát thường có tác

dụng trong khu phong, giải độc, hoạt huyết, tiêu sưng; quả vị ngọt, tính ấm được
dùng để trừ phong huyết.

Co

Công dụng: Chữa đơn sưng: chế rượu với lá thường xuân giã nhỏ, gạn lấy
dịch uống, phần bã còn lại được đắp vào chỗ sưng đau. Khi gặp vấn đề về mụn lở

10


thì lấy thân hoặc rễ cây sắc thuốc hoặc ngâm với rượu uống. Sắc hoặc ngâm rượu

VN
U

với quả Dây Thường Xuân có công dụng chữa huyết bế trong bụng, giúp giảm các
triệu chứng đau lưng, mỏi gối ở người già [2]. Ở Ấn Độ, lá cây còn có thể dùng làm
thuốc chườm nóng trị sưng hạch, quả dùng hãm uống tác dụng trị thấp khớp [3].

ac
y,

1.2.4.2. Theo y học hiện đại
Tác dụng chống đái tháo đường:

dP
ha
rm

Một nghiên cứu đã được thực hiện trên chuột mắc bệnh tiểu đường nhằm
đánh giá hiệu quả của dịch chiết thô H.nepalensis. Hiệu quả được đánh giá dựa trên
nồng độ glucose đo bằng máy đo đường huyết, sau đó so sánh các thông số giữa
chuột được điều trị và không được điều trị. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra

ine

an

H.nepalensis làm giảm đáng kể mức đường huyết theo thời gian và làm phục hồi
chức năng gan [26]. Nghiên cứu khác cũng chỉ ra H.nepalensis chứa các hợp chất tự
nhiên với hoạt tính ức chế dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4). Một trong số cơ chế của
thuốc chống đái tháo đường hiện nay dựa trên nguyên lý ức chế DPP-4, đây là một
enzym phá hủy incretins. Incretins là hóc-môn tự nhiên do cơ thể tiết ra lượng lớn

ed
ic

sau bữa ăn, với vai trò điều chỉnh lượng đường huyết thông qua kích thích tuyến tụy
tiết insulin. Khi ức chế enzym DPP-4 sẽ làm tăng nồng độ và kéo dài thời gian tác

of

M

dụng của incretins, làm tăng tiết insulin và giảm tiết glucagon trong tuần hoàn, dẫn
đến giảm glucose máu. Do đó, H.nepalensis được đánh giá có tiềm năng trong điều
trị đái tháo đường [44].

ho

ol

Tác dụng chống oxy hóa:

Co

py

rig

ht

@

Sc

Nghiên cứu của Samia Inayatullah và cộng sự về tiềm năng chống oxy hóa
của dịch chiết methanol H.nepalensis thử nghiệm trong môi trường nước và lipid.
Khả năng chống oxy hóa đã được nghiên cứu trong nước bằng cách sử dụng xét
nghiệm quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và gốc ABTS (2,2’azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate). Trong khi hoạt tính chống oxy hóa
trong lipid được xác định bằng đánh giá chỉ số ôi hóa (TBARS - Thiobarbituric
Acid Reactive Substances). Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa theo cơ
chế diệt gốc tự do sẽ làm giảm màu của dung dịch có chứa nồng độ chất tự do xác
định. Sau đó, khả năng chống oxy hóa xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang ở
bước sóng thích hợp. Nghiên cứu đưa ra kết quả hàm lượng gốc DPPH là 26,7 ± 0,2
(mM TE/g); ABTS là 54,7 ± 1,6 (mmol TE/g); TBARS là 393 ± 3,4 (mmol TE/g).
Trong đó, mM TE/g là µmol đương lượng chất chuẩn Trolox (Trolox Equivalent -

11

TE) trên 1 g chất khô. Hai hợp chất chính trong dịch chiết thô của H.nepalensis có

VN
U

chất có khả năng chống oxy hóa là axit chlorogen và rutin [36].
Nghiên cứu khám phá các chất chống oxy hóa tự nhiên bao gồm nghiên cứu
các hợp chất polyphenolic và khả năng chống oxy hóa của H.nepalensis cũng đã
được thực hiện. Nguyên liệu sử dụng là dịch chiết thô và các dịch chiết phân đoạn

dP
ha
rm

ac
y,

của nó thu trong dung môi: n-hexan, ethyl acetate và nước. Tổng hàm lượng
flavonoid và phenolic được định tính bằng phương pháp so màu sử dụng quercetin
và axit gallic. Sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-DAD) để phát hiện các
hợp chất flavonoid. Theo đó, hàm lượng flavonoid là 2,4 ± 0,164 QE /100 mg
(đương lượng quercetintrên mỗi gram dịch chiết) và hàm lượng phenolic là 12,90 ±
0,15 mg GAE/100 mg (GAE/g - đương lượng acid galic trên mỗi gram dịch chiết).
Tác dụng chống oxy hóa được đánh giá bằng khả năng dọn sạch nhóm hydro

ine

an

peroxide (H2O2). Các chiết suất thô cũng như phân đoạn của H.nepalensis cho thấy
khả năng chống oxy hóa cao với chỉ số IC50 từ 31,19 đến 200 µg/mL. Trong đó,
dịch chiết ethyl acetate được cho là có khả năng chống oxy hóa cao nhất, dịch chiết

ed
ic

n-hexan thấp hơn và sau cùng là dịch chiết với nước [35].
Tác dụng chống ung thư:

Sc

ho
ol

of

M

Laila Jafri và cộng sự đã thực hiện phân tích các đặc tính hóa học và gây độc
tế bào ung thư trong ống nghiệm của cây. Xét nghiệm hóa trị ung thư trong ống
nghiệm được thực hiện bằng xét nghiệm nitrite, xét nghiệm NFB, xét nghiệm
aromatase và xét nghiệm quinone reductase 1 (QR1). Tiềm năng gây độc tế bào
được đánh giá trên ba dòng tế bào ung thư: MCF-7, MDA-MB-231 và xét nghiệm
sulforhodamine B (SRB). Kết quả xét nghiệm hóa trị ung thư cho thấy các dịch
chiết phân đoạn n-hexan và ethyl acetate của cây được thử nghiệm có tiềm năng
ngăn ngừa ung thư. Dịch chiết thô và các phần dịch chiết phân đoạn của nó đã ức
chế sự tăng trưởng của ba dòng tế bào ung thư hơn 60%, giá trị IC50 của lupeol thay

rig

ht

@

đổi từ 2,32 đến 10,2 μM. Định lượng lupeol dựa trên HPLC-DAD trong các mô
thực vật khác nhau đã được chứng minh rằng lá của H.nepalensis là một nguồn
lupeol phong phú (0,196 mg/100 mg trọng lượng khô) [29].

Co

py

Hai hợp chất chống ung thư chính là hederagenin 3-O-α-Larabinopyranoside (IC50 = 13,69 ± 1,29 g/mL) và pulsatilla saponin A (IC50 = 2,80
± 0,94 g/mL) có vai trò chính cho các hoạt động chống ung thư của H.nepalensis K.
Koch, được nghiên cứu bởi T.Li và cộng sự. Các hợp chất được phát hiện thông qua
các phương pháp sắc ký hóa học và phương pháp quang phổ. Thực hiện phân lập
12


các thành phần chống ung thư và thử nghiệm các hoạt động ức chế tăng trưởng của

VN
U

chúng trên tế bào ung thư phổi A549 ở người. Kết quả cho thấy chiết xuất ethanol
95% của H.nepalensis K. Koch đã ngăn chặn đáng kể sự phát triển tế bào A549 phụ
thuộc vào liều [36].

ac

y,

Tác dụng giảm đau:

dP
ha
rm

Với phương pháp thử nghiệm Hot Plate, được sử dụng trong nghiên cứu
phản ứng đau cơ bản và trong thử nghiệm hiệu quả của thuốc giảm đau bằng cách
quan sát phản ứng với cơn đau do nhiệt. H.nepalensis cho kết quả về khả năng giảm
đau lên tới 59,1% so với morphine là 80% (p < 0,01) [25]. Thử nghiệm sự đau đớn
để đánh giá hiệu quả giảm đau ngoại vi được đặc trưng bởi sự giải phóng các chất
trung gian giảm đau nội sinh chẳng hạn như axit arachidonic, cyclooxygenas. Có
thể nhận định rằng các polyphenol có mặt trong cây có vai trò chính trong hoạt

an

động giảm đau.

ine

Tác dụng kháng viêm:

Để xác định khả năng chống viêm, dịch chiết thô của H.nepalensis ở nồng độ

ed
ic

hiệu quả nhất (200 mg/kg) được đánh giá bằng cách sử dụng mô hình với histamin.

Sự ức chế phù tối đa được phát hiện ở 90 phút. Mẫu đối chứng dương được thực

1.3.

ho
ol

of

M

hiện với chlorpheniramine maleate. Tỷ lệ phần trăm ức chế của chlorpheniramine
maleate là 77% và của H.nepalensis là 63,5% (p < 0,01). Kết quả cho thấy rằng dịch
chiết của H.nepalensis giúp làm giảm đáng kể tình trạng viêm do histamine tạo ra
[25].
Tổng quan về phương pháp nghiên cứu

1.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Sc

Tách chiết axit deoxyribonucleic (DNA) tổng số là quá trình tách DNA khỏi
protein, và các vật liệu tế bào khác có trong tế bào bằng cách sử dụng kết hợp các

rig

ht

@

phương pháp vật lí và hóa học. Tách chiết DNA lần đầu tiên được thực hiện vào
năm 1869 bởi Friedrich Miescher. Đây có thể là một trong những phần tốn nhiều
công sức nhất trong phân tích DNA. Các phương pháp tách chiết có thể yêu cầu ủ
qua đêm, hoàn thành trong vài phút hoặc vài giờ phụ thuộc vào từng quy trình [43].

Co

py

Các quá trình tách chiết DNA đòi hỏi xử lý cẩn thận nhằm ngăn chặn nhiễm
mẫu và nhiễm chéo. Tiêu chuẩn chung đối với các phương pháp phân lập DNA là:
lượng DNA phân lập đủ nhiều, độ tinh sạch cao, ít đứt gãy phù hợp cho các quy
trình phân tích tiếp theo.
13


Khả năng chiết xuất DNA chất lượng cao là rất quan trọng để nghiên cứu di

VN
U

truyền phân tử của một sinh vật. Khác với tế bào động vật, ở thực vật có vách tế bào
dày đồng thời các chất polysacarit và tannin rất khó để loại bỏ vì chúng khó tách
khỏi DNA. Hơn nữa, phân lập DNA từ các mô thực vật đòi hỏi sự tham gia của
carbohydrate và enzym đảm bảo ly giải thành tế bào [46]. Hầu hết các chất gây

dP
ha
rm

ac
y,

nhiễm giống như polysacarit, polyphenol và các hợp chất hữu cơ khác khó phát hiện
có thể ảnh hưởng đến chất lượng DNA và ức chế phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR)
[38]. Bước đột phá đầu tiên trong phân lập DNA vào năm 1980 với ứng dụng của
cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) được nghiên cứu bởi M.G.Murray and
W.F.Thompson [40]. Đến nay, sử dụng hóa chất CTAB để tách chiết DNA được sử
dụng trong nhiều loài thực vật. Kỹ thuật dựa trên khả năng tạo kết tủa chọn lọc
DNA với CTAB. CTAB là chất tẩy cation, ở nồng độ muối cao có khả năng tạo kết

ine

an

tủa với DNA, khi đó các tạp chất trong hỗn hợp không tạo được kết tủa sẽ được loại
bỏ [40]. Kết tủa DNA với CTAB sau đó sẽ được hòa tan với muối nồng độ thấp
(NaCl 1N). Ngoài phương pháp tách bằng hóa chất CTAB, các bộ kit thương mại

ed
ic

được sử dụng với ưu điểm tiết kiệm thời gian, tách DNA có độ tinh sạch cao nhờ
nguyên lí trao đổi ion trên màng silica.
Trong quá trình tách chiết DNA thực vật, không có phương pháp tách chiết

ho
ol

of

M

nào được chứng minh là tối ưu nhất. Năng suất DNA khác nhau giữa các loài khác
nhau và mô tùy thuộc vào kích thước bộ gen, số lượng tế bào và tuổi của từng mẫu
[46, 50]. Để đánh giá phương pháp tách chiết DNA, cần đánh giá không chỉ dựa
trên nồng độ và độ tinh sạch của DNA thu được, mà còn dựa trên khả năng phân lập
thành công các đoạn gen đích sử dụng kỹ thuật PCR.
1.3.2. Phương pháp khuếch đại đoạn gen đích bằng PCR

Sc

Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) là một thành phần không thể thiếu và là kỹ
thuật chính của sinh học phân tử. Sử dụng enzym DNA polymerase có khả năng

Co

py

rig

ht

@

liên kết với khuôn để tổng hợp phân tử DNA mới từ phân tử DNA khuôn ban đầu
với nguyên liệu là các dNTP. Trong phản ứng PCR có sự thay đổi nhiệt liên tục
theo chu kỳ, một chu kỳ thường gồm ba giai đoạn: Giai đoạn biến tính với nhiệt độ
cao (94-980C) tác động làm mạch DNA tách thành hai mạch; giai đoạn gắn mồi
nhiệt độ được hạ xuống tạo điều kiện thuận lợi để mồi gắn vào được sợi DNA

khuôn. Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc nhiều yếu tố như đặc tính mồi, trình tự mồi,…;
giai đoạn kéo dài: Trong bước này DNA polymerase sẽ tổng hợp chuỗi DNA mới
có trình tự bổ sung với DNA mạch khuôn bằng cách thêm các dNTPs từ hỗn hợp

14


thành phần phản ứng theo chiều từ 5’-3’. Sản phẩm được tạo thành sẽ là nguyên liệu

VN
U

cho chu kỳ tiếp theo. Số lượng sản phẩm phân tử DNA tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ,
từ một phân tử DNA ban đầu sau n chu kỳ sẽ tạo thành 2n phân tử DNA [49].

M

ed
ic

ine

an

dP
ha
rm

ac
y,

1.3.3. Giải trình tự gen

of

Hình 1.5. Giải trình tự theo phương pháp Sanger

Sc

ho
ol

Giải trình tự gen là phương pháp xác định trình tự sắp xếp của bốn loại
nucleotit trên phân tử DNA. Nguyên tắc dựa trên phương pháp Sanger – kỹ thuật
kết thúc chuỗi bằng 2’, 3’dideoxynucleotit (ddNTP) đã mất nhóm C3’-OH. Nhóm
3’-OH đóng vai trò cho phép gắn thêm một nucleotit mới vào chuỗi. Khi một
ddNTP được thêm vào chuỗi, vì không có nhóm 3’-OH nên nucleotit không được

@

gắn thêm vào chuỗi, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại.

Co

py

rig

ht

Trong thí nghiệm của Sanger theo mô tả Hình 1.5, 4 ống nghiệm tách biệt
chứa sẵn đoạn mồi, DNA khuôn, dNTP, mỗi ống nghiệm chỉ bổ sung 1 loại ddNTP
đã được đánh dấu phóng xạ, sau đó thực hiện phản ứng tổng hợp. Sản phẩm tổng
hợp điện di trên gel polyacrylamide. Đặc điểm của những đoạn DNA này là hỗn
hợp nhiều phân tử DNA được sao chép không hoàn chỉnh giống nhau ở đầu 5’
nhưng khác nhau về chiều dài và nucleotit kết thúc ở đầu 3’, kích thước sai khác
nhau 1 nucleotit.

15


Phương pháp giải trình tự gen thủ công theo Sanger được ứng dụng rất rộng

VN
U

rãi, Tuy nhiên để giải trình tự DNA ở hệ gen lớn, đa số đều thực hiện phương pháp
giải trình tự tự động. Phương pháp này sử dụng bộ các ddNTP được gắn chất phát
quang khác nhau cho mỗi loại. Nguồn sáng Argon của máy giải trình tự kích thích
các ddNTP, đầu đọc laser trong máy sẽ kích hoạt các chất này khiến chúng hấp thụ

dP
ha
rm

ac
y,

và phát ra các màu, mỗi màu ứng với một loại nucleotit và được hiển thị bằng một
đỉnh. Trình tự đọc được trên máy tự động thường dài khoảng 600 đến 1.000 bp. Ưu

điểm của giải trình tự tự động là khả năng tự động hóa phần lớn các bước, tốc độ
đọc và mức độ chính xác rất cao [9, 10].

1.3.4. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại

Phương pháp Ma trận khoảng cách - Distance Matrix

Đây là một nhóm các thuật toán được sử dụng từ lâu trong các nghiên cứu

ine

an

tiến hóa. Được bắt đầu sử dụng từ những năm 1990, các thuật toán này giúp xác
định mối quan hệ giữa các loài dựa trên các dấu hiệu hình thái. Trong đó thuật toán

ed
ic

UPGMA (Unweighted pair group with arthmetic) phân tích tất cả các dấu hiệu qua
đó xác định khoảng cách di truyền giữa tất cả các cặp mẫu, rồi gộp từng cặp mẫu có
khoảng cách di truyền thấp nhất.

of

M

Nhìn chung các thuật toán dựa trên “ma trận khoảng cách” cho kết quả phân
tích nhanh, phù hợp để xử lí một lượng dữ liệu lớn, cho biết khoảng cách di truyền
tương đối giữa các loài nhưng không phản ánh được sự tiến hóa của mỗi gen [10].

ho
ol

Phương pháp Tiết kiệm tối đa - Maximum Parisimony

Sc

Dựa trên nguyên tắc sinh học là đột biến hiếm khi xảy ra, thuật toán này cho
rằng: cây tiến hóa phù hợp nhất là cây có đột biến thấp nhất trên tất cả các cây tiến
hóa có thể giữa các taxon được phân tích. Do vậy cây tiến hóa thu được từ phương
pháp này được gọi là cây tích phân tiến hóa tối ưu [10].Chỉ số tin cậy cho từng

py

rig

ht

@

nhánh cây gọi là giá trị tin cậy (bootstrap), một nhánh chỉ được coi là có độ tin cậy
khi giá trị này đạt trên 70% [52]. Ưu điểm của phương pháp này là tốc độ tính toán
nhanh và được cho là khách quan nhất vì không đưa ra bất kì một giả định nào về
quá trình tiến hóa.
Phương pháp Hợp lý tối đa - Maximum Likelihood

Co

Đây là một phương pháp xác suất thuần túy thường được dùng để kiểm

chứng lại các cây tiến hóa đã xây dựng bởi các phương pháp khác. Phương pháp
này đánh giá một giả thiết tiến hóa bằng xây dựng tất cả các cây tiến hóa trên cơ sở
16


giả thiết đó rồi xác định cây tiến hóa nội suy là cây có xác suất xảy ra cao nhất qua

VN
U

việc phân tích các yếu tố tiến hóa. Chẳng hạn, về đại thể tần số đột biến đồng hoán
cao hơn khoảng 3 lần so với các đột biến dị hoán [10].

Đây được coi là phương pháp cung cấp thông tin chính xác và chi tiết hơn cả
so với các phương pháp khác. Nhưng thực tế, tốc độ xử lí thông tin theo phương

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

dP
ha
rm

ac
y,

pháp này chậm và không khả thi khi phân tích một lượng dữ liệu lớn. Phương pháp
này cũng cho ra cây tiến hóa có độ tin cậy khi giá trị độ tin cậy (bootstrap) đạt trên
70% ở mỗi nhánh.

17