Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất sulfat hóa từ pectin phân lập từ cây cúc quỳ tithonia diversifolia

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA HÓA

ĐẶNG THỊ THÁI THẢO

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP DẪN XUẤT SULFAT HÓA
TỪ PECTIN PHÂN LẬP TỪ CÂY CÚC QUỲ
TITHONIA DIVERSIFOLIA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CỬ NHÂN HÓA HỌC

Đà Nẵng, 2018


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA HÓA

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP DẪN XUẤT SULFAT HÓA
TỪ PECTIN PHÂN LẬP TỪ CÂY CÚC QUỲ
TITHONIA DIVERSIFOLIA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CỬ NHÂN HÓA HỌC

Sinh viên thực hiện:

ĐẶNG THỊ THÁI THẢO

Lớp:

14CHD

Giáo viên hƣớng dẫn:

TS. GIANG THỊ KIM LIÊN

Đà Nẵng, 2018


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐHSP

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

KHOA HÓA

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên:

Đặng Thị Thái Thảo

Lớp:

14CHD

1.

Tên đề tài: Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa từ pectin phân lập từ

cây cúc quỳ Tithonia Diversifolia
2.

Nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị:

-

Nguyên liệu: pectin phân lập từ cây cúc quỳ (TDP), Sulfuric acid, N-butanol.

-

Dụng cụ và thiết bị:



Cân kỹ thuật



Máy khuấy từ điều nhiệt



Phổ hồng ngoại được đo trên máy FT-IR Affinity-1S SHIMADZU tại Bộ

môn Hóa vô cơ – Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.


Phổ NMR của mẫu nghiên cứu được đo ở nhiệt độ 70ºC, với dung môi D2O,

trên máy Bruker AVANCE 500MHz tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, sử dụng D2O làm dung môi, DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane1-sulfonic acid) làm chất chuẩn nội. Với chế độ đo khử tín hiệu của nước..


Phép đo khối lượng phân tử GPC được thực hiện ở Phòng Thí Nghiệm Phân

tích Trung Tâm - ÐH Khoa học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, trên máy HPLC
Agilent 1100. Pha động 0.1N NaNO3, tốc độ dòng 1ml/phút. Đầu dò RID.


Cốc thủy tinh, các loại pipet, giấy lọc, túi thẩm tách, phễu lọc, máy ly tâm,

con khuấy, giấy chỉ thị, màng thẩm tách MWCO 14000...
3.

Nội dung nghiên cứu:


Bán tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa. Các sản phẩm sẽ được chứng minh cấu trúc bằng
các phương pháp phổ IR và NMR, khảo sát hoạt tính sinh học. Qua đó lựa chọn
được điều kiện và quy trình tối ưu cho quá trình bán tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa.
4.

Giáo viên hướng dẫn:

5.

Ngày giao đề tài: 3/2017

6.

Ngày hoàn thành: 3/2018

TS. Giang Thị Kim Liên

Chủ nhiệm Khoa

Giáo viên hướng dẫn

(Ký và ghi rõ họ, tên)

(Ký và ghi rõ họ, tên)

Sinh viên đã hoàn thành và nộp báo cáo cho Khoa ngày ….. tháng…..năm…..
Kết quả điểm đánh giá:
Ngày….tháng….năm….
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(Ký và ghi rõ họ, tên)


LỜI CẢM ƠN
Giá trị của đề tài là một phần công lao và sự giúp đỡ tận tình mà thầy cô đã
hết lòng truyền dạy cho em trong suốt 4 năm qua. Nhân dịp này em xin được gửi lời
cảm ơn chân thành nhất đến:
Quý thầy cô trong ban chủ nhiệm khoa Hóa trường Đại học Sư phạm Đà

Nẵng cùng toàn thể thầy cô trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng. Đặc biệt cô Giang
Thị Kim Liên và chị Bùi Vũ Thục Uyên, người đã hướng dẫn em hoàn thành khóa
luận này.
Trong thời gian tiến hành nghiên cứu nếu không có sự chỉ bảo tận tình của cô
và chị từ việc tìm tư liệu đến những lúc sửa chữa, bổ sung, động viên khích lệ tinh
thần cho chúng em thì đề tài đã không được hoàn thành như ngày hôm nay. Nhân
dịp này em xin trân trọng gửi đến cô và chị lời cảm ơn sâu sắc nhất.
Do kiến thức và kinh nghiệm còn hạn chế nên khóa luận không tránh khỏi
những thiếu sót. Vì vậy em xin ghi nhận và biết ơn những ý kiến đóng góp quý báu
từ quí Thầy, Cô và các bạn để đề tài được hoàn thiện và có ý nghĩa hơn.
Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc
gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106-NN.02-2013.49
Kính chúc quý thầy cô, các bạn lời chúc sức khỏe, lời cảm ơn chân thành
nhất!
Đà Nẵng, ngày tháng

năm 2018

Sinh viên thực hiện

Đặng Thị Thái Thảo


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài .................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu .............................................................................................. 2
3. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu ............................................................................. 2
4. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 2
4.1.

Thu thập tài liệu............................................................................................... 2

4.2.

Tiến hành thực nghiệm .................................................................................... 2

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................... 2
6. Bố cục khóa luận .................................................................................................... 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 4
1.1. Cây cúc quỳ ( Tithonia Diversifolia) ..................................................................... 4
1.1.1.

Đặc điểm hình thái ....................................................................................... 4

1.1.2.

Nguồn ngốc và phân bố ............................................................................... 4

1.1.3.

Khai thác sử dụng ........................................................................................ 5

1.2. Pectin ...................................................................................................................... 6
1.2.1.

Khái niệm ..................................................................................................... 6

1.2.2.

Cấu trúc ........................................................................................................ 6

1.2.3.

Ứng dụng ..................................................................................................... 8

1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ............................................................ 9
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 11
2.1. Nguyên liệu .......................................................................................................... 11
2.2. Hóa chất và thiết bị .............................................................................................. 12
2.3. Các phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 12
2.3.1.

Phương pháp bán tổng hợp hợp chất hữu cơ ............................................. 12

2.3.2.

Phương pháp tinh chế ................................................................................ 12

2.3.3.

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ ................... 14

2.3.4.

Phương pháp xác định hàm lượng Sulfate ................................................. 17

2.3.5.

Phương pháp khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ........................................ 18

2.4. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................................. 20


2.5. Quy trình tổng hợp ............................................................................................... 21
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................. 24
3.1. Xác định cấu trúc của dẫn xuất Sulfat hóa ........................................................... 24
3.1.1.

Sắc ký thẩm thấu gel GPC của dẫn xuất Sulfat hóa .................................. 24

3.1.2.

Phổ hồng ngoại FT-IR của dẫn xuất Sulfat hóa ......................................... 27

3.1.3.

Phổ 13C-NMR của dẫn xuất Sulfat hóa ...................................................... 28

3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của dẫn xuất ................................................................. 30
3.3. Xác định khả năng gây độc tế bào ung thư của dẫn xuất Sulfat hóa ................... 31
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 33
Kết luận ....................................................................................................................... 33
Kiến nghị..................................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 34


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Các ký hiệu
δ

:Dao động biến dạng

λ

:Bước sóng

Các chữ viết tắt
13

C-NMR

: Phổ cộng hưởng từ Cacbon-13

GPC

: Sắc ký gel

FT-IR

: Phổ hồng ngoại

1

: Phổ cộng hưởng từ proton

H-NMR

IC50

: Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50)

IR

: Phổ hồng ngoại

LDL

: Lipoprotein mật độ thấp

MKN7

: Tế bào ung thư dạ dày

MWCO

: Molecular Weight Cut Offs

NCI

: Viện Ung thư Quốc Gia Hoa Kỳ (Nation Cancer Institue)

TDP

: Pectin phân lập từ cây cúc quỳ Tithonia Diversifolia

TDP-S

: Dẫn xuất pectin Sulfat hóa

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Khối lượng phân tử của pectin và các dẫn suất Sulfat hóa và hàm lượng
Sulfat .............................................................................................................................. 26
Bảng 3.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư MKN7 của các mẫu TDP và TDP-S ........ 32


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây cúc quỳ (Tithonia diversifolia) ................................................................. 4
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử acid D- galacturonic ............................................................. 7
Hình 1.3. Các nhóm chức của pectin. .............................................................................. 7
Hình 1.4. Cấu trúc chung của pectin ................................................................................ 8
Hình 2.1. Pectin đã được phân lập và tinh chế ............................................................... 11
Hình 2.2. Màng thẩm tách MWCO 14000. .................................................................... 13
Hình 2.3. Quá trình thẩm tách mẫu. ............................................................................... 13
Hình 2.4. Mô hình hoạt động của máy đo quang phổ FT-IR ......................................... 15
Hình 2.5. Mô hình máy đo GPC .................................................................................... 17
Hình 2.6. Quy trình tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa từ pectin .......................................... 20
Hình 2.7. Hỗn hợp Sulfuric acid và n-butanol đã được chuẩn bị trong bể nước đá. ..... 21
Hình 2.8. Bộ thiết bị tổng hợp dẫn xuất pectin sulfat hóa ............................................. 21
Hình 2.9. Hỗn hợp sau khi cho pectin vào. .................................................................... 22
Hình 2.10. Dung dịch được kết tủa với Ethanol 95% .................................................... 22
Hình 2.11. Kết tủa tan trong nước .................................................................................. 23
Hình 2.12. Dung dịch cho vào màng thẩm tách ............................................................. 23
Hình 3.1. Sắc ký đồ thẩm thấu gel GPC của mẫu TDP ................................................ 24
Hình 3.2. Sắc ký đồ thẩm thấu gel GPC của mẫu TDP-S1 ............................................ 25
Hình 3.3. Sắc ký đồ thẩm thấu gel GPC của mẫu TDP-S2 ............................................ 25
Hình 3.4. Phổ FT-IR của mẫu TDP ............................................................................... 27
Hình 3.5. Phổ FT-IR của mẫu TDP-S1 .......................................................................... 27
Hình 3.6. Phổ FT-IR của mẫu TDP-S2 .......................................................................... 28

Hình 3.7. Phổ 13C-NMR của các mẫu TDP ................................................................... 29
Hình 3.8. Phổ 13C-NMR của các mẫu TDP-S ................................................................ 29
Hình 3.9. Khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin và các dẫn xuất Sulfat hóa .... 31


1

MỞ ĐẦU
1.

Lý do chọn đề tài
Cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật nói chung và Hóa học nói riêng,

trong đó Hóa học về tổng hợp các hợp chất hữu cơ ngày càng phát triển nhằm tạo ra
các hợp chất phục vụ đời sống con người.
Trước đây, khi ngành Hóa học hữu cơ phát triển và đạt được nhiều thành tựu
như tổng hợp được nhiều nhóm thuốc hóa học mới, có hiệu quả điều trị cao. Nhưng
chủ yếu là các thuốc tổng hợp hóa học toàn phần từ các nguyên liệu cơ bản có trong
than đá, dầu mỏ,…và nhiều thuốc này đã sinh ra nhiều tác dụng phụ độc hại cho cơ
thể. Vì thế, ngày nay việc nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên lại đóng vai trò vô
cùng quan trọng trong việc cung cấp các dược chất mới hoặc chất dẫn đường để tạo
ra dược chất mới.
Polysaccharide là một trong những cấu trúc chính của carbohydrate được tìm
thấy trong hệ thống sống. Polysaccharide được biết đến rộng rãi trong cộng đồng
khoa học là chất kích thích miễn dịch mạnh, là một chất phòng chống rất mạnh mẽ
khối u lành tính và ác tính, làm giảm cholesterol và chất béo trung tính, điều hòa
lượng đường trong máu, chữa lành vết thương, trẻ hóa làn da và có nhiều lợi ích
khác. Polysaccharide giúp tăng cường tác dụng của nhiều loại thuốc. Khi sử dụng
Polysaccharide, các tế bào miễn dịch trở nên chủ động hơn, mạnh hơn, hiệu quả
trong tấn công và tiêu diệt những gì xâm nhập vào cơ thể. Đặc biệt nó lại không gây

tác dụng phụ kể cả khi dùng ở liều cao.
Do đó, việc tìm kiếm các nguồn polysaccharide từ thực vật và các dẫn xuất
mới có hoạt tính sinh học hiện đang là vấn đề rất được quan tâm.
Gần đây sự biến đổi hóa học của nhiều polysaccharide bao gồm pectin đã cho
thấy các hoạt tính sinh học mới như chống đông máu, chống oxy hóa, kháng virus,
chống uốn ván. Trong số những biến đổi hóa học này, các nhóm hydroxyl dọc theo
cấu trúc của polysaccharide được thay bằng các nhóm Sulfat, được sử dụng để tăng
cường các đặc tính sinh học nội tại hoặc sinh ra các đặc tính mới như chống đông
máu và chống ung thư.


2

Khóa luận này tập trung giải quyết nội dung: “Nghiên cứu tổng hợp dẫn
xuất Sulfat hóa từ pectin phân lập từ cây cúc quỳ Tithonia Diversifolia”.
2.

Mục tiêu nghiên cứu
Bán tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa từ pectin phân lập từ cây cúc quỳ Tithonia

Diversifolia có hoạt tính gây độc tế bào. Tạo cơ sở khoa học để có thể đề xuất khả
năng ứng dụng và khai thác loài này phục vụ ngành y, dược, thực phẩm chức năng.
3.

Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu
Tổng hợp dẫn xuất pectin Sulfat hoá.
Các sản phẩm sẽ được chứng minh cấu trúc bằng các phương pháp phổ IR,

MS và NMR, hoạt tính sinh học xác định phương pháp thử độ độc tế bào in vitro
được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI).

4.

Nội dung nghiên cứu

4.1.

Thu thập tài liệu
Thu thập các tài liệu đã công bố trong nước và trên thế giới liên quan đến bán

tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa và hoạt tính sinh học của chúng.
Tổng quan các tài liệu về cây cúc quỳ Tithonia Diversifolia, pectin, và ứng
dụng.
4.2.

Tiến hành thực nghiệm
Trên cơ sở so sánh các phương pháp tổng hợp, dựa trên những khảo sát về các

tác nhân, điều kiện và hiệu suất phản ứng với những điều kiện khả thi về thiết bị,
phòng thí nghiệm chúng tôi đã lựa chọn phương pháp thích hợp để bán tổng hợp dẫn
xuất Sulfat hóa. Các sản phẩm sẽ được chứng minh cấu trúc bằng các phương pháp
phổ IR và NMR, khảo sát hoạt tính sinh học. Qua đó lựa chọn được điều kiện và quy
trình tối ưu cho quá trình bán tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa.
-

Tổng hợp các dẫn xuất Sulfat hóa của pectin.

-

Thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất tổng hợp được.

5.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Tổng hợp được hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguyên liệu là pectin được

phân lập từ câu cúc quỳ (Tithonia Diversifolia) tạo cơ sở cho việc ứng dụng vào thực
tế.


3

Đóng góp vào kho tàng hóa học các hợp chất thiên nhiên của Việt Nam nói
chung và thế giới nói riêng.
6.

Bố cục khóa luận

Khóa luận gồm trang; được bố cục như sau:
Mở đầu

03 trang

Chương 1. Tổng quan tài liệu

08 trang

Chương 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

13 trang

Chương 3. Kết quả và bàn luận

09 trang

Kết luận và kiến nghị

01 trang

Tài liệu tham khảo

02 trang


4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Cây cúc quỳ ( Tithonia Diversifolia)

1.1.1. Đặc điểm hình thái
Cây cúc quỳ hay còn gọi là dã quỳ, sơn quỳ, quỳ dại, hướng dương
dại, hướng

dương

Mexico, cúc

Nitobe

là

một

loài

thực

vật

trong họ

Cúc (Asteraceae), dạng cây bụi cao tới 1-2 m với thân cây mọc thẳng và đôi khi hóa
gỗ. Thân có lông sát, phân thành nhiều cành, lá thuôn, phiến có thùy, bìa có răng
nằm. Hoa ở đầu ngọn trên cuống dai. Hoa ở bìa hình môi lép, vàng tươi; hoa giữa
hình ống; giữa hoa có vảy cao 1cm, quả bế có 2 răng [18].

Hình 1.1. Cây cúc quỳ (Tithonia diversifolia)
1.1.2. Nguồn ngốc và phân bố
Cây có nguồn gốc từ Mehico hiện nay phân bố rộng khắp trong các khu vực
cận nhiệt đới và nhiệt đới, chẳng hạn như Trung Mỹ, Đông Nam Á và Châu Phi [1].
Ở Việt Nam, cây cúc quỳ hiện nay đã được tự nhiên hóa, mọc phổ biến ở rất nhiều
nơi, đặc biệt là ở vùng Tây Nguyên [15].


5

1.1.3. Khai thác sử dụng
Chính do bản thân cây phát triển một cách nhanh chóng cùng với giá trị dinh
dưỡng trong cây khá cao nên trong một thời gian ngắn cúc quỳ đã trở thành một cây

đa mục đích không chỉ trong trồng trọt mà còn ở cả trong chăn nuôi và y học.
Tại Nhật Bản, vào cuối thời kỳ Minh Trị, loài cây này được nhập khẩu như là
cây cảnh mặc dù nó đã từng được trồng tại đây, dù rất ít. Có vị đắng đặc trưng, nó
được sử dụng để gây sốt nhằm chống lại ngộ độc, mặc dù không được sử dụng cho
các mục đích y học trực tiếp. Người ta cho rằng loài này được Nitobe Inazo đưa vào
Nhật Bản, vì thế mà có tên gọi trong tiếng Nhật là cúc Nitobe. Tại Mexico, nó được
sử dụng để chữa bong gân, gãy xương, các vết thâm tím và các vết giập. Tại miền
nam Trung Quốc nó được sử dụng để chữa trị một số bệnh về da (như bệnh nấm bàn
chân), ra mồ hôi trộm ban đêm, cũng như trong vai trò của thuốc lợi tiểu, thuốc
nhuận gan, thuốc chữa bệnh vàng da và viêm bàng quang. Cúc quỳ được bán tại thị
trường thuốc thảo mộc ở Đài Loan như một loại trà để cải thiện chức năng gan. Tại
Việt Nam, cúc quỳ đã được người Pháp đưa vào các đồn điền ở Lâm Đồng. Nó được
trồng khi đó để làm phân xanh cho các vườn cà phê, cao su. Thân cúc quỳ chứa
nhiều chất P, Ca, Mg nên làm phân hữu cơ khá tốt. Nhờ hạt dễ phát tán, cây dễ trồng
nhờ giâm cành nên loài cây này dần dà chiếm lĩnh các nơi hoang dại ở khắp Tây
Nguyên. Tên cúc quỳ xuất hiện trên văn chương từ thập niên 1970, trước đó người ta
gọi nó là sơn quỳ. Cúc quỳ cũng đã được sử dụng làm biểu tượng chính cho lễ hội
hoa Đà Lạt tháng 12 năm 2005. Ở Việt Nam, cúc quỳ thường ra hoa vào mùa đông,
vàng rực cả triền đồi và thảo nguyên. Loài cây này có thể coi như là một loài cây báo
hiệu cho sự xuất hiện của mùa khô, khi hoa dã quỳ nở có nghĩa là mùa khô đã đến rất
gần. Lá của cây này còn sử dụng trong một bài thuốc dân gian để chữa bệnh ghẻ
[18].
Cúc quỳ đã được quan tâm nghiên cứu vì hàm lượng chất dinh dưỡng tương
đối cao được tìm thấy trong sinh khối của nó và nó có khả năng liên quan đến trích
xuất một lượng tương đối cao với đất.


6

1.2.

Pectin

1.2.1. Khái niệm
Pectin là một hợp chất tự nhiên có nhiều trong màng tế bào của các loài thực vật bậc
cao, phân bố chủ yếu ở các bộ phận như quả, củ, thân. Trong màng tế bào, pectin có
mặt ở phiến giữa (với hàm lượng cao nhất) và vách tế bào sơ cấp [7].
“Pectin” là một thuật ngữ để chỉ một nhóm các chất sau:
-

Protopectin: là pectin ở trạng thái tự nhiên (trong vách tế bào thực vật và

phiến giữa), mức độ methyl hóa rất cao, không hòa tan. Protopectin có nhiều trong
quả xanh.
-

Acid pectinic: mức độ methyl hóa trung bình, tan, muối là pectinate.

-

Pectin: mức độ methyl hóa trung bình, tan, bản chất là chất keo, có khả năng

tạo gel, tạo nhũ, tạo đặc và ổn định.
-

Acid pectic: mức độ methyl hóa rất thấp, tan, muối là pectate.

Người ta rất hay lẫn lộn giữa pectin và acid pectinic nên thật ra trong thực tế
“pectin” là tên gọi chung của cả hai chất này.
Pectin được đặc trưng bới các chỉ số sau:

-

Chỉ số methoxyl (MI): biểu hiện tỷ lệ methyl hóa, là % khối lượng nhóm

methoxyl ( -OCH3) trên tổng khối lượng.
Sự methyl hóa hoàn toàn ứng với chỉ số methoxyl bằng 16,3%, các pectin tách từ
thực vật thường có chỉ số methoxyl từ 10% đến 12%.
-

Chỉ số ester hóa (DE): thể hiện mức độ ester hóa của pectin, là % về số lượng

của các gốc acid galacturonic được ester hóa trên tổng số lượng gốc acid
galacturonic có trong phân tử.
1.2.2. Cấu trúc
Pectin có cấu trúc phức tạp, dạng mạch thẳng, mỗi phân tử chứa từ vài trăm
đến 1000 đơn vị, có phân tử lượng trung bình khoảng 50000 – 150000 đvC [4].
Pectin thương phẩm không có khối lượng phân tử xác định mà phụ thuộc vào
nguồn nguyên liệu, phương pháp trích ly và loại sản phẩm.


7

Phẩn tử đơn vị của pectin là acid D-galacturonic, ngoài ra còn có một số
đường trung tính như rhamnose, galactose, arabinose và một số đường khác với hàm
lượng ít hơn [5].
Các nhóm carboxyl (-COOH) có thể tồn tại tự do hoặc ở dạng liên kết ester
với methanol, acid acetic, acid phenolic hoặc ở dạng muối của Na+, K+, NH4+ ,…

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử acid D- galacturonic
Ở pectin amid hóa, một phần các gốc carboxyl trong phân tử pectin bị amid

hóa tạo thành các nhóm amid (-CO=NH2).
Ngoài ra pectin cũng có thể chứa các gốc acetyl.

Hình 1.3. Các nhóm chức của pectin.

Pectin là một polysaccharide, mạch thẳng, cấu tạo từ sự liên kết giữa các
mạch của phân tử acid D- galactoronic C6H10O7 , liên kết giữa với nhau bằng liên kết
1,4-glicozide và một trong số gốc acid có chứa nhóm thế metoxyl (-OCH3) [20].


8

Hình 1.4. Cấu trúc chung của pectin
Những năm gần đây, nhiều hoạt tính quý báu như hoạt tính chống ung thư, hạ
mỡ máu hay chống tiểu đường của các pectin được phân lập từ dịch chiết nước của
nhiều loài thực vật như cây hồng (Diospyros kaki), trà xanh (Camellia sinensis) đã
được công bố [9], [11].
1.2.3. Ứng dụng
Pectin là một loại chất xơ hòa tan trong nước, có tác dụng giảm cholesterol
trong máu bằng cách giảm lipoprotein mật độ thấp (LDL). Điều này sẽ giúp làm
giảm nguy cơ mắc bệnh xơ vữa động mạch và bệnh tim hiệu quả.
Pectin được xem như là một chất chống ung thư. Một nghiên cứu được công
bố trên tờ Glycobiogy của Mỹ năm ngoái đã chỉ ra, Pectin có thể làm chậm quá trình


9

phát triển của tế bào ung thư tuyến tiền liệt. Các nhà khoa học của trường Đại học
Georgia cũng phát hiện ra Pectin có khả năng tiêu diệt đến 40% tế bào ung thư. Các
nghiên cứu này cũng chỉ ra tỉ lệ thành công khi sử dụng Pectin trong việc điều trị ung

thư phổi và ung thư ruột kết.[19]
Pectin có khả năng chống chất độc hại, có thể giúp loại trừ kim loại nặng như
thủy ngân ra khỏi cơ thể, giảm nhiệm vụ đào thải độc tố cho gan.Pectin như một
phương pháp phòng ngừa cá nhân đối với nguy cơ nhiễm độc chì [22], một trong
những chất độc nguy hiểm nhất, nằm trong một nhóm nhiều các chất độc công
nghiệp, có thể gây ra nhiễm độc mãn tính do sự sử dụng rộng rãi trong một loạt các
ngành công nghiệp.
Bột pectin từ táo là nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên, một lực lượng đẩy lùi
gốc tự do rất hiệu quả. Không những thế, báo cáo từ một nghiên cứu năm 2007 đã
cho thấy tác dụng của các chất chống oxy hóa có trong bột pectin cực kỳ bền và còn
hữu hiệu hơn theo thời gian. Chống lão hóa da chỉ mới là một khía cạnh trong công
dụng của bột pectin táo. Thành phần này còn có tác dụng thay thế lớp tế bào da đã
chết bằng các tế bào mới trẻ, khỏe. Theo các nhà nghiên cứu đến từ đại học Paris
Decartes thì bột pectin táo không chỉ tẩy đi lớp da chết mà còn thúc đẩy quá trình tái
tạo tế bào mới để thế chỗ. Nguồn cung cấp tế bào mới ổn định sẽ giữ cho làn da của
bạn được cung cấp đủ nước, có độ đàn hồi và nhìn thật rạng rỡ [21].
1.3.

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
Hiện nay, nghiên cứu về polysaccharide nói chung và pectin nói riêng đang

thu hút sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học trên thế giới. Nhiều công trình về
pectin và các dẫn xuất của chúng từ nhiều loài thực vật khác nhau như chè xanh, lá
hồng,… đã được công bố.
Hướng nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của polysaccharide
Sulfat hóa đã và đang được các nhà khoa học trong nước quan tâm nghiên cứu
cập nhật theo xu hướng của các nước tiên tiến trên thế giới, bao gồm chiết tách,
thử hoạt tính, biến tính để tìm các sản phẩm có hoạt tính cao hơn hay nghiên cứu
mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính.

10

Có hai phương thức để thu polysaccharide Sulfat hóa là đi từ con đường
chiết tách các polysaccharide có sẵn gốc Sulfat trong phân tử từ tự nhiên (chủ yếu
từ rong biển) hoặc tổng hợp, biến tính tạo gốc Sulfat từ polysaccharide thông
thường.
Các Sulfat polysaccharide trong tự nhiên thường có trong các loại rong biển,
nấm và trong một số ít loài thực vật đã thu hút rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa
học. Các kết quả nghiên cứu cho thấy các Sulfat polysaccharide nhiều hoạt tính sinh
học rất đáng chú ý như hoạt tính chống oxi hóa, chống virus, kháng viêm, chống đông
máu, chống đông tụ tiểu cầu và chống ung thư…[12]. Trên cơ sở đó, các nghiên cứu
tạo dẫn xuất Sulfat polysaccharide qua con đường tổng hợp phát triển khá mạnh mẽ.
Do cấu trúc Sulfat hóa của polysaccharide có nhiều điểm tương đồng với heparin,
Sulfat polysaccharide có nguồn gốc từ động vật đang được sử dụng phổ biến làm chất
chống đông máu hiện nay, nên nhiều nghiên cứu tạo các dẫn xuất Sulfat
polysaccharide từ thực vật thường tập trung vào khả năng tăng cường hoạt tính chống
đông máu và chống đông tụ tiểu cầu [14]. Bên cạnh đó, nhiều công bố còn cho thấy
dẫn xuất Sulfat hóa thường tăng cường hoạt tính chống oxi hóa của các
polysaccharide. Năm 2015, Deng và cộng sự công bố nghiên cứu tạo dẫn xuất Sulfat
hóa từ polysaccharide phân lập từ Dictyophora indusiata. Dẫn xuất thu được thể hiện
hoạt tính chống oxi hóa và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao hơn hoạt tính của
polysaccharide ban đầu [8].
Ở Việt Nam, bên cạnh các nghiên cứu về Sulfat polysaccharide chiết xuất từ
rong biển [2], [3], cũng có các nghiên cứu theo hướng tổng hợp, tạo dẫn xuất Sulfat
hóa từ polysaccharide thông thường. Gần đây, nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Trần
Thị Vân Thi, Đại học Huế đã công bố nghiên cứu tạo dẫn xuất Sulfat của
polysaccharide phân lập từ lá cây mãng cầu xiêm. Các dẫn xuất thu được thể hiện khả
năng tăng cường hoạt tính chống oxi hóa so với polysaccharide ban đầu.
Như vậy, tổng quan về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về quá

trình tạo dẫn xuất Sulfat hóa của polysaccharide cho thấy quá trình Sulfat hóa hứa
hẹn có thể tăng cường hoạt tính sinh học của polysaccharide.


11

CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Nguyên liệu
Nguyên liệu để tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa gồm:

-

Pectin được phân lập từ cây cúc quỳ.
Kết quả phân lập và tinh chế pectin được kế thừa từ các nghiên cứu trước của

nhóm nghiên cứu theo quy trình như sau:
Các mẫu thực vật sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khô
ở nhiệt độ 40-450C, sau đó đem nghiền nhỏ. Mẫu sau khi sơ chế, xử lí được ngâm
chiết với etanol (1/2 ngày) x3 lần để loại bỏ chất béo, các chất hữu cơ phân tử lượng
thấp. Chất rắn sau ngâm chiết được sử dụng cho các bước phân tách tiếp theo
Mẫu thực vật sau khi loại bỏ chất béo và các chất hữu cơ phân tử lượng thấp
được đun với nước nóng trong 2-3 giờ. Các dung dịch được cô đặc bằng cách cô
đuổi dung môi. Pectin được kết tủa từ dung dịch cô đặc bằng etanol tỷ lệ 3:1. Tiếp
tục tiến hành ly tâm, lọc, sấy để thu được các pectin thô.
Quá trình tinh chế pectin bao gồm việc tách loại protein bằng phương pháp
Sevag. Các chất màu được tách loại bằng các chất hấp phụ như than hoạt tính, các
nhựa trao đổi ion. Pectin được tiếp tục được tinh chế qua màng thẩm tách...
Sau các quá trình ta thu được mẫu pectin, gọi là mẫu TDP.

Hình 2.1. Pectin đã đƣợc phân lập và tinh chế
-

Sulfuric acid

-

n-butanol


12

2.2.

Hóa chất và thiết bị

- Hóa chất: các hóa chất dùng trong quá trình tổng hợp được mua từ các hãng: Acros
Organics, Sigma Aldrich, Merck và hóa chất Trung Quốc.


Sulfuric acid



N- butanol



Ammonium sulfate



Sodium hydroxide



Ethanol 95%

- Thiết bị


Cân kỹ thuật



Máy khuấy từ điều nhiệt



Phổ hồng ngoại được đo trên máy FT-IR Affinity-1S SHIMADZU tại Bộ

môn Hóa vô cơ – Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.


Phổ NMR của mẫu nghiên cứu được đo ở nhiệt độ 70ºC, với dung môi D2O,

trên máy Bruker AVANCE 500MHz tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, sử dụng D2O làm dung môi, DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane1-sulfonic acid) làm chất chuẩn nội. Với chế độ đo khử tín hiệu của nước…


Phép đo khối lượng phân tử GPC được thực hiện ở Phòng Thí Nghiệm Phân

tích Trung Tâm - ÐH Khoa học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, trên máy HPLC
Agilent 1100. Pha động 0.1N NaNO3, tốc độ dòng 1ml/phút. Đầu dò RID.


Cốc thủy tinh, các loại pipet, giấy lọc, túi thẩm tách, phễu lọc, máy ly tâm,

con khuấy, giấy chỉ thị, màng thẩm tách MWCO 14000...
2.3.

Các phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp bán tổng hợp hợp chất hữu cơ
Các phản ứng hóa học được thực hiện theo các phương pháp thông dụng
trong các phòng thí nghiệm tổng hợp hữu cơ.
2.3.2. Phương pháp tinh chế
Hợp chất sau phản ứng được tinh chế bằng phương pháp thẩm tách.


13

Phương pháp này sử dụng túi thẩm tách ( Dialysis bag) MWCO 14000,
thường được làm bằng cellulose hoặc cellulose ester [16].

Hình 2.2. Màng thẩm tách MWCO 14000.
Nguyên tắc: phân tử lớn (chẳng hạn như tinh bột, protein hoặc một số các
polysaccharide) và các phân tử nhỏ (như glucose hoặc axit amin) có thể được tách ra
trong một dung dịch bằng sự khuếch tán chọn lọc thông qua một màng bán thấm.

Kích thước lỗ trên màng bán thẩm cho phép các phân tử nhỏ đi qua nó chuyển vào
dung dịch có nồng độ thấp hơn và giữ lại các hạt có kích thước keo trong túi thẩm
tách.

Hình 2.3. Quá trình thẩm tách mẫu.
Các màng thẩm tách được sản xuất dành cho các khối lượng phân tử khác
nhau dao động từ 1-1,000,000 kDa. MWCO (Molecular Weight Cut Offs) cho biết
số lượng và kích thước trung bình của các mao dẫn được tạo ra trong quá trình sản
xuất màng thẩm tách. MWCO đề cập đến khối lượng phân tử trung bình nhỏ nhất
của một phân tử chuẩn mà sẽ không khuếch tán qua màng khi thẩm tách. Do đó, một


14

màng thẩm tách với MWCO 10K sẽ giữ lại >90% protein có khối lượng phân tử ít
nhất 10000 Da [16].
Điều quan trọng cần lưu ý là MWCO của màng không hẳn cho ta kết quả
chính xác. Các phân tử có khối lượng gần MWCO của màng sẽ khuếch tán qua màng
chậm hơn các phân tử nhỏ hơn đáng kể so với MWCO. Để một phân tử nhanh chóng
khuếch tán qua màng, thường có khối lượng phân tử nhỏ hơn 20-50 lần so với
MWCO [16].
(Một proton hay neutron có khối lượng khoảng 1 dalton (Da), tương đương
với 1,7.10-24 gram ) [17].
2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ
Việc xác định cấu trúc hóa học của các chất tinh khiết được thực hiện thông
qua việc kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ
cộng hưởng từ hạt nhân một chiều như 13C-NMR.
Các chất tinh khiết sau khi được tổng hợp và tinh chế tiến hành ghi các phổ
như:
-

Phổ hồng ngoại (FT-IR) đối với chất rắn được đo dưới dạng viên nén

KBr, đối với chất lỏng được đo ở dạng màng mỏng (film).
Cùng với phương pháp phổ kích thích electron, phổ hồng ngoại là một trong
các phương pháp quang phổ hấp thu phân tử có rất nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh
vực nghiên cứu khác nhau. Phổ hấp thu hồng ngoại là là phổ dao động quay vì khi
hấp thu bức xạ hồng ngoại thì cả chuyển động dao động và chuyển động quay đều bị
kích thích. Bức xạ hồng ngoại có độ dài sóng từ 0,8 đến 1000µm và chia thành ba
vùng:


Cận hồng ngoại ( near infrared) λ = 0,8 - 2,5µm



Trung hồng ngoại ( medium infrared) λ = 2,5 - 50µm



Viễn hồng ngoại ( far infrared) λ = 50 - 1000µm

Trong thực tế, phổ hồng ngoại thường được ghi với trục tung biểu diễn T%,
trục hoành biểu diễn số sóng với trị số giảm dần (4000 – 400cm-1).
Từ tần số của các vân phổ hấp thu cho phép kết luận sự có mặt của các nhóm
chức trong phân tử, nghĩa là số liệu hồng ngoại có thể giúp xác định cấu trúc phân tử


15

của chất nghiên cứu. Mức độ chính xác của việc xác định cấu trúc phụ thuộc rất lớn
vào độ tin cậy, chính xác của các tần số vân hấp thu trên phổ hồng ngoại [6].
Thiết bị đo phổ IR hiện đại và phổ biến hiện nay là máy đo phổ kế IR biến đổi
Fourier ( FTIR). Nguyên tắc hoạt động của máy như sau:
Nguồn sáng đi qua giao thoa kế gồm gương phẳng di động G1, gương cố định
G2 và một tấm kính phân tách ánh sáng S. Ánh sáng từ nguồn chiếu vào tấm kính S
tách làm hai phần bằng nhau, chiếu vào G1 và G2, sau đó phản xạ trở lại qua kính S,
một nửa trở về nguồn, còn một nửa chiếu qua mẫu đi đến detector. Do gương G1 di
động làm cho đoạn đường của tia sáng đi đến gương G2 rồi quay trở lại (gọi là sự
trễ). Sự trễ này đã làm ánh sáng sau khi giao thoa kế biến đổi từ tần số cao xuống tần
số thấp. Sau đó ánh sáng qua mẫu bị hấp thụ một phần rồi đi đến detector nhờ kỹ
thuật biến đổi Fourier nhận được một phổ IR.

Hình 2.4. Mô hình hoạt động của máy đo quang phổ FT-IR
-

Phổ NMR của mẫu nghiên cứu được đo ở nhiệt độ 70ºC, sử dụng D2O

làm dung môi, DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid) làm chất chuẩn nội.
Với chế độ đo khử tín hiệu của nước.
Phương pháp cộng hưởng từ thuộc nhóm phương pháp dựa vào sự khảo sát
tương tác của nguyên tử hay phân tử vật chất với từ trường, bao gồm phương pháp