Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men tạo đồ uống từ nhãn (dimocarpus logan)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
======

VŨ THỊ KIỀU OANH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ
TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN TẠO ĐỒ UỐNG
TỪ NHÃN (DIMOCARPUS LOGAN)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Hà Nội, 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
======

VŨ THỊ KIỀU OANH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ
TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN TẠO ĐỒ UỐNG
TỪ NHÃN (DIMOCARPUS LOGAN)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Người hướng dẫn khoa học

PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

Hà Nội, 2019


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian em thực hiện và hoàn thiện đề tài em đã nhận
được sự hướng dẫn và giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy cô, đặc biệt là quý
thầy cô khoa Sinh – KTNN. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin
được gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung đã hết
lòng hướng dẫn, dạy bảo em nhiều kiến thức quý báu giúp em hoàn thành đề
tài tốt nghiệp này. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo
trong trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 trong thời gian em học tập tại
trường đã tận tình giảng dạy cho em những kiến thức chuyên ngành giúp em
có nền tảng kiến thức để thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn
tới gia đình, bạn bè và người thân, những người luôn động viên, khích lệ em
trong suốt quá trình học tập nghiên cứu đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Vũ Thị Kiều Oanh


LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan những gì em viết trong khóa luận này đều là kết quả
nghiên cứu của cá nhân em. Tất cả những số liệu trong bảng biểu và hình
ảnh đều được thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, không có số

liệu sao chép hay bịa đặt. Trong đề tài, em có sử dụng một số dẫn liệu của
một số tác giả khác, em xin phép các tác giả được trích dẫn để bổ sung cho
khóa luận của mình. Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
.
Hà Nội, tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Vũ Thị Kiều Oanh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU............................................................................................................. 1
1. Lý do chọn đề tài............................................................................................. 1
2. Mục đích của nghiên cứu ................................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn......................................................................... 3
5. Điểm mới của đề tài ........................................................................................ 3
NỘI DUNG ......................................................................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4
1.1.Tổng quan về nước trái cây lên men ............................................................. 4
1.2. Tổng quan về cây nhãn ................................................................................ 5
1.2.1. Vị trí phân loại .......................................................................................... 5
1.2.2. Đặc tính mùa vụ, năng suất....................................................................... 7
1.2.3. Thành phần dinh dưỡng ............................................................................ 7
1.2.4. Ứng dụng................................................................................................... 8
1.3. Hệ vi sinh vật ............................................................................................... 8
1.3.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo của nấm men ............................................ 8
1.3.2. Sự sinh sản của nấm men .......................................................................... 9
1.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men ................................................ 9
1.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ .......................................................................... 10

1.4.2. Ảnh hưởng của pH .................................................................................. 10
1.4.3. Ảnh hưởng của hàm lượng men giống.................................................... 10
1.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước................................................ 10
1.5.1. Trên thế giới ............................................................................................ 10
1.5.2. Tại Việt Nam........................................................................................... 11
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................ 13
2.1. Đối tượng, thiết bị và hóa chất nghiên cứu ................................................ 13
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................. 13
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ................................................................................. 13


2.1.2.1. Thiết bị nghiên cứu .............................................................................. 13
2.1.2.2. Hóa chất................................................................................................ 13
2.1.3. Môi trường .............................................................................................. 14
2.1.3.1. Môi trường phân lập và giữ giống (g/l) (MT1).................................... 14
2.1.3.2. Môi trường nhân giống g l MT2 ..................................................... 14
2.1.3.3. Môi trường lên men g l MT3 .......................................................... 14
2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian................................................ 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................ 15
2.3.1. Phương pháp vi sinh................................................................................ 15
2.3.1.1. Phương pháp phân lập các chủng VSV................................................ 15
2.3.1.2 Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram với nấm men ..... 15
2.3.1.3. Xác định số lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đếm............. 16
2.3.1.4. Bảo quản chủng giống.......................................................................... 16
2.3.1.5. Phương pháp hoạt lực lên men............................................................. 17
2.3.1.6. Phương pháp hoạt hóa giống................................................................ 17
2.3.1.7. Phương pháp lên men........................................................................... 17
2.3.2. Phương pháp hóa sinh ............................................................................. 17
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến quá
trình lên men ........................................................................................... 18

2.3.3.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên men................. 18
2.3.3.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH.................................. 18
2.3.3.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng giống ................ 18
2.3.4. Phương pháp cảm quan ........................................................................... 18
2.3.5. Phương pháp thống kê toán học.............................................................. 21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.......................... 23
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo sản
phẩm đồ uống từ nhãn............................................................................... 23
3.1.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo sản phẩm đồ uống
từ nhãn..................................................................................................... 23


3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men tạo sản phẩm đồ
uống từ nhãn............................................................................................ 24
3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men tạo sản phẩm đồ uống từ
nhãn ........................................................................................................... 28
3.3. Ảnh hưởng của pH môi trường tới quá trình lên men tạo sản phẩm đồ
uống từ nhãn.............................................................................................. 30
3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng giống bổ sung tới quá trình lên men tạo sản
phẩm đồ uống từ nhãn............................................................................... 31
3.5. Lên men tạo sản phẩm đồ uống từ nhãn .................................................... 33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 36
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ATP

Adenozin triphotphat

CFU

Colony Forming Unit đơn vị hình thành khuẩn lạc

ĐBSH

Đồng bằng Sông Hồng

HL

Hàm lượng

Nxb

Nhà xuất bản

STT

Số thứ tự

S.cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

Tb

Tế bào

VSV

Vi sinh vật


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần hóa học của thịt nhãn ...................................................... 8
Bảng 2.2. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của sản phẩm.................... 19
Bảng 2.3. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu ................................................... 21
Bảng 2.4. Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm ......................... 21
Bảng 3.5. Hoạt lực lên men của chủng nấm men ............................................. 24
Bảng 3.6. Chất lượng cảm quan của các chủng nấm men ................................ 25
Bảng 3.7. Động thái sinh trưởng của chủng nấm men S.cerevisiae M2........... 27
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men tạo sản phẩm đồ
uống từ nhãn...................................................................................... 38
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men tạo sản phẩmđồ uống từ
nhãn................................................................................................... 38
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng giống bổ sung tới quá trình lên men
tạo sản phẩm đồ uống từ nhãn .......................................................... 38


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình ảnh cây nhãn......................................................................... 6
Hình 3.2. Chủng nấm men phân lập được trên môi trường thạch đĩa ........ 23

Hình 3.3. Chủng nấm men M1 và M2 trên môi trường thạch nghiêng ...... 24
Hình 3.4. Hình thái tế bào học của chủng nấm men M2 trên kính hiển vi
quang học (x1000 lần) ................................................................ 26
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men
tạo sản phẩm đồ uống từ nhãn .................................................... 28
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên số lượng tế bào trung bình ở các
mức nhiệt độ khác nhau .............................................................. 29
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men tạo
sản phẩm đồ uống từ nhãn .......................................................... 30
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên số lượng tế bào trung bình ở các
độ pH khác nhau ......................................................................... 31
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng giống bổ sung tới
quá trình lên men tạo sản phẩm đồ uống từ nhãn ....................... 32


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cùng với sự phát triển của các ngành khoa học kỹ thuật, ngành công
nghệ sinh học nói chung và công nghệ lên men nói riêng cũng không ngừng
phát triển và ngày càng có vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực của đời
sống kinh tế - xã hội. Theo đó, ngành sản xuất nước trái cây lên men cũng có
những bước phát triển mới: chất lượng ngày càng cao, số lượng ngày nhiều,
mẫu mã ngày càng đẹp, giá thành hợp lý phù hợp với nhu cầu của số đông
người tiêu dùng; đặc biệt là phụ nữ.
Việt Nam là nước có khí hậu khô nóng nên nhu cầu về nước giải khát
của người dân vô cùng lớn và đang chuyển dần từ loại nước giải khát pha chế
thủ công sang sử dụng nước giải khát được sản xuất từ trái cây. Tại Việt Nam,
bình quân người Việt tiêu thụ nước giải khát là trên 23 lít người năm và theo
Hiệp hội bia rượu - nước giải khát dự tính đến năm 2020 con số này sẽ tiếp
tục tăng trưởng mạnh mẽ, đạt khoảng 8,3 - 9,2 tỷ lít năm [18]. Theo dự đoán

của các nhà chiến lược, trong các loại nước giải khát được sản xuất từ trái cây
thì loại nước giải khát lên men từ trái cây được đánh giá là mặt hàng mạnh
trong tương lai. Chính vì vậy để đáp ứng nhu cầu thị trường và người tiêu
dùng các nhà khoa học đã nghiên cứu ra rất nhiều sản phẩm nước trái cây lên
men tự nhiên bổ dưỡng, có giá trị dinh dưỡng cao nhờ sự lên men của vi sinh
vật. Mặc dù hiện nay đã xuất hiện nhiều sản phẩm nước uống lên men từ
nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như ổi, vải, chanh leo, cam, dâu… nhưng
dòng sản phẩm giải khát lên men từ nhãn còn chưa có trên thị trường Việt
Nam.
Theo báo Nông nghiệp Việt Nam ngày 27 07 2018 , nhãn hiện là cây
ăn quả chủ lực tại các tỉnh miền Bắc, với tổng diện tích năm 2017 khoảng
39,5 nghìn ha chiếm 11% diện tích cây ăn quả miền Bắc , tập trung tại một
số tỉnh vùng Trung du miền núi phía Bắc và ĐBSH, trong đó hai tỉnh trồng
nhãn lớn nhất là Sơn La và Hưng Yên. Sản lượng nhãn cả nước gần đây có xu
hướng giảm nhẹ, nhưng biến động không lớn, duy trì ở mức 500 - 550 nghìn
tấn năm. Những năm gần đây, xu hướng tập trung thâm canh, tăng năng suất

1


chất lượng nhãn diễn ra rất mạnh. Nếu như năm 2005, tổng diện tích nhãn cả
nước lên tới 114 nghìn ha thì hiện nay chỉ còn khoảng 75 nghìn ha. Mặc dù
vậy, năng suất nhãn trung bình cả nước lại tăng từ 6,8 tấn ha năm 2005 lên
7,94 tấn ha năm 2017 . Một số ưu điểm nổi bật của cây nhãn có thể kể đến
như: dễ trồng, ít kén đất và mang lại nhiều giá trị; đặc biệt là cùi nhãn, vừa
được dùng làm thực phẩm đồng thời là một vị thuốc thường được dùng trong
Đông y chữa các chứng bệnh hay quên, thần kinh kém, suy nhược, hoảng
hốt, khó ngủ… . Vì vậy nước giải khát lên men từ nhãn là một sản phẩm đầy
tiềm năng trên thị trường trong và ngoài nước.
Để sản phẩm nước giải khát từ nhãn trước khi đến với người tiêu dùng

có chất lượng tốt thì cần phải tiến hành lên men tạo sản phẩm này trong điều
kiện môi trường thích hợp nhất. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên
cứu đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men
tạo đồ uống từ nhãn (Dimocarpus logan)”.
2. Mục đích của nghiên cứu
Xác định được ảnh hưởng của nhiệt độ, độ pH môi trường, hàm lượng
giống bổ sung tới quá trình lên men tạo sản phẩm giải khát từ nhãn. Lên men
tạo sản phẩm giải khát từ nhãn.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo
đồ uống thơm ngon, bổ dưỡng trên môi trường dịch nhãn (Dimocarpus
logan).
3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men tạo sản phẩm đồ uống từ
nhãn (Dimocarpus logan)
3.3. Ảnh hưởng của pH môi trường tới quá trình lên men tạo sản phẩm đồ
uống từ nhãn (Dimocarpus logan)
3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng giống bổ sung tới quá trình lên men tạo sản
phẩm đồ uống từ nhãn (Dimocarpus logan)
3.5. Lên men tạo sản phẩm đồ uống từ nhãn (Dimocarpus logan)

2


4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Dựa trên cơ chế của quá trình chuyển hóa từ đường thành rượu và
chuyển hóa từ rượu thành acid hữu cơ để tạo ra sản phẩm có hàm lượng rượu
thấp, có hương thơm và giá trị dinh dưỡng cao.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sử dụng dịch nhãn lên men tạo được đồ uống lên men mới, góp phần

làm đa dạng các loại sản phẩm nước trái cây lên men trên thị trường, đáp ứng
nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng. Tận dụng được nguồn nguyên
liệu rẻ, phổ biến lên men tạo đồ uống thơm ngon, có lợi cho sức khỏe con
người đồng thời giúp tạo công ăn việc làm và tăng thu nhập cho người nông
dân.
5. Điểm mới của đề tài
Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men tạo đồ
0

uống từ nhãn bao gồm: nhiệt độ thích hợp là khoảng 30 – 32 C; độ pH môi
trường là 4 - 4,5; hàm lượng giống bổ sung là 10%V cho chủng
Saccharomyces cerevisiae M2. Đưa ra được quy trình công nghệ lên men
tạo đồ uống từ nhãn.

3


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Tổng quan về nước trái cây lên men
Nước trái cây lên men là sản phẩm của quá trình lên men rượu chưa kết
thúc. Tùy vào nguyên liệu mà có các sản phẩm nước trái cây lên men khác
nhau như nước trái cây lên men táo, dứa, chuối, sơri, đào,…
Đặc điểm sản phẩm nước trái cây lên men: nồng chất hòa tan 7 – 9%),
0

độ chua 2 – 4 , nồng độ rượu thấp (3 – 8% thể tích , có ga có CO2 với hàm
lượng thấp: 3 – 4g/l), thời gian tàng trữ để ổn định chất lượng 3 – 6 tuần), sản
phẩm có mùi thơm nhẹ dễ uống [12].
Giá trị dinh dưỡng của nước trái cây lên men: So với các loại sirô quả

hiện nay thường bán trên thị trường thì nước trái cây lên men ngon và có tác
dụng giải nhiệt nhiều hơn. Ngon hơn vì CO2 thoát ra do phản ứng lên men sẽ
hòa tan vào nước giải khát, sau đó tác dụng với các chất hoặc nguyên tố có
trong thành phần của nước giải khát, tạo ra các este đơn giản và phức tạp nên
có mùi thơm và vị dịu hơn. Giải nhiệt tốt hơn khi uống nước giải khát có ga
thì CO2 sẽ bay hơi và thu nhiệt, do đó làm cho ta có cảm giác mát và khoan
khoái. Trong từ điển bách khoa về thực phẩm của Nga nói rằng: uống nước
trái cây lên men còn an toàn hơn cả uống nước và rất tốt cho sức khỏe, xua
tan mệt mỏi, tốt cho tiêu hóa, giúp tăng sức chịu đựng. Ngoài việc sử dụng để
giải khát, nước trái cây lên men còn rất tốt cho những người bị cảm, sốt hay bị
dị ứng mỏi mệt kinh niên, bệnh phù, giúp tăng sức đề kháng cơ thể, ngừa
bệnh khô da vào mùa đông do trong nước trái cây lên men có khá nhiều
khoáng và vitamin B, C) [12].
● Cơ sở khoa học cả quá trình lên men nước trái cây:
Lên men nước trái cây là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của
nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành etanol và CO2.
Lên men ethanol
Đầu tiên, đường cùng các chất dinh dưỡng khác của môi trường lên
men được hấp thụ trên bề mặt của tế bào nấm men, khuếch tán qua màng bán
4


thấm vào trong tế bào. Đường bị chuyển hóa qua một chuỗi phản ứng theo
con đường đường phân để tạo acid pyruvic, acid pyruvic bị decarboxyl dưới
tác dụng xúc tác của enzyme pyruvate decarboxylase tạo thành acetaldehyde
giải phóng CO2, acetaldehyde nhận H

+

từ NADH tạo ethanol.

Dihydroxyacetone phosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trình
đường phân, hợp chất này có thể chuyển hóa thành glycerol. Trong môi
trường pH acid, glycerol chỉ được tạo ra với hàm lượng nhỏ. Ngược lại, trong
môi trường pH kiềm lượng glycerol sinh ra tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ
trở thành một trong những sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men.
Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH acid:
C6H12O6 + 2ADP + 2Pi → 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP
Sự chuyển hóa đường hexose thành ethanol và khí CO2 diễn ra trong tế
bào chất của nấm men. Đây là quá trình trao đổi năng lượng cả nấm men
trong điều kiện kỵ khí. Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ được nấm men
thải vào môi trường lên men. Trong quá trình lên men ethanol, nhiều axit hữu
cơ được tạo thành The Moll, 1990 . Một số axit hữu cơ được sinh tổng hợp
từ chu trình krebs nếu như quá trình lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ
khí nghiêm ngặt, các axit hữu cơ chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lên
men là: axit citric, axit malic, axit acetic, axit lactic…
1.2. Tổng quan về cây nhãn
1.2.1. Vị trí phân loại
Cây nhãn có tên khoa học là Dimocarpus longan thuộc họ Bồ hòn
(Sapindaceae . Có nguồn gốc ở Ấn Độ, được trồng nhiều ở miền Nam Trung
Quốc, Thái Lan, Ấn Độ, Indonesia, và Việt Nam.

5


Hình 1.1. Hình ảnh cây nhãn
Các giống: Ở Việt Nam có 3 giống chính sau:
● Nhãn xuồng cơm vàng
Giống nhãn này có nguồn gốc ở Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu,
được trồng bằng hạt, cùi dày, màu hanh vàng, ráo nước, dòn, rất ngọt, được

thị trường ưa chuộng. Quả có dạng hình xuồng: lúc quả chưa chín gần cuống
có màu đỏ, khi chín vỏ quả nhãn có màu vàng da bò. Nhãn xuồng cơm vàng
thích hợp trên vùng đất cát; nếu trồng trên đất thịt hoặc sét nhẹ nên ghép trên
gốc ghép là giống tiêu da bò.
● Nhãn lồng Hưng Yên
Nhãn Hưng Yên có quả to, vỏ gai và dày, vàng sậm. Quả trên chùm
nhãn có kích thước đồng đều. Cùi nhãn dày và khô, mọng nước, hạt nhỏ. Vị
thơm ngọt như đường phèn. Đáy quả có hai dẻ cùi lồng xếp rất khít.
Hiện nay có một số dòng nhãn ưu tú:
- Dòng chín sớm: PHS99-1-1
- Dòng chín chính vụ: PHT99-1-2; PHT99-2-2; YB28; 2C
- Dòng chín muộn: PHM-1-1; PHM-2.1; HTM-1.
● Nhãn tiêu da bò

6


Có tên gọi khác là "nhãn quế", nguồn gốc từ Huế. Quả nhỏ, vỏ mỏng,
nhẵn và có màu nâu sáng vàng. Ở Việt Nam nhãn được trồng khá phổ biển
dọc theo suốt chiều dài của đất nước từ Bắc vào Nam. Do thu được hiệu quả
kinh tế cao, những năm gần đây diện tích trồng nhãn phát triển khá nhanh.
Tuy chưa có số liệu thống kê cụ thể, nhưng ước đoán hiện nay diện tích trồng
nhãn ở nước ta vào khoảng 70-80 ngàn ha, trong đó các tỉnh phía Nam chiếm
khoảng 2 3 trong tổng diện tích này.
1.2.2. Đặc tính mùa vụ, năng suất
Giống địa phương nhãn nước có đặc tính dễ trồng thích hợp với đất thịt
pha cát và cho năng suất cao, mỗi năm thường có 1 vụ vào khoảng tháng 8
đến tháng 9. Một số giống nhãn khác như nhãn long, nhãn Vĩnh Châu có thể
cho 2 vụ một năm vào tháng 2 – 3 và tháng 8 – 9.
1.2.3. Thành phần dinh dưỡng

Nhãn là trái cây phổ biến của mùa hè ở một số quốc gia châu Á, có thể
ăn tươi hoặc sấy khô. Loại quả này có vị ngọt, dễ ăn và chứa nhiều dinh
dưỡng tốt cho sức khỏe. Nhãn rất giàu giá trị dinh dưỡng như protein, chất
béo, đường thiên nhiên, các loại vitamin và khoáng chất như: vitamin A, C,
B1, B2, kali, photpho, magie, sắt, axit hữu cơ, chất xơ…Trong quả nhãn chứa
hợp chất có khả năng làm chậm quá trình lão hóa ở con người [22].
Nhãn giúp tăng cường hàm lượng vitamin C trong cơ thể con người.
Trong thành phần của quả nhãn có chứa hàm lượng Vitamin C cao, chỉ cần
vài quả nhãn thôi cũng đã đủ cung cấp lượng Vitamin C đủ để hoạt động
trong 1 ngày. Cứ 100 gam nhãn có chứa đến 84 mg hàm lượng vitamin C và
con số này đủ cung cấp 100% nhu cầu vitamin C cần thiết hàng ngày cho nữ
và 93% nhu cầu cho nam giới. Trong thành phần của quả nhãn có chứa
Riboflavin, đây là một loại vitamin có tác dụng tích cực đối với mắt, nếu như
thiếu loại vitamin này rất dễ dẫn đến hiện tượng đục thủy tinh thể hay mờ
mắt…[22]
Thịt quả nhãn có thành phần hóa học được nêu trong bảng sau [10]:

7


Bảng 1.1. Thành phần hóa học của thịt nhãn
Thành phần

Giá trị

Nước %

70,0 – 80,0

Protein (%)

0,5 – 0,8

Gluxit (%)

19,0 – 21,0

Trong đó:
Đường %

12,4 – 20,6

Xenluloza (%)

0,12

Acid (%)

0,05 – 0,1

Tro (%)

0,40

Các chất muối khoáng mg 100g

19,2

VitaminC (mg/100g)

32,1

VitaminB (mg/100g)

0,12

VitaminPP (mg/100g)

1,91

Năng lượng Kj 100g

138,8

1.2.4. Ứng dụng
Cùi nhãn có thể ăn tươi, đông lạnh, đồ hộp, sấy khô, làm nước giải
khát, làm rượu.
Nhãn sấy khô làm long nhãn là thuốc bổ, thuốc an thần, điều trị suy
nhược thần kinh, chứng sút kém trí nhớ, mất ngủ hay hoảng hốt.
Hạt nhãn, vỏ quả nhãn dùng làm thuốc trong đông y. Nhãn là cây
nguồn mật quan trọng có chất lượng cao. Gỗ nhãn non có thể làm thức ăn gia
súc, hạt nhãn có thể làm hồ, chế rượu…[22]
1.3. Hệ vi sinh vật
1.3.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo của nấm men

8


Nấm men thuộc nhóm sinh vật nhân chuẩn đơn bào, tế bào nấm men có
thành phần và cấu tạo khá phức tạp gồm thành tế bào, màng nguyên sinh chất,

tế báo chất, ty thể, riboxom, nhân, không bào và các hạt dự trữ…[3]
Cấu tạo chủ yếu của tế bào nấm men là hemicellulose chiếm 70% trọng
lượng khô trong đó 31% manman, 29% glucan ngoài ra còn chưa 1-3%
kitin, 6-10% protein, 8-8,5% lipid, 7% khoáng.
Hình thái tế bào: thường có dạng hình cầu, hình trụ, elip, ovan…, và có
kích thước rất lớn gấp từ 5-10 lần tế bào vi khuẩn. Chiều dài trung bình từ 910 µm, chiều rộng trung bình từ 2-7 µm. Ở mỗi loài, mỗi lứa tuổi và điều kiện
nuôi cấy khác nhau chúng có hình dạng và kích thước khác nhau [3].
Có rất nhiều cách phân loại,nấm men chủ yếu gồm hai lớp là nấm men
thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungiim porfecti)
+ Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công
nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Sacccharomyces; giống
Schizosaccharomyces giống Endomyces.
+ Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti) gồm: Crytococus (toscula
tornlopsis); Mycoderma; Candida; Rhodotorula.
Khi cấy nấm men vào môi trường dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm
men tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều cho
đến khi cơ chất của môi trường giảm đến mức thấp nhất thì quá trình sinh
trưởng phát triển của chúng chậm và ngừng hẳn. Các nấm men sinh sản bằng
phương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh khối rất lớn sau một thời gian
ngắn. Tế bào sẽ già đi khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế bào không
còn khả năng sinh sản nữa. Tuy nhiên đa số nấm men sinh sản bằng phương
pháp nảy chồi nên hiện tượng phát hiện tế bào già rất rõ.
1.3.2. Sự sinh sản của nấm men
Một số hình thức sinh sản của nấm men là nảy chồi, phân đôi, sinh sản
bằng bào tử và hình thành bào tử tiếp hợp đẳng giao, tiếp hợp dị giao, sinh
sản đơn tính [3].
1.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men
9

1.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ lên men, độ cồn đạt được và ảnh
hưởng trực tiếp đến hoạt động của nấm men [18]:
0

Nếu nhiệt độ < 10 C, hầu như không diễn ra quá trình lên men. Nhưng
0

nếu nhiệt độ < 20 C thì quá trình lên men lại diễn ra chậm, độ rượu tạo thành
thấp.
0

Nhiệt độ ở 35 C: quá trình lên men sẽ tạo ra nhiều chất bất lợi và gây
độc cho nấm men.
0

Nhiệt độ > 35 C: quá trình lên men dừng lại, lượng đường còn sót cao,
tạo điều kiện cho vi khuẩn hoạt động đặc biệt là vi khuẩn sinh khí chuyển hóa
đường thành acid acetic gây chua, làm giảm chất lượng sản phẩm [8,13].
Ở nhiệt độ cao nấm men phát triển càng nhanh sẽ tiết ra nhiều chất phụ.
Trong suốt quá trình lên men nên giữ nhiệt độ ở mức ổn định do nhiệt
độ ảnh hưởng đến quá trình lên men và các chất hình thành.
1.4.2. Ảnh hưởng của pH
Độ pH có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. Nấm men có thể
phát triển trong môi trường pH từ 2 – 8 nhưng thích hợp nhất là từ 4 – 4,5.
Nếu pH = 8 thì nấm men phát triển rất kém còn vi khuẩn lại phát triển rất
mạnh. Vì thế trong quá trình lên men cần điều chỉnh pH phù hợp để nấm men
sinh trưởng và phát triển thuận lợi [17]. Trong sản xuất nước trái cây lên men
người ta thường sử dụng môi trường dịch quả có pH 3,5 – 5.
1.4.3. Ảnh hưởng của hàm lượng men giống

Hàm lượng giống bổ sung là một trong những yếu tố quan trọng ảnh
hưởng đến quá trình lên men: nếu hàm lượng quá nhiều sẽ gây cạnh tranh
dinh dưỡng ảnh hưởng tới quá trình lên men, ngược lại nếu hàm lượng giống
quá ít thì quá trình lên men sẽ diễn ra chậm.
1.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.5.1. Trên thế giới

10


Ngành sản xuất nước uống lên men đã có từ lâu đời và đang ngày
càng phát triển với tốc độ rất nhanh. Trong số các loại nước giải khát thì
đây được coi là mặt hàng chiến lược chủ yếu của thế kỷ XXI nên các quốc
gia như Mỹ, Hà Lan, Trung Quốc, Nhật, Đức…đã và đang tập trung nghiên
cứu và sản xuất các loại nước uống lên men từ nhiều loại trái cây khác nhau
như táo, dứa, chanh leo, mơ, xoài… có chất lượng rất cao đáp ứng được
nhu cầu ngày càng cao của con người. Đối với những người tiêu dùng ở các
nước châu Âu và Mĩ do có thói quen ăn thịt, ít ăn rau đặc biệt là trẻ nhỏ nên
nhu cầu sử dụng các loại nước trái cây và rau củ thơm ngon, bổ dưỡng
ngày càng tăng làm cho thị trường nước trái cây ngày càng phát triển. Theo
thống kê, lượng nước giải khát trung bình người dân Mỹ tiêu thụ
216 lít năm, tiếp theo là Ireland và Na Uy. Tính riêng việc tiêu thụ nước ép
trái cây, đứng đầu là người dân Canada với 52,5 lít người năm, kế đến là
Mỹ và Đức. 10 thị trường dẫn đầu là Mỹ, Nhật, Trung Quốc, Brazil, Đức,
Mexico, Anh, Italy, Tây Ban Nha và Pháp với con số 2 3 doanh số toàn
cầu, tuy dân số chỉ ở mức 1 3 [23]. Và theo dự đoán của các nhà chiến
lược, trong các loại nước giải khát được sản xuất từ trái cây thì loại nước
giải khát lên men được đánh giá là mặt hàng “mạnh” trong tương lai vì đây
là sản phẩm được đánh giá có giá trị dinh dưỡng cao nhờ quá trình lên men
của vi sinh vật và rất phù hợp với thế hệ trẻ.

Vào thế kỉ XVII, loại nước giải khát không gas không có CO 2 đầu
tiên xuất hiện với thành phần pha chế gồm nước lọc, chanh và một chút mật
ong. Đến năm 1767, một nhà hóa học người Anh là tiến sĩ Joseph Priestley
đã pha chế thành công loại nước giải khát có gas. Tuy nhiên, phải đến năm
1832 loại nước khoáng có gas mới trở nên phổ biến nhờ sự ra đời của hàng
loạt loại máy sản xuất nước có ga trên thị trường. Những thập niên sau đó
thị trường nước uống ngày càng phát triển [21].
1.5.2. Tại Việt Nam
Trong những năm gần đây thị trường nước giải khát tại Việt Nam có
tốc độ phát triển khá nhanh. Theo số liệu từ Bộ Công Thương 2010 , thị
trường nước giải khát không cồn tại Việt Nam chạm mốc tiêu thụ 2 tỷ lít, tức
bình quân mỗi người tiêu thụ khoảng 23 lít một năm. Mức tiêu thụ này tiếp
11


tục tăng trưởng 17% vào năm 2011 Nielsen, 2011 , và được dự đoán còn đầy
tiềm năng khi thu nhập của người dân ngày càng được cải thiện và phần lớn
chỉ tiêu đều dành cho việc ăn uống có lợi cho sức khỏe, và họ đang có xu
hướng chú trọng nhiều hơn đến sản phẩm thiên nhiên. Xu hướng này bắt
nguồn từ nguyên liệu trái cây dồi dào, phong phú quanh năm của nước ta và
thị hiếu người tiêu dùng.
Ở Việt Nam có khá nhiều công trình nghiên cứu tạo các sản phẩm đồ
uống lên men từ nguyên liệu tự nhiên như: vào năm 1984 Nguyễn Lân Dũng
và cộng sự đã có công trình nghiên cứu “Lựa chọn chủng nấm men và xây
dựng một quy trình mới sản xuất quả lên men BIEST1”[2], sau đó là các
nghiên cứu của các tác giả Trần Thanh Thủy 2003 , “Nghiên cứu sử dụng vi
sinh vật để lên men lactic đồ uống từ sắn”[20], Lê Cảnh Tuấn 2009
“Nghiên cứu quy trình sản xuất nước giải khát chanh dây lên men” [17].
Những năm gần đây có nhều công trình nghiên cứu về kombucha như
năm 2013, tác giả Lâm Thị Hồng Liên, trường đại học sư phạm Hà Nội 2 thực

hiện đề tài “Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà
Shan tuyết Hà Giang”, kết quả đã phân lập được 25 mẫu nấm men, từ đó định
loại sơ bộ 5 chủng nấm men là Sacharomyces M1; Sacharomyces M2;
Sacharomyces M3; Sacharomyces M4; Sacharomyces M5. Sau cùng tuyển
chọn 2 chủng nấm men M1 và M2 phù hợp cho quá trình lên men kombucha
[6]. Tác giả Nguyễn Thị Minh 2016 đã nghiên cứu và tìm ra được với hàm
lượng đường glucoose là 100 g l , NH4SO4 là 2 g l và MgSO4.7H2O là 1,5
g l thì thích hợp cho quá trình lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh, Vĩnh
Phúc [7].
Còn rất nhiều công trình khác nghiên cứu về đồ uống từ trái cây lên
men tuy nhiên có thể thấy, hiện nay trong nước chưa có công trình nghiên cứu
tạo sản phẩm đồ uống lên men từ nhãn cộng thêm việc nguồn nguyên liệu này
khá dồi dào và giàu chất dinh dưỡng nên việc nghiên cứu ảnh hưởng của một
số yếu tố đến quá trình lên men tạo đồ uống từ nguồn nguyên liệu này là rất
cần thiết.

12


CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, thiết bị và hóa chất nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
-

Quả nhãn
Bộ phận sử dụng: cùi nhãn
Nơi thu mẫu: phường Xuân Hòa, thị xã Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc
Nấm men phân lập được từ dịch nhãn.

2.1.2. Hóa chất và thiết bị
Các dụng cụ trong phòng thí nghiệm Vi Sinh thuộc khoa Sinh – KTNN,
trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.1.2.1. Thiết bị nghiên cứu
-

Tủ ấm, tủ sấy Binder Đức
Nồi hấp Tommy Nhật
Box vô trùng Haraeus
Cân Precisa XT 320M - Thụy Sĩ
Máy lắc Orbital Shakergallenkump Anh
Máy li tâm Sorvall Mỹ
Micropipet Jinson Pháp các loại từ 0.5μl – 10ml
Kính hiển vi quang học Carl Zeiss Đức
Tủ lạnh
Máy đo pH
Máy cất nước 2 lần Hamilton-Anh)
Hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, lamen, đèn cồn… và
nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.

2.1.2.2. Hóa chất
Hóa chất PTN Vi sinh vật khoa Sinh-KTNN, Trường ĐHSP Hà Nội 2
cung cấp
- Nguồn cacbon: Glucose, fluctose, maltose, acid lactic

13


- Nguồn nitơ: Nấm men, pepton, NH4)2SO4, dd NH3
- Nguồn muối khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4

- Thuốc nhuộm: Fucshin, Lugol, tím gentian, phenolphtalein…
- H2SO4,CaCO3, thạch Agar
2.1.3.

i trư ng

2.1.3.1. Môi trư ng phân lập và gi giống g l MT1
Glucose

: 50g

KH2PO4

: 3g

(NH4)2SO4

: 2g

MgSO4.7H2O : 2g
Thạch agar: 20g
Pepton

: 10g

Nước

: 1000ml

2.1.3.2. Môi trư ng nhân giống g l MT2

Glucose: 50g
KH2PO4: 3g
(NH4)2SO4: 2g
MgSO4.7H2O : 2g
Pepton
Nước

: 10g
: 1000ml

2.1.3.3. Môi trư ng lên men g l MT3
Dịch sirô nhãn: 200ml
Nước nhãn: 1000 ml
MgSO4.7H2O : 2g
KH2PO4: 3g
(NH4)2SO4: 2g
14


2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian
- Phạm vi nghiên cứu: Chủng nấm men Saccharomyces, tuyển chọn trên
đối tượng là quả nhãn thu từ chợ Đồng Xuân Xuân Hòa , thị xã Phúc Yên,
tỉnh Vĩnh Phúc.
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm vi sinh vật khoa Sinh-KTNN, Trường
ĐHSP Hà Nội 2
- Thời gian: Từ ngày 10 8 2018 đến tháng 5 2019 trừ khoảng thời gian
thực tập sư phạm
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp vi sinh
2.3.1.1. Phương pháp phân lập các chủng VSV

Môi trường để tuyển chọn các khuẩn lạc nấm men là môi trường
Hanxen.
Cách làm:
●
Môi trường phân lập được khử trùng và được phân bố vào các
hộp vô trùng peptri để nguội theo phương pháp Pasteur.
-1
-10
●
Dịch nhãn được pha loãng từ 10 – 10 bằng nước cất. Dùng
-5

-7

pipet đã vô trùng nhỏ 1,2 giọt huyền phù với độ pha loãng từ 10 – 10 lên bề
mặt thạch rồi dùng que chang vô trùng dàn đều.
●
Đặt ngược các hộp petri xuống, dùng giấy báo gói lại và nuôi
0

trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 28 – 30 C trong 3 ngày. Sau 3 ngày trên bề mặt
thạch sẽ xuất hiện các khuẩn lạc [5].
2.3.1.2 Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram với nấm men
Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng có khả năng lên men
nước trái cây làm vết bôi trên lam kính nhuộm tế bào theo phương pháp
nhuộm Gram. Sau đó soi tiêu bản dưới kính dầu và kính hiển vi quang học ở
độ phóng đại 1000 lần.
Với nấm men: chỉ cần nhuộm bằng fucshin từ 1- 2p sau đó rửa bằng
nước cất chờ khô rồi lên kính.

15