NGHIÊN cứu CHẾ tạo PHỨC hệ GEL AGAROSE CURDLAN MANG THUỐC ENTANERCEPT ức CHẾ yếu tố HOẠI tử KHỐI u TNF α và THỬ NGHIỆM TRÊN đại THỰC bào RAW264 7

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Hữu Tuấn Dũng

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO PHỨC HỆ GEL AGAROSE-CURDLAN MANG
THUỐC ENTANERCEPT ỨC CHẾ YẾU TỐ HOẠI TỬ KHỐI U TNF-α VÀ
THỬ NGHIỆM TRÊN ĐẠI THỰC BÀO RAW264.7

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Hữu Tuấn Dũng

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO PHỨC HỆ GEL AGAROSE-CURDLAN MANG
THUỐC ENTANERCEPT ỨC CHẾ YẾU TỐ HOẠI TỬ KHỐI U TNF-α VÀ
THỬ NGHIỆM TRÊN ĐẠI THỰC BÀO RAW264.7

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số:

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Phạm Thị Thu Hường

Hà Nội – Năm 2018


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm
giúp đỡ, sự hỗ trợ và chỉ dẫn tận tình từ phí thầy cô, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè.
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòngng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Thị
Thu Hường đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá
trình thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ, tập thể nhóm nghiên cứu và các
bạn sinh viên tại phòng Sinh học Nano và Ứng dụng, phòng Protein tái tổ hợp thuộc
Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym & Protein của Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, những người đã giúp đỡ, động viên và khích
lệ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ; các thầy cô giáo trong
Bộ môn Hóa sinh học và các thầy cô thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học
Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã truyền đạt những kiến thức quý báu và tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.
Sau cùng, tôi muốn gửi tới gia đình, bạn bè lời cám ơn chân thành nhất vì đã
động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập vằ hoàn thành luận văn tốt nghiệp
này.
Tôi xin chân thành cám ơn!
Hà nội, ngày tháng năm 2019
Học viên
Nguyễn Hữu Tuấn Dũng

1

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 6
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN........................................................................................8
1. TNF-α trong các phản ứng viêm và viêm khớp dạng thấp.............................8
1.1.

Yếu tố hoại tử khối u TNF-α.......................................................................8

1.2.

TNF-α và bệnh viêm khớp dạng thấp........................................................9

3. Các phương pháp điều trị viêm khớp dạng thấp theo cơ chế trung hòa
TNF-α...................................................................................................................... 13
4. Vật liệu mang thuốc dạng nano......................................................................14
5. Thụ thể Dectin-1 và Curdlan..........................................................................16
6. Mô hình hoạt động của phức hệ và mục tiêu nghiên cứu..............................17
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................19
1. Vật liệu..............................................................................................................19
`Chế tạo phức hệ nano........................................................................................19
Dòng đại thực bào RAW264.7............................................................................19
2. Xây dựng quy trình chế tạo phức hệ dạng nano............................................19
3. Đánh giá các đặc tính vật lý, hóa học của phức hệ........................................20
3.1.

Phương pháp chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử..................................20

3.2.

Phương pháp tán xạ ánh sang động (DLS)..............................................21

3.3.

Phương pháp khố phổ hồng ngoại (FTIR)..............................................21

3.4.

Phương pháp đánh giá khả năng phân tán của phức hệ........................22

4. Đánh giá khả năng giải phóng thuốc và hiệu suất bao gói của phức hệ.......22
5. Phân tích hiệu quả sinh học của phức hệ lên tế bào nuôi cấy.......................23
5.1.

Phương pháp đánh giá biểu hiện Dectin-1..............................................23

5.2.

Phương pháp đánh giá độc tính tế bào sử dụng kit CCK-8...................24

5.3.

Phương pháp Boyden-Chamber...............................................................26

5.4.

Phương pháp ELISA.................................................................................27

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN................................................................28
1. Quy trình chế tạo phức hệ và các tính chất lý hóa của phức hệ...................28
1.1.

Quy trình chế tạo phức hệ........................................................................28

1.2.

Kích thước của phức hệ............................................................................29
2


1.3.

Phân bố kích thước của phức hệ..............................................................30

1.4.

Các thành phần hóa học của phức hệ......................................................31

4. Khả năng giải phóng thuốc và hiệu suất bao gói của phức hệ......................34
5. Khả năng phân tán của phức hệ.....................................................................35
6. Tác động sinh học của phức hệ lên tế bào......................................................36
6.1. Khả năng biểu hiện Dectin-1 của phức hệ trên các dòng tế bào nuôi
cấy. .................................................................................................................... 36
6.2. Ảnh hưởng của phức hệ lên khả năng sinh trưởng của các dòng tế
bào. .................................................................................................................... 37
6.3.

Tính hướng đích của phức hệ lên dòng đại thực bào RAW264.7...........39

6.4.

Khả năng trung hòa TNF-α của phức hệ.................................................44

KẾT LUẬN................................................................................................................. 49
KIẾN NGHỊ...............................................................................................................50
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................51

3


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1. Sự biểu hiện của TNF-α của đại thực bào thông qua thụ thể TLR4..................8
Hình 2. Khớp xương của người bệnh viêm khớp dạng thấp (bên phải) và khớp xương
của người bình thường (bên trái).................................................................................10
Hình 3. TNF-α và cơ chế tác động trong các phản ứng viêm.......................................11
Hình 4. Một số loại thuốc điều trị viêm khớp dạng thấp..............................................13
Hình 5. Thụ thể Dectin-1 và β-Glucan.........................................................................16
Hình 6. Mô hình hoạt động dự kiến của phức hệ nanogel mang thuốc ức chế yếu tố
hoại tử khối u TNF-α khi tương tác với đại thực bào...................................................17
Hình 7. Phản ứng của WTS-8 trong kit CCK-8 (Sigma) với tế bào sống.....................25
Hình 8. Quy trình chế tạo phức hệ...............................................................................28
Hình 9. Ảnh phức hệ dưới kính hiển vi điện tử (A) SEM, (B) TEM............................29
Hình 10. Phân bố kich thước của phức hệ theo mật độ (A), thể tích (B) và số
lượng (C)..................................................................................................................... 30
Hình 11. Kết quả đo khối phổ hồng ngoại hấp thụ (FTIR) của các mẫu: Đối chứng
Agarose (A); Đối chứng Curdlan (B); Mẫu phức hệ ACE (C).....................................32
Hình 12. Hàm lượng entanercept được giải phóng ra khỏi phức hệ theo thời gian......34
Hình 13. Khả năng phân tán của phức hệ nano gel trong dung dịch PBS pH 7.4 ở các
nồng độ khác nhau.......................................................................................................35
Hình 14. Biểu hiện Dectin-1 trên 2 dòng tế bào STO và RAW264.7...........................36

Hình 15. Ảnh hưởng của phức hệ lên khả năng sinh trưởng của tế bào.......................38
Hình 16. Tác dụng hướng đích của phức hệ ACE đối với dòng tế bào biểu hiện Dectin1 (RAW) và không biểu hiện Dectin-01 (STO); *P<0.05............................................39
Hình 17. Tế bào bị hấp dẫn và di chuyển xuống mặt đáy chamber..............................40
Hình 18. So sánh nồng độ TNF-α trong các mẫu dịch nuôi cấy tế bào (** P<0.01)....44

4


DANH MỤC CÁC TỪ NGỮ VIẾT TẮT
ACE: Phức hệ Agarose-Curdlan mang thuốc ức chế hoại tử khối u TNF-α
AC: Phức hệ Agarose-Curdlan không mang thuốc.
A: Hạt nano Agarose.
C: Hạt nano Curdlan.
ETA: Entanercept.
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium.
FBS: Fetal Bovine Serum.
PBS: Phosphate Saline Buffer.
P/S: Pelicinlin and Streptomicin.
LPS: Lipopolisaccharide.
TNF-α: Tumor Necrosis Factor alpha.
cDNA: complement DNA.
mg: milligram.
ml: mililit.
nm: nanomet.

5


MỞ ĐẦU
TNF-α là một cytokine tiền viêm đóng vai trò then chốt trong cơ chế bệnh sinh

của bệnh viêm khớp dạng thấp. Cho đến nay, việc sử dụng Entanercept (ETA) trung
hòa TNF-α là phương pháp hiệu quả nhất cho việc điều trị căn bệnh này. Tuy nhiên,
việc sử dụng sản phẩm này cũng gây ra nhiều tác dụng phụ tới người bệnh do liều tiêm
cao và việc sử dụng kéo dài. Chính vì vậy, việc giảm liều lượng tiêm, số lần tiêm cũng
như kéo dài thời gian hiệu quả cho thuốc là rất cần thiết. Các vật liệu mang thuốc đã
được nghiên cứu nhằm mục đích này, tuy nhiên lại chưa có tính hướng đích. Tại các ổ
dịch khớp viêm các tế bào miễn dịch tập trung với số lượng rất lớn và biểu hiện lượng
Dectin-1 cao hơn rất nhiều lần so với bình thường. Dựa vào đây nhóm nghiên cứu đã
đưa ra ý tưởng sử dụng Curdlan với đặc trung là liên kết β-glucan – một phối tử mạnh
và đặc hiệu với Dectin-1 để tạo ra tính đặc hiệu cho vật liệu mang thuốc. Vật liệu
mang thuốc được đưa về kích thước nano nhằm tận dụng được các ưu điểm của kích
thước này mang lại như khả năng mang thuốc, tính thấm qua thành mạch và tăng khả
năng tương tác bề mặt.
Để đánh giá tác dụng sinh học của một sản phẩm phức hệ mang thuốc dạng
nano có nhiều đối tượng và cấp độ thực nghiệm như sử dụng thực nghiệm trên tế bào
động vật, động vật thực nghiệm hay trên người. Trong đó, biện pháp đánh giá tác dụng
sinh học trên tế bào là dễ triển khai, an toàn và có khả năng đánh giá được tác động
của sản phẩm lên một đối tượng tế bào nhất định, bước đầu đưa ra được các đặc tính
sinh học của phức hệ, từ đó củng cố cơ sở lý thuyết cơ bản, đưa ra bằng chứng thực
nghiệm và hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển phức hệ có tính ứng dụng
nhằm điều trị các bệnh lý nói chung. Trong khuôn khổ đề tài này đó là điều trị bệnh
viêm khớp dạng thấp. Dòng đại thực bào chuột RAW 264.7 là một dòng tế bào thương
mại dễ nuôi, phổ biến, biểu hiện mạnh các cytokines IL-6, IL-1β, IL-10, TNF-α…,
ngoài ra, dòng tế bào này cũng biểu hiện tốt thụ thể Dectin-1, một thụ thể được biểu
hiện nhiều ở các tế bào miễn dịch trong các ổ dịch Viêm khớp dạng thấp. Đại thực bào
RAW264.7 là một ứng cứ viên sáng giá cho mô hình thử nghiệm hoạt tính sinh học ở
cấp độ tế bào cho các sản phẩm điều trị bênh Viêm khớp dạng thấp.
6

Nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo phức hệ nanogel
Agarose-Curldan mang thuốc Etanercept ức chế yếu tố hoại tử u TNF-α và thử
nghiệm trên đại thực bào RAW 264.7” với mục đích chế tạo ra phức hệ mang thuốc
điều trị viêm khớp dạng thấp có kích thước nano và đánh giá các tác dụng sinh học cơ
bản của phức hệ trên mô hình tế bào.

7


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1. TNF-α trong các phản ứng viêm và viêm khớp dạng thấp.
1.1. Yếu tố hoại tử khối u TNF-α.
Yếu tố hoại tử khối u TNF-α là một cytokine tự tiết được sản xuất nhiều bởi
các tế bào miễn dịch đặc biện là Đại thực bào, tế bào bạch cầu, ngoài ra tế bào này còn
được sản xuất bởi các lympho, nguyên bào sợi…. Các thụ thể TNF-α có mặt trên hầu
hết các tế bào, hai thụ thể màng tế bào đã được xác định và nhân bản là thụ thể hoại tử
khối u 1 (TNF-R1) và thụ thể hoại tử khối u 2 (TNF-R2). Cả hai thụ thể này là các
protein màng tế bào tiêu biểu có cấu trúc khá giống nhau và một miền xuyên màng
duy nhất. Cả hai thụ thể đều có khả năng bắt cặp với các dạng liên kết màng và hòa tan
của TNF-α [1].
TNF được cho là được tổng hợ chủ yếu bởi đại thực bào, nhưng tín hiệu này
cũng được tạo ra bởi nhiều loại tế bào bao gồm tế bào bạch huyết, tế bào nội mô, tế
bào cơ tim, mô mỡ, nguyên bào sợi và tế bào thần kinh... Một lượng lớn TNF được
giải phóng để đáp ứng với lipopolysaccharide, các sản phẩm vi khuẩn khác, và
Interleukin-1 (IL-1). Trong cơ thể, đại thực bào là nguồn chủ yếu của TNF được hình
thành trước, có thể được giải phóng khi có mặt yếu tố kích thích viêm (ví dụ như LPS)
[2].

Hình 1. Sự biểu hiện của TNF-α của đại thực bào thông qua
thụ thể TLR4

8


Trên đại thực bào, thụ thể TLR- 4 biểu hiện trong các tế bào phản ứng miễn
dịch có thể nhận biết hiệu quả lipopolysacarit (LPS) và kích hoạt tín hiệu thông qua
một số phân cơ chế phân tử, ví dụ, yếu tố biệt hóa myeloid 88 (MyD88), Toll / IL-1 và
yếu tố liên quan đến thụ thể TNF 6 để kích hoạt các con đường NF-κB, MAP kinase và
JNK. Điều này lần lượt điều chỉnh tăng sự biểu hiện của các cytokine tiền viêm trong
đó có yếu tố hoại tử khối u (TNF) -α[3]. Với cơ chế này, nhóm nghiên cứu sử dụng
LPS để hoạt hóa sự biểu hiện TNF-α trên dòng đại thực bào chuột RAW264.7 để thực
hiện thí nghiệm kiểm tra khả năng trung hòa TNF-α.

1.2.

TNF-α và bệnh viêm khớp dạng thấp
Viêm khớp dạng thấp là căn bệnh tự miễn phổ biến nhất, biểu hiện của bệnh

là quá trình viêm không đặc hiệu xảy ra ở các vùng sụn khớp và đầu xương dưới sụn.
Quá trình biểu hiện viêm gây nên cảm giác đau khớp ở một bộ phận chi hay khắp cơ
thể, lâu dần người bệnh sẽ bị biến dạng khớp, dính khớp.[4] Triệu chứng bệnh có thể
phân biệt với các bệnh khớp khác thông qua triệu chứng viêm không đặc hiệu đối
xứng ở các vị trí trên cơ thể, diễn biến kéo dài tiến triển thành từng đợt, có xu hướng
tăng dần và thông qua một số xét nghiệm có thể chuẩn đoán được bệnh. Hiện nay các
nguyên nhân gây ra bệnh vẫn chưa rõ ràng, một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng
các yếu tố như vị trí địa lý, độ tuổi, giới tính, nhiễm trùng, stress, oxy hoá và khuynh
hướng di truyền được biết là có liên quan đến quá trình bênh sinh của viêm khớp dạng
thấp. Dẫn đến tổn thương sụn khớp, ăn mòn xương gây biến dạng khớp, dính khớp và
mất chức năng vận động của khớp. Bệnh này thường xuất hiện trong khoảng độ tuổi từ
35 đến 50 tuổi và gặp nhiều ở nữ giới hơn nam giới.[5]

9


Hình 2. Khớp xương của người bệnh viêm khớp dạng thấp (bên phải) và
khớp xương của người bình thường (bên trái)
Bệnh viêm khớp dạng thấp gây đau đớn kéo dài, sự khó vận động làm giảm
chất lượng sống của bệnh nhân và có thể gây nhiều biến chứng nguy hiểm khác. Các
tác động của bệnh viêm khớp dạng thấp lên bệnh nhân rất đa dạng và tiến triển theo

Hình 3. TNF-α và cơ chế tác động trong các phản ứng viêm
thời gian. Đầu tiên là tính đối xứng, người bệnh thường bị viêm ở 2 khớp đối xứng
10


nhau như ở hai đầu gối, hai ngón tay cùng vị trí ở hai bàn tay... Tiếp theo là hiện tượng
cứng khớp, khó vận động sau khi khớp đi vào trạng thái nghỉ sau giấc ngủ hoặc làm
việc trong điều kiện ít vận động. Biểu hiện tiếp theo là đau khớp, nhất là các khớp nhỏ
như khớp bàn ngón tay, cổ tay, bàn ngón chân, cổ chân, triệu chứng có đặc điểm là
viêm đau, có thể sưng nhưng không đỏ lên. Bao giờ cũng có hiện tượng đau đối xứng
hai bên. Nếu bàn tay, bàn chân bị biến dạng sau một thời gian đau khớp thì có nghĩa là
bệnh đã đến giai đoạn nặng, lâu dần sẽ dẫn đến tình trạng dính, biến dạng khớp, gây
tàn phế thậm chí các biến chứng có thể gây tử vong. Hiện nay, chưa có phương pháp
điều trị dứt điểm cho bệnh viêm khớp dạng thấp, tình trạng bênh được kiểm soát bằng
một số phương pháp như phẫu thuật, tập luyện vật lý trị liệu, sử dụng một số loại thuốc
giảm đau, kháng viêm, kiểm soát các yếu tố nội tiết…Sự hiểu biết ngày càng tăng về
các cơ chế miễn dịch của viêm khớp dạng thấp đã dẫn đến sự phát triển khá nhiều
phương pháp trị liệu cũng như thuốc điều trị mới nhằm giảm tác động của bệnh tới
bệnh nhân và giảm nguy cơ tử vong.[4] Trong đó, phương pháp sử dụng thuốc điều
hòa yếu tố nội tiết đặc biệt là TNF-α cho thấy kết quả đặc hiệu và rõ rệt nhất trong các
phương pháp đã và đang được sử dụng hiện nay.[6]

TNF-α là một trong những cytokine chính gây viêm ở viêm khớp dạng thấp.
Các thụ thể TNF hoà tan được tìm thấy với nồng độ cao trong dịch khớp và
huyết thanh của bệnh nhân viêm khớp dạng thấp [7]. Là một tín hiệu tự tiết, TNF-α
gây ra hàng loạt các phản ứng viêm dây chuyền khác trong quá trình biểu hiện bệnh
viêm khớp dạng thấp. TNF-α đóng một vai trò chi phối trong quá trình bệnh sinh của
viêm khớp dạng thấp, quá trình nuôi cấy tế bào mô hoạt dịch tách từ những bệnh nhân
bị viêm khớp dạng thấp, việc ức chế khả năng kết hợp của TNF-α với các phối tử của
nó trên bề mặt các tế bào nuôi cấy làm giảm đáng kể sự tạo thành IL-1, IL-6, IL-8 và
GM-CSF.[8] Tế bào tiết TNF-α bên trong màng hoạt dịch làm kích thích quá trình tăng
sinh và tăng tiết các loại cytokines của tế bào T và tế bào, làm tăng sự biệt hóa tạo
thành khớp xương, kích thích quá trình tổng hợp IL-1, kích thích quá trình bạch cầu đa
nhân xâm nhập vào màng hoạt dịch, phân hủy collagen, prostaglandins gây ra hiện
tượng kết dính lại với nhau của tế bào nội mô. Kết quả của quá trình này là dẫn đến sự
biến dạng khớp, gây đau đớn và khó khăn trong quá trình vận động của bệnh nhân
viêm khớp dạng thấp. Các quá trình này còn được chứng minh là gây tổn thương mô
11


và các kết quả sinh lý trong điều kiện viêm mãn tính như trong các bệnhviêm khớp,
ngoài ra, các mao mạch cũng được tăng sinh tạo điều kiện cho quá trình xâm nhập của
các tế bào miễn dịch vào ổ hoạt dịch khiến quá trình viêm trầm trọng hơn theo thời
gian. Các loại tế bào tiết TNF-α kích hoạt các tế bào T CD4 tạo ra các cytokine như
IL-1, IL-6 và TNF α. TNF-α là một cytokine mạnh có liên quan đến phản ứng viêm và
đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu [7, 9-11]. Các bệnh nhân viêm khớp dạng thấp
thường có nồng độ TNF-α cao trong dịch khớp, tác nhân quan trọng trong bênh sinh
của viêm khớp dạng thấp và là một dấu hiệu nổi bật của bệnh [7]. Các nghiên cứu đã
chỉ ra rằng phương pháp trung hòa TNF-α tạo ra sự cân bằng cytokine cải thiện đáng
kể các biểu hiện viêm ở bệnh nhân viêm khớp dạng thấp sau khi điều trị với các chất
trung hòa TNF-α. Việc điều hòa tác động của cytokine này đã được đưa ra nhằm đánh
giá quá trình điều trị của bệnh nhân trong việc kiểm soát biểu hiện viêm nhằm đạt

được sự cân bằng nội môi [8].

12


2. Các phương pháp điều trị viêm khớp dạng thấp theo cơ chế trung hòa
TNF-α.

Để trung
tác động
củathuốc
TNF-α,
cótrị
khá
nhiều
sản dạng
phẩm thấp
đã được nghiên cứu
Hìnhhòa
4. Một
số loại
điều
viêm
khớp
như Adalimumab, Infliximab và Etanercept. Adalimumab là một sản phẩm protein tái
tổ hợp có khả năng liên kết tốt với TNF-α được tiêm dưới da và có thể được sử dụng
đơn lẻ hoặc kết hợp với methotrexate hoặc các thuốc giảm đau giảm đau khác
(DMARDs). Tuy nhiên, thuốc có một số tác dụng phụ hiếm gặp bao gồm các tác động
lên thần kinh hoặc tạo ra các khối u ác tính trên hệ thống bạch huyết [8]. Infliximab là
một kháng thể đa thành phần (25% từ chuột và 75% từ người) liên kết với ái lực cao

và đặc hiệu với TNF-α của con người. Sản phẩm này gây ra các phản ứng phụ phổ
biến bao gồm nhiễm trùng đường hô hấp trên, buồn nôn, nhức đầu, viêm xoang, phát
ban và ho. Phần "chuột" của infliximab có thể hoạt động như một thành phần sinh
miễn dịch, gây phản ứng dị ứng trong quá trình tiêm, truyền hoặc kích thích việc tạo ra
các kháng thể trung hòa gây ra sự giảm hiệu quả ngay sau khi được đưa vào cơ thể [8].
Etanercept (ETA) là một protein tái tổ hợp gồm hai thụ thể TNF-R2 kết hợp
với phần Fc của protein IgG1 ở người. Cấu trúc dimer của etanercept làm cho phân tử
này có ái lực với các TNF hòa tan gấp rất nhiều lần so với thụ thể TNF-R2 trong tự
nhiên, từ đó sản phẩm này có khả năng trung hòa rất tốt TNF-α. Tuy nhiên, sản phẩm
này vẫn có một số tác dụng phụ như gây ngứa, phát ban đỏ, thuốc được sử dụng với
liều lượng cao nên có thể gây khả năng suy tim, thuốc cũng có thời gian bán hủy khá
ngắn nên tác dụng của mỗi liệu trình không kéo dài [12]. Ngoài ra, một số nghiên cứu
đã chỉ ra rằng, chỉ một phẩn Entanercpet được tiêm vào ổ khớp viêm là có thể tồn tại
cũng như phát huy được khả năng trung hòa tại chỗ, ¾ lượng thuốc sẽ bị đưa đến cơ
13


quan khác gây ra các phản ứng phụ không mong muốn [13]. Chính vì vậy, một sản
phẩm có khả năng bao gói entanercept và giải phóng protein theo thời gian được nhóm
chúng em lựa chọn nghiên cứu nhằm hướng tới đưa ra phương pháp điều trị bệnh viêm
khớp dạng thấp trong tương lai.
3. Vật liệu mang thuốc dạng nano.
Nhằm có một giải pháp làm tăng cường thời gian bán hủy, kéo dài tác dụng và
giảm nồng độ Entanercept được đưa vào cơ thể nhằm mục đích điều trị viêm khớp
dạng thấp, nhóm nghiên cứu đã quyết đính sử dụng một nguyên mẫu phức hệ được cấu
thành từ các vật liệu polysachraride có kích thước nano. Như đã nêu trong phần tổng
quan 1, sản phẩm sẽ được chế tạo về dạng nano bằng phương pháp nghiền đồng thể
bằng còi siêu âm nhằm đạt hiệu suất chế tạo cao nhất cũng như dễ dàng thao tác và
làm chủ. Đã có nhiều nguyên mẫu phức hệ polysaccharide được đưa ra để bao gói
protein trong đó có cả Entanercept như của Wang và cộng sự (1997) [14], Erdemli và

cộng sự (2014)[15], tuy nhiên, các sản phẩm này lại chưa có khả năng hướng đích.
Trong nghiên cứu này, nhóm chúng em hướng tới nghiên cứu chế tạo sản phẩm phức
hệ từ 2 polisacharide là Agarose và Curdlan có kích thước nano và khả năng hướng
đích tới các dòng tế bào biểu hiện viêm trong ổ dịch viêm khớp dạng thấp.
Theo hầu hết định nghĩa của các nhà khoa học trong nước và trên thế giới, phức
hệ nano có nguồn gốc là các polimer tự nhiên đặc trưng bởi kích thước “nano” là các
vật thể được chế tạo từ các vật liệu khác nhau có hình dạng ống, hạt hình cầu, tinh thể
hoặc vô định hình có đường kính trung bình từ 10 dến 100 nanomet (nm). Tùy theo vật
liệu và phương pháp chế tạo, thành phần và loại thuốc được bao gói mà các phức hệ
này sẽ có tính chất vật lý, hóa học, tác dụng sinh học khác nhau như tính phân tán, thế
zeta, các thành phần hóa học đặc trưng, khả năng bao gói thuốc, thời gian giải phóng
thuốc, tác động của một phần hay toàn bộ phức hệ đến một đối tượng sinh học ở nhiều
cấp độ như phân tử, tế bào, cơ thể …[16]. Hạt nano polymer đã thu hút sự quan tâm
của nhiều nhóm nghiên cứu và đã được sử dụng trong một số lượng ngày càng tăng
của các lĩnh vực trong những thập kỷ qua. Nói chung, hai chiến lược chính được sử
dụng để chuẩn bị của họ: sự phân tán của các polyme được tạo sẵn và trùng hợp các
monome. Các kỹ thuật khác nhau có thể được sử dụng để sản xuất hạt nano polymer,
chẳng hạn như bốc hơi dung môi, tẩy muối, thẩm tách, công nghệ chất lỏng siêu tới
14


hạn, nhũ tương siêu nhỏ, nhũ tương nhỏ, nhũ tương bề mặt, và trùng hợp interfacial.
Sự lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào một số yếu tố, chẳng hạn như kích thước hạt,
phân bố kích thước hạt, diện tích ứng dụng, vv [17].
So sánh sự phát triển về sinh, y học hiện tại với thế kỷ trước, ta có thể thấy rõ
được sự tiến bộ trên rất nhiều phương diện. Y học hiện đại với sự kết hợp của quá trình
nghiên cứu liên ngành đã cải tiến vô số phương pháp điều trị bệnh cũ và đưa ra rất
nhiều phương pháp điều trị bệnh mới. Nhiều loại thuốc mới đã được phát triển nhằm
điều trị các bệnh lý phức tạp, làm tăng cường hoạt tính sinh học của các loại thuốc
cũng như giảm đáng kể các tác dụng phụ do thuốc gây nên cho bệnh nhân được điều

trị. Trong đó, đáng chú ý nhất là phương pháp bao gói thuốc trong các hợp chất
polymer tự nhiên tạo nên khả năng hướng đích cũng như kéo dài thời gian tồn tại và
hoạt động của các loại thuốc đặc biệt là các sản phẩm có hoạt tính sinh học [18, 19].
Các phương pháp bao gói thuốc ngày càng tiến bộ hơn nhờ sự tiến bộ vượt bậc về
khoa học kỹ thuật của nhân loại, đặc biệt với sự xuất hiện và phát triển mạnh mẽ của
công nghệ nano trong vài thập kỷ qua. Khi đạt được đến kích thước nano, các phức hệ
polymer tự nhiên không những giữ nguyên, tăng cường được các đặc tính sinh hóa học
sẵn có mà còn có thêm được các đặc tính mới nhờ quá trình thay đổi về diện tích và
điện tích bề mặt, thu nhỏ về kích thước và thay đổi về thể tích cũng như quá trình
tương tác với các yếu tố sinh học ở nhiều cấp độ như phân tử, tế bào, mô, cơ thể… Các
hạt có kích thước nano dễ dàng thấm qua các rào cản sinh học như da, thành mạch,
thành tế bào, màng tế bào cũng như di chuyển dễ dàng hơn trong các hệ mạch, giữ các
mô, tế bào và các bào quan nhờ đó sẽ không gây cản trở cho các quá trình vận chuyển,
trao đổi chất giữa các tế bào và các bộ phận trong cơ thể thông qua mạch máu, tế bào
chất, không gây các biến chứng nguy hiểm như các vật liệu có kích thước lớn gây ra.
Việc sử dụng kết hợp khả năng bao gói thuốc, tính thấm, khả năng di chuyển và khả
năng tương tác bề mặt mạnh mẽ của vật liệu polymer dạng nano với các thành phần có
tính hướng đích tốt như các thụ thể, các phối tử sẽ tạo ra các phức hệ có khả năng tìm
kiếm và điều trị các nguồn bệnh trong cơ thể một cách triệt để và kéo dài mà không
ảnh hưởng đến các tế bào, mô, cơ quan lành lân cận. Quá trình phát triển và sử dụng
các phức hệ nano là các sản phẩm bao gói thuốc đang được nghiên cứu phát triển và
ứng dụng rộng rãi. Những năm gần đây đã chứng kiến sự phát triển chưa từng có của
15


các nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ nano, ngày càng có nhiều sản
phẩm được phát triển dưới dạng nano nói chung cũng như như được áp dụng cho y học
nói riêng sẽ mang lại những tiến bộ đáng kể trong chẩn đoán và điều trị [19, 20].
4. Thụ thể Dectin-1 và Curdlan.

5. Thụ
Dectin-1
và kỳ
β-Glucan
PolysaccharidesHình
là một
nhómthể
hợp
chất cực
đa dạng của các polyme tự
nhiên với độ phức tạp khác nhau về cả cấu trúc và kích thước. Hiện có rất nhiều nhóm
poly saccharide khác nhau đang được con người khai thác và sử dụng phổ biến như
cellulose, tinh bột, chitin, agar… [21]. Có nhiều nguồn polysaccharides khác nhau như
động vật, thực vật, vi khuẩn. β-Glucan là một polysaccharides bao gồm các monomer
D-Glucose kết nối bằng liên kế glycosidic. Các hợp chất trong nhóm β-Glucan bao
gồm β-glucan mạch thẳng, mạch nhánh β-(1,3)glucan hoặc β-(1,6)glucan [22, 23].
Curdlan là hợp chất polymer tự nhiên mạch thẳng của đường glucose được tạo thành
từ các liên kết (1-3)-β-glucan và không có sự phân nhánh hoặc có các nhóm thế khác
được phát hiện lần đầu tiên năm 1966. Sự kém tan trong dung môi phân cực của
curdlan là do sự tồn tại của những vùng tinh thể liên kết hydro trong và ngoài phân tử
giống như trong chất (1,4) -β-glucan, cellulose. Tuy nhiên, cellulose không hòa tan
trong dung môi DMSO hoặc dung môi kiềm, trong khi curdlan, và các glucan vô định
hình khác cũng có liên kết (1,3) -β-glucans như paramylon, pachyman và callose hòa
tan trong DMSO và các dung môi kiềm. Các quan sát trực tiếp về cấu hình phân tử của
curdlan trong DMSO và trong dung dịch NaOH 5 mM lắng đọng trên bề mặt mica
bằng cách sử dụng chế độ cạo AFM cho thấy curdlan vẫn giữ được cấu trúc mạch
thẳng khi được hòa tan trong DMSO, nhưng khi được hòa tan trong dung dịch kiềm
yếu thì curdlan tạo cấu trúc micelles được tạo thành bởi ba đoạn mạch đơn xoắn lại
16

[23, 24]. Các đặc điểm này sẽ được sử dụng để đưa curdlan và phức hệ, cấu trúc
polymer (1,3)-β-glucan của curdlan sẽ giúp phức hệ liên kết được với các thụ thể
dectin-1 trên tế bào miễn dịch nhằm vận chuyển thuốc tới các tế bào này [25]. Từ đó,
có thể thấy vai trò của curdlan trong phức hệ vừa là vật liệu bao gói, vừa là thành phần
đem lại tính hướng đích cho phức hệ.
5. Mô hình hoạt động của phức hệ và mục tiêu nghiên cứu.

Hình 6. Mô hình hoạt động dự kiến của phức hệ nanogel mang thuốc ức chế yếu
tố hoại tử khối u TNF-α khi tương tác với đại thực bào
Sau khi được phân tán trở lại vào đệm sinh học phân cực phù hợp hoặc nước,
đường D-manitol sẽ bị hòa tan, phức hệ được giải phóng khỏi các tinh thể đường ra và
phân tán trở lại và dung dịch phân cực. Các thành phần polysaccharide có mặt trong
phức hệ sau khi được giải phóng khỏi cấu trúc tinh thể của đường D-manitol sẽ bắt đầu
hút nước và trương nở đưa phức hệ trở lại kích thước ban đầu và trạng thái hoạt động.
Lúc này, các liên kết β-glucan có mặt trong phức hệ bắt đầu tạo tín hiệu và liên kết với
các thụ thể dectin-1 trên các tế bao miễn dịch tại vị trí ổ viêm. β-glucan sẽ liên kết đặc
hiệu và chặt chẽ với thụ thể dectin-1trên bề mặt các tế bào miễn dịch khiến phức hệ
tập trung lại tại vị trí ổ viêm. Lúc này, cytokine TNF-α sẽ bị trung hòa bởi thành phần
Entanercept được giải phóng ra từ phức hệ, từ đó quá trình viêm của bệnh nhân viêm
17


khớp dạng thấp sẽ được giảm thiểu troing thời gian kéo dài hơn so với việc sử dụng
thuốc điều trị ENtanercept dạng tự do.
Ứng dụng công nghệ nano, nhóm nghiên cứu hướng tới chế tạo phức hệ mang thuốc
Entanercept có khả năng hướng đích tới các tế bào miễn dịch biểu hiện thụ thể Dectin1 trong ổ dịch Viêm khớp dạng thấp.
Đề tài nghiên cứu của nhóm bao gồm 2 mục tiêu chính bao gồm:
 Xây dựng được quy trình chế tạo phức hệ và đánh giá được một số tính chất vật
lý, hóa học, khả năng bao gói thuốc của phức hệ.

 Đánh giá được một số hiệu quả sinh học của phức hệ tạo được trên tế bào nuôi
cấy cụ thể là dòng đại thực bào RAW264.7.

18


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu.
`Chế tạo phức hệ nano.
Nguyên liệu chế tạo phức hệ bao gồm Agarose (Merk), Curdlan (một món quà
của giáo sư Sakurai) và Entanercept (ETA). Phức hệ được chế tạo tại 2 phòng thí
nghiệm là phóng thí nghiệm Sinh học Nano và ứng dụng – Hệ thống phòng thí nghiệm
trọng điểm, trường Đại học Khoa học tự nhiên và phòng thí nghiệm Công nghệ Vật liệu
– Khoa Vật lý, Trường Đại học Khoa học tự nhiên. Trong quá trình nghiên cứu nhóm
nghiên cứu có sử dụng các thiết bị, hóa chất, dụng cụ đạt chuẩn sinh học phân tử.
Phức hệ được kiểm tra về đặc tính vật lý, hóa học tại Viện Vật lý-Viện Hàn lâm
khoa học Việt Nam và Khoa Hóa học, Trường Đại khọc khoa học tự nhiên.
Dòng đại thực bào RAW264.7.
Dòng tế bào RAW 264.7 là dòng tế bào thương mại được sử dụng phổ biến nhất
trong các nghiên cứu y tế, có nguồn gốc từ một loại khối u bạch cầu cho vi khuẩn
Abelson MuLV gây ra dưới sự hỗ trợ của virus Moloney MuLV. Dòng tế bào này có
các đáp ứng miễn dịch đối với các ký sinh trùng, lipopolysaccharide (LPS) hoặc các
dẫn xuất Protein tách từ vi khuẩn lao [26]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy dòng tế
bào RAW264.7 biểu hiện mạnh dectin-1, là một thụ thể có phối tử là các liên kết có
phối tử là các liên kết β-glucan các thụ thể có cấu trúc tương đồng ở con người cũng
có chức năng giống với ở loài chuột. Thụ thể này có khả năng kết hợp với các cấu tử
có thành phần cấu trúc là các liên kết β-glucan kích thích đại thực bào sản xuất ra các
yếu tố gây viêm như yếu tố hoại tử khối u (TNF-α) và các interleukin [27].
Tế bào miễn dịch macrophages Raw264.7 sử dụng cho nghiên cứu được mua từ
trung tâm Riken, Nhật bản, được nuôi trong môi trường DMEM chứa 10% FBS, 1 %

penicillin/Streptomycin, và ủ ở nhiệt độ 37 °C trong tủ ổn nhiệt có cung cấp 5 % CO2.
2. Xây dựng quy trình chế tạo phức hệ dạng nano
Quy trình chế tạo phức hệ Agarose/Curdlan mang thuốc Entanercept trung hòa
TNF-α (ACE) ở dạng nano và kết tinh phức hệ trên bề mặt tinh thể đường D-manitol.
Quy trình bao gồm bước:

19


Bước 1: Hòa tan 20mg curdlan trong 2ml dung dịch đệm kiềm NaOH 0.05%, làm tan
30mg agarose trong 1ml nước cất ở nhiệt độ 90oC.
Bước 2: Trộn 2 dung dịch trên với tỷ lệ 700µl curdlan 1%/NaOH 0.05% và 300µl
agarose 3%, đưa toàn bộ hệ này về nhiệt độ phòng và chỉnh pH của hệ về 7.0. Lúc này
ta thu được hệ gel 2 thành phần đông đặc.
Bước 3: Đưa 40µl entanercept có nồng độ 25mg/ml và phức hệ gel 2 thành phần được
hình thành sau bước 2.
Bước 4: Cho toàn bộ phức hệ mang thuốc vào dung dịch paraphin liquid, bổ sung Span
80, tiến hành nghiền đồng thể phức hệ bằng còi siêu âm.
Bước 5: Ly tâm hệ nhũ tương, loại bỏ dầu paraphin liquid bằng cách hòa tan dầu này
trong dung môi phân cực n-Hexan.
Bước 6: Kết hợp hạt mang thuốc với tinh thể đường D-manitol trong điều kiện dung
môi n-Hexan, để hạt bay hơi tự nhiên trong điều kiện nhiệt độ phòng.
3. Đánh giá các đặc tính vật lý, hóa học của phức hệ
3.1. Phương pháp chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử.
Kính hiển vi điện tử quét (SEM)
Kính hiển vi điện tử quét –Scaning Electron Microscope (SEM) là một loại
kính hiển vi điện tử tạo ra hình ảnh của một mẫu bằng cách quét bề mặt bằng một chùm
electron tập trung. Các electron tương tác với các nguyên tử trong mẫu, tạo ra các tín
hiệu khác nhau chứa thông tin về địa hình bề mặt và thành phần của mẫu. Tia điện tử
được quét trong một mẫu quét raster, và vị trí của chùm tia được kết hợp với tín hiệu

phát hiện để tạo ra một hình ảnh. SEM có thể đạt được độ phân giải tốt hơn 1 nm.
Phức hệ được phân tán lại trong nước cất với nồng độ 10mg/ml, làm khô và đặt
trên lam kính thủy tinh, phức hệ được chụp bằng hệ thống kính hiển vi Nova nano
SEM của hãng FEI.
Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cho phép chụp ảnh trực tiếp hình ảnh của
mẫu. TEM là một công cụ mạnh mẽ để nghiên cứu tính chất của vật liệu trên quy mô hạt
nano. Trong nghiên cứu này của nhóm, TEM chủ yếu được sử dụng để tìm hiểu hình
20


ảnh của một đối tượng bằng cách ghi phân bố biên độ sóng không gian 2D trong mặt
phẳng ảnh và so sánh với hình ảnh của phức hệ trên kính hiển vi điện tử quét SEM.
Phức hệ sau khi được hình thành sẽ được phân tán lại trong dung dịch nước
cất với nồng độ 10mg/ml để làm mẫu chụp. Gắn mẫu chụp vào buồng chứa mẫu 12
mm, đánh dẫu bề mặt mẫu chụp, giá đỡ mẫu được gắn vào buồn chứa mẫu (FEI,
Quata). Đặt vạch bạch kim trên khu vực quan tâm để bảo vệ phần trên của mẫu và
đánh dấu vị trí của vùng đích, thực hiện lắng đọng i-on trên bề mặt Platinum. Cắt mẫu
ra từ hệ trên và nhấc mẫu ra bằng cách sử dụng Omniprobe. Loại bỏ một phần của
đỉnh của lưới điện để ngăn chặn sự tái định vị của đồng từ lưới khi xay mẫu bằng
chùm ion.
3.2.

Phương pháp tán xạ ánh sang động (DLS).

Phương pháp đo phức hệ bằng tán xạ ánh sáng động – Dynamic Light
Scatering (DLS) là một kỹ thuật trong vật lý có thể được sử dụng để xác định cấu hình
phân bố kích thước của các hạt nhỏ trong huyền phù hoặc polyme trong dung dịch.
Trong phạm vi của DLS, biến động thời gian thường được phân tích bằng phương tiện
của cường độ hoặc chức năng tương quan tự động photon (còn được gọi là quang phổ

tương quan photon hoặc tán xạ ánh sáng bán đàn hồi). Trong phân tích miền thời gian,
chức năng tự tương quan (ACF) thường phân rã bắt đầu từ thời gian trễ không, và
động lực nhanh hơn do các hạt nhỏ hơn dẫn đến sự suy giảm nhanh hơn của dấu vết
cường độ phân tán. Nó đã được chứng minh rằng cường độ ACF là phép biến đổi
Fourier của phổ công suất, và do đó các phép đo DLS có thể được thực hiện tốt như
nhau trong miền phổ. DLS cũng có thể được sử dụng để thăm dò hành vi của các chất
lỏng phức tạp cũng như độ phân tán của các dung dịch polymer.
Phức hệ sau khi làm khô được phân tán lại trong nước cất 2 lần với nồng độ
100mg/ml và đưa vào một cuvet thủy tinh và chụp bằng máy đo tán xạ ánh sáng DLS.
3.3.

Phương pháp khố phổ hồng ngoại (FTIR)

Quang phổ hồng ngoại biến đổi (FTIR) là một kỹ thuật được sử dụng để thu
được phổ hấp thụ hồng ngoại hoặc phát xạ chất rắn, lỏng hoặc khí. Một quang phổ kế
FTIR đồng thời thu thập dữ liệu có độ phân giải phổ cao trên một phạm vi phổ rộng.

21


Điều này tạo ra một lợi thế đáng kể so với một phổ kế phân tán, đo cường độ trên một
phạm vi hẹp của các bước sóng tại một thời điểm.
Hạt được phân tán trong các dung môi khác nhau, được kiểm tra thành phần
bằng máy phân tích phổ hồng ngoại FTIR tại bộ môn Hóa vô cơ, Khoa Hóa học, Đại
học khoa học tự nhiên.
3.4.

Phương pháp đánh giá khả năng phân tán của phức hệ.

Phức hệ khô được cân với khối lượng lần lượt là 1mg, 2mg, 4mg, 10mg, 15mg và

20mg sau đó được phân tán trong các ống chứa 1ml dung dịch Phosphate Saline
Buffer (PBS) 1x pH 7.4 và được ủ trong điều kiện nhiệt độ 37 oC mô phỏng quá trình
nuôi cấy tế bào trong thời gian 3 giờ và 24 giờ. Sau thời gian ủ, sản phẩm được đưa ra
đánh giá bằng mắt thường nhằm đưa ra kết luận về khả năng phân tán của phức hệ
theo nồng độ khác nhau nhằm đưa ra nồng độ cho các thực nghiệm tiếp theo.
4. Đánh giá khả năng giải phóng thuốc và hiệu suất bao gói của phức hệ.
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm
Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid
khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu tím có bước sống thấp thu
cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu
xanh dương và hấp thu cực đại ở mức cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bước
sóng 596 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein. Để xác định protein
trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết
được nồng độ. Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện
sau 2 phút và bền tới 1giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế
(Spectrophotometer) ta được ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng protein trong mẫu.
Thực hiện một đối chứng với PBS (Blank). Lấy giá trị ∆OD = ODX – ODO. Lượng
protein trong mẫu dung dịch đo được xác định bằng cách dựa vào đường chuẩn từ giá
trị ∆OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tương ứng trên trục hoành.
Phức hệ được phân tán lại trong dung dịch PBS 1x với nồng độ 100mg/ml, ly tâm
loại hạt, tiếp tục lặp lại việc phân tán và thu dịch theo các mốc thời gian nhất định.
Dịch thu được sẽ được đo hàm lượng protein bằng phương pháp BRADFORD để xác
định được nồng độ protein giải phóng theo thời gian. Nồng độ protein có mặt trong
22


dung dịch thu dược được tính dựa trên giá trị OD của đường chuẩn xây dựng bằng
cách đo các nồng độ BSA khác nhau.
5. Phân tích hiệu quả sinh học của phức hệ lên tế bào nuôi cấy.
5.1. Phương pháp đánh giá biểu hiện Dectin-1.

Phương pháp RT-PCR.
Tế bào RAW 264.7 được xử lí với 1 µg/ml LPS trong 24h nuôi cấy. RNA tổng số
của tế bào sau đó được tách bằng TRIzol (Invitrogen, USA). Nồng độ RNA thu được
được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở 260 và 280 nm.
RNA tổng số được phân lập từ mỗi mẫu, được sử dụng làm mẫu để tổng hợp
cDNA. Phản ứng phiên mã ngược từ RNA tổng số thành cDNA, sau đó cDNA được
khuếch đại trong phản ứng PCR. Các đoạn mồi PCR sau đây được Phusabiochem
(Việt nam) tổng hợp: Dectin-1, forward 5'-CAAGTGCTCTGCCTACCTAG-3', reverse
5'-CACCATCTTTATATTCTCACATAC-3' (sản phẩm là 2 đồng phân khác nhau, kích
thước sản phẩm là 700 và 795 bp). PCR cho beta-actin được thực hiện song song làm
nội chuẩn cho nồng độ cDNA trong mỗi bộ mẫu. Sản phẩm PCR được chạy điện di
trên gel argarose 2% và nhuộm với thuốc nhuộm Ethidium-Bromide để thu được hình
ảnh kết quả.
Phương pháp Western-Blot.
Phương pháp western blot là phương pháp sử dụng kết hợp điện di protein trong ma
trận gel polyacrylamide – bisacrylamide với ủ kháng thể đặc hiệu nhằm hiện màu trên
màng nitroceollulose. Sử dụng phương pháp này có thể định tính về sự có mặt của
từng loại protein một cách đặc hiệu.
Đệm chiết protein RIPA được sử dụng để tách protein từ các mẫu tế bào
RAW264.7, và STO. Pellet tế bào được ủ với đệm RIPA, sau đó sẽ được đóng băng ở
nhiệt độ -196oC và làm tan lại ở 37oC, quy trình này được lặp lại 5 lần nhằm phá hủy
hoàn toàn cấu trúc màng tế bào để thu được lượng protein tối đa. Sau khi đã hòa tan
được protein, các thành phần kết tủa sẽ được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm lạnh
với vận tốc 12000 vòng/phút trong thời gian 10 phút. Protein thu được sẽ được đo
nồng độ bằng máy Nanodrop one(Sigma) và xử lý với đệm nạp mẫu SBB5x(Sigma) ở
nhiệt độ 90oC trong thời gian 10 phút. Lượng protein được đưa vào các giếng chạy
23