Nghiên cứu sự hấp thụ thuốc diclofenac natri của vật liệu cenlulose tạo ra từ gluconacetoacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH –KTNN
===



===

NGUYỄN VÕ HÀ THU

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
TẠO RA TỪ GLUCONACETOACTER XYLINUS NUÔI
CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG NƢỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

HÀ NỘI, 2019


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH –KTNN
===



===

NGUYỄN VÕ HÀ THU

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
TẠO RA TỪ GLUCONACETOACTER XYLINUS NUÔI
CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG NƢỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

ThS. Phạm Thị Kim Dung

HÀ NỘI, 2019


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu Trƣờng Đại học
Sƣ phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa, các thầy, cô giáo trong Sinh –
KTNN, các thầy cô giáo ở Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng trƣờng Đại
học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong quá trình hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Th.S Phạm Thị Kim Dung
là ngƣời đã theo sát và hƣớng dẫn em trong quá trình hoàn hoàn thành khóa
luận tốt nghiệp.
Do lần đầu tiên làm nghiên cứu khoa học về mặt kiến thức em vẫn còn
nhiều hạn chế, nên việc thiếu sót là không thể tránh khỏi. Vì vậy em rất mong
sự góp ý của quý thầy, cô cũng nhƣ các bạn sinh viên để khóa luận cuả em
hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Võ Hà Thu


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi đƣợc
hƣớng dẫn bởi Th.S Phạm Thị Kim Dung. Những số liệu kết quả này là hoàn
toàn trung thực không trùng lặp với đề tài khác. Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn
trách nhiệm.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Võ Hà Thu


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU...........................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài...........................................................................................1
2. Mục đích nghiên cứu.....................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu.....................................................................................2
NỘI DUNG.......................................................................................................3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................... 3
1.1. Tổng quan về chủng vi khuẩn....................................................................3
1.1.1. Vị trí, phân loại của Gluconacetoacter xylinus....................................... 3
1.1.2. Đặc điểm của Gluconacetoacter xylinus.................................................3
1.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy Gluconacetoacter xylinus.....................................3
1.1.4. Đặc điểm cấu trúc màng tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus.................4
1.1.5. Tính độc đáo của màng cellulose vi khuẩn............................................. 4
1.1.6. Ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn..................................................5

1.2. Tổng quan về thuốc Diclofenac natri.........................................................5
1.2.1. Sơ lƣợc về thuốc Diclofenac natri..........................................................5
1.2.1.1. Công thức.............................................................................................5
1.2.1.2. Nguồn gốc và tính chất........................................................................ 6
1.2.1.3. Dƣợc động học và tác dụng.................................................................6
1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri.................7
1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri trên thế
giới.................................................................................................................... 7
1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri tại Việt
Nam...................................................................................................................7
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
9

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................9
2.1.1 Chủng vi khuẩn........................................................................................9
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................9
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ..................................................................................9
2.2. Phạm vi, nội dung nghiên cứu, địa điểm, thời gian nghiên cứu...............10


2.2.1. Phạm vi nghiên cứu...............................................................................10
2.2.2. Nội dung nghiên cứu.............................................................................10
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu.............................................................................10
2.2.4. Thời gian nghiên cứu............................................................................ 10
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.........................................................................10
2.3.1. Phƣơng pháp chế tạo vật liệu cellulose................................................10
2.3.1.1. Lên men thu vật liệu cenlulose từ môi trƣờng nƣớc vo gạo.............11
2.3.1.2. Xử lý vật liệu cenllulose trƣớc khi hấp thụ thuốc............................. 11
2.3.1.3. Đo độ dày màng.................................................................................12
2.3.1.4. Đánh giá độ tinh khiết của vật liệu màng cellulose........................... 12

2.3.2. Xây dựng đƣờng chuẩn........................................................................ 13
2.3.3. Xác định lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ vào vật liệu cellulose..................14
2.3.4. Phƣơng pháp xử lý thống kê.................................................................15
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................16
3.1. Kết quả tạo các loại vật liệu cellulose......................................................16
3.2. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của thuốc Diclofenac natri.......................... 18
3.3. Khối lƣợng thuốc Diclofenac natri hấp thu vào màng............................ 21
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................................23
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................24


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của thuốc Diclofenac natri.................................. 6
Hình 3.1. Màng dày 0,5 cm.............................................................................16
Hình 3.2. Màng nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc vo gạo..............................17
Hình 3.3. Màng dày 0,5 cm.............................................................................17
Hình 3.4. Màng tinh chế..................................................................................18
Hình 3.5. Màng gạo tinh khiết 0, 5 cm; d = 1,5 cm........................................ 18
Hình 3.6. Phƣơng trình đƣờng chuẩn Diclofenac natri OD = 283.................19
Hình 3.7. Rút mẫu đo 1 giờ.............................................................................20


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Môi trƣờng lên men tạo vật liệu cenlulose.....................................11
Bảng 3.1. Giá trị OD của màng sau các khoảng thời gian..............................20
Bảng 3.2. Lƣợng thuốc Diclofenac natri hấp thụ vào màng gạo sau 2 giờ....21
Bảng 3.3. Hiệu suất hấp thụ thuốc Diclofenac natri vào màng gạo sau 2 giờ..
22

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Màng cellulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus là một loại màng sinh
học đặc biệt có cấu trúc và đặc tính giống với cellulose ở thực vật. Tuy nhiên
màng cellulose vi khuẩn khác với màng cellulose thực vật ở: màng cellulose
vi khuẩn có đặc tính dẻo dai, bền chắc hơn màng cellulose thực vật do màng
cellulose vi khuẩn không chứa các hợp chất cao phân tử nhƣ: ligin, peptin,
sáp nến, [9]. … Cellulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus có một số tính
chất hóa lý đặc biệt nhƣ: độ bền cơ học, khả năng thấm hút nƣớc cao, đƣờng
kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ
ẩm ban đầu, ...Vì vậy, nó đƣợc ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực nhƣ: thực
phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, mỹ phẩm, y học, ... đáng chú ý nhất
trong sự kiểm soát các hệ thống vận chuyển thuốc [2]
Dùng màng cenlulose vi khuẩn làm môi trƣờng phân tách cho quá trình
xử lí nƣớc, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng cho tế
bào, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực
phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy [2]....
Trong lĩnh vực y học, màng cenlulose vi khuẩn đã đƣợc ứng dụng làm
da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, làm mạch máu nhân tạo,
điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng da cho con ngƣời. Ngoài ra
màng cenlulose vi khuẩn đã đƣợc sử dụng nhƣ trong một vài hệ thống để
phân phối thuốc, các sợi cellulose vi khuẩn có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống
vận chuyển và phân phối thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc, nó có thể
giúp thuốc không bị phá hủy trong môi trƣờng acid.
Trên thế giới đã có nhiều nghiên về màng cellulose vi khuẩn. Amin và
cộng sự đã nghiên cứu sử dụng màng cellulose vi khuẩn làm màng bọc cho
paracetamol bằng cách phun phủ. Kết quả cho thấy màng cellulose vi khuẩn
có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc chậm lại, làm tăng hiệu quả sử
dụng của thuốc[3]. Ở nƣớc ta việc nghiên cứu và ứng dụng của màng
cellulose vi khuẩn đang đƣợc quan tâm trong những năm gần đây. Năm 2006,

Nguyễn Văn Thanh đã nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose
1


trị bỏng từ vi khuẩn”. Kết quả cho thấy có thể chế tạo màng với quy mô công
nghiệp từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm.
Diclofenac, dẫn xuất của acid phenylacetic là thuốc chống viêm không
steroid. Diclofenac đƣợc dùng chủ yếu dƣới dạng muối natri. Thuốc có tác
dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh. [7]. Natri diclofenac có hoạt
tính chống viêm, giảm đau và hạ sốt do khả năng ức chế đặc hiệu enzym
cyclo- oxygenase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp prostaglandin,
prostacyclin, thromboxane... là các chất trung gian gây đau,sốt. Hoạt tính
chống viêm của nó mạnh hơn aspirin, nhƣng tƣơng đƣơng với indomethacin.
Chủ yếu đƣợc sử dụng trong các bệnh xƣơng khớp nhƣ: viêm khớp dạng
thấp, viêm bao hoạt dịch, viêm gân, viêm khớp vi tinh thể. Thuốc dễ dàng
đƣợc hấp thụ qua đƣờng tiêu hóa khi uống, khi uống lúc đói thuốc đƣợc hấp
thụ nhanh hơn [7].
Với mục đích đánh giá đƣợc khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri
của vật liệu cenlulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus chúng tôi thực hiện
đề tài “Nghiên cứu sự hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu cenlulose
tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo
gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu
Đánh giá đƣợc khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu
cellulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc
vo gạo.
3. Nội dung nghiên cứu
 Chế tạo đƣợc vật liệu màng, xử lý vật liệu màng trƣớc khi cho hấp thụ
thuốc, xác định lƣợng màng tạo thành.
 Đánh giá khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu

cellulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy trong môi trƣờng
nƣớc vo gạo.

2


NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI
LIỆU 1.1. Tổng quan về chủng vi khuẩn
1.1.1. Vị trí, phân loại của Gluconacetoacter xylinus
Gluconacetoacter xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, là loại vi khuẩn
hiếu khí, có khả năng sản xuất cellulose ngoại bào[7].
1.1.2. Đặc điểm của Gluconacetoacter xylinus
- Hình thái: có dạng que, hơi cong hoặc thẳng, là nhóm vi khuẩn gram
âm, không sinh bào tử, không di chuyển, sắp xếp riêng rẽ có khi xếp thành
chuỗi [7].
- Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: Có khả năng oxy hóa ethanol thành
acidacetic, có khả năng tổng hợp cellulose, chuyển hóa đƣờng thành axit, có
phản ứng với catalase dƣơng tính. Chủng vi khuẩn phát triển tối ƣu ở 25 –
300 C, tăng trƣởng trong khoảng pH từ 3 – 8, ở pH bằng 5,5 là mức pH tối ƣu
để sản xuất cellulose.
1.1.3. Môi trường nuôi cấy Gluconacetoacter xylinus
- Gluconacetoacter xylinus đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng tổng hợp
từ các nguồn dinh dƣỡng nhƣ: cacbon, nitơ, photpho, các yếu tố vi lƣợng và
các yếu tố tăng trƣởng. Gluconacetoacter xylinus là loài có khả năng tổng
hợp cellulose từ cacbonhydrat. Glucse, fructose, maninol,… là nguồn
cacbohydrat chủ yếu mà màng cellulose vi khuẩn này sử dụng. Khi sử dụng
Glycerol, galactose, lactose,… thì màng cellulose vi khuẩn này tổng hợp
cellulose cho hiệu suất thấp hơn và không nên dùng mannose, cellobiose,
acetate,…làm nguồn cacbonhydrat[2]. Tùy thuộc vào các màng cellulose vi

khuẩn khác nhau mà ngƣời ta sử dụng các loại đƣờng cũng nhƣ nồng độ các
loại đƣờng sao cho hợp lý.
- Các sản phẩm khác: Rỉ đƣờng, chất thải trong công nghiệp sản xuất
phomat, khoai tây, nƣớc mía, nƣớc dừa già,… cũng là nguồn nguyên liệu để
nuôi cấy Gluconacetoacter xylinus

3


1.1.4. Đặc điểm cấu trúc màng tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus
- Màng cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer không phân nhánh gồm
các gốc glucopyranose nối với nhau bởi liên kết   1, 4  glucan [3]. Các

chuỗi glucan đƣợc vi khuẩn tổng hợp nối lại với nhau thành các thớ sợi thứ
cấp. Khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong thƣợng tầng ở một loài thực
vật thì ngƣời ta thấy sợi thứ cấp là loại sợi tự nhiên mảnh nhất. Các sợi thứ
cấp kết lại với nhau tạo thành vi sợi, các vi sợi tạo thành các bó sợi, các bó sợi
tạo thành dải sợi. Một dải sợi có chiều dài khoảng 130 – 177 nm và dày
khoảng từ 3 – 4 nm.
- Tính đến thời điểm hiện tại Gluconacetoacter xylinus đƣợc đánh giá
là loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp cellulose hiệu quả nhất trong tự nhiên
Cấu trúc hóa học cơ bản của màng cellulose vi khuẩn giống với
cellulose có nguồn gốc tự nhiên, tuy vậy cấu trúc đại thể của chúng vẫn có sự
khác nhau. Ở màng cellulose vi khuẩn các sợi mới sinh ra kết lại với nhau tạo
thành sợi sơ cấp, các sợi sơ cấp kết lại tạo thành vi sợi (vi sợi nằm trong bó),
cuối cùng các dải sợi đƣợc hình thành. [3]. Cấu trúc của màng cellulose vi
khuẩn phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy... Cụ thể cấu trúc hóa học
đƣợc trình bày trong hình:

1.1.5. Tính độc đáo của màng cellulose vi khuẩn

- Là loại màng trong suốt, có cấu trúc mạng tinh thể [3].
- Có sức căng, độ bền sinh học cao, kích thƣớc ổn định [3].
4


- Có khả năng hấp thụ nƣớc và giữ nƣớc tốt, có độ xốp chọn lọc. So với
các loại cellulose khác thì màng cellulose vi khuẩn có độ tinh sạch cao hơn

[3].
- Dễ dàng bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật [3].
- Có khả năng kết sợi và tạo tinh thể tốt, khả năng chịu nhiệt và tính
bền cơ học cao [3].
- Màng cellulose đƣợc tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy, các sản

phẩm từ cellulose vi khuẩn đƣợc sản xuất trực tiếp mà không cần qua các
bƣớc trung gian [3].
- Đặc biệt có thể tổng hợp cellulose dƣới dạng màng mỏng hay sợi cực
nhỏ nhờ vi khuẩn [3].

1.1.6. Ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn
Màng cenlulose vi khuẩn đƣợc ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực công
nghệ khác nhau nhƣ:
- Dùng màng cenlulose vi khuẩn làm môi trƣờng phân tách cho quá
trình xử lí nƣớc, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng cho
tế bào, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực
phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy [2] ...
- Trong lĩnh vực y học, màng cenlulose đã đƣợc ứng dụng làm da tạm
thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, làm mạch máu nhân tạo, điều trị
các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng da cho con ngƣời. Ngoài ra, màng
cenlulose đã đƣợc sử dụng nhƣ trong một vài hệ thống để phân phối thuốc,

các sợi cellulose có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống vận chuyển và phân phối
thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc, nó có thể giúp thuốc không bị phá
hủy trong môi trƣờng acid [2].
1.2. Tổng quan về thuốc Diclofenac natri
1.2.1. Sơ lược về thuốc Diclofenac natri
1.2.1.1. Công thức
Diclofenac natri:
5


-

Tên khoa học: Natri 2-[(2,6-diclorophenyl)amino]phenyl] acetat,
Công thức phân tử: C14H10Cl2NNaO2

-

Công thức cấu tạo: [7].

-

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của thuốc Diclofenac natri
- Khối lƣợng phân tử: 318,10 đvC [7].

o

- Nhiệt độ nóng chảy: 283 - 285 C
[7]. 1.2.1.2. Nguồn gốc và tính chất
- Nguồn gốc: Có nguồn gốc thảo dƣợc
- Tính chất:

Natri diclofenac là một acid yếu. Tồn tại ở dạng kết tinh hoặc tinh thể
trắng[7].
Độ tan: dễ tan trong ethanol 96%, methanol, hơi tan trong nƣớc và
acid acetic băng, thực tế không tan trong ether. Độ tan trong nƣớc phụ thuộc
vào pH, nhiệt độ, và các chất có mặt trong môi trƣờng hoà tan [7].
1.2.1.3. Dƣợc động học và tác dụng
- Thuốc dễ dàng đƣợc hấp thụ qua đƣờng tiêu hóa khi uống, khi uống
lúc đói thuốc đƣợc hấp thụ nhanh hơn [7].

6


- Natri diclofenac có hoạt tính chống viêm, giảm đau và hạ sốt do khả
năng ức chế đặc hiệu enzym cyclo- oxygenase tham gia vào quá trình sinh
tổng hợp prostaglandin, prostacyclin, thromboxane... là các chất trung gian
gây đau, sốt [7].
Hoạt tính chống viêm của nó mạnh hơn aspirin, nhƣng tƣơng đƣơng
với indomethacin [7].
Chủ yếu đƣợc sử dụng trong các bệnh xƣơng khớp nhƣ: viêm khớp
dạng thấp, viêm bao hoạt dịch, viêm gân, viêm khớp vi tinh thể.
1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri
1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri trên
thế giới
Nghiên cứu về màng cellulose vi khuẩn từ Gluconacetoacter xylinus và
ứng dụng của nó đã đƣợc nghiên cứu ở nhiều nơi trên thế giới.
- Năm 1989 Brown và cộng sự đã sử dụng màng nhƣ một chất để biến
đổi độ nhớt, để sản xuất ra các sợi truyền quang, làm môi trƣờng trong cơ
chất sinh học, thực phẩm.
- Năm 1998 Jonas, Farad, năm 2006 Czafa và cộng sự đã nghiên cứu
dùng màng cellulose vi khuẩn để làm mặt nạ dƣỡng da và da nhân tạo

Diclofenac natri là thuốc nằm trong danh mục thuốc thiết yếu của 74
nƣớc, phần lớn đƣợc nghiên cứu và sử dụng để chữa các bệnh viêm khớp
dạng thấp, viêm bao dịch, viêm gân,…
1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri tại
Việt Nam
Ở nƣớc ta việc nghiên cứu và sử dụng màng cellulose vi khuẩn vẫn
dừng lại ở mức khiêm tốn, hầu hết các nghiên cứu đang chỉ dừng lại ở bƣớc
đầu và ở quy mô phòng thí nghiệm
Hiện nay, ở Việt Nam tình hình điều trị các bệnh viêm khớp ngày càng
đƣợc cải tiến. Việc sử dụng màng cellulose vi khuẩn làm tác nhân vận chuyển
thuốc vẫn đang đƣợc nghiên cứu và đang là một hƣớng đi mới.

7


Ở nƣớc ta, Diclofenac natri đƣợc sử dụng là một loại thuốc chữa các
bệnh viêm khớp dạng thấp, viêm bao dịch, viêm gân,…

8


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của màng celllulose vi khuẩn
nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc vo gạo.
2.1.1. Chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn Gluconacetoacter xylinus dùng lên men thu nhận vật
liệu celulose đƣợc mua tại Nhật Bản.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu

Nguyên liệu:
Nƣớc vo gạo, gạc vô trùng
Các loại hóa chất:
+ Diclofenac natri dạng tinh khiết (Việt Nam)
+ Đƣờng glucose (Việt Nam)
+ Pepton (Việt Nam)
+ Nƣớc cất (Việt Nam)
+ NaOH, HCl, (NH4)2SO4 (Việt Nam)
+ Acid acetic (Việt Nam)
+ Metanol (Việt Nam)
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
* Thiết bị:
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản)
- Cân phân tích (Sartorius - Thụy Sỹ)
- Cân kỹ thuật - Sartorius TE 3102 S
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus)
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức)
- Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức)
- Máy nƣớc cất 2 lần (Hamilton - Anh)
9


- Bể ổn nhiệt (Đức)
- Máy lắc
- Tủ lạnh, tủ lạnh sâu và các dụng cụ hóa sinh khác
* Dụng cụ:
- Bình định mức 10 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml
- Pipet 1ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml
- Micropipet 20-200 µl

- Hộp nhựa và đĩa 24 giếng để lên men tạo vật liệu cenlulose vi khuẩn có
các kích thƣớc: 10 x 15 cm, 3 x 5 cm, 1,5 x 1,5 cm, bình tam giác, ống
nghiệm và các dụng cụ hóa sinh khác.
2.2. Phạm vi, nội dung nghiên cứu, địa điểm, thời gian nghiên cứu
2.2.1. Phạm vi nghiên cứu
Đánh giá khả năng hấp thụ Diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra
từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc vo gạo.
2.2.2. Nội dung nghiên cứu
- Tạo và thu màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trƣờng nƣớc vo
gạo.
- Nạp Diclofenac natri vào màng.
- Thử nghiệm khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri vào màng.
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu
- Phòng Sinh lý ngƣời và động vật, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2.
- Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2.
2.2.4. Thời gian nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: 15 tuần
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp chế tạo vật liệu cellulose

10


2.3.1.1. Lên men thu vật liệu cenlulose vi khuẩn từ môi trƣờng nƣớc vo gạo
Bước 1: Chuẩn bị môi trƣờng theo bảng 1.
Bảng 2.1. Môi trƣờng lên men tạo vật liệu cenlulose
Thành phần

Hàm lƣợng

Glucose

30 g

Pepton

10 g

Diamoni photphat

0,3 g

Amoni sulfat

0,5 g

Acid acetic

2%

Nƣớc vo gạo

1000 ml

Dịch giống

10 %

Lƣu ý: pH của môi trƣờng đƣợc đo và hiệu chỉnh bằng HCl hoặc
NaOH; pH của môi trƣờng đƣợc đo và hiệu chỉnh = 4-6,pH thấp sẽ tránh bị

nhiễm những vi khuẩn khác.
Bước 2: Hấp khử trùng các môi trƣờng ở 1130C trong 15 phút.
Bước 3: Lấy môi trƣờng ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi để
nguội môi trƣờng.
Bước 4: Bổ sung 10% dịch giống, lắc đều tay cho giống phân bố đều
trong dung dịch.
Bước 5: Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy theo kích thƣớc nghiên cứu,
dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ, đặt tĩnh trong khoảng 4 – 14 ngày ở

280C.
Bước 6: Thu vật liệu cellulose thô, rửa sạch chúng dƣới vòi nƣớc.
2.3.1.2. Xử lý vật liệu cenllulose vi khuẩn trƣớc khi hấp thụ thuốc


Mục đích: loại bỏ đƣợc các tạp chất trong môi trƣờng nuôi cấy, đồng
thời phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn.

11




Phƣơng pháp: Trong nuôi cấy tĩnh, cellulose tạo thành vật liệu dày ở
mặt môi trƣờng nuôi cấy, ép vật liệu loại bỏ môi trƣờng.

Để thu đƣợc màng tinh chế ta cần thực hiện các bƣớc sau:
+ Tách màng: Trong nuôi cấy tĩnh, cellulose tạo thành vật liệu dày ở mặt
môi trƣờng nuôi cấy, ép vật liệu loại bỏ môi trƣờng.
+ Ngâm trong NaOH: Trong vật liệu chứa một lƣợng lớn vi khuẩn, vì vậy,
hấp vật liệu trong NaOH nóng 3%, nhiệt độ 113 0C trong thời gian 15 phút

bằng nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn
và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1 giờ.
+ Ngâm trong HCl: Màng sau khi đƣợc ngâm trong NaOH, rửa sạch bằng
nƣớc rồi ép màng. Ngâm màng trong HCl 3% trong 48 giờ.
+ Ngâm nƣớc: Vớt vật liệu đặt dƣới vòi nƣớc chảy đến khi vật liệu trắng
trong. Thử quỳ tím kiểm tra môi trƣờng bề mặt vật liệu cenllulose vi khuẩn
cần đạt là trung tính, ta thu đƣợc cenllulose vi khuẩn tinh khiết
2.3.1.3. Đo độ dày màng
Độ dày màng đƣợc đo bằng thƣớc kẹp panme, cần đo ở các vị trí khác
nhau. Sau đó tính toán các lần đo ta đƣợc độ dày màng cần lấy.
2.3.1.4. Đánh giá độ tinh khiết của vật liệu màng cellulose
Mục đích: Nhằm đảm bảo vật liệu màng cellulose vi khuẩn sau khi xử lý
đã loại đƣợc các tạp chất có thể gây độc hại. Chất đƣợc khảo sát là đƣờng
glucose và protein của vi khuẩn.
* Tìm sự hiện diện của glucose trong vật liệu màng cellulose tinh chế
Nguyên tắc: Dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện diện của
đƣờng D - glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
Tiến hành:
+ Bƣớc 1. Lấy dịch thử của màng sau khi đã xử lý hóa học. Mẫu đối
chứng là: nƣớc cất và dung dịch đƣờng glucose.

12


+ Bƣớc 2. Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1
ml thuốc thử Fehling, đun dƣới ngọn lửa đèn cồn từ 10 – 15 phút.
+ Bƣớc 3. Quan sát kết tủa trong ống nghiệm.
*Tìm sự hiện diện của protein trong vật liệu màng cellulose tinh chế
Nguyên tắc: Định tính protein còn lại trong vật liệu bằng phản ứng tạo kết
tủa của protein với acid triclor acetic.

Tiến hành: Vật liệu màng cellulose tinh chế đƣợc cắt nhỏ, cho vào 50ml
nƣớc cất, lắc kỹ với máy rung siêu âm trong 10 phút. Dùng dung dịch acid
triclor acetic 1% để phát hiện sự hiện diện của protein trong dịch chiết vật
liệu. Mẫu chứng âm là nƣớc cất và mẫu chứng dƣơng là dung dịch pepton
1% (pepton đã sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn). Phản ứng dƣơng tính khi cho
kết tủa đục. So sánh với mẫu chứng âm không chứa protein [3].
Vật liệu màng cellulose tinh chế dùng để tạo vật liệu nạp thuốc
Diclofenac natri phải đạt đƣợc những tính chất sau:
+ Cảm quan: mềm mại, dẻo dai, mỏng, có khả năng áp sát vào da, có
tính che phủ tốt.
+ Độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nƣớc và dịch mô [4].
2.3.2. Xây dựng đường chuẩn.
Phƣơng pháp: Dùng máy quét quang phổ
Sử dụng máy đo quang phổ UV- 2450 (Shimadru - Nhật Bản) để đo phổ
vùng tử ngoại và khả kiến. Máy bao gồm hệ thống quang học có khả năng
cung cấp ánh sáng đơn sắc trong dải từ 200 – 800nm. Chúng tôi sử dụng hai
cuvet đo dùng cho dung dịch thử và dung dịch đối chiếu đƣợc làm từ chất liệu
thạch anh, dung sai về độ dài quang trình của cốc đo là ±0,005cm. Các cuvet
đo đƣợc làm sạch và thao tác thận [1], [4].
* Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng: là HCl 0,1N.
* Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân chính xác 300 mg diclofenac natri
chuẩn đƣợc chuyển sang bình định mức 100 ml. 20-30 ml 0,1N HCl đã đƣợc
thêm vào để hòa tan diclofenac natri. Thể tích đƣợc làm thành 100 ml với
13


dung môi tƣơng tự (A). 10 ml dung dịch (A) đã đƣợc thu hồi và thể tích đƣợc
điều chỉnh đến 300 ml (B). Lấy 10 ml từ dung dịch (B) đã đƣợc thu hồi và
pha loãng thành 100ml để lấy 10 (µg/ml) trong dung dịch HCl 0,1 N [2], [5].
Pha dãy dung dịch chuẩn chứa thuốc Diclofenac natri trong dung môi

HCl 0,1 N ở các nồng độ (µg/ml) khác nhau. Quét phổ dung dịch Diclofenac
natri có nồng độ 10 (µg/ml) trong khoảng bƣớc sóng từ 200 đến 800nm, lựa
chọn bƣớc sóng tại đó đạt cực đại (λmax) hấp thụ [4]
Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn tại bƣớc sóng đã lựa chọn với
mẫu trắng là dung dịch HCl 0,1N và xây dựng đƣờng chuẩn biểu diễn mối
tƣơng quan giữa độ hấp thụ và nồng độ Diclofenac natri.
Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV – 2450 để đo mật độ quang phổ
(OD) của các dung dịch đã pha nhƣ trên ở hấp thu cực đại (λmax) [4].
Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc
Diclofenac natri để xây dựng đƣờng chuẩn của thuốc. Phƣơng trình tuyến
tính biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ Diclofenac natri và độ hấp thụ.
Phƣơng trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ có
dạng:
y = ax + b với R2 là hệ số tƣơng quan
Trong đó:

y: độ hấp thu của dung dịch tại λ max
x: nồng độ của dung dịch

Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch thuốc Diclofenac natri ở các
nồng độ khác nhau.
2.3.3. Xác định lượng thuốc được hấp thụ vào vật liệu cellulose
- Sử dụng vật liệu cellulose đƣợc tạo ra từ nƣớc vo gạo có kích thƣớc
0,5cm và độ dày 0,5 cm và 1 cm đều nhau, đem hấp thụ
+ Mẫu 1. Màng có độ dày 0,5 cm không sấy
+ Mẫu 2. Màng có độ dày 0,5 cm ép nƣớc
+ Mẫu 3. Màng có độ dày 1 cm không sấy

14

+ Mẫu 4. Màng có độ dày 1 cm ép nƣớc
- Cho các mẫu vào các bình tam giác đã chuẩn bị sẵn mỗi bình chứa 100
ml dung dịch thuốc. Sau đó cho vào máy lắc, lắc với tốc độ 150 vòng/phút
trong thời gian 30 phút, 1 giờ, 1,5 giờ và 2 giờ, sau đó lấy mãu dung dịch ra
đo bằng máy đo quang phổ bằng máy UV – 2450 để xác định lƣợng thuốc
còn lại trong dung dịch tại thời điểm lấy mẫu, từ đó xác định đƣợc nồng độ
thuốc, xác định khối lƣợng thuốc còn trong dung dịch m2 lƣợng thuốc hấp
thụ vào các vật liệu cellulose theo công thức 1.
mht = m1 – m2 (mg)

(1)

Trong đó: mht: khối lƣợng thuốc đã đƣợc hấp thu vào vật liệu
m1: khối lƣợng thuốc ban đầu trong dung dịch
m2: khối lƣợng thuốc có trong dung dịch sau khoảng thời
gian nhất định vật liệu hấp thu thuốc.
- Thực hiện đo 3 lần để lấy giá trị OD trung bình để tính toán. Lấy giá trị
OD trung bình thay vào phƣơng trình đƣờng chuẩn, tính đƣợc nồng độ
tƣơng ứng
- Hiệu suất thuốc hấp thụ vào màng đƣợc tính theo công thức sau:
EE (%) = Qt - Qd/ Qt x 100%

(2)

Trong đó: EE: phần trăm thuốc nạp vào vật liệu.
Qt: Lƣợng thuyết lý thuyết (mg)
Qd: Lƣợng thuốc còn lại (mg)
2.3.4. Phương pháp xử lý thống kê
Các số liệu đƣợc phân tích, xử lý thông qua phần mềm Excel 2013. Kết

quả đƣợc biểu diễn dƣới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn.
Kiểm định giả thiết về giá trị trung bình của các mẫu bằng cách sử dụng
test thống kê. Những khác biệt đƣợc coi là có ý nghĩa thống kê khi trị số p <
0,05.

15


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO
LUẬN 3.1. Kết quả tạo các loại vật liệu cellulose
Sau 7 ngày nuôi cấy ta thu đƣợc màng có độ dày 0,5 cm và sau 14 ngày
ta thu đƣợc màng có độ dày 1 cm. Tại các thời điểm khác nhau ta thu đƣợc
các màng có độ dày, mỏng khác nhau là do trong môi trƣờng còn chất dinh
dƣỡng các vi khuẩn tiếp tục phát triển tạo các lớp màng có độ dày khác nhau.
Sau đây là một số hình ảnh đƣợc chụp lại trong quá trình làm thí nghiệm:

Hình 3.1. Màng dày 0,5 cm

16


Hình 3.2. Màng nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc vo gạo

Hình 3.3. Màng dày 0,5 cm
Màng đƣợc nuôi cấy từ môi trƣờng gạo sau khi tinh chế sẽ đáp ứng các
nhu cầu sau: Màng mềm mại, linh hoạt, có độ bền, độ đàn hồi cao, dễ gấp, khi
để ngoài không khí không bị khô. Ta có màng tinh chế:

17