Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc neomycin sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc dừa già

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

HOÀNG THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ
THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA
VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƢỜNG NƢỚC DỪA GIÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

HÀ NỘI - 2019


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

HOÀNG THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ
THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA
VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƢỜNG NƢỚC DỪA GIÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

TS. CAO BÁ CƢỜNG

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy
giáo Cao Bá Cƣờng, ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt
quá trình thực hiện khóa luận này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong khoa Sinh KTNN cùng các thầy cô trong Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng đã
tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ cho em trong quá trình làm thực nghiệm
để em hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình,
bạn bè luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và
hoàn thành khóa luận này.
Do lần đầu em tham gia nghiên cứu khoa học, kiến thức còn hạn chế
nên không tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận đƣợc sự góp ý của
thầy cô và các bạn để khóa luận tốt nghiệp của em đƣợc hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Hoàng Thị Quỳnh

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đề tài do chính tôi thực hiện dƣới sự hƣớng
dẫn của TS. Cao Bá Cƣờng. Tất cả các số liệu đều đƣợc thu thập từ thực
nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không
trùng với kết quả đã công bố. Những trích dẫn trong khóa luận lấy từ các công
bố chính thức và có ghi chú rõ ràng.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Hoàng Thị Quỳnh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Tổng quan về vật liệu cellulose (VLC) ...................................................... 3
1.1.1. Vi khuẩn tổng hợp lên VLC .................................................................... 3
1.1.2. Môi trƣờng nuôi cấy G. Xylinus .............................................................. 3
1.1.3. Cấu trúc của VLC.................................................................................... 4
1.1.4. Tính chất của VLC .................................................................................. 6
1.1.5. Ứng dụng của VLC ................................................................................. 6
1.2. Tình hình nghiên cứu VLC ........................................................................ 7
1.2.1. Trên thế giới ............................................................................................ 7
1.2.2. Tại Việt Nam ........................................................................................... 7

1.3. Tổng quan về NS ........................................................................................ 8
1.3.1. Công thức cấu tạo.................................................................................... 8
1.3.2. Tính chất lí hóa........................................................................................ 9
1.3.3. Dƣợc lý học và dƣợc động học .............................................................. 9
1.3.4. Chỉ định và chống chỉ định ..................................................................... 9
1.4. Tình hình nghiên cứu về NS .................................................................... 10
1.4.1. Trên thế giới .......................................................................................... 10
1.4.2. Tại Việt Nam ......................................................................................... 10
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 11
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 11
2.1.1.Chủng vi khuẩn ...................................................................................... 11
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất ........................................................................ 11
2.1.3. Trang thiết bị ......................................................................................... 11
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 11


2.2.1. Chuẩn bị VLC ....................................................................................... 11
2.2.2. Chế tạo VLC nạp NS............................................................................. 13
2.2.3. Phƣơng pháp xử lí thống kê .................................................................. 15
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 16
3.1. Thu VLC và tinh chế màng ...................................................................... 16
3.1.1. Thu VLC từ các môi trƣờng lên men .................................................... 16
3.1.2. Tạo VLC tinh khiết ............................................................................... 16
3.1.3. Phƣơng pháp đánh giá độ tinh khiết củaVLC. ...................................... 17
3.2. Phƣơng trình đƣờng chuẩn NS trong PBS (pH = 7,4) ............................. 18
3.3. Xác định lƣợng thuốc NS nạp vào VLC .................................................. 19
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 24
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 25

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

1

VLC

Vật liệu cellulose

2

G.xylinus

Gluconacetobacter xylinus

3

NS

Neomycin sulfate

4

OD

5

PBS

Mật độ quang phổ
Phosphate buffered saline

6

S.fradiae

Streptomyces fradiae


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Giá trị dinh dƣỡng của nƣớc dừa già trong 100g [9]........................ 4
Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng lên men thu VLC ..................................... 12
Bảng 2.2. Môi trƣờng đệm PBS với pH = 7,4 ................................................ 13
Bảng 3.1. Mật độ quang của dung dịch Neomycin sufate ở các nồng độ
(n = 3) .............................................................................................. 18
Bảng 3.2. Giá trị OD hấp thụ thuốc NS của VLC (n = 3)............................... 19
Bảng 3.3. Khối lƣợng, hiệu suất hấp thụ thuốc NS vào VLC(n=3) ................ 20


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của VLC .................................................... 5
Hình 1.2. Cấu trúc của VLC (Yamanaka et al, 2000) ....................................... 5
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Neomycin sunfate [27] ................................. 8
Hình 3.1. VLC nuôi cấy trong 8 ngày ............................................................. 16
Hình 3.2.VLC thô sau khi thu ......................................................................... 16
Hình 3.3. VLC 0,5 cm đã đƣợc tinh chế ......................................................... 17
Hình 3.4. Thí nghiệm kiểm tra độ tinh khiết của VLC ................................... 17
Hình 3.5. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của thuốc NS ....................................... 18
Hình 3.6. VLC đang hấp thụ thuốc NS ........................................................... 19
Hình 3.7. Khối lƣợng thuốc NS hấp thụ vào VLC( 0,3cm) và VLC(0,5cm)

trong 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ ............................................................... 21
Hình 3.8. Hiệu suất hấp thụ thuốc NS của VLC(0,3cm) và VLC(0,5cm)
trong 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ ............................................................... 21


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay việc sử dụng các vật liệu sinh học để ứng dụng trong các lĩnh
vực nhƣ: y học, mỹ phẩm, thực phẩm,…đang đƣợc các nhà nghiên cứu khoa
học trong nƣớc và trên thế giới đặc biệt quan tâm. Một trong những vật liệu
sinh học đƣợc các nhà khoa học đặc biệt chú ý đến đó là vật liệu cellulose
(VLC).
VLC đƣợc tổng hợp bởi rất nhiều vi khuẩn, trong đó phải kể đến đó là
vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus ( G.xylinus) – loại vi khuẩn có khả năng
tạo ra VLC tốt nhất.
VLC là hợp chất tƣơng hợp sinh học, không độc hại, với cấu trúc siêu
mịn, đặc tính cơ học bền, dai, khả năng giữ ẩm cao nên có rất nhiều ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực nhƣ: công nghệ giấy, thực phẩm, y học, …[4].
Trong y học, VLC đã đƣợc ứng dụng làm màng trị bỏng, mặt nạ dƣỡng
da, mạch máu nhân tạo... [4]. Không chỉ vậy, VLC còn có khả năng hấp thu
thuốc, tăng tác dụng của thuốc, hạn chế đƣợc tác dụng phụ của thuốc.
Để tạo ra VLC, G.xylinus có thể nuôi cấy trong các môi trƣờng nhƣ:
nƣớc dừa già, rỉ đƣờng, dịch ép hoa quả, …Trong đề tài này tôi chọn nƣớc
dừa già là môi trƣờng nuôi cấy G.xylinus vì nƣớc dừa già chứa nhiều chất
dinh dƣỡng cần thiết để nuôi cấy vi khuẩn G.xylinus.
Neomycin sunfate (NS) là loại thuốc kháng sinh nhóm aminoglycoside.
Đƣợc sử dụng để điều trị các nhiễm khuẩn ngoài da, ức chế vi khuẩn đƣờng
ruột trƣớc khi phẫu thuật, điều trị trong hôn mê gan, nhiễm trùng ống tai
ngoài, …
NS hấp thụ qua đƣờng tiêu hóa rất kém, khoảng 97% lƣợng thuốc uống

vào cơ thể bị bài tiết dƣới dạng không đổi qua phân. Kem NS điều trị bệnh
viêm da có khả năng thẩm thấu qua da không cao đạt 45%, nhanh bị khô trên
bề mặt da,…[1].
Chính vì vậy cần phải nghiên cứu hệ thống hấp thụ thuốc NS để giúp
thuốc đƣợc hấp thụ một cách tốt nhất.

1


Với mục đích tạo ra màng cellulose đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn G.
xylinus, để khảo sát khả năng hấp thụ thuốc NS nhằm hạn chế tác dụng phụ
của thuốc, tăng khả năng thẩm thấu thuốc qua da để thuốc hấp thụ vào cơ thể
tốt nhất, rút ngắn thời gian điều trị bệnh.
Đó là lí do mà tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc
Neomycin sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter
xylinus nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc dừa già”.
2. Mục đích nghiên cứu
Tạo VLC từ môi trƣờng nƣớc dừa già để hấp thụ thuốc NS, nhằm tăng
khả năng hấp thụ thuốc vào VLC tối đa, từ đó khắc phục đƣợc nhƣợc điểm
của thuốc ở dạng thông thƣờng khi điều trị bệnh viêm da.
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tƣợng nghiên cứu: Khả năng hấp thụ thuốc NS của VLC tạo ra từ
G. xylinus lên men từ môi trƣờng nƣớc dừa già.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu đƣợc thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
4.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học:
Nghiên cứu tiềm năng của VLC trong việc hấp thu thuốc định hƣớng sử
dụng trên da.
Nghiên cứu khả năng hấp thụ các thuốc khác nhau của VLC nhằm tăng

hiệu quả điều trị của các loại thuốc đó.
Ý nghĩa thực tiễn:
Sử dụng VLC làm vật liệu để hấp thụ thuốc NS có thể làm tăng hiệu
quả của thuốc, khắc phục đƣợc tác dụng phụ không mong muốn trong việc
điều trị các bệnh viêm da bằng thuốc NS.

2


NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về vật liệu cellulose (VLC)
Cellulose là một hợp chất hóa học, là thành phần chính của sinh khối
thực vật. Cellulose ngoài đƣợc tổng hợp từ thực vật nó còn đƣợc tổng hợp từ
vi khuẩn gọi là VLC.
1.1.1. Vi khuẩn tổng hợp lên VLC
VLC đƣợc tổng hợp bởi các loài khác nhau của vi khuẩn, chẳng hạn
nhƣ Acetobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Pseudomonas, Rhizobium
và Sarcina [31]. Đặc biệt phải kể đến đó là vi khuẩn G. Xylinus – có khả năng
tổng hợp VLC tốt nhất.
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey (2005) Acetobacter
xylinum đƣợc đổi tên thành G. Xylinus và xếp vào chi Gluconacetobacter
thuộc họ vi khuẩn Acetobacteraceae.
G. Xylinus là vi khuẩn gram âm, thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc
có khả năng tổng hợp sinh màng cellulose trong môi trƣờng nuôi cấy tĩnh.
Chúng có dạng trực khuẩn, hình que, thẳng hay hơi cong, kích thƣớc khoảng
2 µm. Tế bào đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, có thể di động hoặc không
và không sinh bào tử.
G. xylinus có khuẩn lạc nhỏ, tròn, bề mặt nhầy, trơn bóng, phần giữa
khuẩn lạc lồi lên, dày hơn, sẫm màu hơn các phần chung quanh, rìa mép

khuẩn lạc nhẵn. Trong môi trƣờng lỏng, sau 24 giờ nuôi cấy xuất hiện một lớp
đục mỏng trên bề mặt dƣới có những sợi tơ. Sau 36 – 48 giờ, lớp màng đó dày
dần lên, không còn đục nhƣ trƣớc mà trong hơn [9].
1.1.2. Môi trƣờng nuôi cấy G. Xylinus
Môi trƣờng nuôi cấy G. xylinus là môi trƣờng có bổ sung các chất dinh
dƣỡng cần thiết cho vi khuẩn sinh trƣởng và phát triển nhƣ nguồn cacbon,
nito, nguồn sulfur và phosphor, các yếu tố tăng trƣởng và các yếu tố vi lƣợng.
Để tạo VLC G. xylinum có nhu cầu sử dụng đƣờng rất lớn chính vì vậy rất

3


nhiều nhà khoa học đã sử dụng rỉ đƣờng, nƣớc dừa già, nƣớc mía,... làm
nguyên liệu nuôi cấy G. xylinum.
Ở đề tài này, tôi chọn nƣớc dừa già là nguyên liệu nuôi cấy G.xylinus
để tạo VLC bởi:
- Nƣớc dừa già không khó tìm, có thể mua tại các cơ sở sản xuất mứt
dừa, dừa sấy hay cơ sở sản xuất dầu dừa tại các nhà máy sản xuất dầu
dừa với giá thành rẻ.
- Trong nƣớc dừa chứa rất nhiều chất dinh dƣỡng đƣợc trình bày ở bảng
1.1, chất kích thích tăng trƣởng nhƣ 1,3 – diphenyllurea, hexitol,
cytolunin, myoinositol, sorbitol,… Đó là môi trƣờng dinh dƣỡng thích
hợp để cho G.xylinus sinh trƣởng và phát triển để tổng hợp VLC
Bảng 1.1: Giá trị dinh dƣỡng của nƣớc dừa già trong 100g [9]
Nƣớc

94,99% Zn

0,1 mg

Protein

0,72% Cu

0,04 mg

Chất béo toàn phần
Carbonhydrat

0,2% Mangan
3,17% Selenium

Đƣờng

2.16% Vitamin C

2,4 mg

Ca

24 mg Vitamin B1

0,03 mg

Fe

0,29 mg Vitamin B2

0,057 mg

Mg

25 mg Vitamin B3

0,08 mg

P

20 mg Vitamin B5

0,043 mg

K

250 mg Vitamin B6

0,032 mg

Na

105 mg Vitamnin B9

0,142 mg
1 µg

3 µg

1.1.3. Cấu trúc của VLC
VLC là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng
liên kết β-1,4-glucan

4


Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của VLC
VLC có cấu trúc hóa học cơ bản giống cellulose của thực vật, nhƣng lại khác
nhau về cấu trúc đại thể [14],[16].
Theo AJ. Brown (1886) [18], VLC gồm nhiều sợi thứ cấp có bản chất là
hemicellulose, bề rộng 1,5 nm. Các sợi thứ cấp này kết hợp với nhau tạo
thành vi sợi có kích thƣớc lớn hơn. Các vi sợi này lại kết hợp với nhau thành
bó. Nhiều bó hợp thành dải, mỗi dải có chiều dày 3-4nm, chiều dài khoảng
130- 177nm.

Hình 1.2. Cấu trúc của VLC (Yamanaka et al, 2000)

Đặc tính cấu trúc của VLC phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy:
Khi nuôi cấy theo phƣơng pháp tĩnh (S - BC: Static - Cellulose vi
khuẩn), trong môi trƣờng lỏng G.xylinus tổng hợp tạo thành lớp màng dày
trên bề mặt môi trƣờng. VLC thu đƣợc dẻo dai, dày, độ tinh sạch, độ bền cơ
5


học cao, khả năng chịu nhiệt tốt, có thể bị phân hủy sinh học, không độc hại,
không gây dị ứng, đặc biệt là khả năng cản khuẩn [4].
Khi nuôi cấy động (A - BC: Agitated - Cellulose vi khuẩn), cellulose
hình thành thành dƣới dạng huyền phù với kích thƣớc không đều nhau phân
tán trong môi trƣờng dinh dƣỡng. VLC đƣợc hình thành trong nuôi cấy động
có hình thái đặc điểm khác hẳn so với VLC đƣợc nuôi cấy theo phƣơng pháp
tĩnh.
1.1.4. Tính chất của VLC

- VLC có tính chất độc đáo với cấu trúc mạng tinh thể ổn định, siêu
mịn, thành phần tỉ lệ Iα cao.
- Khả năng giữ nƣớc và hút nƣớc cực tốt. VLC có thể hút khoảng 200
lần trọng lƣợng của nó nhƣng vẫn giữ đƣợc độ thông thoáng cao
- Độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và
hemicellulose.
- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài
nguyên có thể phục hồi.
- Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có
độ bền cao, trọng lƣợng nhẹ, tính bền rất cao,... [5], [10].
- VLC không chứa lignin hay hemicellulose nên VLC dễ dàng bị vi
khuẩn phân hủy. Dựa vào điểm này ngƣời ta có thể ứng dụng trong việc thay
bao bì ni lông bằng VLC để giúp bảo vệ môi trƣờng. VLC còn có khả năng tái
chế.
1.1.5. Ứng dụng của VLC
Với các tính chất độc đáo của VLC, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử
dụng VLC vào các mục đích sử dụng khác nhau trong các lĩnh vực nhƣ: y
học, mỹ phẩm, thực phẩm, công nghiệp giấy, …. [2], [4], [10], [12].
Thực phẩm: Thạch dừa, thuốc rƣợu Kombucha, màng bao xúc xích,
màng bảo quản dừa tƣơi, thịt tƣơi.
Y tế: VLC đƣợc sử dụng để chữa lành các vết thƣơng cho da bị tổn
thƣơng nghiêm trọng, màng bao sụn, ống dẫn niệu, vỏ bọc viên nang, tác
6


nhân vận chuyển thuốc,…
Mỹ phẩm: Làm chất ổn định trong kem dƣỡng da, gel vuốt tóc, làm mặt
lạ dƣỡng da,…
Môi trƣờng: Sử dụng VLC để loại bỏ thủy ngân trong nƣớc, nƣớc thải.
Hút vết dầu tràn trên sông, biển ngăn ngừa ô nhiễm môi trƣờng nƣớc.

Phòng thí nghiệm: Màng cố định protein, cố định enzim, vi khuẩn,…
Ngành công nghiệp khác: VLC đƣợc sử dụng làm màng loa âm thanh
của tai nghe.
1.2. Tình hình nghiên cứu VLC
1.2.1. Trên thế giới
Với tính chất vô cùng độc đáo của VLC, VLC đƣợc các nhà khoa học
đặc biệt quan tâm tới việc nghiên cứu ứng dụng của nó vào trong nhiều lĩnh
vực. Trong đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu ứng dụng của VLC làm vật
liệu hấp thụ thuốc qua da.
Fontana và cộng sự (1990) [22] đã chỉ ra VLC có khả năng băng kín
vết thƣơng, duy trì dịch tiết, làm giảm đau vết thƣơng, tăng tốc tái tạo tế bào,
làm giảm tỷ lệ nhiễm trùng vết thƣơng, giảm sẹo và dễ dàng tháo gỡ, kiểm
tra.
Czaja và cộng sự (2007) [21] sử dụng VLC đắp lên vết bỏng đã thu
đƣợc kết quả tốt.
1.2.2. Tại Việt Nam
Ngày nay, việc nghiên cứu ứng dụng VLC ngày càng đƣợc các nhà
khoa học chú trọng. Một số sản phẩm từ VLC đã đƣợc thƣơng mại hóa trên
thị trƣờng nhƣ: thạch dừa, màng trị bỏng Acetul, mặt lạ dƣỡng da, màng bao
xúc xích,...
Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2006) [9] đã tiến hành thử nghiệm in
vivo ứng dụng VLC để điều trị bỏng với hai loại. Một loại VLC cho thêm
hoạt chất tái sinh mô và một loại cho thêm hoạt chất kháng khuẩn. Kết quả
cho thấy tác dụng của màng có thêm hoạt chất tái sinh mô tốt hơn hẳn dạng
màng thông thƣờng.

7


Nhóm tác giả Nguyễn Thị Kim Ngoan, Đinh Thị Kim Nhung nghiên

cứu ở quy mô phòng thí nghiệm chế tạo VLC làm mặt nạ dƣỡng da.
Tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cs (2012) [4], [5] đã nghiên cứu và
chế tạo thành công chế phẩm VLC trị bỏng có tẩm dung dịch berberin clorid
0,1% có tác dụng kháng khuẩn và tái sinh mô tốt, không gây đau.
Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy VLC có khả năng hấp thụ một
số loại thuốc rất tốt. Đây cũng là một hƣớng đi khả quan trong việc nghiên
cứu phát triển ứng dụng VLC trong việc hấp thụ thuốc NS.
1.3. Tổng quan về NS
NS là dạng chế phẩm của neomycin, kháng sinh nhóm aminoglycoid
đƣợc sản xuất bằng cách nuôi cấy một số chủng S.fradiae [2]. Neomycin ở
dạng thƣờng có tỉ lệ gây dị ứng cao hơn neomycin dạng chế phẩm. Trong
những dạng chế phẩm của neomycin thì dạng muối sulfate là dạng dễ hấp thụ
nhất và ít gây dị ứng cho ngƣời dùng. Bởi vậy, tôi chọn NS để nghiên cứu
trong đề tài này.
1.3.1. Công thức cấu tạo
- Công thức phân tử: C23H46N6O13.3( H2SO4)
- Phân tử khối : 908.866 g/mol
- Công thức cấu tạo thuốc neomycin sunfate thể hiện ở hình:

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Neomycin sunfate [27]

8


1.3.2. Tính chất lí hóa
NS có dạng bột tinh thể màu trắng đến hơi vàng. Rất dễ tan trong nƣớc,
khó tan trong ethanol 96%, không tan trong aceton [2]. Quang phổ hấp thụ ở
bƣớc sóng 277 nm. Định tính NS trong các chế phẩm (thuốc tiêm, thuốc mỡ,
viên nén, dung dịch nhỏ mắt, ...)
1.3.3. Dƣợc lý học và dƣợc động học

NS là kháng sinh nhóm aminoglycoside có cơ chế và phổ tác dụng
tƣơng tự gentamicin sulfat. Khi phối hợp với bacitracin, thuốc có tác dụng với
phần lớn các vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng gây nên các nhiễm khuẩn
ngoài da. Những vi khuẩn nhạy cảm với NS nhƣ: Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Heamophilus influ- enzae, Klebsiella, Enterobacter,
Neisseria.
NS đƣợc hấp thu kém qua đƣờng tiêu hóa, khoảng 97% lƣợng thuốc
uống vào cơ thể đƣợc bài tiết dƣới dạng không đổi qua phân. Khi đƣợc hấp
thu, thuốc sẽ thải trừ nhanh qua thận dƣới dạng hoạt tính. Điều này gây hại
cho thận.
1.3.4. Chỉ định và chống chỉ định
NS đƣợc dùng tại chỗ để điều trị các nhiễm khuẩn ngoài da, tai và mắt
do tụ cầu và các vi khuẩn khác nhạy cảm [1].
NS không đƣợc dùng trong đƣờng tiêm hoặc toàn thân vì độc tính của
thuốc. Không dùng NS tại chỗ lâu với liều lƣợng cao vì có thể gây mẫn cảm
trên da và dễ mẫn cảm chéo với các kháng sinh aminoglycosid khác [15].
Bên cạnh đó thì NS có những tác dụng phụ nhƣ: mụn, làm khô da,
nhiễm trùng da, không có khả năng cản khuẩn. NS có khả năng thẩm thấu
qua da không cao đạt 45%, nhanh bị khô bề mặt trên da,…[1]. Để khắc phục
đƣợc tác dụng phụ của thuốc cần phải sử dụng một loại vật liệu có khả năng
giữ ẩm, cản khuẩn. Chính vì vậy mà tôi chọn VLC nạp NS để hạn chế tác
dụng phụ của thuốc.

9


1.4. Tình hình nghiên cứu về NS
1.4.1. Trên thế giới
Năm 1949 Selman A., Waksman phát hiện NS đƣợc sản xuất từ môi
trƣờng nuôi cấy nấm Streptomyces fradiae [33]. Các nhà khoa học trên đã tìm

ra quá trình sinh tổng hợp và đánh giá khả năng kháng khuẩn của NS.
Pedersoli W.M. và cộng sự (1994) [25] nghiên cứu sự hấp thụ của NS
trên bê con Hà Lan qua đƣờng tiêm. Kết quả cho thấy NS hấp thụ đạt tỷ lệ
không cao, và lƣợng NS đào thải qua thận lớn gây hại cho thận.
Nhóm nghiên cứu của Blanchard C. (2015) [17] cũng chỉ ra rằng NS
kháng khuẩn tốt hơn neomycin, do NS ở dạng muối ít gây dị ứng với cơ thể.
1.4.2. Tại Việt Nam
NS có trong danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam ban hành lần thứ 4
năm 1999 [2]. NS đƣợc bào chế dạng kem, dung dịch pha chế với một số hoạt
chất khác. Tuy nhiên hƣớng nghiên cứu sử dụng VLC nạp thuốc NS thì chƣa
có công trình nào nghiên cứu.

10


CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1.Chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn G.xylinus dùng lên men thu nhận VLC mua từ Nhật
Bản.
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất
- Neomycin sulfate mua từ Trung Quốc
- Dung môi và chất phản ứng khác đƣợc mua từ Đức.
- VLC đƣợc sản xuất bằng cách sử dụng vi khuẩn G. xylinum lên men
trong môi trƣờng nƣớc dừa già.
- Nguyên liệu làm môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật tạo VLC: đƣờng
glucose, peptone, diamoni photphat, amoni sulfat, nƣớc dừa già.
2.1.3. Trang thiết bị
Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản); cân phân tích

(Sartorius – Thụy sỹ); cân kỹ thuật (Sartorius - TE612); nồi hấp khử trùng
HV-110/HIRAIAMA; kính hiển vi điện tử quét; buồng cấy vô trùng
(Haraeus); tủ sấy; tủ ấm (Binder - Đức); khuấy từ gia nhiệt (IKA – Đức););
máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh); tủ lạnh Daewoo
và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuẩn bị VLC
2.2.1.1. Lên men thu VLC thô

11


Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng lên men thu VLC
Khối lƣợng

Thành phần
Glucose

20 g

Pepton

10 g

Diamoni photphat

0,3 g

Amoni sunfat

0,5 g

Nƣớc dừa già

1000 ml

Quá trình lên men thu VLC thực hiện theo các bƣớc sau:
Bƣớc 1: Sấy bình ở nhiệt độ 2000C, để nguội
Bƣớc 2: Chuẩn bị môi trƣờng theo bảng 2.1.
Bƣớc 3: Hấp khử trùng môi trƣờng đó ở 1130C trong 15 phút.
Bƣớc 4: Lấy môi trƣờng ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi để
nguội môi trƣờng.
Bƣớc 5: Bổ sung 20% dịch giống, lắc đều tay cho giống phân bố đều
trong dung dịch.
Bƣớc 6: Dùng gạc vô trùng bịt miệng lọ, ủ tĩnh trong khoảng 6– 8 ngày
ở 260C.
Bƣớc 7: Thu VLC thô, rửa sạch chúng dƣới vòi nƣớc. Dựa trên một số
kết quả nghiên cứu của một số tác giả [7] , [9] tôi chọn VLC có độ dày từ
0,3 - 0,5cm làm hệ thống hấp thu thuốc định hƣớng sử dụng qua da. Sau khi
nuôi cấy tĩnh G. xylinum sau 6 - 8 ngày tiến hành thu VLC, VLC lúc này có
độ dày 0,3 cm – 0,5 cm
2.2.1.2. Tạo VLC tinh khiết
Sau khi ủ tĩnh trong 6 - 8 ngày ở 260C, VLC đƣợc tách ra. Để tạo đƣợc
VLC tinh chế thì phải trải qua các bƣớc sau:
Bƣớc 1: Tách VLC thô ra khỏi môi trƣờng nuôi cấy, ép bỏ bớt nƣớc.
Bƣớc 2: Ngâm VLC 48 giờ trong NaOH 3%, sau đó bỏ ra rửa và ép.

12

Bƣớc 3: Ngâm tiếp trong HCl 3% trong 48 giờ, sau đó bỏ ra rửa và ép
loại bỏ nƣớc.
Bƣớc 4: Ngâm VLC 48 giờ trong nƣớc, sau đó bỏ ra kiểm tra tạp chất
Bƣớc 5: Thu VLC tinh chế
2.2.1.3. Phƣơng pháp đánh giá độ tinh sạch củaVLC.
Để kiểm tra VLC đã tinh khiết hay chƣa ta thực hiện các bƣớc sau:
Bƣớc 1: VLC (0,3 cm), VLC (0,5 cm) sau khi tinh chế, lấy dịch thử,
chia vào 2 ống: ống thử 1 (VLC 0,3 cm), ống thử 2 (VLC 0,5 cm).
Bƣớc 2: Chuẩn bị mẫu đối chứng: D – Glucose và nƣớc cất 2 lần. Nhỏ
thuốc thử Fehling vào 2 ống đối chứng mỗi ống 1 ml. Ống chứa D – Glucose
sẽ có kết tủa đỏ nâu, còn ống chứa nƣớc cất 2 lần sẽ không có hiện tƣợng gì.
Bƣớc 3: Cho vào các ống thử mỗi ống nghiệm 1 ml thuốc thử Fehling
mới pha, đun dƣới ngọn lửa đèn cồn 10 phút.
Bƣớc 4: Nếu ống thử không bị đục nhƣ ống đối chứng chứa nƣớc cất
thì màng đã tinh khiết. Còn nếu có kết tủa đỏ nâu, chứng tỏ VLC vẫn chƣa
tinh khiết, vẫn còn glucose ta tiếp tục xả nƣớc.
2.2.2. Chế tạo VLC nạp NS
2.2.2.1. Chuẩn bị bộ đệm
Môi trƣờng đệm Phosphate buffered saline (PBS) [8] đƣợc chuẩn bị với
các thành phần và cách pha đƣợc trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Môi trƣờng đệm PBS với pH = 7,4
Hóa chất
Thành phần

Cách pha
Khối lượng Cho hóa chất vào cốc đong.

NaCl

0,8g

Thêm đến mức 800ml bằng nƣớc cất.

KCl

0,2g

Điều chỉnh pH tới 7,4 bằng HCl.

Na2HPO4.12H2O

1,44g

Bổ sung nƣớc tới 1000 ml.

Na2HPO4

0,22g

Khử trùng.

13


2.2.2.2. Xây dựng đƣờng chuẩn NS
Sử dụng hệ thống quang phổ tử ngoại UV để ghi mật độ quang hấp thụ
của thuốc NS.
Chuẩn bị dung dịch NS ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau: 0,05; 0,1;
0,15; 0,2; 0,25; 0,3.
Sử dụng dung môi là PBS (pH = 7,4). Dùng máy đo quang phổ tử ngoại

(OD) UV – 2450 để đo UV ở bƣớc sóng 277 nm (bƣớc sóng hấp thụ cực đại
của NS). Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc NS để
xây dựng đƣờng chuẩn của thuốc.
2.2.2.3. Chuẩn bị môi trƣờng cho VLC nạp thuốc
Bƣớc 1: VLC sau khi tinh chế ta lấy giấy thấm bỏ 60% nƣớc
Bƣớc 2: Chuẩn bị 3 bình 250 ml, mỗi bình cho NS (2 mg/ml) sau đó
cho dung dịch đệm PBS (pH= 7,4) đến vạch 100 ml.
Bƣớc 3: Cho màng vào dung dịch vừa pha, rung động ở 180 vòng và
40 C trong 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ đảm bảo cho màng hấp thụ tối đa. Sau đó lấy
ra và cho vào bao nilon, hấp tiệt trùng ở 120 0C trong 20 phút, hàn bao bì và
đặt trong ngăn mát tủ lạnh.
0

2.2.2.4. Xác định lƣợng NS nạp vào VLC
Dùng máy đo quang phổ UV – 2450 xác định lƣợng thuốc có trong
dung dịch sau các khoảng thời gian khác nhau, từ đó xác định lƣợng thuốc
nạp vào màng theo công thức:
mht = m1 – m2 (mg)
(1)
Trong đó:
mht: Khối lƣợng thuốc đã đƣợc hấp thu vào màng.
m1: Khối lƣợng thuốc ban đầu trong dung dịch.
m2: Khối lƣợng thuốc có trong dung dịch sau khoảng thời gian nhất định
màng hấp thu thuốc.
Đánh giá hiệu suất thuốc nạp vào màng đƣợc tính theo công thức:

14


mht (mg/ cm3 )

EE (%) =
x 100%
m0 (mg/ cm3 )

(2)

Trong đó:
EE (%): Hiệu suất nạp thuốc NS của màng BC.
mht (mg/cm3): Khối lƣợng thuốc hấp thụ trong 1 đơn vị thể tích màng.
m0 (mg/cm3): Khối lƣợng thuốc có trong 1 đơn vị thể tích dung dịch
ban đầu.
Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại trong ba lần.
2.2.3. Phƣơng pháp xử lí thống kê
Mỗi công thức đƣợc lặp lại 3 lần để lấy trung bình mẫu, sử dụng phần
mềm Excel để phân tích thống kê số liệu, phân tích phƣơng sai và xác định
khoảng tin cậy. Các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày dƣới dạng “số trung
bình ± SD”. Những khác biệt đƣợc coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p nhỏ
hơn 0,05.

15


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thu VLC và tinh chế màng
3.1.1. Thu VLC từ các môi trƣờng lên men
G. xylinum khi cho vào môi trƣờng nƣớc dừa già sẽ sử dụng các chất
dinh dƣỡng trong nƣớc dừa già để tổng hợp nên Cellulose. VLC dày lên dần
đến khi môi trƣờng hết chất dinh dƣỡng. Thời gian nuôi cấy khác nhau, ta thu
đƣợc VLC có độ dày khác nhau.
Muốn thu VLC (0,3 cm) thì sau khi nuôi cấy tĩnh G. xylinum đƣợc 5

ngày ta tiến hành thu màng.
Muốn thu VLC (0,5 cm ) sau khi nuôi cấy tĩnh G. xylinum 8 ngày

Hình 3.1. VLC nuôi cấy trong 8 ngày
VLC thô sau khi lấy ra khỏi môi trƣờng nuôi cấy có màu trắng đục, rất
dẻo dai, đàn hồi tốt, khả năng chịu lực cao.

Hình 3.2. VLC thô sau khi thu
3.1.2. Tạo VLC tinh khiết
VLC thô đƣợc tinh chế qua các bƣớc:
16