PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MẤT ĐOẠN APOBEC3B VÀ NGUY CƠ BỊ UNG THƢ VÚ Ở NGƢỜI VIỆT NAM
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.67 MB, 105 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Bùi Thị Thu Anh
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MẤT ĐOẠN APOBEC3B VÀ NGUY CƠ BỊ
UNG THƢ VÚ Ở NGƢỜI VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Bùi Thị Thu Anh
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MẤT ĐOẠN APOBEC3B VÀ NGUY CƠ BỊ
UNG THƢ VÚ Ở NGƢỜI VIỆT NAM
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420101.14
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. VÕ THỊ THƢƠNG LAN
Hà Nội - 2019
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành tốt luận văn này, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giáo viên
hướng dẫn PGS. TS. Võ Thị Thương Lan, cô đã luôn tận tình giúp đỡ và chỉ bảo em
trong thí nghiệm, khi gặp vấn đề cô định hướng giúp em làm thí nghiệm một cách độc
lập. Cô không những dạy dỗ em về thí nghiệm mà còn giúp em biết cách trình bày luận
văn và phân tích bài báo khoa học. Cô đã dạy dỗ em biết cách cư xử với mọi người và
những nguyên tắc ứng xử ngoài xã hội. Cô là nhà giáo mà em quý mến nhất và muốn
học hỏi thêm nhiều điều từ cô.
Em xin gửi lời cảm ơn đến Ths. Tạ Bích Thuận, cô là người luôn an ủi và động
viên em khi em gặp khó khăn, nhờ có cô mà những giây phút căng thẳng khi làm thí
nghiệm trở nên nhẹ nhàng hơn. Cô đã giúp em có thêm rất nhiều động lực để hoàn
thành luận văn này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, trường
Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Bệnh viện K Hà Nội, Viện
Huyết học - Truyền máu Trung ương và Bệnh viện Nhi Hà Nội đã tạo điều kiện thuận
lợi cho em thực hiện tốt luận văn này.
Tiếp đến em xin cảm ơn Ths. Ngô Thị Hà, Hv. Nguyễn Thùy Ngân đã chỉ bảo
và giúp đỡ em tận tình trong quá trình thí nghiệm và xin gửi lời cảm ơn tới Hv.
Nguyễn Minh Khôi, em Nguyễn Thị Thanh trong Phòng thí nghiệm Sinh Y đã giúp
đỡ và chia sẻ khó khăn giúp em hoàn thành luận văn này.
Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn đến với gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh động
viên và là nguồn động lực rất lớn giúp em vượt qua mọi khó khăn trong công việc.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm
Học viên
Bùi Thị Thu Anh
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Viết đầy đủ
Viết tắt
APOBEC3 :
Apolipo Protein B mRNA Editing enzyme Catalytic
subunit 3
bp
:
Base pair
CGH
:
Comparative Genomic Hybridization
CNV
:
Copy number variation
Ct
:
Threshold cycle
DCIS
:
Ductal carcinoma in situ
DD
:
Deletion/Deletion genotype
DNA
:
Deoxyribonucleic acid
dNTPs
:
Deoxynucleotide triphosphates
EDTA
:
Ethylenediaminetetraacetic acid
HW
:
Hardy-Weinberg
ID
:
Insertion/Deletion genotype
IDC
:
Invasive ductal carcinoma
II
:
Insertion/Insertion genotype
ILC
:
Invasive lobular carcinoma
kb
:
Kilobase
LCIS
:
Lobular carcinoma in situ
Mb
:
Megabase
MLPA
:
Multiplex ligation-dependent probe amplification
mRNA
:
Messenger ribonucleic acid
NAHR
:
Non-allelic homologous recombination
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
OD
:
Optical density
OR
:
Odds ratio
PCR
:
Polymerase chain reaction
SNP
:
Single nucleotide polymorphism
ssDNA
:
Single-stranded DNA
TBE
:
Tris - Borate - EDTA
TNM
:
Tumor - Node - Metastasis
TD-PCR
:
Touchdown polymerase chain reaction
UDG
:
Uracil-DNA glycosylase
UTR
:
Untranslated region
ZD-CDAs :
Zinc-dependent cytidine deaminase
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Trang
Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi sử dụng cho nghiên cứu
28
Bảng 2.2. Thành phần và điều kiện tối ƣu của phản ứng PCR
30
Bảng 3.1. Điều kiện phản ứng PCR ban đầu
36
Bảng 3.2. Tổng hợp kiểu gen mất đoạn APOBEC3B trên các nhóm mẫu
44
Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra cân bằng HW trên nhóm đối chứng
46
Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra cân bằng HW trên nhóm bệnh nhân
47
thalassemia
Bảng 3.5. Kết quả phân tích đa dạng mất đoạn APOBEC3B với nguy cơ
ung thƣ vú
48
Bảng 3.6. Số lƣợng mẫu nghiên cứu trong một số công bố
48
Bảng 3.7. Kết quả phân tích đa dạng mất đoạn APOBEC3B với nguy cơ
mắc bệnh di truyền thalassemia
51
Bảng 3.8. Liên hệ giữa đa dạng mất đoạn APOBEC3B với các chỉ số lâm
sàng ung thƣ vú
55
Bảng 3.9. Sự thay đổi đa dạng mất đoạn APOBEC3B trong cặp ung thƣ vú
và liền kề
56
Bảng 3.10. Xu hƣớng thay đổi đa dạng mất đoạn APOBEC3B trong cặp
ung thƣ vú và liền kề
57
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình
Trang
Hình 1.1. Đặc điểm họ gen APOBEC3 ở ngƣời
3
Hình 1.2. Mối liên hệ của APOBEC3A với ung thƣ
7
Hình 1.3. Vai trò của APOBEC3B trong tiến trình ung thƣ
8
Hình 1.4. Tái tổ hợp tƣơng đồng không alen (NAHR) hình thành các CNVs
11
Hình 1.5. Mất đoạn hình thành giữa hai gen APOBEC3A và APOBEC3B nằm
trên nhiễm sắc thể 22
13
Hình 1.6. Phân bố tần suất alen mất đoạn APOBEC3B ở một số nơi trên thế
giới
14
Hình 1.7. Tình hình ung thƣ vú trên thế giới và Việt Nam năm 2018
16
Hình 1.8. Độ mô học của ung thƣ vú
18
Hình 1.9. Các bƣớc cơ bản của phƣơng pháp MLPA
22
Hình 1.10. Vị trí đầu dò và mồi trong kỹ thuật MLPA phát hiện đa dạng mất
đoạn APOBEC3B
23
Hình 1.11. Phƣơng pháp phát hiện sản phẩm realtime-PCR
24
Hình 1.12. Vị trí mồi xác định đa dạng mất đoạn APOBEC3B trong kỹ thuật
25
PCR
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu
29
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số của một số mẫu
35
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
Hình 3.2. Kết quả phản ứng PCR
36
Hình 3.3. Kết quả tối ƣu tăng nhiệt độ gắn mồi của phản ứng PCR
37
Hình 3.4. Kết quả PCR kiểm tra đa dạng mất đoạn APOBEC3B trên bệnh
38
phẩm ung thƣ vú
Hình 3.5. Kết quả tối ƣu điều kiện phản ứng PCR
39
Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen 490 bp khuếch đại bằng cặp mồi
40
Ins-F và Ins-R với ngân hàng gen NCBI
Hình 3.7. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen 700 bp khuếch đại bằng mồi Del-
41
F và Del-R với ngân hàng gen NCBI
Hình 3.8. Vị trí xảy ra đa dạng mất đoạn APOBEC3B trên đoạn gen 700 bp
khuếch đại bằng mồi Del-F và Del-R
42
Hình 3.9. Kết quả kiểm tra đa dạng mất đoạn APOBEC3B trên các nhóm mẫu
43
Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện tỷ suất nguy cơ (OR) của đa dạng mất đoạn
APOBEC3B với ung thƣ vú
49
Hình 3.11. Sự phân bố số ca mắc ung thƣ vú và tần suất alen mất đoạn
APOBEC3B trên thế giới
50
Hình 3.12. Biểu đồ tần suất alen mất đoạn APOBEC3B trong nghiên cứu về
ung thƣ vú
52
Hình 3.13. Biểu đồ thể hiện đặc điểm phân bố nhóm tuổi, độ mô học, giai
54
đoạn ung thƣ vú và kích thƣớc u của bệnh nhân ung thƣ vú
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ............................................. 2
1.1. Họ gen APOBEC3 ................................................................................................... 2
1.1.1. Đặc điểm của họ gen APOBEC3 ........................................................................... 2
1.1.2. Mối liên hệ của họ gen APOBEC3 với ung thƣ .................................................... 4
1.2. Vai trò của gen APOBEC3A và APOBEC3B trong ung thƣ .............................. 6
1.3. Đa dạng di truyền ................................................................................................... 9
1.3.1. Đa dạng số bản sao (Copy Number Variation - CNV) ......................................... 9
1.3.2. Đa dạng mất đoạn APOBEC3B và nguy cơ ung thƣ vú ...................................... 12
1.4. Tổng quan về ung thƣ vú ..................................................................................... 15
1.4.1. Tình hình ung thƣ vú ........................................................................................... 15
1.4.2. Phân loại ung thƣ vú ........................................................................................... 16
1.4.3. Độ mô học của ung thƣ vú .................................................................................. 18
1.4.4. Các giai đoạn ung thƣ vú .................................................................................... 18
1.4.5. Các yếu tố tăng nguy cơ ung thƣ vú .................................................................... 20
1.5. Phƣơng pháp xác định đa dạng mất đoạn APOBEC3B.................................... 21
1.5.1. Phƣơng pháp MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) ........ 21
1.5.2. Phƣơng pháp PCR định lƣợng (Realtime-PCR) ................................................. 23
1.5.3. Phƣơng pháp PCR ............................................................................................... 25
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 27
2.1. Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu ........................................................................... 27
2.2. Hóa chất và thiết bị .............................................................................................. 27
2.2.1. Hóa chất .............................................................................................................. 27
2.2.2. Thiết bị................................................................................................................. 28
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu..................................................................................... 28
2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu................................................................................................. 28
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
2.3.2. Phƣơng pháp tách DNA tổng số ......................................................................... 29
2.3.3. Phƣơng pháp PCR ............................................................................................... 30
2.3.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR ............................................................... 30
2.3.5. Phƣơng pháp điện di ........................................................................................... 31
2.3.6. Phƣơng pháp đo mật độ quang học ..................................................................... 31
2.3.7. Phƣơng pháp phân tích thống kê ......................................................................... 32
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 34
3.1. Tách chiết, kiểm tra chất lƣợng, nồng độ DNA tổng số ................................... 34
3.2. Tối ƣu điều kiện phản ứng PCR ......................................................................... 35
3.3. Giải trình tự sản phẩm PCR ............................................................................... 39
3.4. Xác định đa dạng mất đoạn APOBEC3B ........................................................... 42
3.5. Kiểm tra cân bằng Hardy-Weinberg .................................................................. 44
3.5.1. Kiểm tra cân bằng Hardy-Weinberg trên nhóm đối chứng ................................. 44
3.5.2. Kiểm tra cân bằng Hardy-Weinberg trên nhóm bệnh di truyền thalassemia ...... 46
3.6. Phân tích đa dạng mất đoạn APOBEC3B .......................................................... 47
3.6.1. Đa dạng mất đoạn APOBEC3B với nguy cơ mắc ung thƣ vú ở phụ nữ Việt
Nam.... ........................................................................................................................... 47
3.6.2. Đa dạng mất đoạn APOBEC3B với nguy cơ mắc bệnh di truyền thalassemia ... 50
3.7. Tần suất alen mất đoạn APOBEC3B ở ngƣời Việt Nam .................................. 51
3.8. Mối liên hệ giữa đa dạng mất đoạn APOBEC3B với các thông số mô bệnh
học, giai đoạn ung thƣ vú và nhóm tuổi .................................................................... 53
3.9. Sự khác biệt đa dạng mất đoạn APOBEC3B giữa mẫu ung thƣ vú và mẫu liền
kề (U - L) ...................................................................................................................... 55
KẾT LUẬN .................................................................................................................. 59
KIẾN NGHỊ ................................................................................................................. 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 61
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
MỞ ĐẦU
Ung thƣ vú là loại ung thƣ phổ biến nhất và là nguyên nhân gây tử vong
hàng đầu trong các loại ung thƣ ở nữ giới. Năm 2018, trên thế giới có đến 600 nghìn
ngƣời chết vì ung thƣ vú và khoảng 2,1 triệu ca ung thƣ mắc mới. Gần đây, đa dạng
di truyền mất đoạn APOBEC3B ở họ gen APOBEC3 đƣợc báo cáo là có nguy cơ
gây ung thƣ vú. Đa dạng di truyền này do sự tái tổ hợp tƣơng đồng không alen dẫn
đến mất đoạn khoảng 29,9 kb trải dài từ exon thứ năm của gen APOBEC3A đến
exon thứ tám của gen APOBEC3B, tạo thành một gen lai APOBEC3A-APOBEC3B
mang vùng mã hóa của APOBEC3A và vùng 3’- không dịch mã (3’-UTR) của
APOBEC3B.
Tần suất phân bố đa dạng mất đoạn APOBEC3B dao động rất lớn giữa các
khu vực khác nhau trên thế giới. Đa dạng này hiếm xảy ra ở ngƣời châu Phi và châu
Âu (tần suất 0,9% và 6%), phổ biến ở Đông Á, châu Mỹ (36,9% và 57,7%) và xảy
ra phần lớn ở ngƣời châu Đại Dƣơng (92,9%). Gần đây, nhiều nghiên cứu về mối
liên hệ giữa đa dạng mất đoạn APOBEC3B với nguy cơ ung thƣ vú. Đa số nghiên
cứu ở châu Âu cho thấy không có mối liên hệ giữa đa dạng mất đoạn với nguy cơ
ung thƣ vú trong khi một số khu vực khác ở Đông Á, Tây Á lại cho kết quả ngƣợc
lại. Tại Việt Nam chƣa có nghiên cứu nào công bố về đa dạng mất đoạn APOBE3B
cũng nhƣ mối liên hệ với ung thƣ vú. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân tích
đa dạng di truyền mất đoạn APOBEC3B và nguy cơ bị ung thư vú ở người Việt
Nam” nhằm cung cấp thêm số liệu về mất đoạn APOBEC3B cũng nhƣ xác định tần
suất alen mất đoạn tại Việt Nam. Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh
Y, Khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội.
1
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Ung thƣ là một bệnh do sự tăng sinh không kiểm soát của một nhóm tế bào,
trong giai đoạn phát triển, các tế bào này xâm lấn vào mô lân cận hoặc di căn đến
các bộ phận khác của cơ thể [52]. Một trong các nguyên nhân phát sinh ung thƣ
đƣợc nghiên cứu rất nhiều là sự tổn thƣơng DNA [24]. Nguồn gây tổn thƣơng DNA
và đột biến dẫn đến ung thƣ có thể đƣợc phân chia thành ngoại sinh - phát sinh từ
môi trƣờng và nội sinh - phát sinh từ bên trong cơ thể. Tác dụng của tia UV tới
pyrimidine là một ví dụ điển hình về tác nhân ngoại sinh dẫn đến tạo pyrimidine
dimers làm mạch DNA dễ đứt gãy [26]. Bên cạnh đó, tia UV cũng là tác nhân gây
đột biến thay thế G-C thành A-T làm thay đổi thông tin di truyền [17]. Một số
nguồn nội sinh đã đƣợc biết đến nhƣ quá trình oxy hóa guanine và khử gốc amin
trên cytosine [2]. Năm 2002, khoa học đã đạt đƣợc những tiến bộ trong việc tìm
thêm một nguồn nội sinh làm tổn thƣơng DNA có liên quan đến ung thƣ là
APOBEC3B - một thành viên của họ gen APOBEC3 gây khử gốc amin của cytosine
trên sợi đơn DNA (ssDNA) [11]. Nhiều nghiên cứu đã xác định một đa dạng mất
đoạn APOBEC3B tồn tại trong quần thể ngƣời có tần suất alen khác nhau từ khoảng
1% đến 93%, tùy thuộc vào khu vực địa lý [31]. Đa dạng này đã đƣợc chứng minh
có liên hệ với nguy cơ ung thƣ vú và đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu [15, 36, 48].
1.1.
Họ gen APOBEC3
1.1.1. Đặc điểm của họ gen APOBEC3
APOBEC3 (Apolipo Protein B mRNA Editing enzyme Catalytic subunit 3)
là một họ gen mã hóa cho enzyme DNA cytidine deaminase, có khả năng biến đổi
các cytidine trên ssDNA và RNA thành uracil [11]. Các enzyme này đóng vai trò
quan trọng trong miễn dịch bẩm sinh [65]. Nhiều thành viên trong họ APOBEC3 ức
chế retrovirus bằng cách khử gốc amin của cytidine trên sợi RNA hoặc cDNA trung
gian dẫn đến làm rối loạn thông tin di truyền của virus. Trong đó, APOBEC3A khử
2
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
gốc amin đến 97% cytidine trên DNA ngoại lai mà không ảnh hƣởng đến DNA của
tế bào [58]. Bên cạnh đó, enzyme APOBEC3A và APOBEC3B ức chế quá trình
phiên mã ngƣợc của các yếu tố chuyển vị retrotransposon, góp phần làm ổn định hệ
gen [11]. Ở ngƣời, họ gen APOBEC3 gồm 7 thành viên là APOBEC3A,
APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3G và APOBEC3H
nằm trên nhiễm sắc thể số 22 (Hình 1.1).
Hình 1.1. Đặc điểm họ gen APOBEC3 ở ngƣời. Vị trí gen mã hoá cho 7 thành viên
APOBEC3 (A). Các enzyme trong họ gen APOBEC3 xúc tác phản ứng khử gốc amin
chuyển cytosine thành uracil trên ssDNA (B) [70]. APOBEC3A, APOBEC3C, và
APOBEC3H có 1 domain zinc-dependent cytidine deaminase (ZD-CDAs - domain
khử gốc amin của cytidine phụ thuộc kẽm), trong khi đó APOBEC3B, APOBEC3D,
APOBEC3F và APOBEC3G có hai domain ZD-CDAs (C). Vùng hoạt động xúc tác
khử gốc amin của APOBEC3 đƣợc thể hiện bằng màu xanh, vùng không hoạt động
xúc tác trong một số thành viên đƣợc thể hiện bằng màu đỏ (C) [64].
3
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
Các protein APOBEC3 đƣợc chia thành hai nhóm. Nhóm thứ nhất có bốn
thành viên là APOBEC3B, APOBEC3D, APOBEC3F và APOBEC3G chứa hai
domain ZD-CDAs, trong khi đó nhóm thứ hai có ba thành viên APOBEC3A,
APOBEC3C và APOBEC3H chứa một domain ZD-CDAs. Mỗi domain kết hợp với
kẽm thông qua motif H-X-E-X23-28-P-C-X2-4-C (motif có chức năng khử gốc amin)
đƣợc bảo tồn trong các thành viên của họ gen APOBEC3. Đồng thời domain này kết
hợp với glutamate hỗ trợ sự vận chuyển proton trong quá trình khử gốc amin của
cytosine [35]. APOBEC3A khử gốc amin của cytosine trên cả ssDNA và mRNA,
ƣu tiên làm biến đổi các cytosine đứng sau thymine (5’-TC). APOBEC3B,
APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3H cũng ƣu tiên khử gốc amin
của cytosine đứng sau thymine (5’-TC) nhƣng chỉ trên ssDNA; còn APOBEC3G
chỉ làm biến đổi tại các cytosine trƣớc một cytosine khác (5’-CC) [28].
Họ gen APOBEC3 biểu hiện ở nhiều mô nhƣng chủ yếu biểu hiện trong các
mô của hệ miễn dịch [19]. Cả bảy thành viên của họ gen biểu hiện cao ở phổi và
năm thành viên (APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3D, APOBEC3F và
APOBEC3G) biểu hiện cao ở lá lách. Trong đó, APOBEC3A biểu hiện mạnh nhất ở
phổi và lá lách (gấp 69 lần và 15 lần so với mức biểu hiện trung bình trong 20 cơ
quan của cơ thể), ngoài ra nó cũng biểu hiện mạnh ở mô mỡ và nhau thai (gấp 5,1
lần và 2,3 lần) [19]. Một số thành viên biểu hiện cao trong các cơ quan khác nhƣ
APOBEC3B ở tuyến vú và tim; APOBEC3C ở bàng quang và cổ tử cung;
APOBEC3D và APOBEC3H ở tuyến ức; APOBEC3F ở buồng trứng và đại tràng
[10, 19]. Đặc biệt sự biểu hiện của họ gen APOBEC3 đƣợc cảm ứng bởi interferon
phù hợp với vai trò của chúng là đáp ứng miễn dịch chống virus [58].
1.1.2. Mối liên hệ của họ gen APOBEC3 với ung thƣ
Các enzyme APOBEC3 đƣợc xác định vào năm 2002 dƣới dạng các tác nhân
làm đột biến DNA và ức chế virus. Harris cùng cộng sự (2002) trong quá trình
4
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
nghiên cứu APOBEC1 đã phát hiện thêm hai protein APOBEC3C và APOBEC3G
cung cấp những bằng chứng cho thấy chúng là tác nhân gây đột biến DNA. Ông đã
quan sát số lƣợng đột biến gây ra do biểu hiện của APOBEC3C và APOBEC3G
trong dòng tế bào có và không có uracil-DNA glycosylase (UDG - enzyme nhận
biết và loại bỏ uracil trong mạch DNA). Kết quả là số đột biến trong dòng tế bào
không có UDG tăng gấp 260 và 120 lần so với các tế bào có UDG. Không chỉ vậy,
đột biến C>T do hoạt động của APOBEC3C chiếm 94% và APOBEC3G gây đột
biến đến 88% tổng số đột biến của tế bào [25]. Cũng trong năm 2002, APOBEC3G
đƣợc phát hiện có liên quan đến khả năng chống virus. Protein Vif (Virion
infectivity factor - yếu tố lây nhiễm virion) đƣợc mã hóa bởi virus làm suy giảm
miễn dịch ở ngƣời (HIV-1). Vif gây ubiquitin hóa dẫn đến phân hủy các protein
miễn dịch của tế bào, cần thiết cho sự xâm nhiễm của virus. Tuy nhiên sự hiện diện
của Vif lại làm tăng biểu hiện APOBEC3G trong tế bào [29, 56]. APOBEC3G bám
vào và chỉnh sửa sợi DNA âm của virus trong quá trình phiên mã ngƣợc dẫn đến
tăng đột biến và bất hoạt provirus [56]. Những nghiên cứu này mở đƣờng cho hàng
loạt các thí nghiệm tiếp theo làm sáng tỏ vai trò của họ gen APOBEC3 đối với quá
trình ức chế virus.
Sự biểu hiện quá mức của các gen trong họ APOBEC3 làm tăng chỉnh sửa
DNA và RNA có thể dẫn đến đột biến. Đột biến phát sinh trên các gen ức chế khối
u có thể gây ung thƣ. Gen TP53 - một gen ức chế khối u có tần số đột biến tăng cao
trong các khối u biểu hiện mạnh APOBEC3B [63]. Vì vậy, họ gen APOBEC3 đƣợc
cho là các tiền gen sinh ung thƣ [39, 41]. Khi nghiên cứu trình tự gen của mẫu ung
thƣ vú từ 21 bệnh nhân khác nhau, các nhà khoa học đã phát hiện đột biến kataegis
(đột biến C thành T trong cặp TpC của hệ gen) xuất hiện trong hệ gen với tần số
lớn. Protein APOBEC3 đƣợc cho là có liên quan tới sự hình thành đột biến kataegis
vì enzyme này tác động đến cytosine [12, 40]. Steven và cộng sự (2013) nghiên cứu
các đột biến trên 14 loại ung thƣ khác nhau đƣa ra kết quả có 954247 đột biến ở
5
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
2680 exon. Trong đó, mRNA APOBEC3 biểu hiện cao có thể gây đột biến đến 68%
tổng số đột biến [50]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra hai thành viên APOBEC3A và
APOBEC3B có liên hệ đến sự phát sinh ung thƣ. Thật vậy, nhóm nghiên cứu của
Burn (2013) và nhóm nghiên cứu của Roberts (2013) cho thấy biểu hiện quá mức
của APOBEC3B là nguồn gốc phát sinh đột biến ở các loại ung thƣ nhƣ ung thƣ vú,
ung thƣ phổi, ung thƣ cổ tử cung [12, 50].
1.2.
Vai trò của gen APOBEC3A và APOBEC3B trong ung thƣ
APOBEC3A là một gen quan trọng liên quan đến đột biến soma trong hệ gen
ngƣời [13]. Protein APOBEC3A đƣợc tìm thấy trong cả nhân và tế bào chất; vì vậy,
hoạt động của protein này tác động trực tiếp đến DNA [54]. Gen APOBEC3A đƣợc
biểu hiện ở một số loại tế bào, bao gồm các tế bào sừng và các tế bào dòng tủy [6,
63]. Đặc biệt, gen này biểu hiện mạnh trong mô, tế bào dễ bị virus xâm nhập nhƣ tế
bào da [64]. Một số nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng APOBEC3A là thành viên quan
trọng nhất của họ gen APOBEC3 có đích nhắm đến là DNA ngoại lai [64].
APOBEC3A ức chế mạnh retrotransposons và các loại virus bao gồm parvovirus,
alpharetrovirus, HTLV-1 (virus bạch cầu T loại 1 ở ngƣời) và HIV-1 (virus gây suy
giảm miễn dịch ở ngƣời) trong giai đoạn sớm khi xâm nhiễm vào các tế bào dòng
tủy [55]. Tuy nhiên, sự biểu hiện bất thƣờng của APOBEC3A cũng tạo nên áp lực
chọn lọc làm thay đổi hệ gen của virus theo chiều hƣớng thích nghi với hoạt động
của gen này (Hình 1.2). Đối với hệ gen của tế bào, protein APOBEC3A có thể làm
tổn thƣơng DNA, gây đột biến soma và thúc đẩy sự chuyển dạng tế bào thành ung
thƣ do sự khử gốc amin cytidine trên ssDNA trong quá trình sao chép và phiên mã
[27, 37].
6
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
Hình 1.2. Mối liên hệ của APOBEC3A (A3A) với ung thƣ. Protein A3A phân bố
trong cả tế bào chất và nhân (A). A3A ức chế virus nhân bản trong nhân nhƣ virus
papilloma (HPV) và virus viêm gan B (HBV) (B). Sự biểu hiện quá mức của A3A
gây áp lực có thể dẫn đến sự thay đổi của bộ gen virus (đƣợc mô tả bằng màu đỏ)
(C). Biểu hiện A3A tăng khi có mặt của virus có thể làm tổn thƣơng DNA và gây đột
biến soma (D, E). Đột biến soma và tổn thƣơng DNA thúc đẩy sự chuyển dạng của tế
bào thành tế bào ác tính (F) [64].
Theo Se´bastien (2011) hoạt động quá mức của protein APOBEC3A có thể
gây tổn thƣơng DNA mà không liên quan đến quá trình apoptosis. Để đánh giá tác
động hoạt động quá mức của protein này đối với tính toàn vẹn của DNA, tác giả
kiểm tra sự phosphoryl hoá trên histone H2AX (H2AX - một thành viên của họ
histone H2A) [54]. Tế bào phản ứng với sự tổn thƣơng DNA bằng cơ chế DDR
7
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
(DNA damage response) - một cơ chế phân tử phức tạp giúp tế bào phát hiện và sửa
chữa tổn thƣơng DNA. Sự phosphoryl hóa histone H2AX tạo ra H2AX ở vị trí đứt
gãy trên sợi đôi DNA là một trong các đáp ứng theo cơ chế DDR. H2AX là đích
của nhiều protein tham gia sửa chữa DNA nhƣ protein ATM (Ataxia teleangiectasia
mutated protein kinase - truyền tín hiệu khi DNA bị tổn thƣơng để tạo phức hợp sửa
chữa DNA) hay protein DNA-PK (DNA-dependent protein kinase - protein tham
gia phức hợp sửa chữa sợi đôi DNA) [45]. Do đó, phân tích H2AX thƣờng đƣợc sử
dụng để phát hiện đứt gãy trên sợi đôi DNA. Kết quả của Se´bastien khi phân tích
miễn dịch huỳnh quang cho thấy sự có mặt của H2AX trong các tế bào biểu hiện
APOBEC3A mà không thấy ở các dòng tế bào đối chứng. Điều này chỉ ra hoạt động
của protein APOBEC3A có liên quan đến đứt gãy DNA [54]. Nhƣ vậy, biểu hiện
quá mức của APOBEC3A có thể là một trong những nguyên nhân gây đột biến và
tổn thƣơng DNA dẫn đến phát sinh ung thƣ.
Cùng với APOBEC3A, biểu hiện quá mức của APOBEC3B cũng làm tăng
đột biến, gây tổn thƣơng DNA dẫn đến hình thành ung thƣ. Theo Burns (2013),
APOBEC3B biểu hiện cao ở hầu hết các dòng tế bào và khối u vú nguyên phát nên
đƣợc xem là nguồn gây đột biến chính trong ung thƣ này [10].
Hình 1.3. Vai trò của APOBEC3B trong tiến trình ung thƣ [70].
8
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
Nhiều nghiên cứu cho thấy gen APOBEC3B đóng vai trò quan trọng trong
tiến trình ung thƣ vú (Hình 1.3). Thứ nhất, mức biểu hiện APOBEC3B tăng tƣơng
quan với tần số đột biến C>T cao trong khối u ác tính [10]. Những phân tích này
đƣợc thực hiện bằng cách so sánh mức độ biểu hiện mRNA của gen APOBEC3B
với số lƣợng đột biến trong khối u ác tính. Kết quả cho thấy khoảng 1000 đột biến
C>T trong tổng 3000 đột biến đƣợc quan sát trên bộ gen khi APOBEC3B biểu hiện
tăng gấp 3 lần [10]. Thứ hai, sự biểu hiện cao của APOBEC3B làm tăng đột biến
trên gen ức chế khối u TP53. Thực nghiệm xác định đƣợc 15 (25%), 7 (11,9%), 2
(7,1%) khối u có đột biến trên exon 5-9 của gen TP53, tƣơng ứng với mức độ biểu
hiện gen APOBEC3B cao, thấp và không biểu hiện [20]. Mức độ biểu hiện
APOBEC3B cao liên hệ có ý nghĩa với tần số đột biến tăng trên gen TP53 (P =
0,0312) [20]. Qua đó cho thấy vai trò của APOBEC3B trong tiến trình ung thƣ vú,
một trong những đích tác động của nó là gen ức chế khối u TP53.
Hai nhóm nghiên cứu của Burn (2013) và Refsland (2010) đã chứng minh
biểu hiện của APOBEC3B tăng trong các mô ung thƣ nhƣng tƣơng đối thấp trong
các mô lành [10, 46]. Biểu hiện cao của APOBEC3B đƣợc xem là nguyên nhân gây
đột biến trong ít nhất sáu loại ung thƣ bao gồm ung thƣ vú, phổi, cổ tử cung, bàng
quang và ung thƣ đầu cổ [12].
1.3.
Đa dạng di truyền
1.3.1. Đa dạng số bản sao (Copy Number Variation - CNV)
Đa dạng di truyền là những thay đổi có liên quan đến vật chất di truyền, nhờ
những thay đổi này mà mỗi ngƣời trở nên khác biệt với nhau. Một trong những đa
dạng di truyền đã đƣợc nghiên cứu từ lâu là đa hình đơn nucleotide (SNP) chiếm
khoảng 95,9% đa dạng trong hệ gen [4]. Một SNP đƣợc định nghĩa là sự thay đổi
nucleotide tại một vị trí trên chuỗi trình tự DNA, sự thay đổi này chiếm tỷ lệ ít nhất
1% trong quần thể [75]. Bên cạnh các SNPs đã biết, các đa dạng cấu trúc trong
9
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
phạm vi hệ gen (large-scale genomic variants) cũng đã đƣợc chứng minh đóng góp
rất lớn cho đa dạng di truyền. Đa dạng cấu trúc của hệ gen bao gồm mất/thêm đoạn
(Indels) và đa dạng số bản sao (CNV). Indels là sự mất hoặc thêm đoạn DNA nhỏ
hơn 1 kb, chiếm khoảng 4% đa dạng trong hệ gen [4]. Thuật ngữ CNV đƣợc Feuk
sử dụng đầu tiên vào năm 2006, đƣợc tác giả định nghĩa là một đoạn DNA dài bằng
hoặc lớn hơn 1 kb, có số bản sao thay đổi so với hệ gen tham chiếu. CNV tác động
đến kích thƣớc hệ gen lớn hơn Indels bao gồm mất, lặp hoặc thêm đoạn DNA có thể
lên tới một vài Mb [21]. Cơ chế hình thành CNV là tái tổ hợp tƣơng đồng không
alen (NAHR) (Hình 1.4). NAHR là sự tái tổ hợp tƣơng đồng xảy ra giữa hai đoạn
DNA có độ tƣơng đồng cao, nhƣng không phải trong cặp alen với nhau. NAHR
giúp sửa chữa các nhiễm sắc thể bị tổn thƣơng, dẫn đến sự sắp xếp lại hệ gen. Một
phần đáng kể (khoảng 10% - 22%) đa dạng cấu trúc hệ gen ở ngƣời đƣợc cho là kết
quả của NAHR [30]. CNV tuy chỉ xuất hiện với tần số thấp (< 1% đa dạng hệ gen)
nhƣng có thể ảnh hƣởng đến 12% kích thƣớc của hệ gen [4, 49].
10
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
Hình 1.4. Tái tổ hợp tƣơng đồng không alen (NAHR) hình thành các CNVs. Mũi tên
đỏ và xanh là trình tự DNA tƣơng đồng. NAHR gây ra đảo đoạn giữa hai trình tự
tƣơng đồng sắp xếp ngƣợc nhau (A). NAHR giữa các nhiễm sắc tử khác nhau dẫn
đến mất và lặp đoạn (B). NAHR trên cùng một nhiễm sắc tử có thể tạo ra mất đoạn,
phân đoạn DNA vòng sẽ bị mất trong các chu kỳ tế bào tiếp theo (C) [38].
Để xác định sự đóng góp của CNV và SNP tới kiểu hình của cá thể, một
nghiên cứu dựa trên Dự án Bản đồ Haplotype Quốc tế (International HapMap
project phase I) đã phân tích mối liên hệ thông qua mức độ biểu hiện của 1061 gen
với CNV và SNP. Trong đó, 83,6% gen liên hệ với SNP, 17,7% liên hệ với CNV và
1,3% liên hệ với cả hai [5]. Qua đó cho thấy SNP, CNV tác động đến kiểu hình và
có thể gây ra các hậu quả bệnh lý. Hơn 10 năm qua, CNV đã đƣợc chỉ ra đóng vai
trò quan trọng trong cả rối loạn di truyền cũng nhƣ các hội chứng bệnh phức tạp. Ví
dụ, hội chứng mất đoạn 22q11.2 đã đƣợc chứng minh gây ra bởi mất đoạn giữa hai
trình tự tƣơng đồng trên 22q11.2, làm mất một bản sao của các gen TBX1, CRKL,
11
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
MAPK1 và một số gen khác gây dị tật tim, hở vòm họng, giảm tiểu cầu, cong vẹo
cột sống, chậm phát triển… [9, 43]. Ngoài mất đoạn thì lặp đoạn cũng dẫn đến
những bệnh lý nhƣ bệnh thần kinh CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease type 1A).
Bệnh do một đoạn lặp khoảng 1,4 Mb chứa gen PMP22 (gen mã hóa cho protein
myelin ngoại vi 22 - giúp truyền tín hiệu thần kinh) ở trên 17p12. Sự lặp đoạn đó
làm tăng lƣợng protein PMP22 đƣợc tạo ra làm phá vỡ cấu trúc của vỏ myelin gây
teo cơ chân, tay và mất cảm giác [69]. Ngày nay, CNVs vẫn tiếp tục đƣợc các nhà
khoa học quan tâm nghiên cứu. Năm 2005, đa dạng mất đoạn khoảng 29,9 kb trên
22q13 làm mất gần nhƣ hoàn toàn vùng mã hóa của gen APOBEC3B đƣợc tìm thấy
có liên hệ với nguy cơ ung thƣ vú [15, 36, 48, 62].
1.3.2.
Đa dạng mất đoạn APOBEC3B và nguy cơ ung thƣ vú
Đa dạng di truyền mất đoạn APOBEC3B ở họ gen APOBEC3 đƣợc báo cáo
có liên quan đến phát sinh ung thƣ. Đa dạng này đƣợc hình thành do NAHR giữa
hai trình tự 350 bp tƣơng đồng 100% của gen APOBEC3A và gen APOBEC3B
(Hình 1.4 C), làm mất đi một đoạn khoảng 29,9 kb trải dài từ exon thứ năm của gen
APOBEC3A đến exon thứ tám của gen APOBEC3B [31]. Trình tự còn lại của hai
gen này đƣợc nối với nhau hình thành một gen lai APOBEC3A-APOBEC3B chứa
trình tự mã hóa của APOBEC3A và 3’-UTR của APOBEC3B (Hình 1.5) [41]. Nhƣ
vậy, tế bào mang đa dạng mất đoạn APOBEC3B sẽ thiếu đi ít nhất một bản sao của
trình tự mang mã di truyền cho enzyme APOBEC3B.
12
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
Hình 1.5. Mất đoạn hình thành giữa hai gen APOBEC3A và APOBEC3B nằm trên
nhiễm sắc thể 22 [41].
Đa dạng mất đoạn APOBEC3B đƣợc nghiên cứu đầu tiên bởi Kidd và cộng
sự (2007) ở 51 quần thể ngƣời trên thế giới, nhóm nghiên cứu đã đƣa ra tần suất
alen mất đoạn tại một số châu lục. Alen mất đoạn tồn tại rất hiếm trong quần thể
ngƣời châu Phi và châu Âu (tần suất 0,9% và 6%), phổ biến ở Đông Á, châu Mỹ
(36,9% và 57,7%) và gần nhƣ tuyệt đối ở châu Đại Dƣơng (92,9%) [31]. Katarzyna
và cộng sự (2017) cũng đƣa ra bản đồ tần suất alen mất đoạn APOBEC3B tại một số
nơi trên thế giới tƣơng đồng với kết quả của Kidd (Hình 1.6) [33].
13
Luận văn thạc sĩ khoa học
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
Hình 1.6. Phân bố tần suất alen mất đoạn APOBEC3B ở một số nơi trên thế giới. Kết
quả phân tích trên nhóm ngƣời khỏe mạnh trong các nghiên cứu đa trung tâm (metaanalysis). Mỗi chữ cái cho biết khu vực địa lý: A, B - châu Âu; C - Ma-rốc; D - Thụy
Điển; E, F, G - Ba Lan; H - Iran; I - Ấn Độ; J - Malaysia; K, L, M - Trung Quốc; N,
O - Nhật Bản. “n” cho biết số lƣợng mẫu trong nhóm ngƣời khỏe mạnh của mỗi
nghiên cứu, màu đen thể hiện tần suất alen mất đoạn APOBEC3B [33].
Cho đến nay có nhiều nghiên cứu về mối liên hệ giữa đa dạng mất đoạn
APOBEC3B với nguy cơ ung thƣ vú. Một số nghiên cứu tại châu Âu cho kết quả
không có mối liên hệ trong khi một số khu vực khác nhƣ Đông Á, Tây Á, Bắc Âu
lại cho kết quả ngƣợc lại. Tại Ba Lan, nhóm nghiên cứu của Katarzyna thực hiện
trên 2532 bệnh nhân ung thƣ vú cho thấy không có mối liên hệ giữa dạng mất đoạn
với nguy cơ ung thƣ vú [27]. Năm 2013, Long và cộng sự nghiên cứu trên 5830
bệnh nhân ung thƣ vú tại Trung Quốc cho thấy ngƣời mang mất đoạn một bản sao
APOBEC3B có nguy cơ bị ung thƣ tăng 1,31 lần so với ngƣời mang hai bản sao
nguyên vẹn của gen APOBEC3B [36]. Tiếp theo đó, nghiên cứu của Rezaei và cộng
sự (2015) trên 262 bệnh nhân tại Iran cũng cho thấy mối liên hệ có ý nghĩa giữa đa
dạng mất đoạn APOBEC3B với nguy cơ ung thƣ vú [48].
14
Luận văn thạc sĩ khoa học
1.4.
Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm
Tổng quan về ung thƣ vú
1.4.1. Tình hình ung thƣ vú
Ung thƣ là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tật và tử vong
trên thế giới. Chỉ trong năm 2018, ung thƣ đã cƣớp đi tính mạng của hơn 9 triệu
ngƣời. Trong đó ung thƣ vú là loại ung thƣ phổ biến nhất ở phụ nữ, dự tính có đến
600 nghìn ngƣời chết và khoảng 2,1 triệu ca ung thƣ mắc mới [34]. Tại Việt Nam
ung thƣ vú là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở phụ nữ và đứng thứ tƣ trong các
loại ung thƣ gây tử vong ở cả hai giới (Hình 1.7). Số ngƣời mắc ung thƣ vú ngày
càng gia tăng và có độ tuổi trẻ hóa. Từ năm 2012 đến năm 2018 số ca mắc mới hàng
năm đã tăng từ 11067 ngƣời lên 15229 ngƣời, độ tuổi mắc ung thƣ đã bị trẻ hóa chỉ
từ 20 đến 21 tuổi [34]. Với những số liệu nhƣ vậy ung thƣ vú ngày càng đƣợc quan
tâm nghiên cứu.
15
