Nghiên cứu điều kiện nuôi sinh khối vi tảo thalassiosira pseudonana để ứng dụng làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (7.45 MB, 40 trang )
PHỤ LỤC 1: DANH SÁCH CÁC TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN 18S rRNA ĐÃ
CÔNG BỐ TRÊN NGÂN HÀNG GEN (GENBANK) ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ
XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH CHỦNG LOẠI
STT
Loài
Mã số đăng ký
Tài liệu tham khảo
1
T. pseudonana CCAP 1085/12
KU900218.1
Woo (2008)
2
T. hendeyi
AM050629.1
Luddington và cộng sự (2012)
3
T. anguste - lineata
AY810854.1
Woo (2008)
4
T. curviseriata
AJ810859.1
Luddington và cộng sự (2012)
5
T. tenera
AJ810858.1
Luddington và cộng sự (2012)
6
T. concaviuscula
AJ810857.1
Luddington và cộng sự (2012)
7
T. punctigera
AJ810856.1
Luddington và cộng sự (2012)
8
T. delicatula
AJ810855.1
Luddington và cộng sự (2012)
9
T. profunda
AM235383.1
Guo và cộng sự (2015)
10
T. fluviatilis
AJ535170.1
Guo và cộng sự (2015)
11
T. weissflogii
KY399779.1
Woo (2008)
12
Phaeodactylum tricornutum
FR744760.1
Guo và cộng sự (2015)
13
Stephanopyxis turris
KJ671710.1
Guo và cộng sự (2015)
14
Nitzschia pusilla
AJ867015.1
Guo và cộng sự (2015)
PHỤ LỤC 2: PHƯƠNG PHÁP CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI VI TẢO
Sau khi pha môi trường xong cần bao gói cẩn thận và hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 oC
trong thời gian 15 phút, lấy ra để nguội và sử dụng. Tùy vào từng quy mô nuôi T.
pseudonana để sử dụng hàm lượng dinh dưỡng phục vụ sản xuất hiệu quả, cần thực hiện
pha theo công thức định lượng chính xác và chi tiết về hàm lượng, sử dụng sẽ cho hiệu quả
cao mà giảm được chi phí trong sản xuất.
1
2.1. Phương pháp sử dụng môi trường dinh dưỡng
Phương pháp sử dụng môi trường dinh dưỡng, có nhiều phương pháp sử dụng môi
trường dinh dưỡng nhằm mang lại hiệu quả kinh tế trong nuôi sinh khối vi tảo để thu năng
suất sinh khối cao. Trong đó có 2 phương pháp cho hiệu quả cao:
Phương pháp sử dụng môi trường dinh dưỡng một lần: Đây là phương pháp đang được
áp dụng rộng rãi và đem lại hiệu quả cao. Phương pháp này chỉ dùng một lần môi trường
dinh dưỡng khi bắt đầu tiến hành nhân nuôi sinh khối vi tảo, hoà tan hàm lượng dinh
dưỡng vào trong quy mô nuôi từ đầu vụ nuôi cho đến khi thu hoạch, chỉ cần thực hiện 1 lần
duy nhất. Nó sẽ cho hiệu quả cao, giảm được thời gian, ổn định được môi trường dinh
dưỡng trong khi thực hiện sản xuất. Hạn chế cơ bản của phương pháp này là không kiểm
soát được mức hấp thụ dinh dưỡng của tế bào vi tảo theo thời gian nhất định. Phương pháp
2
này được ứng dụng cho quy mô nuôi trong ống nghiệm, bình thủy tinh 0,25 L đến bể
composite 3,5 m3.
Phương pháp sử dụng môi trường dinh dưỡng nhiều lần: Phương pháp này phải tiến
hành cho môi trường dinh dưỡng theo từng đợt và tiến hành sử dụng môi trường sau khi đã
nhân giống, chia thành từng đợt. Phương pháp này có giá trị thực tiễn là kiểm soát mức độ
hấp thụ dinh dưỡng của chúng theo thời gian, kiểm soát được lượng môi trường cần sử
dụng trong quá trình nuôi, vi tảo sử dụng triệt để dinh dưỡng trong môi trường nuôi, hạn
chế dư thừa dinh dưỡng. Tuy nhiên, phương pháp này có thể làm giảm hiệu quả kinh tế và
đòi hỏi trình độ cao, chi phí cao, vì vậy chỉ dùng để nuôi một số vi tảo đặc trưng.
2.2. Hàm lượng sử dụng môi trường dinh dưỡng
Ở quy mô phòng thí nghiệm: Ở quy mô này vi tảo cần nhiều dinh dưỡng để thích nghi
và sinh trưởng. Sử dụng môi trường AGP 20% và silicate 30 µg/L với tỉ lệ 1 mL/L : 2 mL/L ở
quy mô nuôi trong ống nghiệm đến bình thủy tinh 2 L.
Ở quy mô pilot trong bể composite 0,2 - 3,5 m3: Vi tảo đang ở giai đoạn phát triển nhanh
về MĐTB và nhằm tiết kiệm chi phí sản xuất nên cần phải giảm hàm lượng môi trường
nuôi. Sử dụng môi trường AGP 20% và silicate 30 µg/L với tỉ lệ 1 mL/L : 2 mL/L.
PHỤ LỤC 3: TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ, PHẢN ỨNG PCR NHÂN MỘT
PHẦN GEN 18S rRNA, ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE, TINH SẠCH SẢN
PHẨM PCR VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN
Tách chiết ADN tổng số: ADN tổng số của các mẫu tảo được tách chiết nhờ sử dụng
ZR Plant/Seed ADN Mini Prep Kit với các bước như sau:
Chuẩn bị: Zymo - Spin IV - HRC Spin Filters (ống nắp màu xanh): bẻ cột, cho ống IV HRC Spin Filter vào Collection tube. Li tâm 9.000 vòng/phút trong 3 phút.
Bước 1: Cho 150 mg mẫu (nghiền bằng N2 lỏng) vào ZR Bashing Bead Lysis tube. Bổ
sung thêm 750 µL Lysis solution;
Bước 2: Vontex trong 10 phút;
Bước 3: Li tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, 4oC;
Bước 4: Hút 400 µL pha trên sang ống Zymo - Spin IV Spin IV Spin Filter (nắp màu
cam). Li tâm 9.000 vòng/ phút, ở 4oC;
Bước 5: Bổ sung 1.200 µL Plant/Seed ADN Binding Buffer vào ống Spin Filter ở bước
4. Bổ sung thêm 6 µL β - mecaptholethanol, mix đều;
Bước 6: Hút 800 µL hỗn hợp ở bước 5 vào cột Zymo - Spin IIC. Li tâm 12.000
vòng/phút trong 2 phút, ở ở 4oC;
Bước 7: Loại phần dịch trong ở Collection tube và lặp lại bước 6;
Bước 8: Bổ sung 200 µL ADN Pre - Wash Buffer vào cột Zymo - Spin IIC trong
Collection tube mới. Li tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, ở 4oC;
3
Bước 9: Bổ sung 500 µL Plant/Seed ADN Wash Buffer vào cột Zymo - Spin IIC. Li
tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, ở 4oC;
Bước 10: Chuyển lên cột Zymo - Spin IIC sang ống eppendorf 1,5 mL và bổ sung 70
µL ADN Elution Buffer vào cột. Li tâm 12.000 vòng/phút để hòa tan ADN;
Bước 11: Chuyển phần ADN đã hòa tan sang ống IV - HRC Spin Filter, đặt trong ống
eppendorf 1,5 mL. Li tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, ở 4oC để hòa tan ADN;
Bước 12: Thu lấy ADN tổng số đã được tinh sạch phù hợp cho chạy PCR.
Hàm lượng và chất lượng của ADN tổng số của các mẫu vi tảo được đo ở các bước
sóng 260 và 280 nm trên máy quang phổ (Nanno Drop) và kiểm tra bằng điện di trên gel
agarose 0,8%.
Phản ứng PCR nhân một phần gen 18S rRNA: một phần gen 18S rRNA của mẫu
Thalassiosira sp. được khuếch đại nhờ phản ứng PCR với cặp mồi Primer F và R. Sản
phẩm PCR có kích thước dự kiến là 1.100 bp. Phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể
tích là 20 L bao gồm 2 L ADN tổng số (50 - 100 ng/L), 2 L Green buffer (2X); 1 L
Primer F (10 M), 1 L Primer R (10 M), 1,5 μL dNTP (2,5 mM), 0,5 μL MgCl2 (50
mM) và 0,5 μL Taq DNA Polymerase (2u/μL) và 11,5 μL H2O. Chu trình nhiệt: bước 1:
94oC - 3 phút, bước 2: 94oC - 30 giây, bước 3: 55oC - 1 phút, bước 4: 72oC - 1 phút, bước
5: lặp lại 40 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4, bước 6: 72oC - 5 phút, bước 7: giữ sản phẩm ở
15oC cho tới khi sử dụng. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose
0,8%.
Điện di trên gel agarose: dựa trên đặc tính cấu trúc của các axít nucleic đó là các đại
phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt (ở pH =7) nên khi chịu tác động của một
điện trường có điện thế và cường độ thích hợp chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện
trường. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 0,8% và quan sát dưới đèn tử ngoại.
Tinh sạch sản phẩm PCR: sử dụng các cột tinh sạch, trên cột này được gắn các hạt có
vai trò giữ lại phân tử ADN khi chúng đi qua nhờ liên kết thuận nghịch. Sau đó, sử dụng
các dung dịch bám màng và rửa màng để loại bỏ các tạp chất bám trên phân tử ADN. Sản
phẩm PCR được tinh sạch theo Gene JET Purification Kit của hãng Thermo Fisher
Scientific.
Xác định trình tự gen: một phần gen 18S rRNA được xác định trình tự nucleotide trên
máy đọc trình tự tự động (ABI PRISM® 3100 - Avant Genetic Analyzer, USA) bằng cách
sử dụng bộ hóa chất chuẩn BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing ở Viện Công
nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Mô tả các phần mềm sử dụng trong nghiên cứu: mẫu Thalassiosira sp. được đọc trình
tự cả 2 chiều, các thông số về trình tự và chất lượng của trình tự được kiểm tra bằng phần
mềm BioEdit. Kết quả chỉ ra cho thấy, các peak đọc rõ ràng, không bị nhiễu. Việc so sánh,
đối chiếu trình tự của chiều đọc xuôi và chiều đọc ngược được tiến hành trên phần mềm
ClustalX (1.81) nhằm xác định trình tự của đoạn gen 18S rRNA hoàn chỉnh. Kết quả cho
thấy chúng tôi đã thu được đoạn trình tự gen 18S rRNA của mẫu Thalassiosira sp. có chiều
dài 1007 bp. Ngoài ra, để kiểm tra trình tự thu được xem có đúng thuộc chi Thalassiosira
hay không, chúng tôi tiến hành kiểm tra trên ngân hàng gen (GenBank) bằng chương trình
4
BLAST. Kết quả cho thấy đoạn trình tự thu được thuộc chi Thalassiosira có độ tương đồng
rất lớn với các loài thuộc chi Thalassiosira.
Sau khi thu được trình tự gen 18S rRNA của mẫu Thalassiosira sp., chúng tôi đã sử
dụng chương trình phần mềm ClustalX (1.81) và MEGA7 để phân tích trình tự đó với 12
trình tự thuộc chi Thalassiosira và 3 trình tự của nhóm ngoại có quan hệ gần gũi với chi
Thalassiosira. Chương trình MEGA7 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) được
phát triển với việc tích hợp các công cụ phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng
loại tương đối mạnh, cho kết quả phân tích có độ tin cậy cao. Trong chương trình này,
chúng tôi sử dụng phương pháp Neigbour - Joining (NJ) với thuật giải Kimura 2 thông số
(Kimura 2 parameter), giá trị Bootstrap là 1000 lần lặp lại và các thông số mặc định khác
để xây dựng cây phát sinh chủng loại đối với trình tự đoạn gen 18S rRNA của mẫu
Thalassiosira sp. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng sử dụng chương trình DNASTAR để xác
định tỉ lệ phần trăm tương đồng của từng cặp trình tự giữa các loài thuộc chi Thalassiosira,
tỉ lệ phần trăm tương đồng được thống kê dưới dạng ma trận tam giác trên và khoảng cách
di truyền được thống kê dưới dạng ma trận tam giác dưới. Đồng thời cũng kiểm tra lại và
so sánh được cây phát sinh chủng loại được thực hiện bởi 2 chương trình DNASTAR và
MEGA7.
Kết quả đo nồng độ ADN tổng số
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ ADN tổng số của mẫu Thalassiosira sp. bằng máy
quang phổ NanoDrop (Thermo - Scientific, Mỹ)
Stt
A260
A280
A260/A280
1
0,034
0,019
1,789
85
2
0,030
0,016
1,875
75
3
0,031
0,017
1,823
77,5
1,829
79,16
Trung bình
Nồng độ (ng/µL)
Ghi chú: hệ số pha loãng ADN tổng số: 50 lần, pha loãng bằng nước chạy PCR.
PHỤ LỤC 4: TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN 18S rRNA CỦA Thalassiosira sp.
Thalassiosira sp. (1007 bp)
TACCACATCCAAGGAAGGCGGCGCGTAAATTACCCAATACTGAAACAGTGA
GGTAGTGACAATAAATAACAATGCCGGGCCTTTACAGGTCTGGCAATTGGAAT
GAGAACAATTTAAATCCCTTAATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGC
CGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGC
TCGTAGTTGGATTTCTGGCAGGAGCGACCGGTCTCACACTCAGTGCGAGAACT
CGTGTTGTCTCTGGCCATCCTTGGGGATATCCTGTTTGGCATTAAGTTGTCGGG
CAGGGGATACCCATCGTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTTAAAGCAGGCTT
ATGCCAATATATTAGATAATAAGATAGGACCCTGGTACTATTTTGTTGGTTTGC
GCACCGAATGATTAAAAGAGACAGGCGGGGCTATTCGTATTGCATTGTCAGAG
GTGAAATTCTTGGATTTCTGCAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTAGCAAGG
5
ATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGATGATTAGATACC
ATCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTCGGGATTGGCGGTTGTTTTTTGG
CCAGCACCGTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGC
AAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCT
GCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGTGAG
GACAGATTGAGAGTTCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTT
AGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCGCCGCCT
GCTAAATAGTTCTGCGAATGGTTTTTCATTGGCAAGAGCTTCTTAGAGGGACGT
TCATTCTACAAGATGAAGGAAGATGGCGGCAATAACAGGTCTGTGATGCC.
PHỤ LỤC 5: PHƯƠNG PHÁP CHUẨN BỊ NGUỒN NƯỚC BIỂN SỬ DỤNG
TRONG CÁC THÍ NGHIỆM NUÔI SINH KHỐI VI TẢO, SẢN XUẤT GIỐNG
VÀ NUÔI THƯƠNG PHẨM TÔM THẺ CHÂN TRẮNG
Phương pháp chuẩn bị nguồn nước biển sử dụng trong các thí nghiệm nuôi sinh khối vi
tảo: Nguồn nước biển sử dụng cho quy mô phòng thí nghiệm phải được lấy vào bình thủy
tinh 2 L và tiến hành hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 15 phút, chờ nguội và
lấy ra kiểm tra, đưa về nhiệt độ phòng, san ra ống nghiệm, bình thủy tinh (0,25 - 2 L) để
tiến hành thí nghiệm. Nguồn nước sử dụng cho quy mô pilot thì bơm trực tiếp từ bể dự trữ
nước vào các quy mô nuôi trên bể composite (0,2 - 3,5 m3). Sau khi bơm vào các hệ thống
diệt khuẩn nguồn nước bằng javel 30 ppm kết hợp sục khí 12 - 14 giờ, sử dụng sodium
thiosulfate (Na2S2O3) 30 ppm để khử lượng javel dư trong các quy mô nuôi sinh khối T.
pseudonana nói trên.
Chuẩn bị nguồn nước biển sử dụng trong sản xuất giống và nuôi thương phẩm TTCT
đảm bảo các điều kiện môi trường: độ mặn 30 - 31‰, nhiệt độ 29 - 30oC, bổ sung 180 200 mg CaCO3/L và pH 7,9 - 8,2.
PHỤ LỤC 6: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƯỢNG KHÔ
Sinh khối khô tảo (SKK, g/l) được tính theo phương pháp sấy khô mẫu ở 105oC
(Elliquot và cộng sự, 1934) được tiến hành như sau:
Bước 1: Sấy cốc cân ở 105oC trong 3 giờ. Lấy cốc ra để nguội trong silicator (trong 30
phút). Cân khối lượng cốc và lặp lại cho đến khi khối lượng cốc không đổi, được m 1 (g).
Bước 2: Lấy 10 mL dịch tảo cho vào cốc đã sấy ở bước 1 và sấy tiếp ở 105oC trong 24
giờ. Lấy ra để nguội trong silicator (30 phút), cân khối lượng cốc và sinh khối. Lặp lại quá
trình sấy đến khối lượng không đổi được m2 (g). Tiến hành tương tự với 10 mL môi trường
nuôi (không có tảo) được m3 (g).
Bước 3: Tính trọng lượng khô của tảo theo công thức sau:
SKK (g/l) =
(m2 - m1) - (m3 - m1)
6
x 1.000
10
Trong đó: (m2 - m1) là khối lượng khô của (sinh khối tảo + môi trường)
(m3 - m1) là khối lượng khô của môi trường
PHỤ LỤC 7: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHLOROPHYLL A, B VÀ
CAROTENOIT
Bước 1: Lấy 5 mL dịch tảo lọc qua giấy GF/C bằng hệ thống lọc hút chân không. Sau
đó giấy lọc có chứa sinh khối tảo được nghiền bằng cát thuỷ tinh để phá vỡ tế bào. Nghiền
cho đến khi tạo thành một hỗn hợp mịn.
Bước 2: Bổ sung 5 mL axeton 90% vào hỗn hợp trên và đổ vào ống nghiệm (có quấn
giấy bạc).
Bước 3: Lặp lại bước 2 để đảm bảo lấy hết được hỗn hợp dịch axeton có chứa sắc tố tảo
từ cối chày sứ.
Bước 4: Lọc hỗn hợp ở bước 3 với hệ thống lọc hút chân không. Thu phần dịch trong,
định mức lên 10 mL bằng axeton 90% và chuyển dịch này vào ống nghiệm (có quấn giấy
bạc);
Chú ý cần phải tiến hành các bước nêu trên trong tối và các dụng cụ phải được để trong
đá để giảm tối đa sự phá huỷ chlorophyll do tác dụng của ánh sáng.
Bước 5: Đo OD của dịch chiết bằng máy đo quang phổ ở các bước sóng 665, 645, 630
và 480 nm (sử dụng axeton 90% làm blank). Ghi giá trị OD tương ứng với các bước sóng
nêu trên.
Bước 6: Tính hàm lượng sắc tố theo công thức đã được Strick Land và Person (1977)
công bố như sau:
mg sắc tố/m3 (µg/l) = C/V
Trong đó: V là lượng thể tích dịch tảo đem lọc (tính ra lít)
C: Giá trị nhận được từ các công thức sau:
C (chlorophyll a) = 11,6*E665 - 1,31*E645 - 0,14*E630
C (chlorophyll b) = 20,7*E645 - 4,34*E665 - 4,42*E630
C (total carotenoit) = 4,0*E480
Với Ei: là giá trị OD đo được ở bước sóng i
PHỤ LỤC 8: CÁC CÔNG ĐOẠN HOẠT HÓA GIỐNG Thalassiosira
pseudonana TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
7
(1) Cấy chuyển Thalassiosira pseudonana giống từ đĩa gốc sang các đĩa thí
nghiệm
Tiêu chí để lựa chọn đĩa gốc (hình 8.1): quan sát bên ngoài bằng mắt thường xem có dấu
hiệu bị nhiễm các loại nấm, đĩa sạch, đĩa được bọc cẩn thận, có mã số, được ghi ngày cấy
chuyển đầy đủ và không có dấu hiệu sử dụng trước đó. Quan sát dưới kính hiển vi độ phóng
đại 400 lần: chọn đĩa có các cụm tế bào và các tế bào đồng đều, đẹp và có màu sắc đặc trưng
của các vi tảo nói trên.
Phương pháp chuẩn bị đĩa agar:
Bước 1: Chuẩn bị nguồn nước biển để nấu agar có độ mặn 29 - 31‰; pH 7,5 - 8,5; 150 180 mg CaCO3/L.
Bước 2: Sử dụng cân điện tử độ chính xác 0,01 g, cân agar độ đậm đặc 0,8 - 1,5% hòa
tan vào thể tích nước cần dùng đã chuẩn bị sẵn.
Bước 3: Nấu agar bằng máy nấu chuyên dụng kết hợp với thanh nam châm khấy đều
trong suốt quá trình nấu.
Bước 4: Quan sát agar sôi đều và nổi bọt màu trắng tắt máy nấu.
Bước 5: San qua bình tam giác, tiến hành bọc bằng giấy bạc, sau đó đem hấp để tiệt
trùng bằng nồi áp suất nhiệt độ đạt 121oC trong khoảng thời gian 15 phút.
Bước 6: Lấy ra và chờ nhiệt độ của dung dịch agar hạ xuống còn 50 - 60oC, bổ sung môi
trường AGP 20% với 4 mL/L đã được tiệt trùng, lắc đều dung dịch.
Bước 7: Tiến hành san dung dịch agar vào đĩa petri khoảng 1/2 - 2/3 của đáy đĩa.
Bước 8: Để agar đông lại và lật ngược đĩa trong tủ vô khuẩn sau một đêm có thể sử
dụng để san giống vi tảo trên các đĩa này. Các đĩa agar đã chuẩn bị nên sử dụng hết 1 lần
và trong ngày, không nên để quá lâu dễ nhiễm khuẩn.
Kỹ thuật cấy Thalassiosira pseudonana trên đĩa thạch agar:
1
2
3
4
5
Hình 8.1. Sơ đồ cấy T. pseudonana trên đĩa thạch agar
Kỹ thuật cấy T. pseudonana từ ống nghiệm sang đĩa thạch agar (hình 8.1):
Bước 1: Lấy thanh gạt bằng kim loại nhúng vào cồn 96o, sau đó hơ qua lửa cho đỏ rồi
để nguội. Có thể thử thanh gạt lên da cổ tay, nếu còn nóng thì chưa sử dụng và loại bỏ
thanh đã thử không dùng vì dễ nhiễm khuẩn.
Bước 2: Đổ ống nghiệm chứa các vi tảo này vào đĩa thạch agar hoặc lấy thanh kim loại
nhúng vào ống nghiệm có chúng sau đó tráng trên bề mặt đĩa thạch agar.
8
Bước 3: Lấy thanh gạt bằng kim loại dàn đều khắp bề mặt thạch agar cho đến lúc bề
mặt thạch khô.
Bước 4: Lấy giấy parafilm bọc xung quanh vành đĩa vừa cấy các vi tảo nói trên lại, lật
ngược đĩa để phần có thạch agar lên trên tiếp xúc với ánh sáng. Các bước đều được thực
hiện trong tủ vô trùng.
Kỹ thuật cấy T. pseudonana từ đĩa sang đĩa thạch agar:
Mục đích: San từ đĩa agar trước sang đĩa agar mới nhằm bảo quản tảo gốc, tránh các đĩa
agar trước bị nhiễm hay có các tạp chất san qua đĩa agar mới nhằm tạo tảo gốc sạch và
không nhiễm các tạp chất khác. Với mục đích lưu giữ nguồn giống và kiểm tra giống vi tảo
nói trên về các tiêu chí kỹ thuật của nguồn giống, việc làm này sẽ tạo nguồn giống ổn định
và giống khỏe cho việc sử dụng nuôi sinh khối trong các trại sản xuất giống tôm thẻ chân
trắng.
Bước 1: Lấy thanh gạt bằng kim loại nhúng vào cồn 96o, sau đó hơ qua lửa cho đỏ rồi
để nguội. Có thể thử thanh gạt lên da cổ tay, nếu còn nóng thì chưa sử dụng và loại bỏ
thanh đã thử không dùng vì dễ nhiễm khuẩn.
Bước 2: Dùng thanh gạt bằng kim loại chọn 1 - 2 colony tảo đẹp (to và có màu vàng
sẫm hoặc đen).
Bước 3: Cấy lên đĩa thạch agar mới theo 3 đường giống như ở hình 8.1 (từ 1 sang 2).
Bước 4: Ghi mã số cho đĩa thạch agar và ngày cấy giống.
Bước 5: Lấy giấy parafilm bọc xung quanh vành đĩa vừa cấy vi tảo này lại, lật ngược
đĩa để phần có thạch agar lên trên tiếp xúc với ánh sáng. Các bước đều được thực hiện
trong tủ vô trùng.
Bước 6: Đặt lên giàn nuôi và chiếu ánh sáng 24/24 giờ với CĐAS 5,0 - 5,5 klux, nhiệt
độ không khí 25 - 26oC.
Sau thời gian 4 - 7 ngày nuôi trên đĩa thạch agar trở lên thì cần kiểm tra đĩa thường
xuyên bằng mắt thường để loại bỏ các đĩa thạch có dấu hiệu nhiễm nấm lớn hoặc kiểm tra
dưới kính hiển vi để loại bỏ các đĩa không đạt yêu cầu chỉ giữ lại các đĩa có giống T.
pseudonana đạt các tiêu chí kỹ thuật về nguồn giống. Thời gian nuôi trên đĩa thạch agar, vi
tảo nói trên sẽ phát triển tốt từ 7 - 14 ngày nuôi. Kiểm tra dưới kính hiển vi các đĩa thạch
agar có vi tảo này phát triển đều và đẹp, các tế bào sạch và không nhiễm khuẩn, tế bào
không có dấu hiệu hoại tử thì sau đó cần chuyển ngay các đĩa đến khu vực hạn chế ánh
sáng để vi tảo nói trên không bị già hóa ngay từ đĩa thạch. Có thể cho các đĩa thạch agar
vào các hộp đậy nắp kín và bảo quản bằng tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 8 - 12 oC. Trước khi
đem ra sử dụng lại cần đưa các đĩa thạch agar trở lại môi trường ở điều kiện thường ít nhất
3 - 5 giờ để sử dụng nguồn giống hiệu quả tránh gây sốc các điều kiện môi trường cho vi
tảo này.
(2) Cấy chuyển mẫu Thalassiosira pseudonana từ đĩa petri sang ống nghiệm
9
Chúng tôi đã tinh sạch và lựa chọn nhiều phương pháp khác nhau với mục đích tiêu chuẩn
hóa chất lượng nguồn giống T. pseudonana. Các kết quả thu được có độ lặp và cho thấy, vi
tảo nói trên cần được thực hiện qua các công đoạn nuôi cấy bằng ống nghiệm và giữ giống
thì sẽ cho phép có thể bảo quản vi tảo được lâu hơn. Vi tảo này được chúng tôi nuôi với 3
mức là Original line (ống nghiệm gốc), Dilution line (mức lặp) và Production line (mức
sản xuất).
Kỹ thuật cấy T. pseudonana ở mức Original line:
Mục đích: Tạo nguồn giống thuần và tăng thêm thời gian bảo quản và lưu trữ nguồn
giống cho các trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng. Tiêu chuẩn hóa sơ cấp nguồn giống
vi tảo nói trên ngay từ trong các ống nghiệm gốc. Thời gian làm giống gốc mới ở mức nuôi
này thường khoảng 3 - 7 ngày.
Bước 1: Lấy thanh gạt bằng kim loại nhúng vào cồn 96o, sau đó hơ qua lửa cho đỏ rồi
để nguội. Có thể thử thanh gạt lên da cổ tay, nếu còn nóng thì chưa sử dụng và loại bỏ
thanh đã thử không dùng vì dễ nhiễm khuẩn.
Bước 2: Chọn và lấy colony đẹp từ đĩa tảo gốc và thuần cho vào ống nghiệm khoảng 8
mL đã bổ sung môi trường AGP 20%, đánh tan để tế bào lan đều trong nước, rồi hơ miệng
và nắp ống nghiệm qua đèn cồn sau đó đậy nắp, cho vào giá để ống nghiệm.
Bước 3: Ghi mã số cho ống nghiệm và ngày nhân giống.
Bước 4: Đặt lên giàn nuôi và chiếu ánh sáng 24/24 giờ với CĐAS 5,0 - 5,5 klux, nhiệt
độ không khí 25 - 26oC.
Sau thời gian 3 - 4 ngày nuôi trong ống nghiệm ở mức Original line trở lên cần kiểm tra
thường xuyên bằng cách quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 400 lần: có các cụm tế
bào và tế bào đồng đều, đẹp, tế bào hoàn chỉnh, không có tạp chất và có màu sắc đặc trưng
của vi tảo này và số lượng tế bào đang ở giai đoạn phân chia tế bào khoảng 10 - 15% để
nhân giống ở mức tiếp theo, loại bỏ các ống nghiệm không đạt yêu cầu chỉ giữ lại các ống
nghiệm có giống vi tảo nói trên đạt các tiêu chí kỹ thuật về nguồn giống. Thời gian nuôi
trong ống nghiệm ở vi tảo này ở mức Original line phát triển từ 3 - 4 ngày. Kiểm tra dưới
kính hiển vi các ống nghiệm ở mức Original line của chúng thấy tế bào phát triển đều và
đẹp, các tế bào sạch và không nhiễm khuẩn, tế bào không có dấu hiệu hoại tử thì cần
chuyển ngay các ống nghiệm đến khu vực hạn chế ánh sáng để vi tảo này không phát triển
quá mức. Sử dụng các ống nghiệm ở mức Original line để đem nhân nuôi ở mức Dilution
line.
Kỹ thuật cấy T. pseudonana ở mức Dilution line:
Mục đích: Tạo thêm nguồn giống thuần và tăng thêm thời gian bảo quản và lưu trữ
nguồn giống cho các trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng. Tiêu chuẩn hóa sơ cấp nguồn
giống ngay từ trong các ống nghiệm gốc. Tăng gấp 3 lần lượng giống gốc ban đầu. Thời
gian nhân giống gốc mới ở mức nuôi này thường kéo dài khoảng 3 - 4 ngày.
Bước 1: Sử dụng pipet hút nước biển được tiệt trùng đã bổ sung môi trường AGP 20% cho
vào ống nghiệm 10 mL, hút vào 3 loại ống gọi các ống nghiệm lần lượt là X, X’ và X’’.
Bước 2: Hút vi tảo nói trên ở ống nghiệm Original line với thể tích 1 mL cho vào ống
nghiệm thứ nhất (ống nghiệm X), lắc ống nghiệm X nhẹ bằng máy lắc để tế bào lan đều
10
trong nước, rồi hơ miệng và nắp ống nghiệm qua đèn cồn sau đó đậy nắp, cho vào giá để
ống nghiệm.
Bước 3: Hút vi tảo này ở ống nghiệm X với thể tích 1 mL cho vào ống nghiệm thứ hai
(ống nghiệm X’), lắc ống nghiệm X’ nhẹ bằng máy lắc để tế bào lan đều trong nước, rồi hơ
miệng và nắp ống nghiệm qua đèn cồn sau đó đậy nắp, cho vào giá để ống nghiệm.
Bước 4: Hút vi tảo nói trên ở ống nghiệm X’ với thể tích 1 mL cho vào ống nghiệm thứ
ba (ống nghiệm X’’), lắc ống nghiệm X’’ nhẹ bằng máy lắc để tế bào lan đều trong nước,
rồi hơ miệng và nắp ống nghiệm qua đèn cồn sau đó đậy nắp, cho vào giá để ống nghiệm.
Bước 5: Ghi mã số cho ống nghiệm và ngày nhân giống.
Bước 6: Đặt tất cả các ống nghiệm lên giàn nuôi và chiếu ánh sáng 24/24 giờ với CĐAS
5,0 - 5,5 klux, nhiệt độ không khí 25 - 26 oC.
Sau thời gian nuôi trong ống nghiệm X (2 ngày), X’ (3 ngày), X’’ (4 ngày) trở lên cần
kiểm tra thường xuyên tình trạng tảo bằng cách quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 400
lần: có các cụm tế bào và tế bào đồng đều, đẹp, tế bào hoàn chỉnh, không bị nhiễm tạp chất
và có màu sắc đặc trưng của vi tảo này và số lượng tế bào đang ở giai đoạn phân chia tế
bào khoảng 15 - 25% để nhân giống ở mức tiếp theo, loại bỏ các ống nghiệm không đạt
yêu cầu và chỉ giữ lại các ống nghiệm có giống vi tảo nói trên đạt các tiêu chí kỹ thuật về
nguồn giống. Kiểm tra dưới kính hiển vi các ống nghiệm X, X’, X’’. Nếu thấy chúng phát
triển đều và đẹp, các tế bào sạch và không nhiễm khuẩn, tế bào không có dấu hiệu hoại tử
thì cần chuyển ngay các ống nghiệm đến khu vực có hạn chế ánh sáng để chúng không
phát triển quá mức. Sử dụng các ống nghiệm X, X’, X’’ ở mức Dilution line để đem nhân
nuôi ở mức Production line.
Kỹ thuật cấy T. pseudonana ở mức Production line:
Mục đích: Tạo nguồn giống vi tảo nói trên dùng cho việc sản xuất sinh khối trong các
trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng. Tiêu chuẩn hóa sơ cấp nguồn giống này ngay từ
trong các ống nghiệm ở mức sản xuất. Thời gian nhân nuôi giống gốc mới ở mức nuôi này
thường khoảng 2 - 3 ngày.
Bước 1: Sử dụng pipet hút nước biển được tiệt trùng đã bổ sung môi trường AGP 20% cho
vào ống nghiệm 8 mL.
Bước 2: Hút vi tảo này ở ống nghiệm X, X’, X’’ (Dilution line) với thể tích 1 mL cho
vào ống nghiệm Production line, lắc ống nghiệm Production line nhẹ bằng máy lắc để tế
bào lan đều trong nước, rồi hơ miệng và nắp ống nghiệm qua đèn cồn sau đó đậy nắp, cho
vào giá để ống nghiệm.
Bước 5: Ghi mã số cho ống nghiệm và ngày nhân giống.
Bước 6: Đặt các ống nghiệm lên giàn nuôi và chiếu ánh sáng 24/24 giờ với CĐAS 5,0 5,5 klux, nhiệt độ không khí 25 - 26oC.
Sau thời gian 2 ngày nuôi trong ống nghiệm Production line cần kiểm tra thường xuyên
bằng cách quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 400 lần có các cụm tế bào và tế bào đồng
đều, đẹp, tế bào hoàn chỉnh, không có tạp chất và có màu sắc đặc trưng của vi tảo này và
số lượng tế bào đang ở giai đoạn phân chia tế bào khoảng 20 - 30% để nhân giống ở mức
sản xuất, loại bỏ các ống nghiệm không đạt yêu cầu và chỉ giữ lại các ống nghiệm có giống
đạt các tiêu chí kỹ thuật về nguồn giống để sản xuất sinh khối. Sử dụng các ống nghiệm ở
11
mức Production line để đem nhân nuôi sinh khối. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử
dụng các ống nghiệm Production line làm nguồn giống phục vụ nghiên cứu và nuôi sinh
khối để thử nghiệm trong sản xuất giống tôm thẻ chân trắng.
PHỤ LỤC 9: MẬT ĐỘ TẾ BÀO CỦA Thalassiosira pseudonana Ở BỂ
COMPOSITE 3,5 M3
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau lên sinh
trưởng của T. pseudonana
Ngày nuôi
F/2
TMRL
AGP 20%
Conway
Walne
0
0,20 ± 0,00
0,20 ± 0,00
0,20 ± 0,00
0,20 ± 0,00
0,20 ± 0,00
1
0,22 ± 0,03
0,23 ± 0,02
0,24 ± 0,02
0,22 ± 0,04
0,23 ± 0,02
2
0,29 ± 0,01
0,34 ± 0,02
0,37 ± 0,03
0,30 ± 0,01
0,31 ± 0,03
3
0,32 ± 0,04
0,37 ± 0,01
0,40 ± 0,05
0,39 ± 0,02
0,40 ± 0,05
4
0,37 ± 0,04
0,40 ± 0,01
0,50 ± 0,04
0,43 ± 0,01
0,44 ± 0,04
5
0,44 ± 0,03
0,46 ± 0,02
0,58 ± 0,04
0,50 ± 0,02
0,51 ± 0,04
6
0,48 ± 0,05
0,65 ± 0,04
0,57 ± 0,03
0,58 ± 0,04
7
0,49 ± 0,02
0,58 ± 0,02
0,62 ± 0,02
0,53 ± 0,05
0,59 ± 0,03
8
0,55 ± 0,04
0,56 ± 0,04
0,58 ± 0,02
0,49 ± 0,02
0,53 ± 0,03
9
0,49 ± 0,03
0,52 ± 0,03
0,55 ± 0,03
0,43 ± 0,03
0,44 ± 0,03
10
0,43 ± 0,03
0,44 ± 0,02
0,49 ± 0,02
0,39 ± 0,04
0,40 ± 0,04
11
0,40 ± 0,05
0,42 ± 0,04
0,44 ± 0,04
0,36 ± 0,04
0,37 ± 0,04
12
0,33 ± 0,05
0,36 ± 0,02
0,40 ± 0,01
0,32 ± 0,03
0,33 ± 0,03
13
0,30 ± 0,02
0,32 ± 0,04
0,36 ± 0,04
0,29 ± 0,02
0,30 ± 0,02
14
0,27 ± 0,05
0,28 ± 0,02
0,32 ± 0,02
0,27 ± 0,01
0,28 ± 0,03
0,54 ± 0,02
Ghi chú: Số liệu thu được ở trên bảng là kết quả của mỗi công thức được lặp lại 3 lần; MĐTB
là giá trị TB ± SD; đơn vị tính x 106 TB/mL.
12
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu khác nhau lên sinh trưởng
của T. pseudonana
Ngày nuôi
0,1
0,15
0,20
0,25
0,30
0
0,10 ± 0,00
0,15 ± 0,00
0,20 ± 0,00
0,25 ± 0,00
0,30 ± 0,00
1
0,12 ± 0,02
0,17 ± 0,01
0,22 ± 0,02
0,30 ± 0,05
0,33 ± 0,05
2
0,21 ± 0,02
0,23 ± 0,01
0,38 ± 0,03
0,43 ± 0,03
0,41 ± 0,01
3
0,25 ± 0,01
0,28 ± 0,04
0,41 ± 0,05
0,53 ± 0,05
0,56 ± 0,04
4
0,29 ± 0,01
0,33 ± 0,01
0,44 ± 0,01
0,61 ± 0,04
0,57 ± 0,03
5
0,35 ± 0,01
0,45 ± 0,02
0,54 ± 0,03
0,61 ± 0,04
0,53 ± 0,01
6
0,41 ± 0,02
0,66 ± 0,03
0,60 ± 0,05
0,47 ± 0,05
7
0,43 ± 0,01
0,54 ± 0,03
0,63 ± 0,02
0,52 ± 0,03
0,42 ± 0,01
8
0,44 ± 0,03
0,53 ± 0,03
0,57 ± 0,02
0,49 ± 0,05
0,39 ± 0,01
9
0,42 ± 0,05
0,46 ± 0,02
0,53 ± 0,03
0,37 ± 0,03
0,32 ± 0,02
10
0,40 ± 0,01
0,39 ± 0,03
0,46 ± 0,02
0,34 ± 0,02
0,29 ± 0,02
11
0,37 ± 0,05
0,38 ± 0,04
0,42 ± 0,04
0,29 ± 0,01
0,26 ± 0,03
12
0,34 ± 0,01
0,36 ± 0,03
0,40 ± 0,02
0,25 ± 0,02
0,22 ± 0,02
13
0,29 ± 0,03
0,32 ± 0,02
0,35 ± 0,04
0,22 ± 0,01
0,19 ± 0,03
14
0,24 ± 0,01
0,30 ± 0,02
0,32 ± 0,02
0,20 ± 0,02
0,13 ± 0,03
0,48 ± 0,04
Ghi chú: Số liệu thu được ở trên bảng là kết quả của mỗi công thức được lặp lại 3 lần; MĐTB
là giá trị TB ± SD; đơn vị tính x 106 TB/mL.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng khác nhau lên sinh trưởng của
T. pseudonana
Ngày nuôi
4 klux
6 klux
8 klux
10 klux
12 klux
0
0,20 ± 0,00
0,20 ± 0,00
0,20 ± 0,00
0,20 ± 0,00
0,20 ± 0,00
1
0,21 ± 0,01
0,22 ± 0,02
0,23 ± 0,02
0,23 ± 0,04
0,24 ± 0,02
2
0,28 ± 0,03
0,30 ± 0,02
0,31 ± 0,05
0,35 ± 0,04
0,35 ± 0,03
3
0,30 ± 0,05
0,32 ± 0,01
0,34 ± 0,04
0,37 ± 0,05
0,41 ± 0,05
4
0,34 ± 0,04
0,35 ± 0,04
0,37 ± 0,04
0,40 ± 0,04
0,44 ± 0,01
13
5
0,36 ± 0,02
6
0,39 ± 0,03
7
0,43 ± 0,03
8
0,39 ± 0,02
0,40 ± 0,01
0,47 ± 0,02
0,54 ± 0,03
0,44 ± 0,04
0,59 ± 0,01
0,65 ± 0,03
0,45 ± 0,02
0,46 ± 0,03
0,55 ± 0,05
0,63 ± 0,02
0,44 ± 0,02
0,44 ± 0,01
0,46 ± 0,05
0,51 ± 0,02
0,57 ± 0,02
9
0,40 ± 0,03
0,42 ± 0,03
0,44 ± 0,02
0,46 ± 0,03
0,53 ± 0,03
10
0,36 ± 0,04
0,39 ± 0,02
0,40 ± 0,03
0,41 ± 0,04
0,46 ± 0,02
11
0,32 ± 0,04
0,38 ± 0,04
0,39 ± 0,05
0,39 ± 0,01
0,42 ± 0,04
12
0,26 ± 0,03
0,36 ± 0,02
0,37 ± 0,04
0,37 ± 0,03
0,40 ± 0,02
13
0,23 ± 0,02
0,29 ± 0,04
0,33 ± 0,02
0,33 ± 0,01
0,35 ± 0,04
14
0,19 ± 0,02
0,27 ± 0,02
0,29 ± 0,05
0,30 ± 0,03
0,32 ± 0,02
0,43 ± 0,01
Ghi chú: Số liệu thu được ở trên bảng là kết quả của mỗi công thức được lặp lại 3 lần; MĐTB
là giá trị TB ± SD; đơn vị tính x 106 TB/mL.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn khác nhau lên sinh trưởng của T.
pseudonana
Ngày nuôi
15‰
20‰
25‰
30‰
35‰
0
0,20 ± 0,00
0,20 ± 0,00
0,20 ± 0,00
0,20 ± 0,00
0,20 ± 0,00
1
0,22 ± 0,03
0,23 ± 0,03
0,23 ± 0,05
0,24 ± 0,04
0,23 ± 0,05
2
0,29 ± 0,05
0,33 ± 0,03
0,37 ± 0,02
0,38 ± 0,02
0,34 ± 0,05
3
0,39 ± 0,05
0,39 ± 0,04
0,40 ± 0,04
0,46 ± 0,04
0,44 ± 0,01
4
0,43 ± 0,04
0,44 ± 0,03
0,45 ± 0,04
0,50 ± 0,03
0,47 ± 0,04
5
0,46 ± 0,03
0,48 ± 0,02
0,49 ± 0,02
0,54 ± 0,04
0,50 ± 0,02
6
0,49 ± 0,05
0,51 ± 0,03
0,66 ± 0,04
0,53 ± 0,03
7
0,50 ± 0,04
0,51 ± 0,03
0,52 ± 0,03
0,63 ± 0,03
0,48 ± 0,03
8
0,50 ± 0,03
0,50 ± 0,01
0,50 ± 0,04
0,60 ± 0,03
0,46 ± 0,02
9
0,46 ± 0,04
0,48 ± 0,03
0,49 ± 0,03
0,55 ± 0,04
0,42 ± 0,03
10
0,42 ± 0,03
0,45 ± 0,04
0,46 ± 0,04
0,51 ± 0,03
0,37 ± 0,02
11
0,40 ± 0,04
0,41 ± 0,04
0,43 ± 0,04
0,47 ± 0,03
0,32 ± 0,04
0,50 ± 0,03
14
12
0,37 ± 0,03
0,38 ± 0,03
0,39 ± 0,02
0,42 ± 0,02
0,28 ± 0,02
13
0,27 ± 0,02
0,28 ± 0,02
0,33 ± 0,02
0,39 ± 0,01
0,23 ± 0,04
14
0,15 ± 0,03
0,24 ± 0,03
0,28 ± 0,01
0,32 ± 0,02
0,16 ± 0,02
Ghi chú: Số liệu thu được ở trên bảng là kết quả của mỗi công thức được lặp lại 3 lần; MĐTB
là giá trị TB ± SD; đơn vị tính x 106 TB/mL.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ sục khí khác nhau lên sinh trưởng của T.
pseudonana
Ngày nuôi
15/24h
17/24h
19/24h
21/24h
23/24h
24/24h
0
0,20 ± 0,00
0,20 ± 0,00
0,20 ± 0,00
0,20 ± 0,00
0,20 ± 0,00
0,20 ± 0,00
1
0,21 ± 0,01
0,22 ± 0,05
0,22 ± 0,02
0,24 ± 0,01
0,25 ± 0,04
0,25 ± 0,03
2
0,27 ± 0,03
0,29 ± 0,02
0,31 ± 0,03
0,33 ± 0,04
0,38 ± 0,04
0,41 ± 0,03
3
0,30 ± 0,05
0,32 ± 0,02
0,32 ± 0,02
0,35 ± 0,01
0,39 ± 0,05
0,46 ± 0,05
4
0,33 ± 0,04
0,34 ± 0,01
0,35 ± 0,01
0,38 ± 0,04
0,43 ± 0,04
0,51 ± 0,04
5
0,35 ± 0,02
0,36 ± 0,02
0,37 ± 0,02
0,46 ± 0,04
0,54 ± 0,05
0,57 ± 0,01
6
0,37 ± 0,03
0,38 ± 0,05
0,38 ± 0,02
0,53 ± 0,02
0,60 ± 0,03
0,65 ± 0,04
7
0,43 ± 0,03
0,45 ± 0,02
0,45 ± 0,03
0,50 ± 0,04
0,52 ± 0,04
0,61 ± 0,02
8
0,43 ± 0,01
0,43 ± 0,04
0,44 ± 0,02
0,46 ± 0,02
0,49 ± 0,02
0,57 ± 0,03
9
0,40 ± 0,03
0,41 ± 0,03
0,42 ± 0,03
0,43 ± 0,02
0,46 ± 0,03
0,53 ± 0,03
10
0,36 ± 0,04
0,37 ± 0,02
0,38 ± 0,02
0,39 ± 0,03
0,41 ± 0,04
0,49 ± 0,04
11
0,31 ± 0,04
0,33 ± 0,04
0,34 ± 0,04
0,35 ± 0,04
0,36 ± 0,04
0,38 ± 0,05
12
0,26 ± 0,03
0,28 ± 0,02
0,29 ± 0,02
0,30 ± 0,04
0,34 ± 0,03
0,36 ± 0,03
13
0,20 ± 0,02
0,23 ± 0,04
0,25 ± 0,04
0,27 ± 0,02
0,28 ± 0,02
0,29 ± 0,02
14
0,17 ± 0,02
0,19 ± 0,02
0,20 ± 0,02
0,22 ± 0,02
0,25 ± 0,03
0,27 ± 0,03
Ghi chú: Số liệu thu được ở trên bảng là kết quả của mỗi công thức được lặp lại 3 lần; MĐTB
là giá trị TB ± SD; đơn vị tính x 106 TB/mL.
15
PHỤ LỤC 10: HÌNH ẢNH MINH HỌA BỐ TRÍ CÁC THÍ NGHIỆM CỦA Thalassiosira pseudonana
16
PHỤ LỤC 11: HÌNH ẢNH CÁC QUY MÔ NUÔI TRỒNG Thalassiosira
pseudonana
Trong công trình nghiên cứu này chúng tôi đã thiết kế và vận hành các quy mô nuôi
trồng khác nhau để nuôi trồng T. pseudonana thành công, sinh khối tươi được thu hoạch để
làm thức ăn tươi sống cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng. Kết quả của các quy mô nuôi trồng
được trình bày ở trên hình 11.1.
Hình 11.1. Hình ảnh nhân nuôi của T. pseudonana ở các quy mô khác nhau.
(A): đĩa thạch, (B): Ảnh tế bào dưới kính hiển vi quang học nuôi trong đĩa, (C): ống
nghiệm, (D): bình thủy tinh 0,25 L, (E): bình thủy tinh 1 L, (F): bình thủy tinh 2 L, (G): bể
composite 0,2 m3, (H, I): bể composite 1 m3, (K, L, M): bể composite 3,5 m3.
PHỤ LỤC 12: QUY TRÌNH THU HOẠCH Thalassiosira pseudonana Ở
QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ PILOT
Mục đích thu hoạch sinh khối của chúng tôi là để làm thức ăn tươi trong trại sản xuất
giống tôm thẻ chân trắng đạt hiệu quả cao. Phương pháp thu hoạch phải đáp ứng các yêu
cầu đơn giản, nhanh chóng, năng suất lớn và làm như thế nào để giữ nguyên được sinh
khối tươi sạch, tế bào tảo ổn định, tránh làm hỏng, gãy, vỡ tế bào ảnh hưởng tới chất lượng
sản phẩm thu được làm giảm chất lượng của thức ăn. Xác định đây là một thách thức lớn
trong việc nuôi trồng vi tảo trên quy mô lớn là việc thu hoạch vi tảo bởi MĐTB tảo thấp
(chỉ khoảng 0,5 g/L đối với hệ thống nuôi hở), kích thước tế bào của T. pseudonana (4 - 5
µm) bé là một trong những vấn đề gây khó khăn cho việc thu hoạch tảo ngoại trừ những loài có
kích thước lớn như S. platensis (Van và cộng sự, 2013). Ngoài ra, phân tách và thu hồi sinh
khối tảo từ môi trường nuôi là một bước rất quan trọng trong quy trình sản xuất sinh khối tảo
cho nhiều mục đích khác nhau và bước này chiếm 20 - 30% giá thành sản xuất tảo (Uduman và
cộng sự, 2010). Do vậy, công nghệ về thu hoạch tảo luôn được đầu tư nghiên cứu và tìm kiếm
hướng tính ổn định cao. Việc lựa chọn phương pháp thu hoạch thích hợp phụ thuộc vào các
đặc tính của vi tảo chẳng hạn như MĐTB, kích thước cũng như yêu cầu của các sản phẩm đầu
17
ra (Brennan và cộng sự, 2010; Bilad và cộng sự, 2014). Nhìn chung, quá trình thu hoạch vi tảo
có thể được chia thành hai bước bao gồm việc thu hoạch tảo từ lượng thể tích lớn bằng cách sử
dụng phương pháp keo tụ, tuyển nổi, hoặc lắng trọng lực. Bằng phương pháp này, tổng số chất
rắn có thể đạt 2 - 7%. Sau đó là bước làm đặc với mục đích là cô đặc dịch tảo thu được thành
dạng bùn nhão bằng cách lọc và li tâm. Bước này cần nhiều năng lượng hơn bước thu hoạch từ
lượng lớn (Brennan và cộng sự, 2010).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng máy bơm để thu sinh khối tươi sống và cung
cấp trực tiếp vào trong bể ương nuôi ấu trùng tôm thẻ chân trắng. Dưới đây là các bước thu
hoạch sinh khối tươi sống của T. pseudonana trong trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng
của chúng tôi đang áp dụng:
(1) Chuẩn bị hệ thống máy bơm
Hệ thống máy bơm được vệ sinh sạch sẽ bao gồm cả vệ sinh hệ thống ống dẫn Φ60 mm
bằng cách bơm qua nước có chứa chất diệt khuẩn 1 lần, bơm lại bằng nước ngọt 1 - 2 lần
và tiến hành xả hết nước trong ống với khí đã diệt khuẩn. Phải đảm bảo rằng các ống dẫn
tảo tươi sống đã được vệ sinh sạch sẽ nhằm loại bỏ các tác động không mong muốn từ bên
ngoài môi trường lẫn vào trong sinh khối tảo thu được.
(2) Ngừng sục khí của hệ thống nuôi hở
Cần xác định rõ thu hoạch hệ thống sản xuất nào, để tiến hành ngưng sục khí từ 1 - 2
giờ trước khi bơm nhằm giảm lượng cặn có thể tồn tại trong hệ thống nuôi. Trong các quy
mô chúng tôi nuôi cấy hầu như không có cặn lắng đáy vì nguồn nước đã được xử lý sạch
trước khi đưa vào nuôi và hơn nữa nuôi bằng bể composite cũng có thể hạn chế được cặn
so với các loại hệ thống nuôi khác. Tuy nhiên, vào mùa mưa thì việc này có thể xuất hiện
một lớp cặn ở đáy của bể nuôi trồng.
(3) Cho bơm vào hệ thống nuôi
Cho bơm vào hệ thống nuôi nhẹ nhàng, tránh tác động mạnh gây vỡ, gãy tế bào của tảo
sẽ làm giảm chất lượng đáng kể của sinh khối thu được.
(4) Bơm trực tiếp vào bể ương ấu trùng tôm thẻ chân trắng
Bể ương ấu trùng được chuẩn bị nước biển sạch đã qua xử lý trước đó, để bơm tảo vào
nuôi cùng với ấu trùng tôm thẻ chân trắng để giúp chúng sử dụng thức ăn có hiệu suất cao.
Đây là kỹ thuật nuôi cùng một bể có tảo và ấu trùng tôm, cả hai đối tượng này sẽ hỗ trợ
nhau phát triển và góp phần có tính ổn định trong môi trường nước nuôi. Tảo phát triển
giúp tôm sử dụng làm thức ăn, phân thải của tôm cũng có thể là nguồn dinh dưỡng để tảo
phân chia và sinh trưởng, bởi vì trong nghiên cứu chúng tôi đã quan sát trong quá trình
nuôi trồng vi tảo nói trên từ khi bơm vào bể ương tôm cho đến khi kết thúc giai đoạn PL1
kiểm tra thấy tế bào của tảo vẫn còn.
(5) Vệ sinh sau khi kết thúc đợt thu hoạch
Sau khi việc thu hoạch kết thúc chúng tôi tiến hành vệ sinh máy bơm, vệ sinh ống dẫn
tảo Φ60 mm và làm tương tự như khâu chuẩn bị. Sau đó hệ thống ống dẫn sẽ được ngâm
hóa chất diệt khuẩn, hệ thống nuôi hở được vệ sinh sạch sẽ và phơi khô, chờ sử dụng lại.
18
Trong công trình này, chúng tôi đã thu hoạch sinh khối của T. pseudonana để nghiên
cứu tính an toàn của sinh khối nuôi trồng được. Việc thu hoạch đã được tiến hành thành
công và lặp lại nhiều lần, chúng tôi xây dựng quy trình thu hoạch T. pseudonana được trình
bày ở hình 12.1.
Bước 1: Cô đặc các tế bào tảo bằng chất kết bông hoặc lọc qua lưới lọc
T. pseudonana có MĐTB ở các bình thủy tinh 1 - 2 L đạt 1,58 - 1,59 x 106 tb/mL; 0,68 1,18 x 106 tb/mL ở quy mô bể composite 0,2 - 3,5 m3 sẽ tiến hành thu hoạch toàn bộ dịch nuôi
tảo. Việc tiến hành thu hoạch tảo còn phụ thuộc vào trạng thái sinh lí của tế bào. Nếu tế bào tảo
ở trạng thái sinh lí tốt, thu đúng pha thì việc thu hoạch tảo dễ dàng, đạt hiệu suất cao và chất
lượng tốt. Khi nuôi trồng vi tảo nói trên ở các bể hở lớn có sử dụng ánh sáng mặt trời thì nên
tiến hành thu hoạch vào buổi sáng sớm có ánh sáng mặt trời do quá trình quang hướng động
sau thời gian tối, tế bào tảo sẽ nổi lên trên bề mặt nước và việc thu hoạch sẽ dễ dàng hơn.
Nhiều công trình nghiên cứu cũng đã công bố cho thấy hàm lượng protein trong vi tảo nói
chung và vi tảo này có giá trị cao hơn vào buổi sáng so với các thời điểm khác trong ngày.
Hình 12.1. Quy trình thu hoạch T. pseudonana
Vì tế bào của T. pseudonana không có lông roi và kích thước bé nên nếu chúng ta có túi
lọc có kích thước nhỏ hơn 5 µm thì có thể áp dụng cách thu sinh khối tảo này bằng cách
dùng ống nhựa mềm Φ21 mm cho chảy từ từ bể nuôi ra các túi lọc. Tuy nhiên, vì kích
thước lỗ của túi lọc nhỏ hơn 5 µm nên việc lọc sẽ nhanh chóng bị giảm do túi lọc sẽ bị bít
kín lỗ. Do vậy, để tiến hành lọc được tốt thì định kỳ thay túi lọc 1 lần trong thời gian lọc từ
2 - 3 giờ sẽ cho hiệu quả nhanh và cao hơn. Có thể tiến hành hai dãy lưới lọc có kích thước
khác nhau. Với hàng lưới thứ nhất có kích thước lỗ khoảng >10 µm nhằm giữ lại các phần
không phải là T. pseudonana. Còn hàng lưới thứ hai có kích thước <5 µm sẽ cho phép lọc
19
được phần lớn tế bào của T. pseudonana. Tuy nhiên, đối với vi tảo nói trên thì việc sử dụng
lọc tảo qua túi lọc nhìn chung không hiệu quả và khó thực hiện trên quy mô lớn vì tốc độ
lọc tảo chậm, lưới dễ bị bít tắc. Hiệu quả lọc theo phương pháp này chỉ đạt từ 40 - 55%.
Bước 2: Dịch tảo cô đặc (5 - 10% thể tích dịch ban đầu) thu được
Sau khi tủa bông bằng chitosan 0,4% axít axetic, dịch phía trên được xi phông loại nước
chỉ giữ lại khoảng 5 - 10% thể tích dịch ban đầu hoặc tảo được giữ lại trên bề mặt túi lọc được
gạt dồn vào trong ca nhựa loại 5 L có lót mặt trong là các túi vải có kích thước mắt lỗ là 2 - 5
µm. Ca nhựa và túi vải này đều được khử trùng bằng cồn 70o để vô trùng tối đa.
Bước 3: Li tâm loại nước thu dạng nhão (paste)
Sau khi dịch tảo cô đặc được thêm nước cất. Sau đó, tiến hành li tâm loại nước nhằm thu
tảo ở dạng nhão (li tâm 3000 vòng/phút, 5 phút).
Bước 4: Sấy khô tảo
Tùy thuộc vào quy mô sản xuất mà chúng ta có thể lựa chọn các phương pháp sấy khô phù
hợp như sấy khô sinh khối tảo bằng điện, sử dụng các tủ sấy ở nhiệt độ <55oC, sấy khô sinh
khối tảo dạng nhão bằng năng lượng ánh sáng mặt trời, sấy đông khô, sấy phun khô, sấy khô
bằng nhiệt với phần tạo nhiệt bằng than đá, than tổ ong và bằng máy hút chân không.
Trong nghiên cứu này, với mục đích sử dụng sinh khối khô của T. pseudonana ở dạng
viên để phục vụ nghiên cứu tính an toàn của sinh khối nuôi trồng được. Chúng tôi đã sấy
khô, đủ số lượng để thử nghiệm độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trên các động vật
thực nghiệm thành công.
PHỤ LỤC 13: HÌNH ẢNH MINH HỌA THU HOẠCH SINH KHỐI
Thalassiosira pseudonana TƯƠI SỐNG
20
PHỤ LỤC 14: HÌNH ẢNH MINH HỌA SINH KHỐI TƯƠI VÀ SINH KHỐI
KHÔ CỦA Thalassiosira pseudonana
Hình 14.1. Ảnh sinh khối tươi của T. pseudonana
Hình 14.2. Ảnh sinh khối khô của T. pseudonana
PHỤ LỤC 15: BỐ TRÍ THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CẤP CỦA SINH KHỐI
KHÔ Thalassiosira pseudonana
15.1. Cơ sở để tính toán liều dùng cho chuột thí nghiệm
Tính liều dùng cho chuột thí nghiệm dựa trên cơ sở tính toán liều độc tính cấp, bán
trường diễn và liều điều trị do sinh khối tảo T. pseudonana không tính được LD50 và sinh
21
khối tảo dạng viên có thể pha được tối đa là 500 mg/mL nước cất, nên lấy liều đánh giá độc
tính bán trường diễn là 2 liều 100 mg/kg và 300 mg/kg (liều tối đa bán trường diễn thấp
hơn một chút so với liều tối đa có thể pha được của sinh khối, và dùng 2 liều, liều 1 bằng
1/3 liều 2). Liều điều trị thường bằng liều bán thấp của bán trường diễn mà không thấy độc
tính (nên lấy liều điều trị 1 là 100 mg/kg) liều 2 thì cao hơn một chút so với liều 1 là 150
mg/kg. Khối lượng sử dụng là mg tảo khô của sinh khối T. pseudonana.
15.2. Phương pháp xử lý tảo T. pseudonana để cho chuột thí nghiệm uống
Phương pháp cho chuột thí nghiệm uống là pha bột tảo với nước cất với liều làm sao để
chuột uống liều 1 mL/100 g cân nặng/ngày (chuột nặng 200 g uống 2 mL/lần/ngày) và đạt
được liều là 100 mg/kg hoặc 150 mg/kg hoặc 300 mg/kg cân nặng chuột. Dung dịch tảo
được đưa vào xilanh với thể tích định trước và cho chuột uống bằng kim đầu tù (đưa kim
qua thực quản vào dạ dày chuột thì bơm thuốc, đảm bảo thuốc không trào ra ngoài).
15.3. Kết quả dò liều cho tảo T. pseudonana
Liều tối đa có thể hòa tan của T. pseudonana (để có thể cho chuột uống được) trong thí
nghiệm này là 50 mg/1 mL nước cất. Cho chuột uống thuốc với liều là 0,1 mL/10 g cân
nặng (hay 5 mg/10 g cân nặng vì 0,1 mL chứa 5 g T. pseudonana), tức là 500 mg/kg cân
nặng, ngày cho uống 3 lần.
Bảng 15.1. Các mức liều thử nghiệm của T. pseudonana
Liều dùng
Nhóm chuột
Nhóm chứng
(mg mẫu thử/kg trọng lượng cơ thể
chuột)
Số chuột thí
nghiệm
0 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột
10
Mức liều 1
125 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột
10
Mức liều 2
142,86 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột
10
Mức liều 3
166,67 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột
10
Mức liều 4
200 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột
10
Mức liều 5
250 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột
10
Mức liều 6
333,33 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột
10
Mức liều 7
500 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột
10
PHỤ LỤC 16: HÌNH ẢNH GIẢI PHẪU MÔ BỆNH HỌC GAN, THẬN CỦA
CHUỘT KHI DÙNG Thalassiosira pseudonana DÀI NGÀY
Sau 28 ngày theo dõi, tiến hành giải phẫu chuột cho thấy bằng mắt thường và dưới kính
lúp có độ phóng đại 25 lần thấy màu sắc, hình thái của gan, thận ở hai lô dùng T.
pseudonana không khác so với lô chứng (hình 16.1). Hình ảnh gan, thận của chuột ở các lô
22
trị 1 (hình 16.1C, D), lô trị 2 (hình 16.1E, F) có màu nâu đỏ thẫm đồng đều, bề mặt nhẵn,
không có u cục hoặc xuất huyết, có đàn hồi khi ấn xuống, không khác biệt so với hình ảnh
gan, thận của chuột ở lô chứng (hình 16.1A, B).
Hình 16.1. Hình ảnh đại thể gan, thận chuột lô chứng (A, B), lô trị 1 (C, D), lô trị 2 (E, F)
Gan
A
B
C
D
E
F
Thận
Hình 16.2. Hình ảnh mô bệnh học vi thể gan, thận chuột sau 28 ngày uống T. pseudonana
lô chứng (A, B), lô trị 1 (C, D) và lô trị 2 (E, F), tương ứng (HE, x 400)
Ghi chú: Lô chứng: uống dung dịch NaCl 0,9% tương ứng với liều 1,00 mL/kg trọng lượng
cơ thể/ngày; Lô trị 1: uống vi tảo liều 100 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày (liều dự kiến có
tác dụng); Lô trị 2: uống vi tảo liều 300 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Mức liều ở lô trị 2
gấp 3 lần mức liều lô trị 1.
Kết quả hình 16.2 cho thấy vi thể gan, thận dưới kính hiển vi với độ khuếch đại 400 lần
của chuột ở lô trị 1 (hình 16.2C, D) và lô trị 2 (hình 16.2E, F) không có khác biệt so với
hình ảnh vi thể gan, thận chuột ở lô chứng (hình 16.2A, B).
23
Cấu trúc các bè gan bình thường, không thấy hình ảnh hoại tử, thoái hóa tế bào gan. Cấu
trúc các tế bào ống thận và các vùng chức năng khác của thận bình thường. Như vậy, có
thể kết luận T. pseudonana an toàn cho ĐVTS khi chúng sử dụng làm thức ăn tươi sống.
PHỤ LỤC 17: MÔ TẢ PHƯƠNG PHÁP VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
HÀNH VI CỦA CHUỘT THỰC NGHIỆM SAU KHI SỬ DỤNG SINH KHỐI
Thalassiosira pseudonana
17.1. Mô tả phương pháp bố trí thí nghiệm
17.1.1. Bài tập môi trường mở (Open field)
- Thực nghiệm được thực hiện trong môi trường mở hình hộp, kích thước 60 x 60 x 60
cm (hình 17.1) được dùng để đánh giá hoạt động tự nhiên của chuột.
- Chuột được đặt vào một góc của môi trường mở và được phép di chuyển tự do trong
hộp nhựa trong vòng 5 phút. Hoạt động của chuột trong hộp nhựa được ghi hình và phân
tích trên phần mềm Any maze (stoelting - USA).
- Các thông số tính toán: (1): Quãng đường chuột vận động; (2): Tốc độ trung bình
chuột vận động; (3): Số lần ngang qua đường kẻ.
17.1.2. Bài tập mê lộ chữ Y (Y maze)
- Mê lộ hình chữ Y, được làm bằng tôn, sơn đen, các cánh chia đều 3 hướng, chiều dài
mỗi cánh 60 cm, rộng 5 cm, cao 10 cm (hình 17.2).
- Chuột được thả vào một cánh bất kỳ, cho chuột tự vận động trong 10 phút.
- Hoạt động của chuột trong Y maze được ghi hình và phân tích kết quả bằng phần mềm
Any maze (stoelting - USA).
- Các thông số tính toán bao gồm: (1): Số lần chuột ra vào các cánh của Y maze; (2): Số
lần thay đổi đi vào 3 cánh liên tiếp được tính là 1 Alternation; (3): % Alternation = [số lần
Alternation (tổng số lần vào các cánh - 2)] x 100.
Hình 17.1. Hình ảnh môi
trường mở
Hình 17.2. Mê lộ chữ Y
Hình 17.3. Hình ảnh buồng
tập nhận thức đồ vật
17.1.3. Bài tập nhận thức đồ vật (Object recognition)
- Buồng tập: hình hộp, chiều dài 45 cm, rộng 45 cm, cao 45 cm (hình 17.3).
24
- Thử nghiệm tiến hành được tiến hành trong 3 ngày.
- Ngày 1: làm quen (habituation session), không đặt đồ vật trong buồng tập, cho chuột
làm quen không gian trong buồng tập trong thời gian 5 phút.
- Ngày 2: luyện tập (training session), đặt 2 đồ vật giống hệt nhau trong buồng tập, cho
chuột vào buồng tập, để chuột tự do khám phá trong 5 phút.
- Ngày 3: đánh giá trí nhớ (retetion session), đặt 2 đồ vật, 1 đồ vật cũ của ngày 2, 1 đồ
vật mới trong buồng tập, thả chuột vào buồng tập trong 5 phút.
- Hoạt động của chuột trong thử nghiệm Object recognition được ghi hình và phân tích
trên phần mềm Any maze (stoelting - USA).
- Các thông số tính toán: (1): Thời gian chuột khám phá các đồ vật trong buồng tập;
(2): Số lần chuột khám phá các đồ vật trong buồng tập.
17.2. Kết quả nghiên cứu hành vi của chuột thực nghiệm sau khi sử dụng sinh
khối Thalassiosira pseudonana
Các nghiên cứu đánh giá về khả năng vận động, khả năng nhận thức và trí nhớ của
chuột khi uống T. pseudonana với liều 100, 150 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày, tương ứng
sau 4 tuần được tiến hành tại Bộ môn giải phẫu sinh lý Bệnh - Học viện Quân y Việt Nam.
17.2.1. Kết quả nghiên cứu trong môi trường mở
Kết quả về các chỉ số của chuột trong bài tập môi trường mở cho thấy quãng đường
chuột vận động trong thời gian 5 phút khi được đặt vào trong môi trường mở ở các nhóm
gần tương đương nhau (khoảng từ 6,5 đến 10 m). Tương tự, tốc độ vận động trung bình của
chuột trong thời gian 5 phút khi được đặt vào trong môi trường mở ở các nhóm cũng không
có sự khác biệt (khoảng từ 20 cm/s đến 40 cm/s).
Thời gian chuột ở vùng trung tâm của môi trường mở ở các nhóm cũng cho kết quả
tương tự, mặc dù ở nhóm T. pseudonana chỉ số này có xu hướng thấp hơn so với hai nhóm
còn lại nhưng sự khác biệt này là không đáng kể.
Bài tập môi trường mở có các chỉ số như quãng đường vận động, tốc độ vận động
thường được dùng để đánh giá khả năng, mức độ vận động. Trong khi chỉ số về thời gian ở
vùng trung tâm thường cho thấy khả năng khám phá cũng như cảm giác an toàn của động
vật. Một khi động vật không cảm thấy lo lắng trong môi trường mở thì chúng sẽ có thời
gian khám phá nhiều hơn và như vậy thời gian chúng ở trong vùng trung tâm sẽ nhiều hơn
(Walsh và cộng sự, 1976; Laetitia và cộng sự, 2003). Bài tập này đã được nhiều tác giả
nghiên cứu trước đây sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của một số loại thuốc lên chức năng
vận động của chuột (Kalueffa và cộng sự, 2006; Bourin và cộng sự, 2008). Trong nghiên
cứu của chúng tôi nhận thấy các chỉ số về quãng đường vận động, tốc độ vận động trung
bình và thời gian ở vùng trung tâm của chuột ở cả 3 nhóm không có sự khác biệt. Điều đó
chứng tỏ uống T. pseudonana với liều 100, 150 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày, tương ứng
không ảnh hưởng đến chức năng vận động và khả năng khám phá của chuột.
25
