Tổng hợp một số dẫn xuất của axit gambogic (2017)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC

ĐỖ THỊ HỘI

TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT
CỦA AXIT GAMBOGIC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Hóa học Hữu cơ
Người hướng dẫn khoa học

TS. TRẦN THỊ THU THỦY

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận với đề tài: “Tổng hợp một số dẫn xuất của axit gambogic”
được thực hiện tại phòng Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa học các Hợp chất thiên
nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Em xin trân trọng cảm ơn GS.TS Phạm Quốc Long và Ban lãnh đạo
Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho em được học tập và sử dụng các thiết bị
tiên tiến của viện để hoàn thành tốt các mục tiêu đề ra trong khóa luận của
mình.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Trần Thị Thu Thủy, cùng các
anh - chị phòng Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên đã
giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa Học - Trường
ĐHSP Hà Nội 2 đã tận tình dạy dỗ và chỉ bảo cho em trong suốt 4 năm học

tập tại trường.
Trong quá trình thực hiện khóa luận, mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng
chắc chắn sẽ không tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy, em kính mong nhận
được sự đóng góp, chỉ bảo của các quý thầy cô và bạn bè.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 06 tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Đỗ Thị Hội


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................... 3
1.1.1. Giới thiệu chi Garcinia....................................................................... 3
1.1.2. Giới thiệu về cây Garcinia hanburyi................................................... 4
1.1.3. Axit gambogic (GA). ........................................................................... 8
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................. 12
1.2.1.

ớp m ng

122

ột

.................................................................... 12

................................................................................. 14

1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC ................................. 15
1 3 1 Phổ hối ượng M

........................................................................ 15

1.3.2. Phổ cộng từ hạt nhân ( NMR) ........................................................... 16
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM.................................................................... 18
2.1. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT ...................................... 18
2.1.1. Nguyên liệu....................................................................................... 18
2.1.2. Thiết bị ............................................................................................. 18
2.1.3. Dụng cụ và hóa chất......................................................................... 18
2.2. CÁC QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM.................................................... 19
2.2.1.Phân lập axit gambogic ..................................................................... 19
2.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của axit gambogic........................................ 20
2.2.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào của axit gambogic và các dẫn xuất ..... 23
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 25
3.1. TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA AXIT GAMBOGIC ................... 25
3 1 1 Định hướng nghiên cứu .................................................................... 25
3.1.2. Kết quả tổng hợp các dẫn xuất ......................................................... 26


3.2. HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO CỦA AXIT
GAMBOGIC VÀ CÁC DẪN XUẤT ........................................................ 34
KẾT LUẬN.................................................................................................. 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 38
PHỤ LỤC .................................................................................................... 43


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Bản đồ phân bố cây Đằng hoàng .................................................. 4
Hình 1.2: Lá và quả Đằng hoàng ................................................................. 5
Hình 1.3: Nhựa Đằng hoàng dạng bột và dạng thỏi ..................................... 6
Hình 1.4. Một số hợp chất trong nhựa cây Đằng hoàng ............................... 7
Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của axit gambogic ............................................ 9
Hình 1.6: Bình giải ly bản mỏng ................................................................ 13
Hình 1.7: Sắc ký cột .................................................................................. 14
Hình 2.1: Cấu trúc hóa học của axit gambogic .......................................... 19
Hình 3.1: Cấu trúc hóa học và tinh thể của axit gambogic ......................... 25
Hình 3.2: Phản ứng chuyển hóa nhóm COOH của axit gambogic. ............. 27
Hình 3.3: Cấu trúc hóa học của hợp chất (2)............................................... 28
1

Hình 3.4: Phổ H-NMR của axit gambogic ................................................ 28
1

Hình 3.5: Phổ H-NMR của dẫn xuất (2) ................................................... 29
13

Hình 3.6: Phổ C-NMR của axit gambogic ............................................... 29
13

Hình 3.7: Phổ C-NMR của dẫn xuất (2) .................................................. 30
Hình 3.8: Cấu trúc hóa học của hợp chất (3)............................................... 31
1

Hình 3.9: Phổ H-NMR của chất (3) .......................................................... 31
13

Hình 3.10: Phổ C-NMR của dẫn xuất (3) ................................................ 32

Hình 3.11: Cấu trúc hóa học của hợp chất (4)............................................. 33
1

Hình 3.12: Phổ H-NMR của dẫn xuất (4) ................................................. 33
13

Hình 3.13: Phổ C-NMR của dẫn xuất (4) ................................................ 34


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Hiệu suất phản ứng chuyển hóa của axit gambogic ..................... 34
Bảng 3.2: Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của axit gambogic và các dẫn
xuất. .......................................................................................... 35
Bảng 3.3: Giá trị IC50 của axit gambogic và các dẫn xuất ............................ 35


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
13C-NMR

: Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13)

1H-NMR

: Proton Magnetic Resonance Spectroscopy
(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton)

COSY

: 1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

(Phổ tương tác hai chiều đồng hạt nhân 1H-1H)

DEPT

: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
(Phổ DEPT)

HMBC

: Heteronuclear Multiple Bond Connectivity
(Phổ tương tác đa liên kết hai chiều trực tiếp dị hạt nhân)

HSQC

: Heteronuclear Single Quantum Coherence
(Phổ tương tác hai chiều trực tiếp dị hạt nhân)

MS

: Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng)

HR-MS

: Hight resolution Mass Spectroscopy
(Phổ khối lượng phân giải cao)
s: singlet

q: quartet

d: doublet

dd: doublet doublet

t: triplet

dt: doublet triplet

m: multiplet
δ H, δ C

: Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon

ppm

: parts per million (phần triệu)

CC

: Column Chromatography (Sắc ký cột)

TLC

: Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

Me

: Nhóm metyl

DCM

: Diclomethane

EtOAc

: Etyl axetat


EtOH

: Etylic

MeOH

: Methanol

EDC

: 1-Ethyl-3-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide

DNAP

: Dimetylaminopiridin

GA

: axit gambogic

EGA1

: ethyl gambogate (2)

DIALY.GA

: N –diallyl-gambogamide (3)

3FGA

: 1(4-trifuoromethylbenzene-piperazinyl)-gambogamide (4)


MỞ ĐẦU
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên được thừa hưởng nguồn
thiên nhiên vô cùng phong phú và đa dạng sinh học với nhiều loại dược liệu
quý. Theo số liệu thống kê gần đây, hệ thực vật Việt Nam có trên 10.000 loài
trong đó có khoảng 3.200 loài cây được sử dụng trong Y học dân tộc [1].
Các hợp chất thiên nhiên thể hiện hoạt tính sinh học rất phong phú và là
một trong những định hướng để con người có thể chiết, tách, tổng hợp tìm ra
các loại thuốc mới chống lại bệnh tật, chất bảo quản thực phẩm, mỹ phẩm
cũng như các chế phẩm phục vụ nông nghiệp, chăn nuôi có hoạt tính sinh học
cao mà không ảnh hưởng đến môi trường sinh thái.
Cùng với sự phát triển của ngành sinh học phân tử, hóa học các hợp chất
thiên nhiên đã và đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên
cứu. Tìm kiếm và phát hiện các chất có hoạt tính sinh học trong thảm thực vật
Việt Nam, qua đó đưa ra các giải pháp bảo tồn sự đa dạng sinh học của môi
trường xung quanh là một nhiệm vụ luôn đòi hỏi sự cố gắng của tất cả mọi
người trong xã hội đặc biệt là các nhà khoa học.
Tuy nhiên, phần lớn các cây cỏ được sử dụng làm thuốc chưa được
nghiên cứu đầy đủ và có hệ thống về mặt hóa học cũng như hoạt tính sinh học
mà chủ yếu dựa trên kinh nghiệm dân gian.Vì vậy chưa phát huy hết hiệu quả
của nguồn tài nguyên quý giá này.

Trong vô số các loài thực vật ở Việt Nam, có nhiều loài cây thuộc họ
Guttiferae có giá trị sử dụng cao được sử dụng làm thuốc chữa bệnh. Đặc biệt,
trong số đó phải kể đến cây Đằng hoàng.
Axit gambogic (GA) là thành phần chính mang lại hoạt tính đáng chú ý
của nhựa cây Đằng hoàng. Mặc dù được phân lập và xác định cấu trúc từ
những năm 60 của thế kỷ trước [2,3] nhưng mãi đến năm 2004 hoạt tính ức
chế sự phát triển và di căn của nhiều loại tế bào ung thư của axit gambogic

1


mới được giới khoa học chú ý như ung thư phổi, ung thư bạch cầu, ung thư
tiền liệt tuyến, ung thư tụy, ung thư dạ dày, ung thư vú, ung thư ruột kết, ung
thư não, ung thư gan…
Từ đó đến nay, các nhà khoa học trên thế giới đã phân lập được axit
gambogic có độ tinh từ 95-99

và có gần 200 bài báo khoa học được công bố

về hoạt tính in vitro, in vivo, mối quan hệ hoạt tính – cấu trúc (QSAR),
chuyển hóa hóa học cũng như các kết quả thử lâm sàng của axit gambogic.
Hiện nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về vấn đề này được công
bố. Trong khi đó, nước ta lại là một trong những vùng đặc hữu mà nguồn
nguyên liệu này sinh trưởng tốt. Bởi vậy việc khai thác hoạt tính chống ung
thư từ nhựa cây Đằng hoàng, nhất là axit gambogic là việc làm cần thiết từ
các nhà khoa học để không phí hoài nguồn tài nguyên dược liệu s n có.
Các nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất của axit gambogic là rất cần thiết
và tiềm năng trong việc phát hiện các chất mới có hoạt tính sinh học cao hơn
chất đầu và ít độc tính hơn. Việc thực hiện nhiệm vụ góp phần vào việc nâng
cao trình độ nghiên cứu của các cán bộ thực hiện trong lĩnh vực tổng hợp hữu

cơ và hóa hợp chất thiên nhiên
Xuất phát từ những cơ sở trên tôi đã chọn đề tài “Tổng hợp một số dẫn
xuất của axit gambogic”.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
1.1.1. Giới thiệu chi Garcinia
Garcinia là một trong những chi lớn nhất thuộc họ Bứa (hay Măng cụt)
với khoảng 400 loài trên thế giới. Tên gọi Garcinia lấy theo tên của nhà thực
vật học Laurence Garcinia, người đã sưu tập các mẫu cây cỏ và sống tại Ấn
Độ vào thế kỷ 18. Họ Bứa ở Việt Nam có tất cả 62 loài, phân bố trên khắp đất
nước từ vùng rừng núi phía Bắc đến ven sông rạch của các tỉnh phía Nam 1].
Các loài trong họ Bứa chủ yếu là cây gỗ hoặc cây bụi, đặc trưng bởi có nhựa
mủ vàng, cành thường nằm ngang, hoa thường đơn tính, nhị thường nhiều, rời
hay hợp thành bó.
Ở Việt Nam, chi này có khoảng 29 loài và là chi lớn nhất trong họ Măng
cụt [4]. Các loài trong chi này thuộc loại thân thẳng có chiều cao trung bình
830m. Lá của chúng có màu xanh đậm, có các đường gân r ràng. Hoa màu
vàng nhạt hoặc trắng hơi xanh có từ 4-5 cánh, bao phấn không cuống, buồng
phấn hẹp. Nhiều loài cây trong chi Garcinia có quả ăn được như quả măng
cụt, quả dọc…Quả thường hình tròn, có từ 4-10 múi, có nhiều nước, hạt có
lớp vỏ mỏng bao bọc. Vỏ cây, vỏ quả và gỗ của các cây thuộc chi này thường
tiết ra nhựa màu vàng hoặc trắng.
Thành phần hóa học của chi Garcinia khá đa dạng, chủ yếu là các
xanthon, benzophenon, biflavonoid [5] và triterpenoid [6]. Trong đó, xanthon
là nhóm hợp chất đặc trưng của chi Garcinia.
Nhiều loài thuộc chi Garcinia có quả ăn được và rất ngon như quả măng

cụt (G. mangostana , bứa lửa (G. fusca , bứa mọi (G. harmandii , bứa núi (G.
oliveri . Hạt của trái G. indica có chưa một loại chất b o ăn được giống như
bơ. Trái của loài G. livingstonei dùng để lên men thức uống. Trước đây khi

3


chưa có acid citric tổng hợp người ta xem tai chua (G.pendunculata là nguồn
cung cấp acid citrcic đáng quý.
Trong công nghiệp, nhựa và vỏ trái nhiều loài được dùng làm phẩm
nhuộm vàng như vỏ trái sơn v (G. merguensis , nhựa cây đằng hoàng (G.
hanburyi . Dầu lọc (G. multiflora được dùng làm xà phòng, dầu nhờn…
Từ lâu trong dân gian người ta đã biết sử dụng nhiều loài thuộc chi
Garcinia để làm thuốc chữa các bệnh đơn giản. Vỏ cây bứa lá tròn, dài (G.
oblongifolia thường dùng trị lo t dạ dày, lo t tá tràng, viêm dạ dày, ho ra
máu, mụn nhọt, nhựa dùng trị bỏng. Vỏ trái bứa mọi (G. harmandii được
dùng ăn với trầu, phối hợp với nhiều vị thuốc khác để trị tiêu chảy. Dầu dọc
được dùng để đắp mụn nhọt khi chưa vỡ mủ. Ngoài ra, khi phối hợp với các
thuốc khác như Calomel và Lô hội, nhựa của chúng còn được dùng để trị giun
và cả sán sơ mít…
1.1.2. Giới thiệu về cây Garcinia hanburyi
1.1.2.1. Đặ điểm hình thái và phân bố
Cây Garcinia hanburyi có tên thông thường là Đằng hoàng, thuộc họ
Măng cụt Clusiaceae (Guttiferae) phân bố đặc hữu ở vùng Đông Nam Á bao
gồm Việt Nam, Hải Nam (Trung Quốc), Campuchia, Thái Lan, và mới đây
được trồng thành công ở Singapo [7].

Hình 1.1: Bản đồ phân bố cây Đằng hoàng

4

Cây cao, to 10 - 20cm, thân nh n, thẳng đứng. Lá mọc đối, cuống ngắn,
hình bầu dục hay hình mác, hai đầu hơi tù, phiến lá dai, nguyên nh n, rộng 3
10cm. Quả mọng hơi hình cầu, đường kính 2 - 5cm, phía cuống có đài tồn tại,
4 ngăn, mỗi ngăn có một hạt hơi cong hình cung. Mùa hoa tháng 12 - 1, mùa
quả tháng 2 - 3.

Hình 1.2: Lá và quả Đằng hoàng
Tất cả các bộ phận của cây đều có những ống bài tiết nằm trong mô vỏ,
trong libe, tủy và cả trong mô gỗ. Thường sau mùa mưa (ở miền Nam, vào
các tháng 1 - 5 người ta dùng rìu khía thành vòng xoắn ốc trên thân, những
khía sâu vài mm từ dưới đất lên đến cành thứ nhất. Một chất dịch mủ màu
vàng chảy ra được hứng vào các ống tre, sau một thời gian nhựa mủ đặc lại.
Hơ nóng đều ống tre cho nước bốc hết đi. Chẻ lấy vị Đằng hoàng. Mỗi cây
mỗi năm có thể cho ba thỏi đằng hoàng dài 0,50cm, đường kính 4cm. Loại
Đằng hoàng thỏi này được chuộng nhất trên thị trường tiêu thụ. Nhưng có khi
vị Đằng hoàng còn đang mềm, người ta nặn thành bánh hay thành miếng to
nhỏ không đều. Có nơi người ta uốn cong cả cành Đằng hoàng cắt đầu cho
nhựa mủ chảy ra, hứng vào ống tre hay vại rồi chế thành đằng hoàng thỏi hay
miếng. Vị Đằng hoàng thỏi thường là những thỏi dài 15-20 cm, đường kính 36 cm, trên mặt thường có những khía dọc dấu vết của ống tre, trên mặt có bụi
màu vàng nhạt. Đằng hoàng dễ vỡ, vết vỡ bóng hay mờ, màu vàng, sẫm hay
5


vàng cam nâu nhạt. Khi miết ngón tay ướt lên vị đằng hoàng ta sẽ thấy tay có
màu vàng tươi. Đằng hoàng tan trong cồn (cho màu đỏ), trong ete (cho màu
vàng . Đun nóng mềm ra nhưng không chảy lỏng và cháy không cho mùi gì
đặc biệt. Vị hắc, mùi không rõ.

Hình 1.3: Nhựa Đằng hoàng d ng ột và d ng th i
1.1.2.2. hành ph n h

h

ủ nh

ây Garcinia hanburyi

Trong nhựa cây Đằng hoàng có 70-80% chất nhựa, 18 đến 24% chất gôm,
ngoài ra còn có tinh dầu, một ête phenolic. Thành phần chính của chất nhựa
này là axit gambogic (G

, axit neogambogic và axit allogambogic [8,9].

Ngoài ra còn có một số xanthone, các triterpene khác và có hoạt tính gây độc
tế bào nhưng ở hàm lượng rất nhỏ [10,11].

6


H nh 1.4. Một số hợp chất t ong nhựa cây Đằng hoàng

7


1.1.2.3. Công dụng
- Là thuốc tẩy rất mạnh: với liều 0,1 đến 0,2g đã cho phân lỏng, với liều
0,25 đến 0,4g phân rất nhiều, đau bụng và có khi nôn, với liều cao nữa thì độc
(nôn, viêm dạ dày và ruột) có khi đến chết sau khi đau bụng nặng, phân có

máu… Đằng hoàng chỉ có tác dụng ở khu vực ruột khi tiếp xúc với chất béo
và với mật nhung không có tác dụng thông mật.
- Nhựa Đằng hoàng là một vị thuốc cổ truyền được dùng để điều trị một
số bệnh như cầm máu, tẩy giun sán, viêm hô hấp, viêm phế quản, sổ mũi,
nhuận tràng, trị các vết thương nhiễm trùng ngoài da.
- Trong công nghiệp dùng trong sơn, vẽ màu, phẩm nhuộm và chế vecni
phủ lên kim loại.
1.1.3. Axit gambogic (GA).
1.1.3.1. Giới thiệu về axit gambogic
Axit gambogic (GA- còn gọi là -guttiferin, axit guttatic) là thành phần
chính mang hoạt tính của nhựa cây Đằng hoàng.
- CTPT là C 38H44O8
- Khối lượng phân tử: 628 (g/mol)
- Trạng thái: dạng bột
- Màu: vàng nghệ
- Độ tan: DMSO 10 mg/mL
3

- Tỉ trọng: 1,29 (g/cm )
- Tan trong các dung môi: Diclometan, methanol, axeton, cồn, n-hexan,
etyl axetat...

8


Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của axit gambogic
1.1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của G được thực hiện chủ yếu tại
các nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan và Hàn Quốc.
Mặc dù được phân lập và xác định cấu trúc từ những năm 60 của thế kỷ

trước [12,13] nhưng mãi đến năm 2004 hoạt tính chống ung thư của axit
gambogic mới được chú ý. Từ đó đến nay, đã có gần 200 bài báo khoa học
trên thế giới công bố về hoạt tính in vitro, in vivo, mối quan hệ hoạt tính – cấu
trúc (QSAR), chuyển hóa hóa học cũng như các kết quả thử lâm sàng của AG.
xit gambogic đã được chứng minh in vitro và in vivo là có hoạt tính
ức chế sự phát triển và di căn của nhiều loại tế bào ung thư 14,15], ví dụ như:
ung thư phổi (IC50 tại 24h, 48h, 72 h : 1,74 ; 1,01; 0,81g/mL thấp hơn 4 lần
so với thuốc chống ung thư hydroxycamthothecin , ung thư bạch cầu (ED50
0,35 g/mL , ung thư tiền liệt tuyến, ung thư tụy, ung thư dạ dày (MGC-803:
IC50 0,96 g/mL , ung thư vú (ED50 1,64 g/mL , ung thư ruột kết (ED50 0,45
g/mL , ung thư não, ung thư gan…Ngoài ra, axit gambogic còn được phát
hiện có hoạt tính ức chế kênh ion chỉnh lưu Kir2.1 (EC< 100 nm 16].
Cơ chế chống ung thư của G có liên quan đến việc thúc đẩy quá trình tự
chết (apoptosis) của tế bào bằng cách hoạt hóa enzyme caspase 3 (EC50 0,78
M),
ức chế sự gắn kết của protein anti-apoptotic với peptid BH3 (IC50 = 1,47;
1,21;
2,02; 0,66; 1,06; 0,79 M lần lượt đối với Bcl-XL, Bcl-2, Bcl-W, Bcl-B, Bfl-1,
9


Mcl-1) [12, 13, 14]. AG gắn với thụ thể transferring (IC50 = 4,1 M) gây ra sự
chết lập trình của nhiều dòng tế bào ung thư 17,18].
Một số nghiên cứu khác chỉ ra AG ức chế hoạt động của chymptrypsin
trên 20S proteasome [19], gây độc trên dòng tế bào ung thư não thông qua cơ
chế AMPK ảnh hưởng trên EGFR và tín hiệu Akt/mTORC1 [20].

G ngăn

chặn sự tạo mạch máu, ức chế quá trình tăng sinh tế bào và di căn 21].

xit gambogic có độc tính thấp, hoạt tính chọn lọc và khả năng là một
tác nhân hóa trị tiềm năng. Nghiên cứu độc tính cấp và trường diễn trên chuột
và chó đã chỉ ra liều không gây độc theo đường uống là 60 mg/kg trọng lượng
trong 13 tuần, gấp 18 lần so với liều thử lâm sàng trên người (20 mg/60 kg,
hàng ngày) [22,23]. Hiện tại, axit gambogic đã được các nhà khoa học Trung
Quốc điều chế thuốc từ trạng thái tinh khiết 92-95

và đã thử nghiệm lâm

sàng ở các giai đoạn I và II trên bệnh nhân ung thư phổi, ruột và thận [24].
Kết quả nghiên cứu lâm sàng giai đoạn II đã bước đầu chứng minh tác dụng
hiệu quả của AG trên các bệnh nhân ung thư và cho thấy AG dạng bào chế an
toàn hơn so với nhựa Đằng hoàng tự nhiên, đồng thời có thể tiếp tục đưa vào
thử nghiệm lâm sàng ở các giai đoạn sau.
Nhiều công trình khoa học gần đây nhất cũng cho thấy AG còn thể hiện
khả năng tăng cường hiệu lực điều trị (synergistic) khi kết hợp với một số loại
thuốc điều trị ung thư khác như docetaxel, vincristine, verapamil, adreamycin,
cisplatin, 5-fluorouracil hay sunitinib trên các dòng tế bào ung thư ác tính
khác nhau [25,26,27,28].
Cấu trúc hóa học của axit gambogic đã được xác định bằng phương
pháp phổ NMR [29], và gần đây được khẳng định thêm nhờ phân tích nhiễu
xạ tia X tinh thể [30]. Nó bao gồm một hệ vòng 4-oxatricyclo[4.3.1.0]decan-

10


2-one, một dạng cấu trúc của một số hợp chất thiên nhiên phân lập được từ
các loài Garcinia (chi Bứa) [31].
Vào năm 2004, công trình đầu tiên về việc chuyển hóa AG nhằm
nghiên cứu mối quan hệ hoạt tính – cấu trúc (S R được công bố bởi các nhà

khoa học của hãng Dược Maxim (San Diego, Mỹ) [32]. Từ đó đến nay, đã có
hơn 10 công bố về việc tổng hợp các dẫn xuất (derivative) và các chất tương
tự (analogue). Một số chất tổng hợp được từ AG có hoạt tính mạnh hơn nhiều
lần so với chất đầu, ví dụ như methyl ester của AG có hoạt tính trên dòng tế
bào ung thư phổi A549 mạnh hơn 2-3 lần, dẫn xuất epoxy có hoạt tính mạnh
hơn 3-6 lần GA trên dòng tế bào ung thư gan 33], 3 dẫn xuất este khác có
hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư gan mạnh hơn G

và hơn 27,8-14,5

lần so với taxol [34]… Các hợp chất analogue tổng hợp được tuy không có
hoạt tính kháng ung thư mạnh như G

nhưng việc nghiên cứu chúng đã làm

sáng tỏ phần cấu trúc có hoạt tính của axit gambogic [35-38].
1.1.3.3. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
xit gambogic cũng như dược liệu Đằng hoàng chưa có trên thị trường
Việt Nam nên tiêu chuẩn cơ sở là chưa có. Việc xây dựng tiêu chuẩn chất
lượng cơ sở và phương pháp phân tích định tính, định lượng axit gambogic là
rất quan trọng. Nhờ thế, sản phẩm axit gambogic mới trở thành thương phẩm
có giá trị.
Tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, từ năm 2013, chỉ có nhóm
TS. Trần Thị Thu Thủy đang tiến hành nghiên cứu quy trình phân lập axit
gambogic tinh khiết ở quy mô phòng thí nghiệm và hiện đang triển khai ở
quy mô lớn hơn. Cấu trúc của axit gambogic phân lập được đã được khẳng
định bằng phổ NMR và MS, kết hợp với so sánh dữ liệu đã công bố. Các
nghiên cứu sơ bộ về hoạt tính sinh học tại Viện đã chứng minh hoạt tính gây
độc tế
11

bào trên 3 dòng tế bào ung thư phổi, gan và màng tim. Hoạt tính và cơ chế
tác dụng của axit gambogic trên dòng tế bào ung thư não T98 đã được thực
hiện và công trình đã được đăng trên tạp chí Bioorg. Med. Chem. Lett. vào
năm 2015.
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.2.1.

ớ

)

Sắc ký lớp mỏng (TLC được sử dụng để phân tích định tính các hỗn
hợp chất, định hướng và kiểm tra các quá trình phân tách và phân lập bằng
sắc ký.
Phân tích sắc ký lớp mỏng thường được thực hiện trên bản mỏng tráng
silica gel, chiều dày 0,2 mm trên nền nhôm. Nếu các chất không phát hiện
được bằng đèn UV 256/354 nm thì dùng các thuốc thử hiện màu là dung dịch
Vanilin/H2SO4 đặc1%, Ce(SO4)2/H2SO4đặc 15%, p-Anisaldehyde/H2SO4,
Ce(SO4)2 / molybdate / H2SO4, I2, KMnO4, N-inhydrin…
Các dung môi thường dùng cho TLC được xếp theo thứ tự độ phân cực
tăng dần là: ete dầu hỏa < hexane < cyclo hexane < toluen < diethyl ete <
dichloromethan < chloroform < etyl axetat < axeton < ethanol < axit
axetic.
 Giải ly bản m ng
Pha dung môi (hệ dung môi) phù hợp cho vào bình giải ly có đặt s n
một tấm giấy thấm (giấy lọc , nghiêng đảo nhẹ để dung môi thấm ướt tờ giấy
lọc (làm cho dung môi trong bình được bão hòa).
Đặt tấm bản mỏng vào bình giải ly, cạnh đáy của bản mỏng chạm vào

đáy của bình và ngập vào dung môi. Các vết chấm mẫu không được ngập vào
dung môi.

12


Hình 1.6: Bình giải ly bản m ng
Khi dung môi đến mức tiền tuyến (vạch phía trên) bản mỏng thì ngưng
quá trình giải ly, lấy bản mỏng ra, sấy khô dung môi và tiến hành hiện hình
mẫu thử bằng các thuốc thử đặc trưng.
 Hiện hình các vết sau khi giải ly.
Sau khi giải ly xong, các hợp chất có màu sẽ được nhìn bằng mắt
thường, nhưng phần lớn các chất hữu cơ không có màu nên muốn nhìn thấy
các vết cần sử dụng các phương pháp hóa học hoặc vật lý.
 Phương pháp vật lý.
Phát hiện bằng tia tử ngoại (UV). Bản mỏng sau khi giải ly xong, sấy
khô, đặt bản mỏng vào đèn UV, quan sát màu, nếu cần quan tâm thì dùng vết
chì khoanh lại.
 Phương pháp hóa h c.
Phát hiện bằng các thuốc thử đặc trưng như I2, KMnO4,dung dịch
vanillin, dung dịch FeCl3, dung dịch H2SO4, dung dịch Ce(SO4)2. Thường sử
dụng thuốc thử vanillin.

13


)
Trong phương pháp sắc ký cột, pha tĩnh thường là silica gel được nhồi
vào cột sau đó hỗn hợp chất hoà tan trong dung môi hữu cơ được đưa lên cột
sắc ký. Tiếp đó sắc phổ được triển khai, nghĩa là các vùng của từng chất lúc

đầu chưa tách ra khỏi nhau, thì nay do rửa giải tiếp bằng dung môi (tức là cho
dung môi tinh khiết liên tục chảy qua cột) mà tách hẳn ra khỏi nhau.
Đây là phương pháp được ứng dụng phổ biến nhất để phân tách các
chất trong một hỗn hợp dựa vào sự khác nhau về độ phân cực của chúng. Khi
dung môi kém phân cực đi qua cột sắc ký, những phần kém phân cực sẽ bị
rửa giải đi ra cùng dung môi, những phần phân cực hơn chỉ đi qua khi dung
môi được đưa vào có độ phân cực cao hơn.

Hình 1.7: Sắc ký cột
Trong sắc ký cột dung môi dùng để rửa giải thường là n-hexan, axeton,
etyaxetat, điclometan, methanol. Để hứng dung môi trong quá trình rửa giải
hấp phụ ta thường dùng ống nghiệm 20mL hoặc lọ thủy tinh, ống nghiệm hoặc
bình nón, tuỳ vào kích thước cột mà ta sử dụng lọ hứng chất cho phù hợp.

14


Các ống nghiệm đều được đánh số thứ tự và sắp xếp lần lượt. Sau khi
kiểm tra bằng TLC để gom các phân đoạn có đặc điểm giống nhau. Các phân
đoạn sau đó được chuyển vào các lọ chứa để làm các phân tích tiếp theo.
Nhồi cột có 2 cách nhồi: nhồi khô và nhồi ướt.
Nhồi khô: Cột sau khi được dựng cẩn thận, ta đưa silicagel vào cột theo
một tỷ lệ nhất định. Dùng dung môi thích hợp cho vào cột sắc ký, sau đó từ
từ cho dung môi ngấm dần và chảy xuống cuối cột. Chú ý không để các bọt
khí còn trong cột sẽ làm ảnh hưởng tới quá trình tách chất. Để ổn định cột
trước khi chuyển mẫu phân tích lên.
Nhồi ướt: Cột được chuẩn bị và lắp cố định vào giá, cân một lượng
silicagel thích hợp khuấy trộn đều với dung môi thành một hỗn hợp lỏng
sệt. Mở và rót vào cột cho dung môi chảy và để silicagel lắng tự nhiên xuống
đáy cột. Tránh xuất hiện các bọt khí. Cho dung môi chảy liên tục một thời

gian đến khi cột đã hoàn toàn ổn định.
Đưa chất phân tích vào cột: Có 2 cách đưa chất vào cột: tẩm mẫu bằng
silica gel hoặc đưa trực tiếp lên cột.
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ
vào phương pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất
mà người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu
cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để
xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất, người ta phải sử dụng
các phương pháp bổ sung khác như chuyển hóa hóa học, các phương pháp sắc
ký so sánh,…
1.3.1 Phổ hối ượ

M )

Máy phối khổ sử dụng một chùm electron bắn vào một lượng nhỏ
chất thử, phá chúng thành nhiều mảnh ion mang điện dương. Các mảnh
15


ion này nhờ một bộ phận phát hiện và ghi thành pic với cường độ khác
nhau tương

16


ứng với khối lượng của mỗi ion, đó là khối phổ. Đa số ion phân tử (ion mẹ) bị
phá rất nhanh từ 10

-10

-3

đến 10 giây để hình thành các mảnh ion mang điện

dương, những ion này lại tiếp tục bị phá thành những ion nhỏ hơn. Chỉ có
một số ít ion phân tử chưa kịp bị bắn phá di chuyển đến bộ phận tập hợp
và thể hiện thành pic ion phân tử trên phổ, pic này sẽ cho ta biết khối lượng
phân tử của chất thử.
Giá trị lớn của khối phổ là việc ứng dụng các mảnh ion tạo nên để
phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Vì vậy, kết quả phân tích khối phổ
cho chúng ta khối lượng phân tử của hợp chất và cấu trúc sơ bộ của chúng.
1.3.2. Phổ c ng từ hạt nhân ( NMR)
Phổ cộng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu
hiệu nhất hiện nay. Các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc
của các hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử với việc sử dụng kết
hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ
1

cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ ( H và

13

C dưới

tác dụng của tử trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu
diễn bằng độ dịch chuyển hóa học (chemical shift, δ . Ngoài ra, đặc trưng
của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân
tử

với nhau (spin coupling).
1

1.3.2.1. Phổ H-NMR
1

Trong phổ H -NMR, độ dịch chuyển hóa học (δH) của các proton được
xác định trong thang ppm từ 0 -14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của
nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc
trưng của độ dịch chyển hóa học và tương tác spin mà ta có thể xác định
được cấu trúc hóa học của hợp chất.
17