Ký sinh trùng thực hành dùng cho đào tạo cử nhân xét nghiệm

A

. •

Bộ
ẹ

KỸ SINH TRỈIIVG
THỮC HAMH
ị

Chủ biên: PGS. TS. LẼ THỊ XUÂN

;GHN

)284

N H À XU Ấ T’BẢN

g iá o d ụ c

.


BỘ Y TẾ
■

GIÁO TRÌNH

KÝ SINH TRÙNG
THỰC HÀNH

(DÙNG CHO ĐÀO TẠỌ c ử NHÂN XÉT NGHIỆM)
MÃ SỐ; DK.01.Z.15

NHÀ XUẤT BẢN GIÁO DỤC
H À NỘI - 2008


Chỉ đạo biên soạn:
VỤ KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TẾ

Chủ biên:
PGS. TS. LÊ THI XUÂN

Những người biên soạn:
CN. VÕ THỊ MỸ DƯNG
CN. NGUYỄN THỊ HIỆN
CN. TRỊNH TUYẾT HUỆ
CN. NGUYỄN HỒ PHƯƠNG LIÊN
PGS.TS. LÊ THI XUÂN

Tham gia tổ chức bản thảo:
ThS. PHÍ VĂN THÂM
TS. NGUYỄN MANH PHA

© Bản quyển thuộc Bộ Y tế (Vụ Khoa học và Đào tạo)
965 - 2008/CXB/2 - 1917/GD

Mã số : 7K789Y8 - DAI

LỜI GIỚI THIỆU

Thực hiện một số điều của Luật Giáo dục, Bộ Giáo dục & Đào tạo và Bộ Y tế
đã ban hành chvíơng trình khung đào tạo c ử n h â n xét nghiệm. Bộ Y tế tổ chức
biên soạn tài liệu dạy - học các môn cơ sở và chuyên môn theo chương trình trên
nhằm từng bưốc xây dựng bộ sách đạt chuẩn chuyên môn trong công tác đào tạo
nhân lực y tế.
Giáo trình KÝ SINH TRÙNG THựC HÀNH được biên soạn dựa vào chương
trình giáo dục của Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh trên cơ sở chương trình
khung đã được phê duyệt. Giáo trình được PGS.TS. Lê Thị Xuân (Chủ biên),
CN. Võ Thị Mỹ Dung, CN. Nguyễn Thị Hiện, CN. Trịnh Tuyết Huệ,
CN. Nguyễn Hồ Phương Liên biên soạn theo phương châm: kiến thức cơ bản, hệ
thốhg; nội dung chính xác, khoa học; cập nhật các tiến bộ khoa học, kỹ thuật hiện
đại và thực tiễn Việt Nam.
Giáo trình KÝ SINH TRỪNG THựC HÀNH đă được Hội đồng chuyên môn
thẩm định sách và tài liệu dạy - học chuyên ngành c ử nhân xét nghiệm của Bộ Y
tế thẩm định năm 2008. Bộ Y tê quyết định ban hành tài liệu dạy - học đạt chuẩn
chuyên môn của ngành trong giai đoạn hiện nay. Trong thòi gian từ 3 đến 5 năm,
sách phải được chỉnh lý, bổ sung và cập nhật.
Bộ Y tê chân thành cảm ơn các tác giả và Hội đồng chuyên môn thẩm định đã
giúp hoàn thành cuốn sách; cảm ơn PGS.TS. Vũ Đức Chính, PGS.TS. Hoàng Tân Dần
đã đọc và phản biện đế cuốn sách sớm hoàn thành, kịp thòi phục vụ cho công tác
đào tạo nhân lực y tế.
Lần đầu xuất bản, chúng tôi mong nhận được ý kiến đóng góp của đồng nghiệp,
các bạn sinh viên và các độc giả để lần xuất bản sau sách được hoàn thiện hơn.
VỤ KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TẾ


LÒI NÓI ĐẦU
Giáo trình Ký s in h t r ù n g th ự c h à n h được biên soạn cho sinh viên khoa

Kỹ thuật Y học có mục đích hưống dẫn cho những sinh viên học môn Ký sinh
trùng nhằm hoàn thiện khả năng chẩn đoán dựa trên một sô' thông tin lâm
sàng cơ bản và xét nghiệm bệnh phẩm bằng cách xem kính hiển vi, cấy. Một số
kỹ thuật miễn dịch cũng được để cập đến.
Giáo trình gồm có ba phần:
P h ầ n m ôt: Phần kỹ thuật trình bày những kỹ thuật xét nghiệm cơ bản bao
gồm phương pháp thu thập, bảo quản, xử lý bệnh phẩm.
P h ầ n hai: Định danh, gồm các hình ảnh các ký sinh trùng và vi nấm gây
bệnh thường gặp ỏ nước ta.
Ngoài việc các sinh viên phải nắm vững các kỹ thuật được giới thiệu, điều
chúng tôi quan tâm hơn nữa là sinh viên phải biết được ưu, nhược điểm của các
phương pháp được chọn, phải hiểu ích lợi và hạn chế của nó. Sinh viên cần phải
biết lựa chọn các phương pháp chẩn đoán phù hợp vối từng loại ký sinh trùng
và từng loại bệnh phẩm.
Nội dung các kỹ thuật trình bày trong giáo trình này có thể không được đầy
đủ, nhưng nó cũng chứa đựng các phương pháp phổ biến nhất và đủ dùng cho
các phòng xét nghiệm lâm sàng ở nước ta.
Trong cuốn giáo trình này, chúng tôi đã cô gắng trình bày những điểm đặc
trưng về hình thể để phân biệt ký sinh trùng và giải thích làm thế nào để xác
định chung.
P hần ba: Phụ lục, giới thiệu các hóa chất thưòng dùng trong xét nghiệm ký sinh
trùng đường ruột; các hóa chất, thuốc nhuộm và môi trường trong xét nghiệm nấm.
Những hình ảnh minh họa, mặc dù không hoàn chỉnh nhưng cũng khá đầy
đủ về số lượng và chất lượng, cung cấp một cách khái quát vể hình thái của ký
sinh trùng và vi nấm cùng như các kỹ thuật phát hiện chúng.
Các tác giả là những người làm việc ở phòng thí nghiệm trong nhiều năm qua
và có kinh nghiệm giảng dạy vê môn Ký sinh trùng, hy vọng rằng cuôn sách này sẽ
cung cấp những thông tin có giá trị cho sinh viên nhằm giúp họ có kiến thức về thực
tiễn chẩn đoán ký sinh trùng, giúp cho việc phòng, chữa bệnh đạt hiệu quả.
Do trình độ và thòi gian có hạn, chúng tôi không tránh khỏi những thiếu

sót về chuyên môn cũng như in ấn, rất mong nhận được sự góp ý của các sinh
viên và đồng nghiệp để lần xuất bản sau giáo trình được hoàn thiện hơn.
Xin chân th ành cảm đn.
CÁC TÁC GIẢ


MỤC LỤC

ỉ^òi giới thiệu................................................. ....................... ................................. ........... 3
Lòi nói d ầ u ......................................................................... ................................................... 4
Í^HẨN MỘT. KỸ THUẬT ............................................................................................................7
Bài 1. Cách sử dụng và bảo quản kính hiển v i ...........................................................7
Bài 2. Cách chuẩn độ kính hiển vi.............................................................................. 10
Bài 3. Thu thập và bảo quản phân đế xét nghiệm tìm kýsinh trù n g ....................13
Bài 4. Kỹ thuật xét nghiệm phân tìm ký sinh t r ù n g ...............................................22
Bài 5. Kỹ thuật tập trung ký sinh trùng trong p hân...............................................28
Bài 6. Các kỹ thuật chuyên biệt để phát hiện ký sinh trùng đưòng r u ộ t ............. 36
Bài 7. Cấy phân............................................................................................................. 41
Bài 8. Các kỹ thuật nhuộm mẫu p h â n ...................................................................... 44
Bài 9. ước lượng số giun bằng cách đếm trứng........................................................ 52
Bài 10. Kỹ thuật tìm mỡ trong p h â n ...........................................................................59
Bài 11. Kỹ thuật tìm máu trong phân.........................................................................61
Bài 12. Kỹ thuật làm làn máu mỏng và giọt máu dày..............................................65
Bài 13. Kỹ thuật nhuộm tiêu bản máu tìm ký sinh trùng sôt r é t .......................... 71
Bài 14. Kỹ thuật khảo sát tiêu bản m áu .................................................................... 76
Bài 15. Kỹ thuật xét nghiệm tìm giun chỉ trong m á u ..............................................80
Bài 16. Phưdng pháp chẩn đoán băng kỹ thuật miễn dịch học ............................. 82
Bài 17. Phương pháp điểu tra tiết túc........................................................................ 89
Bài 18. Kỹ thuật bảo quản và chuyên chở tiết tú c ....................................................94
Bài 19. Phương pháp làm tiêu bản tiết t ú c ................................................................97

Bài 20. Kỹ thuật mổ muỗi...........................................................................................103
Bài 21. Đại cương xét nghiệm vi n ấ m ...................................................................... 107
Bài 22. Kỹ thuật xét nghiệm cơ bản tìm n ấ m ..........................................................112
Bài 23. Kỹ thuật cấy n ấ m ...........................................................................................118
PHẨN HAI. ĐỊNH DANH ...................................................................................................... 127
Bài
Bài
Bài
Bài
Bài

24.
25.
26.
27.
28.

Hình thế ấu trùng và giun trưởng t h à n h ...................................................127
Nhận dạng các loại sán l á .............................................................................137
Nhận dạng các loại sán dải (sán dây)......................................................... 143
Hình thể trứng giun, sán thường gặp ......................................................... 149
Đơn bào đường r u ộ t....................................................................................... 158


Bài
Bài
Bài
Bài
íĩài
Bài

Bài
Bài
Bài

29,
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.

Những vật thể có thể tìm thấy trong phân................................................. 171
Hình thể ký sinh trùng sốt rét ỏ người........................................................173
Hình thể tiết túc V học................................................................................... 186
Chẩn đoán vi nấm ngoài d a ......................................................................... 207
Chẩn đoán vi nấm ngoại b iên ...................................................................... 213
Chẩn đoán vi nấm Candida......................................................................... 215
Chẩn đoán vi nấm Aspergillus..................................................................... 220
Chẩn đoán vi nấm Cryptococcus.................................................................. 222
Vi nấm hoại s i n h ............................................................................................224

PHẦN BA. PHỤ LỤ C ............................................................................................................ 232
Phụ lục 1. Các hóa chất thường dùng trong xét nghiệm
ký sinh trùng đường ru ộ t........................................................................ 232
Phụ lục 2. Hóa chất - thuốc nhuộm - môi trường trong xét nghiệm n ấ m ....... 235

PHẦN MỘT

KỸ THUẬT
Bài 1

CÁCH SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI

MỤC TIÊU

Đa số ký sinh trùng (KST) không thể nhận thấy bằng mắt thưòng mà cần có
những dụng cụ quang học để phóng đại chúng lên như kính lúp, kính hiển vi.
Tùy theo yêu cầu của kỹ thuật, kính hiển vi còn cần có những phụ tùng để đo
kích thước KST, tụ quang nển đen,...
1. NHẮC LẠI CẤU TRÚC CỦA KÍNH HIỂN VI
Kính hiển vi là một công cụ thường dùng và quan trọng nhất của một phòng
xét nghiệm KST. Kính hiển vi có thể có những hình dạng khác nhau tùy theo
mẫu sản xuất, nhưng cấu tạo cơ bản giông nhau, gồm có những bộ phận:
® Thị kính là một thấu kính nằm ở phía trên đế mắt nhìn ảnh qua vật
kính. Có 3 loại thị kính x5, xio , Xl5; loại x i o thường được dùng nhiều nhất.
(D Ông kính là một ống mà ánh sáng phải đi qua từ vật kính đến thị kính và
có chức năng giữ thị kính và vật kính nằm cách nhau một khoảng nhất định.
@ Đĩa mang vật kính là một bộ phận có 4 lỗ để gắn vật kính, khi xoay sẽ
đưa vật kính cần sử dụng vào ông kính.
@ Vật kính: ánh sáng đi qua vật quan sát rồi đến thấu kính này. Có 4 loại
vật kính, nhưng thường dùng 3 loại;


- Vật kính xlO: có thị trường lỏn nhất, sau khi điểu chỉnh dể thấy rõ mẫu
vật, vật kính này thưòng cách kính mang vật khoảng 16mm.
Vật kính X 40: có độ phóng đại trung bình, sau khi điều chỉnh đê thấy rõ

mẫu vật, vật kính này thường cách kính mang vật khoảng 4mm.
-

- Vật kính xlOO: có độ phóng đại lớn nhất, sau khi điêu chỉnh để thấy rõ

mẫu vật, vật kính này thường cách kính mang vật khoảng Imm. s ử dụng vật
kính vối dầu soi kính và dùng ô"c vi cấp để điều chỉnh.
® Kính tụ quang; tập trung ánh sáng.
(D Màng chắn ánh sáng: để cho ánh sáng qua nhiều hay ít để vào vật kính.
® Gưđng tròn dùng để lấy ánh sáng, thường có 2 mặt:
- Mặt lõm: khi sử dụng vật kính xio, x40.
- Mặt phẳng: khi sử dụng vật kính xioo.
Những loại kính dùng ánh sáng của bóng đèn gán trong thân máy không có gương.
(D Tiểu xa: dùng để giữ tiêu bản được gắn vỏi một trục có một ốc dùng để di
chuyến sang trái, sang phải và một ốc dùng để di chuyển phía trưốc, về sau.
(D Thân kính mang ông kính, bàn mang mẫu vật, kính tụ quang, ốc vi cấp,
ốc thứ cấp và gương.
® Chân: có chức năng giữ cho kính đưỢc vững và ổn định.

DTa m a n g v ệ l kirth

Vật kính
Thân kính

Tiểu xa
Bàn mang mẫu vật
Tụ quang

Ốc thứ cấp
Ôc vi cấp

ốc chỉnh màn chắn sáng.
Đèn

Ốc di chuyển tiểu xa

Chân

Dây điện

Ốc chỉnh độ sáng
Cấu tạo kính hiển vỉ quang học


2. CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI
® Đặt tiêu bản lên bàn mang tiêu bản.
(2) Điều chỉnh ánh sáng với gương tròn, kính tụ quang và màn chắn sáng.
@ Xoay trục mang vật kính xio vào đúng vị trí.
® Vặn ốc thứ cấp để thây rõ vật.
Nếu cần quan sát với độ phóng đại lớn thì đổi qua vật kính lớn hơn x40,
dùng ốc vi cấp để điều chỉnh đến khi thấy rõ vật. Khi sử dụng vật kính xioo, ta
phải dùng dầu soi kính. Nhỏ 1 giọt dầu lên tiêu bản rồi đổi qua vật kính xioo.
3. CÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIEN VI
COĐặt kính hiển vi đúng chỗ, xa hơi nóng và chỗ ẩm ướt.
(D Cầm kính hiển VI bằng thân kính, tay kia đỡ chân của kính. Phải để đứng
kính hiển vi, không được để kính nghiêng.
@ Cẩn thận không làm rơi chất ăn mòn hay bất cứ một dung dịch nào lên
bàn kính.
@ Không được để tay ướt hay bẩn lên kính hiển vi.
® Lau thị kính và vật kính bằng giấy lau kính trước và sau khi dùng. Khi

SOI với vật kính dầu, thâ'm giấy lau kính với một giọt xylen để lau vật kính. Sau
khi lau với xylen, phải lau khô ngay bằng giấy lau kính, nếu không xylen có thể
làm bong những thấu kính gắn trong vật kính.
® Trước khi cất kính hiển vi, đế vật kính nhỏ ở vị trí quan sát và hạ thấp ô"ng
kính bằng ôc lớn. Vặn nhẹ nhàng, đừng ấn mạnh ống kính. Nếu cẩn thận hơn, hạ
tii quanp kính xviông Nôn tụ qiiang kính hẩn, lan bnng giấy líiii kính khô
© Để gương nghiêng, mặt phẳng ra phía ngoài để tránh bụi.
(D Che kính hiển vi bằng bao của kính. Cất kính vào đúng chỗ của kính, để
lui vào phía trong, đừng để mâ'p mé phía ngoài.

CÀU HỎI LƯỢNG GIÁ
1. Trình bày cách sử dụng kính hiển vi đế quan sát một mẫu phân tươi.
2.

Khi sử dụng kính hiển vi để soi lam máu, anh (chị) cần chú ý đến yếu tố
nào để có thể nhìn thấy rõ KST sô't rét (KST SR) trên phết máu nhuộm?

3. Sau khi soi lam máu tìm KST SR, anh (chị) bảo quản kính hiển vi như thế
nào trước khi cất vào tủ kính?


Bài 2

CÁCH CHUẨN ĐỘ KÍNH HIỂN VI

MỤC TIÊU

•r

1. Trình bày được quy trình chuẩn độ kính hiển vi.

2. Đo được kích thước của mẫu vật bằng thước trắc vi.

Xác định loài KST cần dựa vào nhiều tiêu chuẩn, trong đó có tiêu chuẩn
kích thước của KST. Ta có thể ước lượng kích thước KST bằng cách so sánh vối
một vật đã biết kích thước trước như hồng cầu, nhưng cách này không cho ta
kết quả chính xác. Đe đo được chính xác kích thước KST, ta dùng thưâc trắc vi
đặt trong thị kính.
1. DỤNG CỤ
-

Kính hiển vi 2 mát với các vật kính X 10, X 40, X 100
Dầu
Giấy lau kính
Thưốc trắc vi thị kính (chia thành 50 đơn vỊ)
Thước trắc vi nền với 2 độ chia 0,1 và 0,01mm
Thị kính (nên sử dụng thị kính xlO);
+ Thước trắc vi nền có kích thưâc bằng lam kính bình thường và ở giữa có
những gạch cách nhau 0,1 và O.Olmm
+ Thưốc trắc vi đặt ở thị kính là một đường thẳng được chia thành 50 vạch.
Tùy theo độ phóng đại của vật kính, các vạch này có các sô' đo khác nhau.

Hình 2.1. a) Thước trắc vi nền; b) Thước trắc vi thị kính

10


2. QUY TRÌNH KỶ THUẬT
® Tháo thị kính ra và đặt thước trắc vi thị kính vào (mặt khắc vạch hưống
xuông dưới). Đặt thị kính trở lại vị trí cũ.
@ Đặt thưỏc trắc vi nền lên bàn kính hiển vi.

® Di chuyển bàn kính sao cho 2 thưóc nằm chồng lên nhau, vạch 0 trên
thước trắc vi thị kính trùng với vạch 0 trên thước trắc vi nền.
® Nhìn phía bên phải vạch 0 của thước trắc vi nền để tìm điểm mà 1 vạch của
thước trác vi thị kính trùng với 1 vạch của thưốc trắc vi nền, điểm trùng này gọi là
điểm Y. Khoảng cách sẽ thay đổi tùy theo các vật kính sử dụng (xio, x40, xlOO).
(ẵ) Đếm số vạch chia trên thưỏc trắc vi thị kính, từ số 0 đến vạch trùng lắp
(Y), Đếm số vạch chia (0,lmm) trên thước trắc vi nền từ vạch 0 đến vạch trùng
lắp (Y), Tính đoạn đếm được trên thước trắc vi thị kính theo công thức sau:
N X 1000f.im _ .
u
------ Z—-L— = đơn vi thi kính (m)
nxlm m
N = Số vạch đếm được trên thước trắc vi nền (mm).
n = Số vạch đếm được trên thước trắc vi thị kính (mm).
Ví dụ: ở vật kính xio, ta có N = 0,3mm, n = 40.
_ 0,3mm X lO O O m n
Đơn vị thị kính =
40 XImm

_

Thưón trắc \/i thị kính
___ Thước trắc vị nền

Điểm trùng lắp giữa
hai thước trắc vi
Hình 2.2. Cách đặt thước trắc vi thị kính và tắc vi nến

Ví dụ: Đo chiều dài của trứng giun kim.
Đặt tiêu bản lên bàn kính, quan sát trứng vói vật kính x io , chiều dài của

trứng giun kim tương ứng vối 8 khoảng chia của thước trắc vi thị kính.
Ta đã có đơn vị thị kính ỏ vật kính x i o là 7,5|im, chiều dài của trứng giun
k i n sẽ là 7,5|im X 8 = 60f.im.
L ư u ý:
- Mỗi độ phóng đại của vật kính (xio, x40 và xlOO) có đơn vị thị kính khác
11


nhau, vì mỗi vạch của thưỏc trác vi nền sẽ thay đổi kích thước trong khi vạch
của thước trắc vi thị kính vẫn duy trì kích thước cù. Vìvạy, cần phải chuẩn độ
cho từng loại vật kính và ghi lại các đơn vị này lôn kính hoặc tờgiấy dán gần
kính để dễ tra cứu.
- Khi muôn có sô đo của KST thì chỉ cần nhân sô vạch đo được với đơn vị thị
kính để có kích thước thật.
- Sau khi mỗi vật kính đã được chuẩn độ, ta không trao đổi thị kính chứa
thước trắc vi và những vật kính của kính hiển vi này vói thị kính hoặc vật kính
của kính hiển vi khác. Phải sử dụng vật kính và thị kính đã được chuẩn độ.
- Nên chuẩn độ định kỳ để bảo đảm tính chính xác.

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ
1. Tạo sao cần phải biết kích thưốc của KST?
2.

Trình bày cách tính đơn vị thị kính.

3.

Làm thế nào để đo kích thước của trứng giun đũa?

12

Bài 3

THU THẬP VÀ BẢO QUẢN PHÂN
ĐỂ XÉT NGHIỆM TÌM KÝ SINH TRÙNG
■

MỤC TIÊU

■■■,:

^

1. Trình bày được cách lấy phân đúng quy cách,
2. Làm được kỹ thuật lưu giữ trứng, ấu trùng, đơn hào,
3. Làm được kỹ thuật lưu giữ giun, sán trưởng thành.

^

1
■

' .
Ị?:,

y Ệ ^ ỈỈỈ^

1 . THU THẬP BỆNH PHẨm

Có nhiều phương pháp lấy bệnh phẩm, việc quyết định chọn phương pháp nào
dựa vào giá trị và giới hạn của mỗi phương pháp. Nếu bệnh phẩm không được lấy
và xử lý đúng yêu cầu kỹ thuật, chúng ta có thể không phát hiện được mầm bệnh.
1.1. C huẩn bị b ệ n h n h â n trư ớc k h i lấ y p h â n
Nhiều kết quả xét nghiệm phân là âm giả tạo do bệnh nhân không đưỢc hưống
dẫn đầy đủ hay hướng dẫn không đúng cách. Phải hưóng dẫn bệnh nhân một cách
cẩn thận; tốt nhất là phòng thí nghiệm đưa cho bác sĩ điều trị những bản in sẵn
những chi tiết cần thiết để phát cho bệnh nhân được chỉ định xét nghiệm phân.
Dặn bệnh nhân trong 3 ngày trưóc khi lấy bệnh phẩm, tránh dùng những
loại thuốc và thực phẩm có thể làm cho việc nhận dạng KST khó khăn như:
- Thuốc: Bismuth, Magnesium, Kaolin, Baryte, thuoc đặt vào hậu môn có dầu, mõ.
- Thực phẩm nhiều cặn bă: ngũ cốc, bắp cải, salad, quả có nhiều hạt nhỏ,
nhiều chất béo, dầu, mỡ.
Bệnh nhân nên ăn chê độ ít chất bã như: bánh, đồ ăn loãng, trứng, sữa, gan,....
1.2. Lây b ệ n h p h ẩ m
1.2.1. Tai p h ò n g x ét n g h iêm
Tốt nhất nên lấy phân tại phòng xét nghiệm.
- Lọ đựng phân:
+ Cần phải khô và sạch, bằng nhựa trong hoặc giấy carton không thấm nưốc
hoặc thủy tinh.
+ Có miệng rộng, nắp vặn chặt.
13


+ Có dán nhãn để ghi họ, tên, tuổi, địa chỉ của bệnh nhân và ghi ngày, giờ
lây bệnh phẩm.
- C ách lấy phân:
+ Có thể lấy bất cứ chỗ nào của khuôn phân dể tìm trứng giun, sán. Nhưng
đê phát hiện đơn bào, nên làV phân ở chỗ bất thường như máu, nhày, lỏng, bọt
hoặc lấy phân ngay trong trực tràng.

+ Không được lấy phân lẫn với nước tiểu, dầu, các chất muối Mg, Al,Ba, Bi,
Fe vì các chất đó làm biến dạng đơn bào.
+ Nếu cho bệnh nhân uô"ng thuôc xổ, chỉ nên cho uô’ng sulfat natri và sẽ lấy
phân khi bệnh nhân đi ngoài lần thứ hai hay thứ ba sau khi uống thuốc.
- LưỢng phân cần lấy:
+ Thay đổi tùy theo mục đích và kỹ thuật xét nghiệm, thường chỉ cần khoảng
5 - 1 0 gam phân (khoảng bằng hạt lạc) để có thể đủ làm nhiều phương pháp.
+ Trong một sô trường hỢp như tìm giun, đôt sán, các bệnh về bộ tiêu hoá
phải lấy toàn bộ sô' lượng phân được thải ra để có thể thấy được KST và màng
nhày hay mô bì bị tróc ra cùng với phân.
1.2.2. N goài p h ò n g xét nghiệm
Lấy phân ỏ ngoài phòng xét nghiệm là điều bất đắc dĩ, cần tôn trọng những
nguyên tắc sau:
- Phải gửi đến phòng xét nghiệm trong thời gian ngắn nhất, đặc biệt là đơn
bào, phân phải luôn được giữ ấm.
- Không được giữ ở nhiệt độ lạnh quá.
- Nếu ở xa: giữ hộp phân trong nước ấm 37°c và đồng thòi lấy một chút
phân cho vào luộl trong uhữiig dung dịch cố dịnh;
+ MIF: Merthiolate lod Formol,
PVA: Polyvinyl Alcohol.
F2AM; Formol + Phenol + Alcool + Xanh Methylene.
1.3.

T hời g ia n x é t n g h iệ m p h â n

Sau khi thu hồi bệnh phẩm cần xét nghiệm ngay, càng sớm càng tôt. Thòi
gian từ khi lấy mẫu đến khi khảo sát:
- Phân bình thưòng cần xét nghiệm trong vòng 12 - 24 giò hoặc có thể để 1 - 2
ngày trong tủ lạnh.
- Phân mềm, nhão, lỏng hay có màng nhày và máu cần phải xem ngay

trong vòng 30 phút sau khi lấy.
Trong trường hợp sau khi lấy phân mà chưa xét nghiệm ngay hoặc lấy phân
tại nhà ở xa, nên bảo quản phân bằng cách để phân trong các dung dịch định
hình (fixative) đế trứng giun, sán không phát triển, đơn bào không bị thoái hóa.
14


2. HÓA CHẤT BẢO Q ư ẢN p h â n
- Để bảo quản hình thể và ngăn sự phát triển tiếp tục của trứng và ấu
trùng giun, sán, phân được đựng trong chất bảo quản ngay lập tức sau khi lấy
(bệnh nhân lấy) hoặc khi phòng xét nghiệm nhận bệnh phẩm.
- Một số chất cố định đvíỢc ưa dùng là: formol, sodium acetat-acetic acidformol (SAP), dung dịch Schaudinn, polyvinyl alcohol (PVA).
- Khi chọn phương pháp cô định, phải đảm bảo chất cố định được chọn phù
hỢp vối kỹ thuật xét nghiệm sẽ làm. Vì mỗi chất cô’ định có tính chất riêng,
không thể dùng cho tất cả các loại kỹ thuật xét nghiệm.
2.1. F orm ol
Formol đặc biệt thích hỢp để cô định ấu trùng giun, sán và bào nang đơn
bào. Hai nồng độ thường dùng là 5% cho bào nang đơn bào và 10% cho trứng và
ấu trùng giun, sán.
Để giữ hình dạng đơn bào được tốt, nên pha loãng formol với dung dịch đệm
phosphat, tạo thành formol trung hòa.
Cách pha c h ế dung dịch formol

10%

5%

Formaldehvd 40% (USP)
lOOml
50ml

NaCl 0,85%
900ml
950ml
G hi chú: Formaldehyd bán thị trường thưồng chỉ 37 - 40% HCHO, tuy
nhiên vẫn được xem là 100%.
Bào nang đơn bào, trứng nang của trùng bào tử, trứng giun, sán và ấu
trùng được bảo quản lâu dài trong formol 10%. Formol nóng (60'’C) có thể dùng
đối vói bệnh phẩm có trứng giun, sán (vì trong formol lạnh, một vài loại trứng
dày sẽ tiếp tục phát triển, gây nhiễm và sông trong một thời gian dài).
Lấy vài gram phân trộn kỹ trong dung dịch formol 5 - 10%.
ưu điểm:
- Cô định toàn bộ phân.
- Pha chế dễ, bảo quản lâu.
- Cặn lắng có thể làm thử nghiệm miễn dịch.
Nhược điểm:
- Không bảo quản thể hoạt động.
- Hình dạng KST không đẹp trên phết nhuộm cô" định.
2.2. S o d iu m a c e t a t - a c e t ic a cid form ol (SAF)
SAF được dùng để bảo quản trứng và ấu trùng giun, sán, bào nang và thể
hoạt động đdn bào, trứng nang trùng bào tử và bào tử Microsporidỉa.
15


Bệnh phẩm cô định trong SAP" đêu dùng được vỏi phương pháp tập trung
phân và làm phết nhuộm cô định. Khi làm phết phân để nhuộm, nên trộn thêm
albumin vào phân để tăng độ dính của bệnh phẩm vào lam kính,
SAF được coi là chất cố định mềm hơn thủy ngân clorua. Hình dạng KST sẽ
không sắc nét bằng khi cô’ định trong dung dịch có thủy ngân clorua. Kết hỢp cố
định SAF với nhuộm hematoxylin sắt cho hình dạng tôt hơn nhuộm Trichrome.
- Thành phần;

+ Sodium acetate

l,5g

+ Acid acetic băng

2ml

+ Formaldehvd 40%

4ml

+ Nước cất

92ml

P h a chê A lb u m in M ayer: trộn một thể tích lòng trắng trứng với một thể
tích glycerin. Cho một giọt hỗn hợp này lên lam kính, cho thêm một giọt cặn
lắng phân SAF, trộn đều, để khô ở nhiệt độ phòng 30 phút rồi nhuộm.
ư u điểm:
- Dùng cho tiêu bản tập trung và cố định.
- Không có hỢp chất thủy ngân.
- Dễ pha chế, bảo quản lâu.
- Cặn lắng có thể làm kỹ thuật miễn dịch men.
Nhược điểm:
Bệnh phẩm ít bám vào lam kính.
2.3. D u n g d ịc h S c h a u d in n
Được dùng vỏi phân tưdi hoặc bệnh phẩm niêm mạc ruột, có thể dùng cho
tiêu bản nhuộm cố định và phương pháp tập trung.
Cách pha chế:

Dung dịch thủy ngân clorua bão hoà:
+ HgCl2
+ Nước cất

llOg
lOOOml

Dùng một cốc để chưng, đun sôi đến khi thủy ngân clorua tan. Để yên vài
giò đến khi tạo tinh thể.
Dung dịch cố định Schaudinn (dung dịch mẹ):
+ Dung dịch thủy ngân clorua bão hòa
+ Cồn ethylic 95®

600ml
300ml

Thêm 5ml acid acetic lạnh vào lOOml dung dịch mẹ ngay khi sử dụng.
16


ưu điểm:
- Cố định tiêu bản từ mẫu phân tươi hoặc niêm mạc ruột.
- Bảo quản tô't thể hoạt động và bào nang đơn bào.
Nhược diểm:
- Không khuyên cáo dùng trong phương pháp tập trung.
- Dung dịch có chứa thủy ngân clorua, nên đặt ra vấn đề xử lý nưốc thải.
- It dính với bệnh phẩm lỏng hoặc nhày.
2.4. P o ly v in y l a lc o h o l (PVA)
PVA là một nhựa dẻo phối hỢp vâi dung dịch cố định Schaudinn. Bột PVA
được dùng như chất dính cho bệnh phẩm phân khi hỗn hỢp phân - PVA đưỢc

trải trên lam kính, còn việc cố định vẫn là dung dịch Schaudinn.
Dung dịch cố định PVA được dùng để bảo quản tất cả các thế của KST đưòng
ruột, nhất là bào nang và thể hoạt động đơn bào cho những kỹ thuật chuyên sâu.
PVA cũng được dùng để cô định bệnh phẩm cần gửi qua bưu điện đến
những phòng thí nghiệm chuyên sâu, rất tôt với bệnh phẩm lỏng và pha theo tỷ
lệ 3 phần PVA với 1 phần phân,
Cách pha chế:
+ PVA
lOg
+ Cồn ethylic 95°
62,5ml
+ Dung dịch thủy ngân clorua bão hòa
125ml
+ Acid acetic băng
lOml
+ Glycerin
bml
Trộn các dịch lỏng vào cốc 500ml, thêm bột PVA vào (không khuấy). Đậy cốc
bằng đĩa Petri lớn, giấy sáp hoặc lá kim loại, để qua đêm. Đun từ từ cỉến 75”C, lấy
côc ra và khuấy trong khoảng 30 phút đến khi có dung dịch đồng nhất như sữa.
ưu điểm:
- Có thể làm tiêu bản cố định và phương pháp tập trung.
- Bảo quản tô’t bào nang và thể hoạt động đđn bào.
- Bảo quản lâu (hàng năm) trong lọ kín ở nhiệt độ phòng.
- Bệnh phẩm có thể gửi bằng bưu điện đến phòng thí nghiệm chuyên sâu.
- Trứng Trichuris trichura và bào nang Giardia lambia trong phương pháp
tập trung dễ nhận ra như trong phương pháp formol-ether.
Nhược điểm:
- Hình dạng ấu trùng Strongyloides stercoraỉis không đẹp như cô’ định bằng
formol. Trứng nang Isospora belli có thể không quan sát đưỢc (forn^I tốt hờn).

2-GTKSTTH

^


- Dung dịch có chứa thủy ngân, nên đặt ra vấn đề xử lý nước thải.
- Có thể trở nên trắng và sệt do mất nước hay do làm lạnh.
- Khó pha chế trong phòng thí nghiệm.
- Không thể dùng tiêu bản để làm kỹ thuật miễn dịch men.
2.5. PVA cả i tiế n
PVA được cải tiến không chứa thủy ngân, mà thay vào đó người ta dùng
sulfat đồng hoặc sulfat kẽm. Sulfat đồng không cho kết quả tốt như thủy ngân
clorua. Sulfat kẽm được dùng trong nhuộm Trichrome.
ưu điểm:
- Dùng được cho phết nhuộm cô’ định và phương pháp tập trung.
- Không chứa thủy ngân.
- Cô" định bằng sulfat kẽm cho kết quả tôt hơn vì thế nhiều người thích
dùng PVA có chứa sulfat kẽm hơn sulfat đồng.
NhưỢc điểm:
- Hình dạng của bào nang và thể hoạt động đơn bào khó thấy khi cố định
bằng sulfat đồng, đặc biệt khi so sánh với thủy ngân clorua.
- Đặc điểm cấu tạo của đơn bào khi nhuộm không ổn định: có thể rõ, có thể
không rõ. Vì vậy, việc định danh có thể gặp khó khăn, đặc biệt đối vối những
bào nang của đơn bào nhỏ như Endolimax nana.
3. KỶ THUẬT LƯU GIỬ KÝ SINH TRÙNG TRONG BỆNH PHẨ m
Giũ bệiih phẩm ở 40"C, có thể giữ dưỢc trứng giun, sán và bào naug đoii bào
nhiều ngày, nhiều tuần mà vẫn có thể định danh được dễ dàng. Muôn giữ lâu
phải dùng dung dịch định hình.
3.1. Trứng, â*u tr ù n g g iu n , sá n và bào n a n g đơn b ào
a) Lưu g iữ trên tiều bản làm từ p h â n ướt

- Đề tránh loang phải dùng lam kính sạch, rửa sạch mõ trong dung dịch
đồng thể tích cồn - ether.
- Để tránh khô do tiếp xúc với không khí, không bay hơi, người ta hàn tiêu
bản bằng:
+ Vaselin: mẫu không giữ lâu hơn vài giò, dùng đế quan sát KST sông.
+ Paraffine:
Loại paraffine dùng cho mô học, hđ nóng chảy hay để ở tủ ấm 56°c. Phương
pháp này dễ thực hiện nhưng tiêu bản dễ bị vỡ khi va chạm.
18


+ Thuốc sdn móng tay:
* Phải để tiêu bản bốc hơi, khô bât ở viền hàn, ấn xem còn hở không. Sau đó
hàn lần thứ 2 và để khô. Phương pháp này giản dị không cần dụng cụ đặc biệt.
* Nếu hàn kín, mẫu lưu giữ tôt, trứng giun, sán còn nguyên vẹn; ngược lại
bào nang và dạng hoạt động lưu giữ không tốt.
b) Lưu g iữ K S T lâ u d à i
Dùng dung dịch formol mà nồng độ tùy thuộc vào độ cứng của phân (phân
rắn dùng formol 5%; phân sệt: formol 10%), phân có trứng giun có sức chịu
đựng cao (20%, F2AM).
- Quy trình thực hiện:
® Cho phân vào dung dịch cô' định theo thể tích:
1 thể tích phân + 3 thể tích dung dịch bảo quản.
® Nghiền đều, lược qua lưối kim loại để loại những cặn bã lốn.
@ Để 1 phút ỏ bình thủy tinh có chân để loại trừ những phần tử nặng.
® Đổ phần trên vào chai có nút và có nhãn.
(D Ghi KST có trong mẫu, ngày lấy mẫu, nồng độ dung dịch cố định.
+ KST được giữ tôt ở cặn lắng trong chai.
+ Đê làm giảm sự bốc hơi của formol, thêm vào dung dịch bảo quản 10%
glycerine.

Đôi với dạng hoạt động của amíp.
+ Dùng dung dịch cô định và lưu giữ kề trên, dung dịch formol 10% chỉ giữ
đvíỢc a m í p v à i t i i ầ n , s a i ỉ đ ó a m í p s ẽ bị ly g iả i

+ Dung dịch MIF: dung dịch này đắt tiền nhưng giữ được dạng hoạt động
của amíp nhiều năm.
+ Dung dịch PVA: giữ được dạng hoạt động của amíp và có thể làm phết
nhuộm Hematoxyline sắt.
Đối vối dạng hoạt động của trùng roi đưòng ruột:
Những cách kể trên đều dùng được nhưng không tốt vì những dạng hoạt
động thường thu tròn lại, không thấy được như khi quan sát trực tiêp. Dung
dịch tương đôi tốt là MIF, F2AM.
3.2. G iun, sá n tr ư ở n g th à n h
a) Giun, sá n tìm th ấ y đ ã chết tro n g p h â n
- ít có giá trị vì chúng thường đã bị hủy hoại.
- Hóa chất thường dùng là formol 5% hoặc cồn ethylic 70°.
19


b) Giun, sá n còn sống trong p h â n
- Rửa bằng nước muối sinh lý.
- Phương thức cô’ định thay đổi tùy theo loại giun, sán:
+ Giun:
* Lấy giun ra khỏi nưốc rửa đế’ trong hộp Petri hay bát sử.
* Đổ ngay cồn ethylic 70° sôi (đun sôi cồn trong bình Erlenmeyer có khuấy
từ). Cách cô định này làm giãn giun ngay lập tức.
* Giữ trong bình thủy tinh có nút mài. Không đậy bằng nút bấc hay cao
su vì sẽ làm hư mẫu mau chóng.
L ư u ý:
* Không cô định bằng cồn lạnh.

* Không làm chết giun trong NaCl 0,85%.
* Không dùng dung dịch formol.
+ Sán dây và sán lá:
* Kẹp sán giữa 2 lam kính ở trạng thái trải rộng, để cả trong hộp Petri lớn.
* Cho dung dịch cô định;
• Cồn ethylic 70° sôi.
• Dung dịch đồng thể tích dung dịch formol 10% và cồn 70“ sôi. Ngâm
sán tối thiểu nửa giờ rồi mối lấy sán ra.
Lưu mẫu:
* Bỏ dung dịch cô' định.
* Lưu mẫu trong cồn 70”, trong chai thủy tinh nút mài hoặc nút cao BU.
c) Loai g iu n có k íc h thước nhỏ
- Để từng lô giun trong ống nghiệm chứa cồn ethylic 70°, đậy nút bông gòn
không thấm nưốc, bao miệng.
- Phải dán nhãn, viết ngày bằng bút mực tàu, bút mỡ.
- Để cả lô vào bình có nắp, dưói lót bông thấm nước, đổ đầy cồn ethylic 70°,
đậy nắp. Tránh cồn bay hơi (nắp phải có vòng cao su).
3.3. N h ữ n g đ iể u c ầ n b iế t k h i lưu g iữ KST lâ u dài
- Giun mất độ trong và màu tự nhiên: khi bị cô định trở nên đục và hđi
trắng nhưng giữ đưỢc rất lâu trong cồn.
- Trứng giun, sán thì dễ nhận nhưng không giông hệt như trong phân tưđi.
Vài loại trứng như trứng giun đũa, trứng giun móc sẽ bị phân bào nêu dung dịch
cô định không đủ nồng độ (dạng phân bào không bao giờ gặp trong phân tươi).
20


- Bào nang đơn bào ở dạng tươi thì nhân có màu kém. Sau một thòi gian
lưu, những nhân này không nhuộm màu nhưng lại rõ hơn là ở trạng thái tươi.
- Dạng hoạt động của amíp mất nhanh chóng độ chiết quang trong dung
dịch formol.

- Trong MIF, amíp không bị ly giải, nhận ra dễ. Ngược lại, sau khi để trên
lam kính và đậy bằng lá kính, màu của chúng biến mất, không thể dùng làm
mẫu để lâu dài trên lam kính và lá kính.

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ
1. Thế nào là thu thập phân đúng quy cách?
2.

Đối vối anh (chị), điều gì quan trọng trong khâu thu thập phân?

3. Theo anh (chị) hiện nay, các phòng xét nghiệm trong nước ta có chú trọng
đến việc lấy bệnh phẩm? và kết quả của việc có/không chú trọng đến việc
lấy bệnh phẩm là gì?
4.

Bảo quản bệnh phẩm có ích lợi gì?

5.

Nêu tên những hóa chất bảo quản phân thường được dùng, cho biết ưu và
nhược điểm của từng hóa chất bảo quản được nêu.

6.

Cách bảo quản đơn bào khác với cách bảo quản giun, sán như thê nào?

7.

Hóa chất bảo quản có ảnh hưởng gì đến KST khi KST được ngâm trong thòi
gian lâu dài?

21


Bài 4

KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PHÂN TÌM KÝ SINH TRÙNG
■

•

MỤC TÍÊU
Ị. Mồ tậ ậựợc quy trình xét nghiệm phân.
2. Lầm được xét nghiệm phân bằng phương pháp trực tiếp.
3. Phát hiện đưỢc những sai lầm trong thao tác xét nghiệm phân trực tiếpXs

I. ĐẠI CƯƠNG
Trong phòng xét nghiệm, khi nhận được bệnh phẩm, nếu là phân tươi
không có chất bảo quản, chúng ta cần quan sát bằng mắt (đại thể) trưổc để có
được những nhận xét sơ bộ về mẫu phân, ghi nhận những đặc tính của mẫu
phân, phân loại bệnh phẩm để xét nghiệm: mẫu phân lỏng, có chất nhày, máu
phải xét nghiệm ngay.
Không nên đế phân ngoài trời, không có nắp đậy; không nên để lọ phân trên
phiếu xét nghiệm hoặc để dồn mẫu vào cuôi buổi mối xét nghiệm.
Đôi vái phân được bảo quản trong dung dịch cố định thì quan sát đại thể
không thực hiện được.
Để phát hiện được KST chúng ta cần phải dùng kính hiển vi để quan sát (vi thể).
1. QUAN SÁT ĐẠI THỂ
Quan sát đại thể (bằng mắt hoặc kính lúp) để ghi nhận trạng thái, màu sắc,
các chất lạ, tìm kiếm và xác định các loại giun, sán được thải ra theo phân.

1.1. T r ạ n g th á i p h â n
Phân có thể ở các trạng thái;
- Cứng rắn (khó đâm thủng).
- Cứng (đâm thủng được).
- Mềm (cắt được).
- Nhão (có thể biến dạng).
- Lỏng.
- Lỏng như nưốc.
1.2. M àu sắ c
Thay đổi từ đen, nâu đậm, nâu, nâu nhạt, vàng, xanh, màu đất sét hay đôi
khi đỏ, trắng.
22


I.3. Các c h ấ t la
- Chất nhày: thường đục, có thể kết thành sỢi, hình dáng giống như ký sinh
trùng. Chất này được xem xét cẩn thận đề tìm các đơn bào, các trứng Schistosoma.
- Mô liên kết: màu tráng như xà cừ. Xem dưói kính hiển vi sau khi làm
trong với acid acetic sẽ thấy những sỢi dài.
- Máu: chỉ cần ghi nhận sự hiện diện máu tươi hoặc đã được tiêu hóa làm
phân có màu đen đều.
- Mủ: gồm có nhiều bạch cầu đã biến dạng.
- Các cặn bã thực vật chưa tiêu hóa, thường dưói hình thức sỢi.
2. QUAN SÁT VI THỂ
Quan sát vi thể có thể được thực hiện vối kỹ th u ậ t xét nghiệm phân trực
tiếp, tập trung KST trong phân, kỹ thuật chuyên biệt, cấy và nhuộm cố định.
II. KỸ THUẬ T XÉT NGHIỆM PHÂN TRựC TIẾ P
•

•

•

Kỹ thuật xét nghiệm phân trực tiếp sử dụng phân hòa tan trong nưóc muối
cho phép phát hiện sự di động của thể hoạt động đơn bào, trứng giun, sán, ấu
trùng giun và các vật thể bất thưòng ti-ong phân (hồng cầu, bạch cầu,...),
ưu điểm:
- Đơn giản
- Cho kết quả nhanh chóng và chính xác
- Không đòi hỏi dụng cụ, hóa chất đắt tiền.
Nhược điểm:
- Độ nhạy thấp.
1. DỤNG CỤ
-

Kính hiển vi
Lam kính, lá kính
Viết (bút) chì sáp
Que gỗ
Khăn vải
Bình đựng dung dịch sát trùng
Kẹp.

2. HÓA CHẤT
- NaCl
- Lugol
- Dung dịch sát trùng.

0,85%
1%

23


3. QUY TRÌNH LÀM TIÊU BAN PHÂN
® Lấy một tấm lam kính sạch, khô. Dùng viết chì sáp chia lam kính ra làm
3 phần. Ghi tên bệnh nhân vào ô nhỏ ở đầu lam kính.
® Nhỏ lên lam kính 1 giọt NaCl 0,85% vào ô giữa, 1 giọt Lugol ở ô cuối.
(D Dùng que gỗ lấy một ít phân bằng đầu que diêm, hòa tan phân vào giọt
NaCl 0,85%.
® Lấy phân lần thứ hai rồi hòa tan phân vào giọt Lugol.
® Bỏ que gỗ vào dung dịch sát trùng.
® Đậy lá kính lên 2 giọt phân.
® Khảo sát tiêu bản dưói kính hiển.

0

Tên BN

NaCI 0,85%

Lugol 1%

0

0

(D

Tên BN

Hình 4.1. Mô tà các bưóc chính của quy trình làm tiêu bản phân

4. TIÊU CH ư Ẩ n Củ a m ộ t t i ê u b ả n t ố t
Không quá dày: phân nhiều sẽ làm tiêu bản đục tôi, che lấp KST, khó
phát hiện.
24