Tóm tắt luận văn Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu sự thay đổi của Heparansulfate Interacting Protein (HIP) và Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) ở mô ung thư vú

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯

§Æng thÞ tuyÕt minh

nghiªn cøu sù thay ®æi cña
heparansulfate interacting protein (HIP) Vμ epidermal growth
factor receptor (EGFR) ë m« ung th− vó

Chuyên ngành :
Hóa sinh Y học
Mã số : 62.72.04.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2010


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI :
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

Người hướng dẫn khoa học :
PGS.TS. Tạ Thành Văn
PGS.TS. Nguyễn Thị Hà

PHẢN BIỆN 1: GS. TSKH. Đái Duy Ban - Viện cộng nghệ sinh học
PHẢN BIỆN 2: PGS. TS. Bạch Vọng Hải - Học viện quân Y.

PHẢN BIỆN 3: PGS. TS. Ngô Thị Thu Thoa - Bệnh viện K
Luận án sẽ được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án cấp Trường tại Trường Đại
học Y Hà Nội.
Vào 15 giờ ngày 19 tháng 11 năm 2010

CÓ THỂ TÌM HIỂU LUẬN ÁN TẠI
- Thư viện Quốc gia
- Thư viện Trường Đại học Y Hà Nội
- Viện Thông tin – Thư viện Y học Trung ương


MỘT SỐ CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN

1. Tạ Thành Văn, Đặng Thị Tuyết Minh (2006), “Heparansunfate interacting
protein (HIP) điều hòa sự phát triển tế bào thông qua mitogen – activated
protein kinase (MAPK)”, Tạp chí Y học Việt Nam, số 3(20),
tr 49-54.
2. Đặng Thị Tuyết Minh, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn
(2008), “Tăng cường sao chép Heparansunfate interacting protein (HIP) ở
mô ung thư vú”, Tạp chí Nghiên cứu Y học, số 53(1), tr 8-15.
3. Đặng Thị Tuyết Minh, Trần Văn Khánh, Trần Thị Chính, Tạ Thành
Văn (2008), “Đánh giá mức độ sao chép mRNA của EGFR ở mô ung thư
vú”, Tạp chí Nghiên cứu Y học, số 59(6), tr 29-33.
4. Đặng Thị Tuyết Minh, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn
(2009), “Đánh giá mức độ biểu hiện protein HIP ở mô ung thư vú theo các
giai đoạn và các thể tế bào học khác nhau”, Tạp chí Y học Việt Nam, số 354
(1), tr 27-32.

1

T VN
1. Tớnh cp thit ca ti
Ung th vú (UTV), một bệnh ung th hay gặp nhất ở
phụ nữ v l nguyên nhân hng u gây tử vong do ung
th ở phụ nữ trên ton thế giới. Năm 2006, UTV l loại
ung th thờng gặp nhất ở phụ nữ Hoa K v Châu Âu.
Vit Nam, t l mc bnh UTV cú xu hng tng dn v
trong nhng nm gn õy UTV cng l loi thng gp
nht ph n. Mc dự t l mc bnh UTV cú xu hng
tng lờn nhng t l t vong li gim dn nh nhng
thnh tu mi t c trong vic phỏt hin sm, chn
oỏn chớnh xỏc v iu tr cú hiu qu. Hiện nay bờn cnh
cỏc phng phỏp ang c ỏp dng trong chn oỏn v
iu tr UTV, các nh khoa học ó v đang đi sâu vo
nghiên cứu các gen, các marker ung th đặc hiệu trong ú
cú nhóm cỏc protein mng tế bo nhm góp phần chẩn
đoán sớm mc sinh hc phõn t. Tin b ca khoa
hc k thut, c bit trong lnh vc sinh hc phõn t
trong thp k gn õy cho phộp i sõu nghiờn cu cỏc c
im sinh hc, cu trỳc v chc nng ca nhúm cỏc
protein mi ny. Nhng bng chng khoa hc ó chng
minh cú s tng cng biểu hiện ca Heparansulfate
Interacting Protein (HIP) v Epidermal Growth Factor
Receptor (EGFR) mc mRNA v protein trong mt
s loi hỡnh ung th. Kt qu ny ó m ra mt trin vng
nghiờn cu ng dng HIP v EGFR nh mt marker ung

2

th gúp phn chn oán sm, tiên lng v theo dừi
iu tr bnh lý ung th.
2. Mc tiờu ti
1. Xác định sự thay đổi của HIP, EGFR ở mức độ
mRNA v protein ti mô ung th vú (so với u xơ
tuyến vỳ lnh tính).
2. Kho sỏt s thay i ca HIP, EGFR ở mức độ
mRNA v protein trong cỏc th ung th vỳ phõn
loi theo mụ bnh hc.
3. í ngha thc tin v úng gúp mi ca ti
Ung th cho n nay vn c coi l mt trong
nhng cn bnh nan y vỡ bnh tin trin tun tin v khú
kim soỏt; c ch bnh hc cha rừ rng v trong nhiu
trng hp, kh nng can thip ca ngi thy thuc rt
hn ch. Mt trong nhng gii phỏp can thip hiu qu
nht hin nay i vi cn bnh ny l chn oỏn sm v
iu tr can thip sm.
õy l nghiờn cu u tiờn Vit Nam v HIP v
EGFR bnh nhõn ung th vỳ. Nhng kt qu nghiờn
cu cho thy mc sao chộp mRNA v biu l protein
ca HIP, EGFR tng rừ rt trong ung th biu mụ tuyn
vỳ, nht l trong ung th biu mụ tuyn v th ng. Trờn
c s phỏt hin ny, HIP v EGFR khụng ch cú th l
nhng marker mi trong chn oỏn ung th vỳ m cũn cú
th c xem nh mt ớch y ha hn (khõu then cht)


3

ca liu phỏp iu tr nhm ngn chn dũng thỏc tớn hiu
c truyn vo trong t bo.
4. Cu trỳc lun ỏn
Lun ỏn c trỡnh by trong 111 trang (khụng k ti
liu tham kho v ph lc), bao gm cỏc phn: t vn
(3 trang); tng quan ti liu (31 trang); i tng v
phng phỏp nghiờn cu (18 trang); kt qu nghiờn cu
(28 trang); bn lun (29 trang); kt lun (1 trang); kin
ngh (1 trang).
Lun ỏn gm 11 bng, 6 biu , 39 hỡnh. Trong 128
ti liu tham kho cú 23 ti liu ting Vit, 105 ti liu
ting Anh. Ph lc gm cỏc bng kt qu tỏch chit RNA,
m vch HIP, EGFR v GAPDH, danh sỏch bnh
nhõn.
CHNG 1
TNG QUAN TI LIU
1.1.3. Ung th vú
Ung th vỳ (UTV) l u ác tính phát sinh từ các tế bo
biểu mô của ống tuyến vú (sinh sữa v dẫn sữa). Các đơn
vị mô có chức năng sản xuất sữa đợc gọi l đơn vị ống
tận - tiểu thuỳ (ống tận cùng - tiểu thuỳ tuyến). Trong
vùng ny các tế bo trở nên bất thờng v có thể tiến triển
thnh UTV. UTV liên quan chặt chẽ với hoạt động của
các tuyến nội tiết nên c gọi l bệnh phụ thuộc nội tiết.
1.1.4. Cỏc phng phỏp chn oỏn ung th vỳ
Cỏc phng phỏp chn oỏn UTV cú th l chụp
phim X quang vi sự tập trung vo các vùng nghi ngờ,
siêu âm sử dụng các sóng âm tần số cao để xác định rõ

4

các vùng nghi ngờ của vú. Siêu âm không gây đau v có
thể phân biệt giữa các tổn thơng lnh tính v ác tính. Cho
n nay, sinh thiết l cách duy nhất chn oỏn xỏc nh
UTV. Tuy nhiờn, iu quan trng l phi chn oỏn phõn
bit u x tuyn vỳ v UTV. U xơ tuyến l một thể lnh
tính của bệnh vú, thờng l một u đặc đơn độc (chỉ có một
u) của mô xơ v tuyến. Loại u ny rất phổ biến ở phụ nữ
mọi lứa tuổi, nhng u phổ biến hơn ở lứa tuổi 15 - 35 tuổi.
Nếu u đợc phát hiện ở một phụ nữ trẻ, vì lý do tâm lý, họ
thờng muốn đợc theo dõi. Nu u c phỏt hin
nhng phụ nữ ln tui dự u lnh tớnh cng nờn phu thut
ct b u.
Chớnh vỡ vy, vic xỏc nh tng trng hp u x
tuyn hay UTV luụn l thỏch thc i vi cỏc nh t bo
hc. Hn na, thụng thng t bo ung th ch c phỏt
hin khi khi u ó thnh hỡnh rừ, vo thi im ny hiu
qu ca s can thip b hn ch. Bi vy, trong nhng
nm gn õy nhiu nh nghiờn cu ó ngh n xu hng
s dng k thut chn oỏn sinh hc phõn t nhm phỏt
hin nhng bin i v gen sm nht trc khi cú bin
i v hỡnh thỏi t bo. Vic tỡm hiu cỏc bin i gen
trong quỏ trỡnh phỏt sinh ung th l cn thit giỳp tỡm ra
cỏc du n ung th mi, gúp phn chn oỏn sm bnh
ung th.
1.2.3. Cu trỳc HIP
* Cu trỳc v chc nng sinh hc ca HIP
HIP thuc nhúm cỏc protein gn vi ribosom L29,

liờn quan n s dch mó ca t bo cú nhõn. Khong


5

80% trình tự nucleotid và protein của HIP giống L29,
mRNA của HIP có chiều dài 1,3 kb và DNA của HIP mã
hóa 159 acid amin có trọng lượng phân tử khoảng 24
kDa, pI là 11,75.
Một số chức năng sinh học của HIP đã được công
bố: (1) Gắn đặc hiệu và chọn lọc với
heparin/heparansulfate (HP/HS); (2 Tham gia quá trình
liên kết tế bào - tế bào để qua đó tham gia quá trình làm tổ
của trứng, quá trình phát triển, biệt hoá và di căn của tế
bào; (3) Tham gia điều hoà quá trình đông máu
Khi HIP giảm tổng hợp hoặc bị loại bỏ hoàn toàn,
ảnh hưởng trầm trọng đến quá trình phiên mã và hậu quả
làm cho mức độ sinh tổng hợp protein trong tất cả các tế
bào của các cơ quan bị giảm nghiêm trọng.
* Vai trò của HIP trong ung thư
Sự tổng hợp “dư thừa” của HIP ở mô ung thư đã giải
phóng mạnh mẽ các yếu tố phát triển tế bào lưu giữ ở
khoảng gian bào. Thông qua con đường tín hiệu MAPK,
yếu tố phát triển sẽ tác động vào các thụ thể trên bề mặt tế
bào để thông qua các con đường tín hiệu thông tin sẽ
được truyền từ khoảng gian bào vào trong nhân để thúc
đẩy quá trình phân bào. Điều này cho thấy HIP có thể
thuộc trong nhóm các tác nhân hoạt hóa trong quá trình
khởi phát và phát triển của ung thư. Con đường tín hiệu
mà HIP tham gia có thể là một mắt xích quan trọng góp

phần lý giải thêm cơ chế của quá trình hình thành phân
chia, biệt hóa và phát triển vô hạn độ của tế bào ung thư.


6

a s cỏc th loi ung th l ung th biu mụ, trong
ú dũng t bo biu mụ l dũng t bo cú s tng hp HIP
cao hn hn so vi cỏc dũng t bo khỏc nh l dũng t
bo si. Cu trỳc ca khong gian bo trong cỏc khi u
cng khỏc bit hon ton so vi cỏc mụ bỡnh thng v
thnh phn HS/HP cng nh s phong phỳ v chng loi
v lng cỏc yu t phỏt trin. Thờm vo ú, s tng sinh
mch (angiogenesis) trong cỏc khi u cng khin cho s
lng t bo ni mc (dũng t bo cú mc sao chộp
HIP rt mnh) trong mụ sinh thit cng cao hn rt nhiu
so vi mụ u x. Tt c nhng iu ú u dn n mt kt
qu l tng cng tng hp HIP c tng cng mnh
cỏc khi u ung th so vi cỏc t chc lnh tớnh khỏc, nh
l cỏc khi u x.
1.2.4. Cu trỳc v chc nng ca EGFR
* Cu trỳc ca th th yu t phỏt trin biu mụ
(EGFR)
EGFR l glycoprotein bề mặt mng, gia ỡnh EGFR
cú bn thnh viờn: HER1 (EGFr, ErbB1), HER2 (neu,
ErbB2), HER3 (ErbB3) v HER4 (ErbB4). Trọng lng
phân tử ca EGFR l170 kDaltons (kDa), gồm một vùng
gắn kết các phối tử nằm ngoi mng tế bo, một vùng
xuyên mng đặc hiệu v một vùng trong t bo với vai trò
kích thích sự tăng sinh, biệt hoá của tế bo bình thng v

các tế bo ác tính. Khi phi t l yu t phỏt trin biu mụ
(Epidermal Growth Factor: EGF) gn với EGFR sẽ gây
nên sự phân cực thụ thể v sự tự phosphoryl hoá vùng có
hoạt tính enzym ca th th. Điều ny khởi đầu cho một


7

loạt phản ứng tế bo dẫn đến sự tăng sinh v tiến triển ác
tính của khối u: tăng sinh mạch máu, di căn v ức chế quá
trình chết theo chng trình (apotosis).
* Chc nng ca th th yu t phỏt trin biu mụ
(EGFR)
Cỏc EGFR u cú phn liờn kt ngoi mng, phn
xuyờn mng v phn trong bo tng cú hot tớnh tyrosin
kinase. Phn ngoi mng, vựng III (domain III) chớnh l
vựng gn kt cỏc yu t hot húa hay c ch cỏc th
th, dn truyn tớn hiu vo trong t bo lm t bo cú
th phỏt trin bỡnh thng hoc tr nờn ỏc tớnh. Phn
trong bo tng, u tn carboxy chớnh l phn ỏp ng
tr li hot tớnh tyrosin kinase v iu hũa chc nng
tyrosin kinase. Phn ng t phosphoryl húa ca tyrosin
kinase xy ra vựng ny nú úng vai trũ chớnh trong iu
hũa s phỏt trin tng sinh ca t bo. Khi vng mt cỏc
phi t (vớ d GF,TGF), vựng tyrosin kinase khụng
phosphoryl húa, chỳng dng n phõn v vựng kinase
khụng hot ng. Vựng tyrosin kinase tr nờn hot húa
khi phi t gn vi vựng ngoi bo kt qu lm phõn cc
l cỏc gc phosphat v t phosphoryl húa tyrosin iu
hũa trong vũng hot húa ca kinase. Sau khi hot húa,

vic t phosphoryl húa l nhng v trớ gn kt cỏc
protein tớn hiu v hot húa cỏc con ng tớn hiu.
* Th th yu t phỏt trin biu mụ (EGFR) v cỏc
ớch iu tr trong ung th
Tng hot tớnh ca EGFR cng cú th thỳc y kh
nng di cn ca cỏc t bo ung th. S gia tng biu l


8

EGFR liờn quan vi cỏc loi hỡnh ung th. c ch quỏ
trỡnh biu l EGFR l mt trong nhng nh hng ca
liu phỏp iu tr gen cho mt s loi hỡnh ung th. T
cỏc nghiờn cu ny, hai hng nghiờn cu chớnh gn õy
tip cn sn xut thuc iu tr ung th trờn lõm sng l:
1) sn xut khỏng th n dũng c ch cỏc EGFR phn
ngoi mng t bo; 2) sn xut cht c ch tiu phõn t
tyrosin kinase EGFR c bit l cỏc EGFRvI-III. Cỏc cht
ny hoc c ch phn ngoi mng t bo hoc phn trong
t bo ca EGFR nhng mc ớch chớnh l ngn chn
dũng thỏc tớn hiu c truyn vo trong t bo ca
EGFR.
CHNG 2
I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU
2.1. I TNG NGHIấN CU
47 mu ca 47 bnh nhõn c chn oỏn UTV v
15 mu ca 15 bnh nhõn u x tuyn vỳ lm i chng.
Chn oỏn UTV v u x tuyn vỳ da trờn kt qu mụ
bnh hc. Bnh nhõn c ly mu mụ nghiờn cu khụng
mc bt k mt ung th phi hp no khỏc. Cỏc mu

nghiờn cu (mu mụ ung th v mụ u x tuyn vỳ) gm
hai dng mu mụ ti v mu mụ ỳc trong block
paraffin. Quy trình lấy mẫu đợc đảm bảo vô trùng mụ
ti khụng b hng v bảo quản ở nhiệt độ - 800C ti
Trung tõm nghiờn cu Gen - protein, Trng i hc Y
H Ni.


9

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu mô tả cắt ngang, có đối chứng.
2.3. CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN
CỨU
2.3.1. Quy trình tách chiết RNA tổng sô
2.3.2. Xác định nồng độ, độ sạch RNA, cDNA bằng
phương pháp quang phổ kế
2.3.3. Phương pháp điện di acid nucleic
2.3.4. Kỹ thuật RT-PCR tổng hợp cDNA
2.3.5. Kỹ thuật PCR xác định mức độ sao chép HIP và
EGFR
* PCR bán định lượng: Sử dụng 3 cặp mồi để khuếch
đại toàn bộ chiều dài đoạn gen HIP, EGFR và GAPDH.
Sản phẩm sau PCR được điện di trên gel agarose 1,5%.
Đậm độ mỗi vạch HIP, EGFR và GAPDH được xác định
nhờ phần mềm chuyên dụng ChemiDoc iQ, 76S0053, đơn
vị tính đậm độ vạch sao chép biểu lộ HIP là pixel. Mức
độ sao chép của HIP và EGFR được tính bằng giá trị
trung bình đậm độ vạch HIP và EGFR.
* PCR định lượng: Sản phẩm sau PCR của HIP, EGFR

và GAPDH được điện di mao quản trên máy Agilent 2100
Bioanalyzer kết quả điện di có thể cho biết đồng thời cả
kích thước và nồng độ đoạn DNA được phân tách. Xác
định giá trị của HIP và EGFR thông qua tỷ lệ
HIP/GAPDH và EGFR/GAPDH.


10

2.3.6. Kỹ thuật Western blot xác định mức đ biu hin
protein HIP
2.3.7. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch xác định biểu hiện
protein EGFR
CHNG 3
KT QU NGHIấN CU
3.3. KT QU XC NH MC BIU HIN
GEN HIP TRONG UNG TH BIU Mễ V
3.3.1. Kt qu sao chộp mRNA ca HIP mụ u x tuyn
vỳ v mụ ung th biu mụ tuyn vỳ
* Hỡnh nh in di trờn gel agarose
Mc sao chộp ca HIP v GAPDH th hin bi
mRNA, c thc hin nh k thut PCR trờn mu
cDNA ca mụ u x tuyn vỳ lnh tớnh v mụ UTBM
tuyn vỳ. Mt cp mi c hiu c thit k da trờn
trỡnh t gen HIP v GAPDH ó c cụng b GenBank.
on gen HIP c nhõn cú kớch thc 504 bp v
GAPDH l 350 bp (hỡnh 3.3).

Hỡnh 3.3. Hỡnh nh in di sn phm PCR ca HIP v
GAPDH trờn gel agarose 1,5% ca mụ u x tuyn vỳ

v mụ UTBM tuyn vỳ. Mụ u x vỳ (1-7)v mụ ung th
(8-14). M (Marker): thang chun DNA chun 100 bp.


11

Nhận xét: Đậm độ vạch sản phẩm PCR của HIP các mẫu
mô UTBM tuyến vú rõ hơn nhiều so với mô u xơ tuyến
vú lành tính. Đậm độ vạch sản phẩm PCR của GAPDH
khá đồng đều, không có sự khác biệt giữa mẫu ung thư và
u xơ tuyến vú.
* Hình ảnh điện di mao quản

Hình 3.4. Hình ảnh điện di mao quản sản phẩm
PCRcủa HIP và GAPDH mô u xơ tuyến vú và mô
UTBM tuyến vú
Nhận xét: Trên hình ảnh điện di mao quản, các mẫu mô
u xơ tuyến vú đỉnh sản phẩm PCR của HIP thấp hơn
nhiều so với các mẫu mô UTBM. Tuy nhiên đỉnh sản
phẩm PCR của GAPDH khá đồng đều không có sự khác
biệt giữa các mẫu mô UTBM và u xơ tuyến vú.
Kết quả sao chép mRNA của HIP thu được từ điện di mao
quản tương đương với hình ảnh thu được từ điện di trên
gel agarose của sản phẩm PCR
3.3.2. Kết quả sao chép mRNA HIP ở mô ung thư biểu
mô tuyến vú thể ống
* Hình ảnh điện di trên gel agarose


12

GĐ I
1

2

3

4

GĐ II
5

6

7

8

9

GĐ III
10 11

12

13 14 15

16

M

HIP
504 bp

GAPDH
504 bp

Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của HIP và
GAPDH ở các giai đoạn khác nhau của mô UTBM
tuyến vú thể ống trên gel agarose 1,5%. Mẫu 1-6:GĐ I;
mẫu 7-11:GĐ II; mẫu 12-16:GĐ III; M (Marker): Thang
DNA chuẩn 100 bp
Nhận xét: Đậm độ vạch sản phẩm PCR của HIP tăng dần
theo giai đoạn trên mô UTBM tuyến vú thể ống. Đậm độ
vạch PCR sản phẩm của HIP tăng cao nhất ở các mẫu mô
ung thư GĐ III, thấp dần ở GĐ II và GĐ I. Nhìn chung,
đậm độ vạch PCR của GAPDH không có sự khác biệt
giữa các mẫu mô ung thư ở các giai đoạn khác nhau.
Bảng 3.3. Giá trị trung bình đậm độ vạch PCR HIP
của các mẫu mô u xơ và mô ung thư tuyến vú thể ống
Mô Mô ung thư thể ống
p
u xơ
Giai đoạn
(1) GĐI GĐ II GĐ p(1,2a)
<0,05
(2a) (2b)
III
(2c) p(1,2b)
Số lượng mẫu

15
6
16
14 < 0,01
Đậm độ vạch
131 173 199
221 p(1,2c)
< 0,01
HIP trung bình
(đơn vị pixel)
± SD
± 10 ± 6 ± 11 ± 10


13

p(2a-2b) < 0,01; p(2a-2c) < 0,01; p(2b-2c) < 0,05.
Nhận xét:
Đậm độ trung bình vạch điện di sản phẩm PCR thể hiện
sự sao chép mRNAcủa HIP ở mô u xơ vú là 131 trong khi
đó ở mô UTV thể ống là 173, 199, 221 và tăng theo giai
đoạn từ giai đoạn I đến giai đọan III. Sự khác nhau này có
ý nghĩa thống kê với p < 0,05 và 0,01.
* Hình ảnh điện di mao quản
GĐ I

GĐ II

GĐ III

Hình 3.6. Hình ảnh điện di mao quản sản phẩm PCR
của HIP và GAPDH theo giai đoạn UTBM tuyến vú
thể ống
Nhận xét: Trên hình ảnh điện di mao quản, những mẫu
mô UTBM tuyến vú thể ống ở các GĐ khác nhau mức độ
sao chép gen HIP cũng khác nhau. Các đỉnh HIP tăng cao
hơn rõ rệt ở GĐ III và thấp dần ở GĐ II, thấp nhất ở GĐ
I. Kết quả này tương đồng với kết quả PCR bán định


14

lng gen HIP. nh GAPDH khỏ ng u gia cỏc mu
mụ UTBM v u x vỳ, khụng cú s khỏc bit.
3.3.2. Kt qu sao chộp mRNA ca HIP mụ ung th
vỳ giai on II theo cỏc th mụ bnh hc
* Hỡnh nh in di trờn gel agarose
Th ty
1

2

Th tiu thựy
3

4

5

6

7

8

9

Th ng
10 11 12

Th nhy
13 14

15

16

M

HIP
504 bp

GAPDH
504 bp

Hỡnh 3.7. Hỡnh nh in di sn phm PCR trờn gel
agarose ca HIP v GAPDH mụ ung th vỳ giai
on II theo cỏc th mụ bnh hc. Th ty (1-3); th
tiu thu (4-8); th ng ( 9-13) v th nhy (14-16) M
(marker): Thang DNA chun 100 bp

Nhn xột: m vch sn phm PCR ca HIP cỏc
mu mụ ung th cựng G II rừ nht hai th nhy v
th ng, thp hn hai th tiu thựy v th ty. Trong
khi, m vch PCR ca GAPDH khỏ ng u, khụng
cú s khỏc bit gia cỏc mu mụ UTBM cỏc th mụ
bnh hc.
Bảng 3.4. Giá trị trung bình đậm độ vạch PCR HIP
của các mẫu ung th vú giai đoạn II theo phõn loại mô
bnh học

Loại mô
học
SL mẫu

Mụ u
xơ
15

Th
ty
3

Mụ ung th
Th tiu Th ng
thựy
5
16

Th
nhy

3


15

§Ëm ®é
v¹ch HIP
trung bình
(đơn vị
pixel)
SD

131

141

174

199

254

± 10

±5

±4

± 11

±5

Nhận xét: Đậm độ vạch mRNA trung bình của HIP ở các
mẫu mô ung thư cùng ở GĐ II cao hơn ở hai thể nhày và
thể ống: 199 và 254, trong khi đó ở hai thể tiểu thùy và
thể tủy: 141 và 131.
* Hình ảnh điện di mao quản
Thể tủy

Thể tiểu thùy

Thể ống

Thể nhày

Hình 3.8. Hình ảnh điện di mao quản sản phẩm PCR
của HIP và GAPDH theo các thể mô bệnh học
Nhận xét:- Trên hình ảnh điện di mao quản, những mẫu
mô UTBM tuyến vú trên cùng giai đoạn II nhưng ở các
thể mô bệnh học khác nhau có mức độ sao chép gen HIP


16

khác nhau. Các đỉnh sản phẩm PCR của HIP tăng cao rõ
rệt ở UTV thể nhày và thể ống, giảm dần ở UTV thể tiểu
thùy và thấp nhất ở UTV thể tủy. Đỉnh sản phẩm PCR của
GAPDH khá đồng đều giữa mẫu mô UTBM tuyến vú,
không có sự khác biệt giữa các thể mô bệnh học. Kết quả
này tương đồng với kết quả PCR bán định lượng gen HIP.

3.3.4. Đánh giá tỷ lệ HIP/GAPDH của các mẫu nghiên
cứu được định lượng bằng điện di mao quản
B¶ng 3.5. Gi¸ trÞ tỷ lệ HIP /GAPDH trên điện di mao
quản
Loại mô học
U xơ
Ung thư
Số lượng mẫu
4
21
Tỷ lệ
0,40
1,26
HIP/GAPDH
SD
± 0,10
± 0,44
Nhận xét: Tỷ lệ HIP/GAPDH ở các mẫu mô UTV cao rõ
rệt so với các mẫu mô u xơ tuyến vú. Tỷ lệ HIP/GAPDH
ở các mẫu mô nghiên cứu khẳng định HIP tăng cường sao
chép rất rõ ở những mô ung thư.
3.3.5. Mức độ biểu hiện protein HIP ở mô u xơ vú và
mô ung thư biểu mô tuyến vú.
U xơ
1

2

3

Ung thư
4

5

6

7

8

9

10

11

M

kDa

100
70
55
35
27


17

Hình 3.9. Hình ảnh điện di SDS-PAGE protein tổng số
của mô u xơ và mô ung thư biểu mô tuyến vú (nhuộm
Coomasie blue) .
M: marker (protein ladder, SM 1811, Fermantas); 1- 6:
mẫu u xơ;
7-11: mẫu ung thư
Nhận xét: Trên bản gel polyacrylamid xuất hiện các vệt
protein với các trọng lượng phân tử khác nhau. Không có
khác biệt về sự phân bố và đậm độ các vệt protein giữa
các mẫu mô ung thư và u xơ tuyến vú. Kết quả này cho
thấy sự đồng nhất về lượng protein tổng số được tách
chiết sử dụng trong mỗi giếng điện di
* Mức độ biểu hiện protein HIP ở mô u xơ với mô ung
thư vú bằng kỹ thuật Western blot
Bản gel chuyển qua màng nitrocellulose ở điều kiện
thích hợp sẽ cho ủ với kháng thể bậc 1, bậc 2 theo đúng
quy trình, phát hiện màu bằng cơ chất BCIP/NBT, kết quả
được chụp bằng máy UV chuyên dụng, băng protein HIP
thu được có trọng lượng phân tử bằng 24 kDa
Ung thư

U xơ
1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

M

kDa

70
55

35

24 kDa

27
15

Hình 3.10. Kết quả Western blot đánh giá mức độ
biểu hiện protein HIP ở u xơ và mô ung thư biểu mô

tuyến vú. M: marker (protein ladder, SM 1811,
Fermantas); 1-5 : u xơ tuyến vú; 6-11: mẫu UTBM tuyến
vú.


18

Nhận xét: Protein HIP biểu hiện ở vị trí marker ứng với
trọng lượng phân tử khoảng 24kDa. Đậm độ vạch protein
HIP rõ ở mô ung thư vú, trong khi đó ở mô u xơ đậm độ
nhạt hơn rất nhiều.
1

U x¬
2

GĐ I
3

4

5

6

GĐ II
7

8

9

GĐ III
10

11

M

kDa
70
55
35
27

24kDa

15

Hình 3.11. Kết quả Western blot đánh giá mức độ biểu
hiện protein HIP của mô ung thư thể ống theo từng
giai đoạn.
M: marker (protein ladder, SM 1811, Fermantas);1-3:
mẫu u xơ tuyến vú; 4-5: mẫu ung thư GĐ I; 6-8: mẫu ung
thư GĐ II;
9-11: mẫu ung thư
GĐ III.
Nhận xét: Các vạch protein HIP biểu hiện rõ hơn ở mô
ung thư so với mô u xơ tuyến vú và tăng theo giai đoạn
trên lâm sàng của ung thư tuyến vú thể ống từ GĐI –

GĐIII
* Mức độ biểu hiện protein HIP ở mô ung thư vú giai
đoạn II theo phân loại mô bệnh học
1

Thể tủy
2

3

Thể tiểu thùy
4
5
6

7

Thể ống
8

9

Thể nhày
10
11

M

kDa
70

55

35
27
24kDa
15


19

Hình 3.12. Kết quả Western blot đánh giá mức độ biểu
hiện protein HIP của mô ung thư vú giai đoạn II theo
phân loại mô bệnh học.
M: marker (protein ladder,
SM 1811, Fermantas); 1-3: thể tủy; 4-6 thể tiểu thùy; 7-9:
thể ống; 10 -11: thể nhày.
Nhận xét: Protein HIP biểu lộ khác nhau theo thể loại mô
bệnh học của ung thư vú. Protein HIP biểu lộ cao hơn ở
UTV thể ống và thể nhày, thấp hơn ở thể tiểu thùy và thể
tuỷ.
3.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN
EGFR TRONG UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN VÚ
3.4.1. Kết quả sao chép mRNA EGFR ở mô u u xơ so
với mô ung thư vú biểu mô tuyến vú
Mức độ sao chép của EGFR cũng như HIP, được
thực hiện nhờ kỹ thuật RT-PCR trên mẫu cDNA của mô u
xơ vú và ung thư. Đoạn gen EGFR được nhân có kích
thước 420 bp, gen GAPDH luôn được khuếch đại song
song trên tất cả các mẫu nghiên cứu (hình 3.13).
* Hình ảnh điện di trên gel agarose

Ung thư

U xơ
1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

M

EGFR
420 bp

GAPDH
350 bp

Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của EGRF
vμ GAPDH trªn gel agarose 1,5% của m« u x¬ vμ m«
UTBM tuyÕn vó. M« u x¬ vó (1-3) và m« ung th− vó ( 411); M (Marker): Thang DNA chuÈn 100 bp.


20

Nhn xột: m vch sn phm PCR ca EGFR cỏc
mu mụ UTBM tuyn vỳ rừ hn nhiu so vi mụ u x
tuyn vỳ lnh tớnh. m vch sn phm PCR ca
GAPDH khỏ ng u, khụng cú s khỏc bit gia mu
ung th v u x tuyn vỳ.
3.4.2. Kt qu sao chộp mRNA EGFR mụ ung th
biu mụ tuyn vỳ th ng
* Hỡnh nh in di trờn gel agarose
U x
1

2

G I
3

4

5

G II
6

7

8

9

G III
10

11

12

13

14

M

EGFR
420 bp

GAPDH
350 bp

Hỡnh 3.15. Hỡnh nh in di mRNA trờn gel agarose
ca EGRF v GAPDH trên mô u xơ vú v mô UTBM

tuyến vú thể ống. Mô u xơ vú (1-3) v mô ung th thể
ống GĐ I (4 - 6), GĐ II (7-10), GĐ III (11-14).
M
(Marker): Thang DNA chuẩn 100 bp.
Nhn xột: ậm độ vạch của EGFR ở những mẫu ung th
rõ hơn những mẫu u xơ v độ đậm tăng dần theo các giai
đoạn của UTV thể ống. EGFR đợc tăng cờng sao chép
ở mô ung th so với mô u xơ tuyến vú. Trên cùng một thể
mô bệnh học sự tăng cờng sao chép của EGFR tăng theo
giai đoạn lâm sng của ung th biểu mô tuyến vú.
Bng 3.8. Giỏ tr trung bỡnh m vch PCR EGFR
ca cỏc mu u x v ung th vỳ th ng
Mô UTV thể ống
Mô u
lnh G II G II
G
III

p


21

Sè l−îng mÉu 15(1) 6(2a) 16(2b) 14(2c) p (1,2a)
<0,05
ĐĐ v¹ch
100
122
191
217 p (1,2b) <

EGFR trung
0,01
bình (®¬nvÞ
p (1,2c) <
pixel)
± SD
± 11 ± 13
± 33
± 33 0,01
p (2a-2b) < 0,01; p (2a-2c) < 0,01; p (2b-2c) < 0,05.
Nhận xét: Đậm độ trung bình vạch điện di sản phẩm PCR
thể hiện sự sao chép mRNA của EGFR ở mô u xơ vú là
100 trong khi đó ở mô UTV thể ống là 122, 191, 217 và
tăng theo giai đoạn từ giai đoạn I đến giai đoạn III. Sự
khác nhau này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 và 0,01.
* Hình ảnh điện di mao quản

Hình 3.16. Hình ảnh điện di mao quản sản phẩm PCR
của EGFR và GAPDH theo GĐ UTBM tuyến vú thể
ống
Nhận xét: Trên hình ảnh điện di mao quản, những mẫu
mô UTBM tuyến vú thể ống ở các GĐ khác nhau có mức


22

sao chộp gen EGFR cng khỏc nhau. Cỏc nh sn
phm PCR ca EGFR tng cao hn rừ rt G III, gim
dn G II v thp nht G I. Kt qu ny tng ng
vi kt qu PCR bỏn nh lng sn phm PCR ca gen

EGFR. nh sn phm PCR ca GAPDH khỏ ng u
gia cỏc mu mụ UTBM v u x vỳ, khụng cú s khỏc
bit.
3.4.3. Kt qu sao chép mRNA EGFR mô ung th vú
giai on II theo phõn loại mụ bnh hc
* Hỡnh nh in di trờn gel agarose
U x
1

2

Th ty
3

4

5

Th tiu thựy
6

7

8

Th ng

9 10 11 12 13

Th nhy

14 15 16

17 18 M

EGFR
420 bp

GAPDH
350 bp

Hỡnh 3.17. Hỡnh nh in di sn phm PCR ca EGFR
v GAPDH mô ung th vú G II theo phân loại mô
bệnh học ống trờn gel agarose 1,5%. U xơ vú (1-3); thể
tuỷ (4-6), thể tiểu thuỳ (7-10), thể ng (11-15), thể nhy
(16-18). M (Marker): thang DNA chuẩn 100 bp.
Nhn xột: m vch sn phm PCR ca EGFR cỏc
mu mụ ung th cựng G II rừ nht hai th nhy v
th ng, thp hn hai th tiu thựy v th ty. Trong khi
m vch PCR ca GAPDH khỏ ng u, khụng cú
s khỏc bit gia cỏc mu mụ UTBM cỏc th mụ bnh
hc
Bảng 3.9. Giá trị trung bình đậm độ vạch PCR EGFR
ca các mu ung th vú giai đoạn II theo phõn loi mụ
bnh hc