Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nuôi trồng thủy sản: Nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VŨ THỊ HOAN

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT
OLIGOCHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG
TRONG BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN
LIỆU SAU THU HOẠCH

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

Chuyên ngành: Công nghệ chế biến thủy sản
Mã số:
9540105

Khánh Hòa - 2018
1


Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Nha Trang

Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Trần Thị Luyến
2. PGS. TS. Vũ Ngọc Bội

Phản biện 1:

PGS. TS. Nguyễn Anh Dũng
Trường Đại học Tây Nguyên

Phản biện 2:

PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩa
Trường Đại học Nha Trang

Phản biện 3:

GS. TS. Nguyễn Thị Hiền
Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp trường họp tại Trường Đại
học Nha Trang vào hồi ……… giờ, ngày …… tháng ……. năm 2018

Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia
Thư viện Trường Đại học Nha Trang
2


TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Đề tài luận án: Nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm
nguyên liệu sau thu hoạch
Ngành/Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản
Mã số: 9540105
Nghiên cứu sinh: ThS. Vũ Thị Hoan
Khóa: 2011
Người hướng dẫn: GS. TS. Trần Thị Luyến
PGS. TS. Vũ Ngọc Bội
Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang
Nội dung:
Luận án đã thu được một số kết quả mới bổ sung vào lĩnh vực nghiên cứu, sản xuất và ứng
dụng oligochitosan:

1) Luận án đã xác định được các thông số thích hợp cho quy trình sản xuất chitin bằng
phương pháp sinh học sử dụng phối hợp giữa vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC-B 431 lên men
khử protein, khoáng chất của đầu vỏ tôm thẻ và enzyme flavourzyme khử protein còn lại ở vỏ đầu
tôm: vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC-B 431 nuôi hoạt hóa trong 28 giờ và thu dịch sinh khối
có mật độ tế bào 2.109 cfu/ml, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1/1, tỷ lệ rỉ đường bổ sung 11,15% (w/w),
tỷ lệ dịch vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431 bổ sung 11,20% (v/w), lên men ở nhiệt độ phòng,
trong thời gian 6,19 ngày với pH ban đầu là 7,0; Sử dụng enzyme flavourzyme khử protein còn lại
ở đầu vỏ tôm thẻ chân trắng sau lên men với tỷ lệ enzyme sử dụng 0,06%, nhiệt độ thủy phân 50oC
ở pH 7,5, trong thời gian 8h. Sử dụng acid HCl 3% khử khoáng còn lại ở chitin thô với tỷ lệ dung
dịch acid/chitin thô: 2/1. Quá trình khử khoáng còn lại thực hiện ở nhiệt độ phòng trong thời gian
10h. Chitin sản xuất có chi phí nguyên vật liệu là 111.000 đồng/kg.
Quy trình sản xuất này giảm thiểu lượng hóa chất sử dụng nên giảm nguy cơ gây ô nhiễm môi
trường. Mặt khác sản phẩm phụ: protein, astaxanthin,.. tách ra từ quá trình lên men đầu vỏ tôm
bằng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B431 hoàn toàn có thể sử dụng làm thức ăn chăn nuôi. Do vậy,
quy trình sản xuất này vừa có ý nghĩa khoa học và vừa có ý nghĩa thực tiễn lớn trong bảo vệ môi
trường đồng thời tạo ra sản phẩm chitin theo sản xuất theo phương pháp sinh học “xanh” và “sạch”
hơn.
2) Luận án đã xác định được các thông số thích hợp cho quy trình sản xuất chitosan có độ
deacetyl trên 90%: deacetyl chitin bằng NaOH 50% ở nhiệt độ phòng trong thời gian 120h và tỷ
lệ dung dịch NaOH so với chitin 4/1. Chitosan sản xuất theo quy trình có độ deacetyl trên 93% và
có chi phí nguyên vật liệu là 361.365 đ/kg.
Đóng góp mới của kỹ thuật này ở chỗ quá trình deacetyl chitin thành chitosan được tiến
hành ở nhiệt độ phòng mà không sử dụng nhiệt độ cao như các phương pháp khác. Vì thế về mặt
công nghệ, quy trình sản xuất sẽ đơn giản và dễ thực hiện hơn. Do vậy, công nghệ này có thể dễ

3


dàng triển khai trong thực tế sản xuất ở quy mô lớn - đây chính là điều các doanh nghiệp chế biến
chitosan từ đầu vỏ tôm đang mong muốn.

3) Luận án đã xây dựng được quy trình sản xuất chế phẩm oligochitosan bằng cách sử dụng
bức xạ gamma coban 60 để phân cắt chitosan dạng vẩy với cường độ 166kGy. Oligochitosan thu
được sau khi chiếu xạ có 3 phân đoạn và có khả năng kháng 5 loại vi khuẩn: E. coli O157:H7,
Salmonella typhimurium, S. aureus, B. subtilis và Listeria monocytogenes.
Việc sản xuất oligochitosan theo kỹ thuật sử dụng bức xạ gamma coban 60 để phân cắt
chitosan dạng vẩy có ưu điểm là sản phẩm sau phân cắt không cần phải kết tủa bằng cồn, tinh
sạch và sấy khô như các phương pháp phân cắt chitosan thành oligochitosan bằng enzyme và hóa
học. Mặt khác, sản phẩm oligochitosan lại có khả năng kháng 5 loại vi khuẩn và dễ bảo quản, vận
chuyển. Do vậy về mặt công nghệ, phương pháp này có tính khả thi cao và dễ dàng triển khai sản
xuất đại trà chế phẩm oligochitosan.
4) Luận án đã xác định được cấu trúc phân tử của oligochitosan có 13 monomer.
5) Luận án đã tiến hành thử nghiệm độc tính của oligochitosan trên chuột thí nghiệm và
phân tích máu, nước tiểu, giải phẫu, cắt lát quan sát vi thể gan thận, lách của chuột sử dụng
oligochotosan cho thấy oligochitosan hoàn toàn an toàn và không gây độc cho chuột qua con
đường tiêu hóa cũng như không có bất cứ một ảnh hưởng nào tới các nội quan của chuột.
Đây là nghiên cứu đầu tiên tiến hành thử nghiệm oligochitosan trên chuột thí nghiệm. Việc
thử nghiệm đã chứng minh rằng chế phẩm oligochitosan sản xuất theo kỹ thuật phân cắt chitosan
bằng bức xạ gamma coban 60 hoàn toàn an toàn với chuột thí nghiệm tức là an toàn với con người
- đây chính là một hướng mới trong sản xuất và sử dụng oligochitosan cho lĩnh vực thực phẩm và
dược học.
6) Luận án đã nghiên cứu và xây dựng quy trình bảo quản tôm bạc biển bằng cách nhúng
chế phẩm oligochitosan với nồng độ 1% trong thời gian 1 phút. Tôm bạc nguyên liệu sau xử lý
oligochitosan 1% có thể bảo quản 6 ngày trong điều kiện mát mà vẫn đạt tiêu chuẩn chất lượng
dùng làm nguyên liệu chế biến.
Nghiên cứu này cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng oligochitosan trong bảo quản thủy sản
- nghiên cứu này nếu được triển khai trong thực tế sẽ góp hạn chế việc lạm dụng hóa chất trong
bảo quản nguyên liệu thủy sản.
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

GS. TS. Trần Thị Luyến

NGHIÊN CỨU SINH

PGS. TS. Vũ Ngọc Bội

4

Vũ Thị Hoan


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Nguyên liệu thủy sản thường dễ bị dập nát hư hỏng trong quá trình lưu giữ, bảo quản sau
thu hoạch. Vì thế, người dân có xu thế lạm dụng các loại phụ gia độc hại, có khả năng kháng khuẩn
như kháng sinh, hàn the, ure... để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu thủy sản sau thu hoạch
gây nên tình trạng mất an toàn thực phẩm. Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng các chất kháng khuẩn
có nguồn gốc tự nhiên, không độc hại trong bảo quản nguyên liệu thủy sản đang được các nhà
khoa học quan tâm nghiên cứu.
Theo hướng nghiên cứu này, các nhà nghiên cứu đang quan tâm tới việc nghiên cứu sử dụng
oligochitosan - tác nhân sinh học có nguồn gốc từ đầu vỏ tôm, có khả năng kháng khuẩn, chống
oxy hóa và không độc hại trong bảo quản nguyên liệu thủy sản. Do vậy việc “Nghiên cứu sản
xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch” là một hướng
nghiên cứu mới, cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn.
2. Mục đích của luận án
- Sử dụng phương pháp sinh học phối hợp giữa vi khuẩn lactic và enzyme protease để khử
protein và khoáng chất ở đầu vỏ tôm thẻ trong quá trình sản xuất chitin nhằm giảm thiểu hóa chất
sử dụng trong quá trình này.
- Sản xuất chitosan có độ deacetyl cao bằng NaOH nồng độ cao trong điều kiện nhiệt độ
thường để dễ dàng triển khai sản xuất ở quy mô lớn.
- Sản xuất được oligochitosan bằng công nghệ bức xạ Coban 60 và sử dụng oligochitosan

sản xuất được trong bảo quản tôm biển.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Đầu vỏ tôm: đầu vỏ tôm dùng trong nghiên cứu sản xuất oligochitosan là phế liệu đầu vỏ
tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) thu nhận tại bàn chế biến của Công ty Cổ phần Nha
Trang SeaFood (F17).
3.2. Phạm vi nghiên cứu
1) Nghiên cứu sử dụng phối hợp vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC-B và enzyme
flavourzyme để khử protein và các tạp chất còn lại ở đầu vỏ tôm thẻ chân trắng trong sản xuất
chitin.
2) Nghiên cứu sản xuất chitosan có độ deacetyl trên 90%.
3) Nghiên cứu sản xuất oligochitosan bằng phương pháp sử dụng bức xạ gamma coban 60.
4) Nghiên cứu xác định cấu trúc của oligochitosan.

5


5) Nghiên cứu đánh giá độc tính oligochitosan.
6) Thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của oligochitosan.
7) Thử nghiệm sử dụng oligochitosan trong bảo quản tôm nguyên liệu..
4. Phương pháp nghiên cứu
Luận án sử dụng các phương pháp nghiên cứu chuẩn của Thế giới và Việt Nam trong nghiên
cứu thu nhận oligochitosan từ phế liệu đầu vỏ tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), có sử
dụng toán học để tối ưu hóa nhằm đảm bảo kết quả thí nghiệm có độ tin cậy cao.
5 . Kết cấu của luận án
Luận án gồm 157 trang, trong đó 38 trang tổng quan, 13 trang phương pháp nghiên cứu, 87
trang kết quả nghiên cứu, kết luận 2 trang, 35 bảng số liệu, 91 hình, 136 tài liệu tham khảo (tiếng
Việt 28 tài liệu, tiếng Anh 108 tài liệu) và phụ lục 32 trang.

6

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHITIN VÀ CHITOSAN
Chitosan là một dẫn xuất của chitin, được hình thành khi thực hiện quá trình deacetyl hóa
chitin (tách nhóm acetyl) khỏi chitin. Chitosan là một polyme sinh học gồm các nhóm Dglucosamine (80%) và N-acetyl-D-glucosamine (20%) liên kết với nhau nhờ liên kết β(1 →4)
và được mô tả là “vật liệu sinh học đa năng nhất của tạo hóa” là một dẫn xuất chứa rất nhiều nhóm
amin. Công thức cấu tạo của chitosan gần giống như chitin và cellulose, chỉ khác là chitosan chứa
nhóm amin ở cacbon thứ 2.
Oligochitosan, thu được nhờ thủy phân chitosan, là một loại oligosaccharide có chứa một số
lượng có hạn các phân tử D-glucosamine.
Không giống như chitosan chỉ tan trong acid, oligochitosan do có cấu trúc mạch ngắn hơn
nên dễ tan trong nước hơn. Mặt khác oligochitosan lại có khả năng kháng khuẩn nên người ta có
thể dễ dàng sử dụng oligochitosan trong nhiều lĩnh vực thực phẩm chẳng hạn như sử dung làm
phụ gia giúp kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm, sử dụng làm tác nhân kháng khuẩn ứng dụng
trong sản xuất các chế phẩm sinh học dùng làm phân bón lá,…
Chitin

Nhóm N-acetyl

Chitosan

Nhóm amin

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin và chitosan
1.2. QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT CHITOSAN VÀ OLIGOCHITOSAN
Quá trình sản xuất chitin và các dẫn xuất của nó từ phế liệu thủy sản, đặc biệt là từ phế liệu
đầu vỏ tôm, phụ thuộc vào công nghệ sản xuất, hàm lượng chitin của phế liệu. Quá trình sản xuất
chitin từ phế liệu thủy sản nói chung và từ đầu vỏ tôm nói riêng bao gồm ba bước: khử protein,
khử khoáng và tẩy màu. Từ chitin, người ta thường tiến hành quá trình deacetyl hóa để tạo thành

chitosan và các sản phẩm khác. Để sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm, người ta có thể sử dụng phương

7


pháp hóa học, phương pháp sinh học kết hợp với hóa học hay sử dụng enzyme kết hợp với hóa
học,…
Trong phương pháp hóa học, trước tiên protein được tách khỏi đầu vỏ tôm bằng cách xử lý
đầu vỏ tôm bằng dung dịch NaOH loãng hoặc KOH loãng ở nhiệt độ cao. Nồng độ kiềm thường
sử dụng trong khoảng 1% - 10% ở dải nhiệt độ 30oC ÷ 100oC. Thời gian xử lý kiềm rất khác nhau
khoảng 30 phút ÷ 12 giờ. Sau đó, canxi cacbonat, canxi phosphat và các loại muối khoáng khác
trong phế liệu đầu vỏ tôm được tách ra bằng cách xử lý đầu vỏ tôm bằng dung dịch acid loãng. Tỉ
lệ acid sử dụng phải phải đủ lớn để đảm bảo tách hoàn toàn các muối khoáng trong đầu vỏ tôm.
Thường người ta sử dụng acid HCl để khử khoáng ở nhiệt độ phòng, trong thời thời gian từ 2 –
3h. Quá trình tẩy trắng chitin thường sử dụng các chất tẩy trắng như NaOCl, H2O2,… và hầu hềt
tiến hành ở nhiệt độ phòng.
Quá trình deacetyl chitin thành chitosan có thể được thực hiện bằng dung dịch NaOH hoặc
KOH đặc (40% - 50%) và được thực hiện ở nhiệt độ cao từ 80oC - 100oC. Chitin và chitosan có
thể được thủy phân bằng HCl đậm đặc ở nhiệt độ cao để tạo ra các monome glucosamine. Tuy
nhiên, quá trình thủy phân chitin hoặc chitosan bằng phương pháp hóa học thường tạo ra các
oligose có trọng lượng phân tử không định hướng được và một số lượng lớn các monome. Mặt
khác, quá trình thủy phân chitin hoặc chitosan bằng phương pháp hóa học có thể tạo ra các hợp
chất không mong muốn và nguy cơ ô nhiễm môi trường.
Ngoài phương pháp hóa học, người ta cũng có thể sản xuất chitin, chitosan bằng phương
pháp sinh học sử dung enzyme hay vi sinh vật. Trong sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học
sử dụng enzyme hoặc vi sinh vật để khử protein và khoáng chất ở đầu vỏ tôm, hàm lượng protein
còn lại ở chitin thường cao hơn phương pháp hóa học. Do vậy người ta có thể kết hợp giữa phương
pháp sinh học sử dụng enzyme và phương pháp hóa học để đảm bảo hàm lượng protein còn lại ở
chitin thấp. Hiện trên thị trường có sẵn một số enzyme protease thương mại có khả năng khử
protein ở đầu vỏ tôm như alcalase (EC 3.4.21.62), chymotrypsin (EC 3.4.21.2), papain (EC

4.3.22.2) và bromelain (EC 3.4.22.32). Sau khi thu được chitin, người ta thưởng sử dụng phương
pháp hóa học để deacetyl chitin tạo thành chitosan.
Từ chitosan thu được, người ta có thể sử dụng enzyme thủy phân liên kết glycosid để thủy
phân chitosan thành oligochitosan. Người ta cho rằng có một số enzyme có nguồn gốc từ vi sinh
vật có khả năng thủy phân chitosan như chitinase, chitosanase, … Theo một số nhà nghiên cứu,
phương pháp sử dụng enzyme thủy phân chitosan thành oligochitosan có ưu điểm là hiệu suất thủy
phân cao hơn và oligomer thu được có chiều dài mạch lớn hơn phương pháp hóa học. Mặc dù,
chitosanase vi khuẩn được cho là khá tuyệt vời cho sản xuất oligochitosan, song phương pháp này
được coi là quá đắt đối với sản xuất ở quy mô công nghiệp.
Hiện nay, người ta có thể chia phương pháp sản xuất oligochitosan từ chitosan thành 3 loại

8


như sau:
- Phân cắt chitosan bằng tác nhân hoá học: acid vô cơ (HCl, H2SO4, H3PO4, HNO2…), acid
hữu cơ (CH3COOH, HCOOH…), chất oxi hoá (O3, H2O2…),…
- Phân cắt bằng tác nhân lý học: tia X, ánh sáng, vi sóng hay chiếu xạ gamma, …
- Phân cắt bằng tác nhân sinh học (enzyme): chitosanase, chitinase, cellulase,
hemicellulase,…
Trong các phương pháp kể trên, phương pháp sử dụng chiếu xạ gamma để phân cắt chitosan
được nhiều nhà khoa học cho rằng có triển vọng lớn do giá thành sản xuất thấp và quan trọng hơn
oligomer thu được có kích cỡ và trọng lượng phân tử có thể điều chỉnh được thông qua điều chỉnh
liều chiếu xạ.
1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG OLIGOCHITOSAN
Oligochitosan là hợp chất có nguồn gốc tự nhiên, không độc hại, là sản phẩm của quá trình
thủy phân chitosan nhưng khả năng tan trong nước tốt hơn và có những tính chất sinh học gần giống
chitosan như có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, ... Vì vậy, oligochitosan theo
một số nhà khoa học sẽ được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực bảo quản và chế biến thực phẩm. Tuy
nhiên, hiện các nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung vào nghiên cứu ứng dụng chitin, chitosan còn các

nghiên cứu ứng dụng oligochitosan chỉ mới được quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây.
Theo một số tài liệu nghiên cứu được công bố gần đây, oligochitosan có một số tác dụng
như: kháng và hạn chế sự phát triển của vi sinh vật, chống oxy hóa, chống phát triển của tế bào
ung thư và có một số hoạt tính sinh học khác nữa.
Một số nhà nghiên cứu cho rằng có thể thủy phân chitosan thành chitosan oligosaccharide
bằng phương pháp hóa học sử dụng acid HCl đậm đặc (oligochitosan). Sản phẩm sản xuất theo
quy trình này đạt hiệu suất 70%. Các tác giả này bước đầu cũng nghiên cứu đề xuất quy trình sản
xuất oligochitosan bằng cách sử dụng enzyme cellulase, hemicellulase, papain để thủy phân
chitosan. Ngoài ra, một số tác giả còn thử nghiệm sử dụng enzyme cellulase kỹ thuật từ xạ khuẩn
ưa nhiệt để thủy phân chitosan tạo thành oligochitosan với hiệu suất thu oligochitosan từ chitosan
là 52,6%. Một số tác giả còn cho rằng sử dụng enzyme hemicellulase thương phẩm để thủy phân
chitosan tạo thành oligochitosan có thể thu được 88,9% oligochitosan từ chitosan.
Một nghiên cứu cho thấy có thể sử dụng enzyme hemicellulase để thủy phân chitosan thành
oligochitosan và điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân chitosan bằng enzyme hemicellulase
của nấm mốc: nhiệt độ thích hợp là 37oC, pH thích hợp 5, nồng độ enzyme 2%, thời gian thủy
phân 5 giờ. Oligochitosan thu được có thể sử dụng trong bảo quản sữa tươi với tỷ lệ sử dụng
oligochitosan thích hợp cho bảo quản sữa là 0,2% - 0,3%.
Nghiên cứu chế tạo oligochitosan bằng kỹ thuật bức xạ cho thấy khối lượng phân tử chitosan

9


giảm khi liều xạ tăng, chiếu xạ dung dịch chitosan 10% trong acid acetic nhận được các
oligochitosan chiếm 50% khối lượng sản phẩm.
Nghiên cứu chế tạo oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ dung dịch chitosan trong acid
lactic cho thấy hàm lượng oligochitosan tan trong nước pH=7 đạt khoảng 75%, độ deacetyl của
oligochitosan thay đổi hầu như không đáng kể so với chitosan ban đầu.
Một số nghiên cứu sử dụng chitosan oligosaccharide trong bảo quản nông, thủy sản sau thu
hoạch:
- Trong bảo quản cá ngân: sử dụng oligochitosan nồng độ 1% có khả năng giữ tươi cá sau 8

giờ ngay cả ở nhiệt độ phòng, nếu kết hợp với bảo quản lạnh ở nhiệt độ 8 – 10oC thì sau 36 giờ,
da cá vẫn còn sáng bóng như tự nhiên, chưa xuất hiện mùi lạ. Oligochitosan có tác dụng làm giảm
sự gia tăng hàm lượng NH3 trong cá do oligochitosan có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát
triển của vi sinh vật gây thối, ngoài ra, nó còn có tác dụng đáng kể sự giảm lượng vi sinh vật tổng
số trên bề mặt cá.
- Trong bảo quản thịt bò, thịt heo tươi: nồng độ oligochitosan tối ưu để giữ tươi thịt là 2%,
khi kết hợp giữ tươi thịt ở nhiệt độ thấp (8 – 10oC) thì hiệu quả giữ tươi tăng lên đáng kể, có thể
giữ tươi được 5 ngày. Ở điều kiện nhiệt độ thường, oligochitosan đã có tác dụng làm giảm 90% vi
sinh vật trên bề mặt thịt. Nếu dùng oligochitosan 2% kết hợp với sorbitol 2% thì thời gian bảo
quản dài hơn, làm giảm trên 95% lượng vi sinh vật tổng số trên bề mặt thịt.
- Khi so sánh khả năng bảo quản dứa của chitosan và oligochitosan thì màng bao chitosan
có tác dụng hạn chế sự hao hụt trọng lượng tốt hơn oligochitosan. Tuy nhiên khi kết hợp với bảo
quản lạnh thì khả năng diệt khuẩn của oligochitosan lại tốt hơn chitosan.
Từ các nghiên cứu về chitosan trong nước và trên thế giới cho thấy chitosan có nhiều đặc
tính phù hợp cho việc sử dụng trong bảo quản thực phẩm như có nguồn gốc tự nhiên từ vỏ tôm
cua nên không độc hại và có tính kháng khuẩn. Mức độ kháng khuẩn của chúng phụ thuộc vào
cấu trúc và mức độ deacetyl. Độ deacetyl càng lớn, cấu trúc mạch nhỏ ở một mức độ nhất định sẽ
có tính kháng khuẩn mạnh hơn và việc ứng dụng trong bảo quản thực phẩm càng có hiệu quả hơn.
Hiện tại, các nghiên cứu ứng dụng oligochitosan trong bảo quản thực phẩm mới chỉ được bắt đầu
nghiên cứu và chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ mặc dù đã có một số nghiên cứu chứng
minh oligochitosan có tính kháng khuẩn tốt.

10


CHƯƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Đầu vỏ tôm dùng sản xuất oligochitosan
Đối tượng dùng để nghiên cứu sản xuất oligochitosan là phế liệu đầu và vỏ tôm thẻ chân
trắng (Litopenaeus vannamei) thu nhận tại bàn chế biến của Công ty Cổ phần Nha Trang SeaFood

(F17). Từ các phần sau đây của tóm tắt luận án, thuật ngữ “đầu và vỏ tôm thẻ chân trắng” được
gọi tắt là “đầu vỏ tôm” cho tiện sử dụng.
2.1.2. Tôm bạc biển
Tôm bạc biển (Metapenaeus brevicornis) tươi được thu mua trực tiếp tại ghe đánh bắt tại
Cảng Cá Lương Sơn - Vĩnh Lương - Nha Trang. Tôm tươi đạt tiêu chuẩn TCVN 3726-89 và có
trọng lượng trung bình 30-40 con/kg.
2.1.3. Enzyme protease
* Alcalase (B4882): do hãng Novozyme - Đan Mạch sản xuất và Công ty TNHH Thương
Mại và Dịch vụ Nam Giang - TP. Hồ Chí Minh cung cấp. Alcalase có hoạt tính 2,4 AU/mg. Nhiệt
độ thích hợp của enzyme: 50oC – 60oC, khoảng pH thích hợp 7,5 - 8.
* Neutrase (P1236): do hãng Novozyme - Đan Mạch sản xuất và Công ty TNHH Thương
Mại và Dịch vụ Nam Giang - TP. Hồ Chí Minh cung cấp. Neutrase có hoạt tính 50.000 UI/g. Nhiệt
độ thích hợp của enzyme: 45oC – 55oC, khoảng pH thích hợp: 5,5- 7,5.
* Flavourzyme 1000MG: do hãng Novozyme - Đan Mạch sản xuất và Công ty TNHH
Thương Mại và Dịch vụ Nam Giang - TP. Hồ Chí Minh cung cấp. Flavourzyme có hoạt tính 1.000
LAPU/g. Nhiệt độ thích hợp khoảng 50oC, khoảng pH thích hợp: 5,0- 7,0.
* Enzyme pepsin: Pepsin P7000 do công ty Sigma-Aldrich cung cấp. Enzyme này được thu
nhận từ niêm mạc dạ dày lợn, có khoảng pH thích hợp 1,5 ÷4,0; pH tối thích từ 2,0-2,5; khoảng
nhiệt độ thích hợp 37 ÷ 42oC.
2.1.4. Nguyên vật liệu dùng cho xác định độc tính trên chuột
Chuột thí nghiệm: chuột lang (Cavia porcellus), có trọng lượng trung bình 300-350g: 80
con.
2.1.5. Vi khuẩn lactic
Sử dụng 3 chủng vi khuẩn lactic do Bảo tàng giống chuẩn Việt Nam (VTCC) - Đại học Quốc
gia Hà Nội cung cấp: L. plantarum (VTCC-B 431), L. bulgaricus VTCC 703, L. thermophillus.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

11

2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm theo sơ đồ nghiên cứu
tổng quát sau:
Đầu vỏ tôm

Nghiên cứu khử protein bằng tác nhân khác nhau

Enzyme protease

Vi khuẩn lactic

Chọn chế độ khử protein
Nghiên cứu khử protein và khoáng còn lại
Chitin
Nghiên cứu deacetyl chitin
Chitosan có độ deacetyl cao
Nghiên cứu phân cắt chitosan bức xạ Co-60
Đánh giá độc tính

Oligochitosan

Đánh giá chất lượng
và cấu trúc

Nghiên cứu bảo quản tôm nguyên liệu
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm trên, tiến hành nghiên cứu xác định từng công đoạn cho quá trình
nghiên cứu, chẳng hạn, xác định loại tác nhân sinh học (enzyme protease hay vi khuẩn thích hợp)
cho công đoạn khử protein ra khỏi đầu vỏ tôm thẻ chân trắng. Từ kết quả lựa chọn tác nhân khử
protein sẽ tiến hành tối ưu hóa quá trình khử protein. Trên cơ sở đó, sản xuất chitin và nghiên cứu

deacetyl để tạo ra chitosan có độ deacetyl cao sử dụng trong quá trình nghiên cứu phân cắt thành
oligochitosan bằng công nghệ bức xạ coban 60…. Sau khi đánh giá độc tính của oligochitosan,

12


tiến hành thử nghiệm bảo quản tôm bằng chế phẩm oligochitosan đã thu được.
2.2.2. Các phương pháp phân tích hóa học
+ Lấy mẫu và xử lý mẫu: theo TCVN 276 - 90
+ Phân tích cảm quan: đánh giá cảm quan nguyên liệu thủy sản bằng phương pháp cho điểm
theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3215-79, sử dụng thang điểm 20 để đánh giá cảm quan sản phẩm.
+ Xác định hàm ẩm: bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo phương pháp
sấy ở 105oC của AOAC, 1990
+ Xác định hàm lượng tro tổng số: bằng phương pháp nung ở 550oC của AOAC, 1990.
+ Xác định hàm lượng NH3: bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.
+ Định lượng nitơ tổng số: bằng phương pháp Kjeldal theo tiêu chuẩn TCVN 3705-90.
+ Định lượng lipid: bằng phương pháp Soclext theo tiêu chuẩn TCVN 3703-90.
+ Xác định hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp Microbiuret (Hein và cộng sự,
2004)
+ Xác định hoạt độ của enzyme protease: theo phương pháp Anson cải tiến.
+ Xác định độ nhớt bằng nhớt kế Ubbelohde theo phương pháp của Roberts và Domszy,
1982
+ Xác định độ hòa tan chitosan theo phương pháp của Kofuji, 2005
+ Xác định khả năng hút nước của chitosan theo phương pháp của No và cộng sự, 2000
+ Xác định biến đổi cấu trúc oligochitosan bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân.
+ Xác định hàm lượng chất không tan
Nguyên lý: hòa tan oligochitin/oligochitosan vào trong nước hoặc dung dịch đệm, sau một
thời gian nhất định tiến hành lọc dung dịch, sau đó thu giấy lọc và bã, sấy khô, cân giấy lọc và bã
không tan còn lại.
+ Xác định độ deacetyl của chitosan bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại IR.

+ Xác định khối lượng phân tử của chitosan bằng phương pháp sắc ký.
+ Cắt mạch chitosan bằng cách sử dụng nguồn bức xạ gamma phát ra từ đồng vị Co-60.
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn
* Phương pháp thu sinh khối vi khuẩn lactic
Các chủng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431, L. bulgaricus VTCC 703, L. thermophillus
do bảo tàng giống chuẩn Việt Nam (VTCC) - Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp. Các chủng vi
khuẩn bảo quản ở dạng đông sâu ở - 69oC. Trước khi sử dụng, được hoạt hóa và nhân giống trên
môi trường dinh dưỡng MRS.

13


2.2.4. Các phương pháp phân tích vi sinh vật
+ Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí: theo tiêu chuẩn ISO 6887-1 (9/1999).
+ Xác định Coliforms: theo tiêu chuẩn ISO 4831 (8/2006).
+ Xác định E.coli: theo tiêu chuẩn ISO 7251 (7/2005).
+ Xác định Staphylococcus aureus: theo tiêu chuẩn ISO 6888-1 (1/2004).
+ Xác định Salmonella: theo tiêu chuẩn ISO 6579 (2/2006).
+ Xác định tổng số nấm men và nấm mốc: theo tiêu chuẩn ISO 7954 (8/1988).
+ Xác định Clostridium perfringens: theo tiêu chuẩn ISO 7937 (2/2005).
2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Theo phương pháp thống kê. Mỗi thí nghiệm đều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu và kết quả
là trung bình cộng của các lần thí nghiệm. Tính toán và vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft office
excel 2007, xử lý kết quả theo thống kê kiểm định so sánh các giá trị trung bình giữa các nhóm
bằng phần mềm SPSS (version 16), phân tích phương sai ANOVA. Phân tích dữ liệu và tiên đoán
bề mặt đáp ứng bằng phần mềm Design Expert 8 trial.

14

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CƠ BẢN CỦA ĐẦU VỎ TÔM
Kết quả phân tích theo hàm lượng chất khô ở bảng 3.1 cho thấy phế liệu đầu vỏ tôm có hàm
lượng protein chiếm tỷ lệ khá cao tới 48,6% và hàm lượng khoáng tới 25,2%. Ngoài protein và
khoáng chất, đầu vỏ tôm còn có một lượng astaxanthin cao tới 146mg/kg. Do vậy việc nghiên cứu
tìm kiếm một phương pháp xử lý sinh học trong xử lý protein, khoáng chất ở đầu vỏ tôm trong sản
xuất chitin, chitosan nhằm tận thu nguồn protein, astaxanthin từ đầu vỏ tôm để sử dụng trong chăn
nuôi là cần thiết.
Bảng 3.1. Thành phần hoá học cơ bản của đầu vỏ tôm thẻ chân trắng
Chỉ tiêu phân tích

STT

Hàm lượng

1

Độ ẩm (%)

77,8±1,1

2

Hàm lượng khoáng tổng số (% theo trọng lượng chất khô)

25,2±0,6

3

Hàm lượng chitin (% theo trọng lượng chất khô)

17,9±0,5

4

Hàm lượng protein (% theo trọng lượng chất khô)

48,6±1,3

5

Hàm lượng lipid (% theo trọng lượng chất khô)

5,8±0,3

6

Hàm lượng astaxanthin (mg/kg, theo trọng lượng chất khô)

146 ± 6,2

3.2. NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ KHỬ PROTEIN VÀ
CÁC TẠP CHẤT CÓ TRONG ĐẦU VỎ TÔM TRONG SẢN XUẤT CHITIN
3.2.1. Nghiên cứu sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng enzyme
protease
3.2.1.1. Nghiên cứu lựa chọn enzyme protease
3.2.1.1.1. Ảnh hưởng của loại và tỷ lệ enzyme protease đến hiệu suất khử protein
Kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme flavourzyme có hiệu suất tách protein cao nhất đạt
71,3 ÷ 84,6%, enzyme alcalase và neutrase có hiệu suất tách protein tương đương nhau là 64,3 ÷
77,5 và 65,8 ÷ 78,3. Enzyme pepsin có hiệu suất khử protein thấp nhất và hiệu suất khử protein

của enzyem này nằm trong khoảng 36,9 ÷ 38,4%. Tỷ lệ enzyme so với nguyên liệu thích hợp để
khử protein ra khỏi đầu vỏ tôm thẻ là 0,08%.
3.2.1.1.2. Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất khử protein đầu vỏ tôm bằng enzyme protease
Kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy, nếu tính theo mức độ giảm dần của hoạt tính khử
protein ra khỏi đầu vỏ tôm tại các pH thích hợp của enzyme thì thứ tự enzyme được sắp xếp như
sau: flavourzyme, neutrase, alcalase, pepsin và pH thích hợp cho từng enzyme như sau: 7÷7,5;
7,5÷8; 7,5÷8; 2÷2,5.

15


3.2.1.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất khử protein đầu vỏ tôm bằng enzyme
protease
Kết quả nghiên cứu của luận án đã xác định được khoảng nhiệt độ thích hợp cho quá trình
khử protein đầu vỏ tôm của các enzyme alcalase, neutrase, flavourzyme và pepsin tương ứng là:
50oC ÷ 60oC, 50oC ÷55oC, 50oC ÷ 55oC và 35oC ÷ 40oC.
3.2.1.1.4. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất khử protein đầu vỏ tôm bằng enzyme
protease
Kết quả nghiên cứu cho thấy chế độ phù hợp cho các enzyme protease khử protein ở đầu vỏ
tôm như sau: alcalase ở nhiệt độ 55oC, pH 7,5, thời gian 10h; neutrase ở nhiệt độ 50oC, pH 7,5,
thời gian 10h; flavourzyme ở nhiệt độ 50oC, pH 7,5, thời gian 8h và pepsin ở nhiệt độ 40oC, pH
2, thời gian 12h.
3.2.1.1.5. Đánh giá chitin thô sản xuất theo phương pháp sử dụng enzyme protease khử
protein đầu vỏ tôm
Kết quả sử dụng enzyme protease khử protein đầu vỏ tôm được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Các chỉ tiêu chất lượng của chitin từ quy trình hoá học và quy trình sử
dụng enzyme protease để khử protein
Chỉ tiêu

Enzyme protease sử dụng khử protein đầu vỏ tôm

Alcalase

Flavourzyme

Neutrase

Pepsin

Trắng hơi có mầu

Trắng hơi có

Trắng hơi có

Trắng hơi có

hồng nhạt

mầu hồng nhạt

mầu hồng nhạt

mầu hồng nhạt

Dạng vảy

Dạng vảy

Dạng vảy

Dạng vẩy

Tro (%)

13,65±0,36

6,29±0,26

9,00±0,12

15,00±0,36

Độ ẩm (%)

14,80±1,70

12,60±2,80

13,70±1,90

14,90±2,20

10,98±0,22

4,16±0,25

7,12±0,26

13,18±0,28

Màu sắc

Trạng thái

Hàm

lượng

protein (%)
Kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme flavourzyme có khả năng khử protein tốt nhất trong số
các enzyme đã sử dụng nhưng hàm lượng protein còn lại ở đầu vỏ tôm vẫn còn tới 4,16%. Vì vậy
vẫn cần tiếp tục khử tiếp protein còn lại ở chitin thô bằng NaOH loãng và khử khoáng chất bằng
HCl loãng.
Từ các nghiên cứu ở trên cho thấy enzyme flavourzyme có hiệu suất khử protein cao hơn
các enzyme khác đã thử nghiệm. Do vậy, luận án lựa chọn enzyme flavourzyme để khử protein ra
khỏi đầu vỏ tôm.

16


3.2.1.2. Nghiên cứu khử protein còn lại ở đầu vỏ tôm bằng NaOH loãng và khử khoáng
bằng HCl loãng
3.2.1.2.1. Nghiên cứu khử protein còn lại ở đầu vỏ tôm bằng NaOH loãng
Kết quả nghiên cứu cho thấy có thể sử dụng xút 2% hoặc xút 3% để khử protein còn lại ở
đầu vỏ tôm. Nếu sử dụng xút 2% thì thời gian khử protein còn lại là 12 giờ và nếu dùng xút 3%
thì thời gian khử là 10 giờ.
3.2.1.2.2. Nghiên cứu khử khoáng còn lại ở đầu vỏ tôm bằng HCl loãng
Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ acid HCl sử dụng khử khoáng còn lại ở chitin thô là
3%, trong thời gian xử lý là 10 giờ.
3.2.1.3. Đề xuất quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng

enzyme flavourzyme khử protein
Từ các nghiên cứu đã làm, cho phép đề xuất quy trình sản xuất chitin từ phế liệu đầu vỏ tôm
theo phương pháp sử dụng enzyme flavourzyme khử protein trình bày ở hình 3.1.
* Thuyết minh quy trình
Đầu vỏ tôm
tôm thẻ
Xay nhỏ 0,5 - 0,6cm
Khử protein
Dịch protein

Thu hồi protein

Enzyme flavourzyme
Tỷ lệ E/S: 0,08%
Tỷ lệ nước/đầu vỏ tôm: 1/1
Nhiệt độ: 50oC
pH: 7,5
Thời gian: 8h

Khử protein còn lại bằng
NaOH 2%, 12h, to phòng

Rửa trung tính
Khử khoáng còn lại bằng
HCl 3%, 10h, to phòng

Rửa trung tính

Chitin
Hình 3.1. Sơ đồ qui trình sản xuất chitin từ phế liệu tôm bằng phương pháp sử dụng

enzym flavourzyme

17


+ Đầu vỏ tôm: Phế liệu đầu vỏ tôm được thu nhận từ bàn chế biến của Công ty Cổ phần Nha
Trang SeaFoods (F17) được rửa sạch tạp chất, bảo quản bằng đá xay và vận chuyển ngay về phòng
thí nghiệm làm đông lạnh để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất chitin.
+ Xay nhỏ: đầu vỏ tôm sau khi thu nhận được xay sơ bộ đến kích cỡ 0,5-0,6 cm với mục
đích làm dập phần đầu tôm để đảm bảo cho nguyên liệu đầu vỏ tôm tiếp xúc với enzyme trong
quá trình khử protein.
+ Khử protein: phế liệu đầu vỏ tôm đã làm dập được phối trộn với enzyme protease
flavourzyme với tỷ lệ nước so với đầu vỏ tôm 1/1 (v/w), tỷ lệ enzyme bổ sung so với nguyên liệu
0,08% (w/w), nhiệt độ khử protein là 50oC, pH 7,5 và thời gian thuỷ phân là 8h. Sau thời gian thuỷ
phân đem lọc và tách phần bã rắn chứa chitin thô. Phần dịch lỏng chứa protein và astaxanthin được
tận dụng để thu hồi protein và astaxanthin. Phần bã (chitin thô) thu được dùng cho các công đoạn
tiếp theo.
+ Khử protein còn lại: chitin thô thu được có hàm lượng protein 4,16% được khử protein
còn lại bằng NaOH loãng 2%, trong thời gian 12h, ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ dung dịch NaOH so
với chitin thô là 2/1.
+ Rửa trung tính: Sau khi khử protein còn lại, chitin thô thu được cần được rửa về pH trung
tính trước khi tiếp tục khử khoáng còn lại bằng HCl.
+ Khử khoáng còn lại: mục đích của khử khoáng là làm giảm hàm lượng khoáng ở chitin
về ≤ 1%. Chitin thô thu được ở trên được khử khoáng bằng HCl với nồng độ 3%, trong thời gian
10h, ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ dung dịch so với nguyên liệu là 2/1.
+ Rửa trung tính: Sau khi khử khoáng còn lại, chitin thu được cần được rửa về pH trung
tính trước khi sấy khô.
+ Chitin: chitin thu được sẽ được sấy lạnh ở 50oC, vận tốc gió 2m/s đến độ ẩm 12,3% và
đóng bao bì bảo quản.
Bảng 3.3. Chỉ tiêu chất lượng cơ bản của chitin thu được theo qui trình kết hợp sử

dụng enzym flavourzyme
STT

Chỉ tiêu chất lượng

Mẫu 1

Mẫu 2

Trắng hơi sẫm màu

Trắng sáng

1

Màu sắc

2

Độ ẩm (%)

13,60 ± 0,5

12,30 ± 0,5

3

Hàm lượng tro (%)

2,61 ± 0,9

1,00 ± 0,02

4

Hàm lượng Protein (%)

3,06 ± 0,6

0,99 ± 0,01

Ghi chú: Mẫu 1: chitin được sản xuất theo phương pháp hoá học và mẫu 2: chitin thu nhận
theo quy trình sử dụng enzym flavourzyme.

18


Như vậy sử dụng chế phẩm protease flavourzyme để khử protein đầu vỏ tôm trong sản xuất
chitin đã làm cho chitin có độ tinh sạch cao hơn và giảm thiểu lượng hóa chất sử dụng mà chất
lượng chitin được nâng cao và chất thải thu được có thể sử dụng để tận thu protein và asthaxanthin.

Hình 3.2. Bán chế phẩm chitin sau khi khử
protein bằng enzyme flavourzyme

Hình 3.3. Sản phẩm chitin sản
xuất bằng phương pháp sử dụng
enzyme flavourzyme

3.2.2. Nghiên cứu sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn
lactic để khử protein và các tạp chất

3.2.2.1. Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic thích hợp
3.2.2.1.1. Xác định thời gian nhân giống
Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng L. plantarum VTCC-B 431 có khả năng phát triển mạnh
nhất thể hiện qua độ đục môi trường nuôi cao hơn so với độ đục của môi trường nuôi 2 chủng L.
bulgaricus VTCC 703, L. thermophillus. Thời gian kết thúc quá trình nuôi vi khuẩn và thu sinh
khối tế bào ở thời điểm 28 giờ nuôi.
3.2.2.1.2. Đánh giá khả năng sử dụng vi khuẩn lactic trong xử lý đầu vỏ tôm
* Xác định tỷ lệ vi khuẩn lactic bổ sung
Tiến hành nhân giống để thu sinh khối 3 chủng vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC-B 431,
L. bulgaricus VTCC 703, L. thermophillus dùng cho quá trình nghiên cứu lên men khử protein ở
vỏ tôm. Sau khi nhân giống vi khuẩn có mật độ 109 cfu/ml.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, chủng vi khuẩn L. plantarum có hoạt tính mạnh nhất khi làm
giảm hàm lượng protein trong đầu vỏ tôm và tỷ lệ vi khuẩn lactic bổ sung vào nguyên liệu để thực
hiện việc khử protein đầu vỏ tôm được lựa chọn là 25%.
* Xác định thời gian lên men
Trong 3 chủng vi khuẩn lactic đã sử dụng, chủng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431 vẫn
thể hiện khả năng khử protein đầu vỏ tôm tốt hơn 2 chủng còn lại. Thời gian lên men 6 ngày là
phù hợp.
* Xác định pH lên men
Kết quả nghiên cứu cho thấy, khoảng pH thích hợp cho quá trình khử protein đầu vỏ tôm là
pH 7,0 ÷ 7,5. Chủng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431 luôn có khả năng khử protein đầu vỏ

19


tôm tốt hơn các chủng khác. Do vậy chủng L. plantarum VTCC-B 431 được lựa chọn sử dụng để
nghiên cứu quá trình khử protein ra khỏi đầu vỏ tôm thẻ.
3.2.2.2. Nghiên cứu sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn
lactic L. plantarum VTCC-B 431 để khử protein và các tạp chất
3.2.2.2.1. Xác định điều kiện thích hợp cho việc sử dụng vi khuẩn L. plantarum VTCCB 431 khử protein đầu vỏ tôm

* Xác định tỷ lệ vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431 bổ sung
Tiến hành nhân giống vi khuẩn L. plantarum VTCC 431 và thu sinh khối vi khuẩn có mật
độ tế bào 2.109 cfu/ml để dùng cho quá trình nghiên cứu khử protein đầu vỏ tôm. Kết quả nghiên
cứu cho thấy, tỷ lệ dịch sinh khối vi khuẩn bổ sung vào đầu vỏ tôm thẻ để thực hiện việc khử
protein và khoáng chất được lựa chọn là 10%.
* Xác định thời gian lên men
Kết quả nghiên cứu cho thấy, thời gian khử khoáng và protein từ đầu vỏ tôm bằng L.
plantarum VTCC-B 431 thích hợp là 6 ngày.
* Xác định pH lên men
Khi pH môi trường là 6,5 thì hiệu quả khử khoáng và hiệu quả khử protein cao nhất và đạt
mức 72,53% và 79,79%. Kết quả nghiên cứu cho thấy, pH thích hợp cho quá trình xử lý protein,
khoáng ở đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L. plantarum VTCC 431 là pH > 6,5 và để thuận tiện cho quá
trình nghiên cứu chọn pH =7.
* Xác định tỷ lệ rỉ đường bổ sung thích hợp
Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ rỉ đường bổ sung để lên men đầu vỏ tôm phù hợp là 10%
(w/w).
3.2.2.2.2. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình khử protein ở đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L.
plantarum VTCC-B 431
* Xác định mô hình hồi quy
Y = 8,83 - 0,13A + 0,37B + 0,19C + 0,091AB + 0,099AC + 0,034BC - 0,78A2 - 0,36B2 0,33C2 (1)
Từ đồ thị đường đồng mức và 3D biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường, nồng độ vi khuẩn
và thời gian lên men đến hiệu quả khử protein, chọn được khoảng tối ưu của chế độ lên men của
vi khuẩn L. plantarum VTCC-B431 là tỷ lệ rỉ đường (9,0 ÷ 18,0%), tỷ lệ vi khuẩn bổ sung (10 ÷
12%), thời gian lên men (5,5 ÷ 7 ngày).

20


Hình 3.4. Đường đồng mức biểu diễn ảnh
hưởng của tỷ lệ rỉ đường và tỷ lệ vi khuẩn

đến hiệu quả khử protein của vi khuẩn L.
plantarum

Hình 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường
và tỷ lệ vi khuẩn đến hiệu quả khử
protein của vi khuẩn L. plantarum

Hình 3.6. Đường đồng mức biểu diễn ảnh
hưởng của tỷ lệ rỉ đường và thời gian lên
men đến hiệu quả khử protein của vi khuẩn
L. plantarum

Hình 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và
thời gian lên men đến hiệu quả khử
protein của vi khuẩn L. plantarum

* Xác định thông số tối ưu cho quá trình lên men
Tiến hành tối ưu hóa và kiểm chứng lại thí nghiệm cho kết quả thông số tối ưu cho quá trình
lên men đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B431: tỷ lệ vi khuẩn bổ sung là 11,20%;
tỷ lệ rỉ đường là 11,15% và thời gian lên men là 6,19 ngày.
3.2.2.3. Nghiên cứu khử protein còn lại trong đầu vỏ tôm bằng enzyme flavourzyme
Nguyên liệu đầu vỏ tôm sau khi lên men khử protein bằng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B
431 vẫn còn chứa một lượng protein là 9,96%. Do đó, đầu vỏ tôm sẽ tiếp tục được xử lý bằng
enzym flavourzyme. Quá trình được thực hiện ở nhiệt độ 50oC; pH 7,5. Sau đó, rửa sạch chitin và
sấy khô đến độ ẩm 12,3% và tiến hành phân tích xác định hàm lượng protein còn lại. Kết quả
nghiên cứu cho thấy tỷ lệ enzym flavourzyme bổ sung 0,06% và thời gian thủy phân 8 giờ là thích
hợp cho công đoạn khử protein còn lại sau lên men ở đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L. plantarum
VTCC-B 431.

21

3.2.2.4. Nghiên cứu khử khoáng còn lại ở chitin thô bằng HCl
Kết quả nghiên cứu cho thấy, sử dụng HCl với nồng độ 3% và thời gian 10 giờ ở nhiệt độ
thường thì hàm lượng khoáng còn lại ở đầu vỏ tôm đạt thấp hơn 1%.
3.2.2.5. Đánh giá chất lượng chitin sản xuất theo quy trình sử dụng enzyme protease
và quy trình sử dụng vi khuẩn lactic để khử protein
Bảng 3.4. So sánh chất lượng chitin sản xuất theo các quy trình đã nghiên cứu và quy trình
tham khảo
STT

Chỉ tiêu chất lượng

Chitin 1

Chitin 2

Chitin 3

Trắng hơi sẫm màu

Trắng sáng

Trắng sáng

1

Màu sắc

2

Độ ẩm (%)

13,5 ± 0,5

12,4 ± 0,5

12,2 ± 0,5

3

Hàm lượng tro (%)

2,60 ± 0,5

0,99 ± 0,02

0,89 ± 0,02

4

Hàm lượng protein (%)

3,04 ± 0,7

0,98 ± 0,01

0,79 ± 0,01

Ghi chú: Chitin 1: chitin từ đầu vỏ tôm thẻ sản xuất theo phương pháp hóa học. Chitin 2:

chitin từ đầu vỏ tôm thẻ sản xuất theo quy trình sử dụng enzyme flavourzyme để khử protein và
khoáng chất. Chitin 3: chitin từ đầu vỏ tôm thẻ sản xuất theo quy trình sử dụng vi khuẩn L.
plantarum VTCC-B 431 để khử protein và khoáng chất.
Kết quả phân tích cho thấy, chitin sản xuất theo quy trình sử dụng vi khuẩn L. plantarum
VTCC-B 431 để khử protein và khoáng chất có hàm lượng protein và khoáng chất thấp hơn quy
trình sử dụng enzyme flavourzyme để khử protein và khoáng chất. Quy trình sản xuất chitin từ
đầu vỏ tôm chân trắng bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431 còn ưu
điểm hơn ở chỗ sau khi lên men và khử protein còn lại bằng enzyme thì chỉ cần dùng HCl loãng
để khử khoáng mà không phải sử dụng NaOH loãng để khử protein còn lại.
3.3. NGHIÊN CỨU DEACETYL CHITIN ĐỂ SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ ĐỘ
DEACETYL CAO

Hình 3.8. Hình ảnh về phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin
trong 120 giờ bằng xút ở các nồng độ: a: NaOH 50%; b: NaOH 45%; c: NaOH 40%;
d: NaOH 35%; e: NaOH 30%

22


Luận án tiến hành xác định nồng độ xút và thời gian deacetyl thích hợp. Kết thúc thời gian
deacetyl, lấy mẫu đánh giá độ deacetyl theo kỹ thuật FTIR. Kết quả nghiên cứu cho thấy, độ
deacetyl của chitosan khi xử lý bằng NaOH 50% ở 120 giờ đạt được là cao nhất.
Từ các nghiên cứu, luận án đề xuất quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao trên 90%
như hình 3.9.
Vi khuẩn L. plantarum
VTCC-B431

Đầu vỏ tôm

Rửa sơ bộ

Nhân giống 2.109 cfu/ml
Lên men

Rỉ đường 11,15% (w/w)
Nước/nguyên liệu: 1/1
Tỷ lệ vi khuẩn: 11,20% (v/w)
Thời gian: 6,19 ngày
pH ban đầu: 7,0

Ép
Dịch protein
Chitin thô
Thu hồi protein
Khử protein còn lại
HCl 3%
Tỷ lệ acid/chitin: 2/1
Nhiệt độ phòng
Thời gian: 10h

Enzyme flavourzyme
Tỷ lệ enzyme: 0,06%
Nhiệt độ: 50oC
pH: 7,5
Thời gian: 8h

Rửa
Khử khoáng còn lại
Rửa

Nhiệt độ: 50oC
Tốc độ gió: 2m/s

Sấy
NaOH 50%
Tỷ lệ xút/chitin: 4/1
Nhiệt độ phòng
Thời gian: 120h

Chitin

Độ ẩm: 12,3%

Deacetyl

Chitosan

Hình 3.9. Sơ đồ quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl trên 90% từ đầu vỏ tôm
* Thuyết minh quy trình:
+ Nguyên liệu đầu vỏ tôm: đầu vỏ tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) được thu mua tại Công
ty Cổ phần Nha Trang Seafood (F17), Khánh Hòa. Đầu vỏ tôm tươi sau khi thu mua, vận chuyển

23


ngay về phòng thí nghiệm.
+ Rửa sơ bộ: Tại phòng thí nghiệm, đầu vỏ tôm được loại bỏ tạp chất, rửa sơ bộ, đóng túi
5kg/túi, cấp đông và bảo quản – 20oC để dùng trong quá trình nghiên cứu.
+ Lên men: Trước khi lên men khử protein và khoáng chất bằng vi khuẩn lactic, tiến hành
nuôi hoạt hóa vi khuẩn trong 28 giờ và thu dịch sinh khối vi khuẩn có mật độ vi khuẩn 2.109 cfu/ml

để dùng làm giống khởi động cho quá trình lên men khử protein và khoáng chất ở đầu vỏ tôm.
Đầu vỏ tôm sau khi rã đông, bổ sung: nước với tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1/1, rỉ đường với tỷ lệ 11,15%
(w/w), vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431 với tỷ lệ 11,20% (v/w) và tiến hành lên men ở nhiệt độ
phòng, trong thời gian 6,19 ngày với pH ban đầu là 7,0.
+ Ép: Hỗn hợp đầu vỏ tôm sau khi lên men được ép thu dịch thủy phân để tận thu protein
phục vụ cho chăn nuôi. Bã đầu vỏ tôm (gọi là chitin thô) được rửa sơ bộ và sử dụng cho công đoạn
tái khử protein và khoáng chất.
+ Khử protein còn lại: Sử dụng enzyme flavourzyme để khử phần protein còn lại ở chitin thô
với tỷ lệ enzyme sử dụng là 0,06% và ở nhiệt độ 50oC, pH 7,5, trong thời gian 8 giờ.
+ Rửa: Chitin thô sau khi khử protein còn lại, được rửa sơ bộ để làm sạch dịch thủy phân
và sử dụng cho quá trình khử khoáng. Nếu lượng chitin thô quá nhiều có thể sấy khô để dùng dần
trong quá trình nghiên cứu.
+ Khử khoáng chất còn lại: tiến hành khử khoáng còn lại ở chitin thô bằng acid HCl 3%
với tỷ lệ dung dịch acid/chitin thô: 2/1 (v/w) và thực hiện khử khoáng ở nhiệt độ phòng, trong thời
gian 10 giờ.
+ Rửa: Sau khi khử khoáng, chitin được rửa về pH trung tính.
+ Làm khô: sấy khô chitin ở nhiệt độ 50oC, tốc độ gió 2m/s đến độ ẩm 12,3% hoặc phơi
nắng và bảo quản trong bao bì PE để dùng cho quá trình sản xuất chitosan.
+ Deacetyl: tiến hành deacetyl chitin bằng NaOH 50% ở nhiệt độ thường trong thời gian
120 giờ và tỷ lệ dung dịch NaOH so với chitin 4/1. Kết thúc quá trình deacetyl, thu chitosan, rửa
sạch và sấy khô bằng phương pháp sấy lạnh ở 50oC, tốc độ gió 2m/s.
* Sản xuất chitosan và đánh giá chất lượng
Luận án tiến hành sản xuất chitosan theo quy trình ở trên và đánh giá chất lượng của chitosan
sản xuất. Kết quả đánh giá trình bày ở bảng 3.5.
Kết quả phân tích tính chất chitosan cho thấy chitosan được sản xuất theo quy trình sử dụng
vi khuẩn lactic kết hợp enzyme protease để khử protein đầu vỏ tôm có độ deacetyl cao hơn chitosan
sản xuất theo quy trình sử dụng enzyme flavourzyme và quy trình hóa học. Kết quả này là phù
hợp vì quá trình sản xuất chitin bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn lactic kết hợp enzyme protease
ít làm cắt mạch chitin trong quá trình khử protein.

24


Bảng 3.5. So sánh đánh giá chất lượng chitosan sản xuất theo quy trình đã đề xuất và
quy trình tham khảo
Tính chất

STT

Chitosan 1

Chitosan 2

Chitosan 3

1

Màu sắc

Trắng đục

Trắng sáng

Trắng sáng

2

Độ ẩm (%)

12,7±0,40

12,46±0,40

12,32±0,35

3

Khoáng (%)*

0,98 ± 0,04

0,48 ± 0,04

0,18 ± 0,04

4

Protein (%)*

1,11 ± 0,07

0,46 ± 0,02

0,21 ± 0,02

5

Độ nhớt (cps)

1052 ± 32

1214 ± 23

1117± 23

6

Độ deacetyl (%)

84,16 ± 1,15

91,69 ± 1,12

93,56 ± 1,12

7

Độ tan (%)

96,28 ± 0,62

98,12 ± 0,26

99,29 ± 0,22

(*): tính theo hàm lượng chất khô
Ghi chú: Chitosan 1: chitosan từ đầu vỏ tôm thẻ sản xuất theo quy trình hóa học. Chitosan
2: chitosan từ đầu vỏ tôm thẻ sản xuất theo quy trình sử dụng enzyme flavourzyme. Chitosan 3:
chitosan từ đầu vỏ tôm thẻ sản xuất theo quy trình sử dụng vi khuẩn lactic.
3.4. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM OLIGOCHITOSAN BẰNG KỸ THUẬT

BỨC XẠ COBAN 60
3.4.1. Xác định độ hòa tan của chitosan trong dung dịch acid
Kết quả nghiên cứu cho thấy dung dịch acid acetic luôn cho hiệu suất hòa tan chitosan cao
hơn acid citric. Do vậy, luận án đã chọn dung dịch acid acetic làm dung môi hòa tan chitosan. Ở
tỷ lệ chitosan sử dụng 10% thì độ hòa tan chitosan trong dung dịch acid acetic 1% đạt 90%. Vì
vậy, để giảm thể tích khi chiếu xạ luận án chọn tỷ lệ chitosan hòa tan trong acid acetic 1% là 10%
(w/v).
3.4.2. Xác định liều xạ thích hợp cho việc cắt mạch chitosan tạo oligochitosan
Kết quả phân tích cho thấy liều chiếu xạ phù hợp cho quá trình phân cắt chitosan ở dạng
dung dịch trong khoảng 50-70 kGy và liều chiếu xạ phù hợp cho quá trình phân cắt chitosan ở
dạng vảy khô là > 150kGy. Tuy nhiên, thực hiện quá trình chiếu xạ khô, chế phẩm sau chiếu xạ
có đặc tính ở trạng thái khô nên dễ vận chuyển, bảo quản, sử dụng và quan trọng hơn giá thành
chế phẩm thấp hơn.
3.4.3. Tách phân đoạn chitosan sau khi chiếu xạ
Quá trình tách các phân đoạn oligochitosan từ chitosan sau chiếu xạ trình bày ở bảng 3.6.

25