Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết đề tài
Bacillus   anthracis  và  Yersinia   pestis  là   hai   loài   vi   khuẩn   gây 
bệnh tối nguy hiểm tương ứng là bệnh than và dịch hạch, từng gây 
nên nỗi kinh hoàng trong lịch sử loài người, có thể bị lợi dụng làm 
vũ khí sinh học.  Ở Việt Nam, B. anthracis còn xuất hiện rải rác ở 
các tỉnh miền núi phía Bắc, trong khi  Y. pestis vẫn tồn tại trên một 
số  loài gặm nhấm  ở  khu vực Tây Nguyên và có thể  bùng phát  
thành dịch bất kỳ  lúc nào. Mặt khác, chúng ta cần có phương án  
ứng phó nhanh, kịp thời trong phòng chống khủng bố sinh học.  
Trong một vụ tấn công nghi ngờ có khủng bố sinh học hay mẫu 
môi trường nghi nhiễm các mầm bệnh này, việc phát hiện nhanh, 
chính xác tác nhân sinh học là một trong những yếu tố quyết định 
đến sức khỏe cộng đồng và an ninh quốc gia. Việc sàng lọc nhanh 
những mẫu nghi ngờ giúp kiểm soát sự lây lan và đảm bảo điều trị 
chính xác. Phương pháp nuôi cấy truyền thống được xem là “tiêu 
chẩn vàng” trong xác định B. anthracis và Y. pestis. Tuy nhiên, mặc 
dù có độ  nhạy cao, phương pháp này đòi hỏi thời gian 2 ­ 3 ngày,  
một số  trường hợp độ  đặc hiệu không cao, cần tiến hành các thử 
nghiệm bổ sung. Ngoài ra, phương pháp này cần tiến hành ở điều 
kiện phòng an toàn sinh học cấp 3 (BSL­3) với nhân viên được đào  
tạo và có kinh nghiệm. Các phương pháp miễn dịch được nghiên 
cứu dưới dạng các que thử  nhanh rất thuận tiện nhưng độ  nhạy, 
độ đặc hiệu thấp. Do đó, các phương pháp này khó ứng dụng trong 
chẩn đoán trên thực địa và phòng chống khủng bố sinh học. 
Hiện nay, đã có một số kỹ thuật dựa trên PCR dùng để xác định  
nhanh và chính xác B. anthracis cũng như  Y. pestis được phát triển 
với những  ưu điểm nổi bật như  độ  nhạy, độ  đặc hiệu cao và có 
thể  thực hiện với các mẫu đã bất hoạt (nên chỉ  cần thực hiện  ở 
điều kiện phòng an toàn sinh học cấp 2). Tuy nhiên, hầu hết các kỹ 
thuật này chỉ phát hiện một loại plasmid độc lực với từng tác nhân 

nên không phát hiện được các trường hợp chủng thiếu một trong 
các plasmid trên. Đối với B. anthracis trong tự nhiên, để chẩn đoán 
chính xác những chủng gây bệnh, ngoài gen đặc trưng trên nhiễm 


sắc thể, cần chỉ ra được sự có mặt đầy đủ của hai plasmid độc lực  
là   pXO1   và   pXO2.   Trong  thực  tế   có   những  chủng   B.   anthracis 
thiếu một trong hai plasmid trên nên khả  năng gây bệnh thay đổi.  
Tương  tự,  Y.   pestis  chứa  hai   plasmid liên  quan đến tính độc   là 
pPCP1 và pMT1 với các gen đặc trưng tương  ứng. Do đó, các kỹ 
thuật này có thể  không đánh giá được đầy đủ  tình trạng độc lực  
của  B. anthracis,  Y. pestis  và phải phụ  thuộc vào thiết bị  chuyên 
dụng đắt tiền nhưng vẫn có thể  bỏ  sót chẩn đoán, chưa đề  cập 
đến là chúng có thể không phù hợp với một số chủng trong nước. 
Ở Việt Nam, việc sử dụng các kỹ thuật dựa trên PCR để chẩn  
đoán B. anthracis và Y. pestis đã được một số tác giả  công bố, tuy 
nhiên những nghiên cứu này chỉ mới dừng ở việc thiết kế kỹ thuật  
PCR để  chẩn đoán từng loại vi khuẩn trên. Điều này có nghĩa là  
trong thực tế khi bệnh dịch xảy ra mà chưa biết tác nhân nào được  
sử dụng, nếu dùng PCR với tác nhân thứ nhất cho kết quả âm tính 
thì phải dùng PCR lần thứ  hai với tác nhân khác, như  vậy đòi hỏi  
thời gian và kinh phí. Do đó, kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR ­ 
mPCR) có thể  xác định chính xác đồng thời hai loại tác nhân  B.  
anthracis và Y. pestis là một lựa chọn khả thi. Xuất phát từ những 
vấn đề  trên, chúng tôi thực hiện đề  tài: “Nghiên cứu phát triển 
kỹ   thuật   multiplex   PCR   xác   định   nhanh   đồng   thời  Bacillus  
anthracis và Yersinia pestis”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
­ Phát triển kỹ  thuật  multiplex  PCR xác định nhanh  đồng thời 
Bacillus anthracis và Yersinia pestis.

­ Đánh giá khả  năng phát hiện của kỹ  thuật   multiplex  PCR trên 
các bộ mẫu chuẩn và các chủng phân lập.

3. Nội dung nghiên cứu của đề tài
­ Thiết kế  các cặp mồi cho kỹ  thuật mPCR xác định nhanh  
đồng thời B. anthracis và Y. pestis.
­ Thiết kế, tối  ưu kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng thời B.  
anthracis và Y. pestis.


­ Đánh giá khả  năng phát hiện của kỹ  thuật mPCR chẩn đoán 
đồng thời  B. anthracis  và  Y. pestis  trong phòng thí nghiệm và  các 
chủng phân lập.
­ Phân tích trình tự  các gen đích đặc trưng và gen độc lực của 
các chủng B. anthracis và Y. pestis.
4. Đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình đầu tiên  ở  Việt Nam đã thành công trong 
nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng 
thời  B. anthracis  và  Y. pestis. Kỹ  thuật multiplex PCR với 6 cặp  
mồi được thiết kế, tối  ưu cho phép khuếch đại đồng thời 7 sản 
phẩm bao gồm: 3 gen đích là  vrrA  (thuộc nhiễm sắc thể),  pagA 
(thuộc   plasmid   pXO1),  capA  (thuộc   plasmid   pXO2)   của  B.  
anthracis;  và  3  gen  đích  là  ypo2088  (thuộc  nhiễm   sắc  thể),  pla 
(thuộc plasmid pPCP1),  caf1  (thuộc plasmid pMT1) của  Y. pestis, 
cùng 1 gen chứng nội tại là plasmid tái tổ hợp để xác minh kết quả 
chẩn đoán. Do đó, khắc phục được hiện tượng dương tính giả đối 
với trường hợp các chủng vi khuẩn B. anthracis và Y. pestis không 
đầy  đủ  độc  lực,  phân biệt  với  chủng gây bệnh,  giúp giảm  giá 
thành chẩn đoán so với việc phải thực hiện các lần PCR riêng rẽ,  

rút ngắn thời gian chẩn đoán.
5. Cấu trúc của luận án


Luận án gồm 139 trang, được chia thành các phần: Mở  đầu 
(3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (30 trang); Chương 2: Vật 
liệu và phương pháp nghiên cứu (14  trang); Chương 3: Kết quả 
nghiên cứu (47 trang); Chương 4: Bàn luận kết quả (21 trang); Kết 
luận và kiến nghị (2 trang); Các công trình đã công bố của tác giả 
(1 trang). Tóm tắt nội dung luận án bằng tiếng Anh (6 trang), Tài 
liệu tham khảo (15  trang). Luận án có  16  bảng biểu,  44  hình và 
151 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án đã tham khảo các tài liệu trong và ngoài nước về 3  
vấn đề chính: (1) Tổng quan về vi khuẩn B. anthracis và Y. pestis: 
đặc điểm sinh học, hệ gen cũng như sự liên quan giữa  B. anthracis, 
Y.   pestis  và   vũ   khí   sinh  học;   (2)  Các  phương   pháp  xác   định  B.  
anthracis  và  Y. pestis:  các phương pháp vi sinh truyền thống, xác 
định sinh hóa, dựa trên ái lực và các phương pháp dựa trên axit 
nucleic; (3) Kiểm định kit mPCR chẩn đoán.
B.  anthracis  là trực khuẩn  thuộc chi  Bacillus,  họ  Bacillaceae. 
Chi  Bacillus  gồm  các  vi  khuẩn Gram dương  sinh  bào tử,  đa số 
không   gây   bệnh,   một   số   gây   nhiễm   trùng   nhiễm   độc   thức   ăn 
(Bacillus cereus), một số  có lợi cho con người ( Bacillus subtilis,  
Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides). Đặc điểm hình thái, tính 
chất sinh lý, sinh hoá, tính chất nuôi cấy của các loài thuộc chi  
Bacillus rất giống nhau. Tuy nhiên, B. anthracis có đặc điểm khác 
biệt với các loài trực khuẩn hiếu khí sinh bào tử  khác, đo la co
́ ̀ ́ 

plasmid pXO1 ma hoa khang nguyên b
̃ ́
́
ảo vệ  va pXO2 mã hoá vo.
̀
̉ 
Y. pestis thuộc chi Yersinia, họ  Enterobacteriaceae. Chi Yersinia có 
11 loài, là các vi khuẩn Gram âm, không sinh bào tử. Trong chi  
Yersinia,  chỉ   có  ba  loài   gây  bệnh  ở   người   là  Y.   pestis,  Yersinia  
pseudotuberculosis  và  Yersinia   enterocolitica  (Radnedge,   2001). 
Loài nguy hiểm nhất,  Y. pestis  gây bệnh dịch hạch và viêm phổi 
cấp tính. 
Vũ khí sinh học hiện nay  đã trở  thành mối quan tâm hàng đầu 
của an ninh quốc gia bởi có thể bị  các tổ chức khủng bố lợi dụng 
trong chiến tranh sinh học.   Trong các tác nhân đã được WHO và 


CDC nêu ra,  B. anthracis,  Y. pestis  được đánh giá là tác nhân có 
nguy cơ cao nhất trong khủng bố vì gây bệnh nguy hiểm, dễ nuôi  
cấy, tăng sinh khối với số lượng lớn, không cần trang bị hiện đại 
lại dễ sử dụng, vận chuyển và gây nhiễm. 
Ở  Việt Nam đã có một số  nghiên cứu về  phòng chống chiến 
tranh sinh học đề  phòng các tình huống địch tấn công bằng vũ khí  
sinh học. Sự  quan tâm được đặt  ở  mức đặc biệt với hai loại vi  
khuẩn là  B. anthracis  và  Y. pestis. Xác định tầm quan trọng của  
việc xác định nhanh và chính xác hai loại vi khuẩn này, đề tài KCB 
01­09 và một số  đề  tài đã thiết kế  các phản  ứng PCR chẩn đoán 
cho từng loại tác nhân. Năm 2005, Lê Thanh Hòa và cs. đã nghiên 
cứu xây dựng phương pháp chẩn đoán nhanh Y. pestis trên các loại 
môi trường giả  định. Tuy nhiên, công trình chỉ  dừng lại  ở  việc  

khẳng định Y. pestis thông qua một đoạn gen duy nhất trên plasmid  
gây độc là pPCP1 (Lê  Thanh Hòa, 2005). Trên thực tế, một số 
chủng Y. pestis plasmid pPCP1 có thể  bị  mất đi thì sản phẩm của 
nghiên   cứu   này   sẽ   không   áp   dụng   được   (Marston,   2005).   Hay 
nghiên   cứu   tách   dòng   và   đọc   trình   tự   gen  pagA  mã   hóa   kháng 
nguyên   bảo   vệ   từ   chủng  B.   anthracis  VCM1167   (Phạm   Thúy 
Kiều, 2006).
Như  vậy, có thể  nói các đề  tài về  B. anthracis  và  Y. pestis  ở 
Việt Nam hiện nay còn ít và riêng lẻ cho từng loại tác nhân. Do đó,  
việc nghiên cứu phát triển kỹ thuật mPCR xác định nhanh và chính  
xác đồng thời hai tác nhân nguy hiểm này là cấp thiết, đáp ứng yêu 
cầu   an   ninh   quốc   phòng   và   phòng   chống   dịch   bệnh.   Kỹ   thuật  
mPCR được phát triển nhằm xác định đồng thời B. anthracis và Y. 
pestis một cách chính xác hơn bằng việc sử dụng cặp mồi thiết kế 
trên nhiễm sắc thể, đồng thời cũng sử  dụng các cặp mồi để  phát  
hiện các gen độc lực trên plasmid. 

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN 
CỨU
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ


Các chủng vi khuẩn, plasmid
Chủng   chuẩn  B.   anthracis  17JB   (ký   hiệu:   Ba)   và  Y.   pestis 
SVCM7 (ký hiệu: Yp) đầy đủ  độc lực. Chủng chuẩn đối chứng 
âm:  Bacillus   cereus  ATCC   6464,  E.   coli  ATCC   25922,  Y. 
enterocolitica ATCC 27729. Các chủng vi khuẩn phân lập nghi ngờ 
B.   anthracis:  gồm   23 chủng  B.   anthracis  Ba1­Ba23;   2 chủng  Y. 
pestis Yp1, Yp2. 
Plasmid pJET1.2­capA chứa toàn bộ  trình tự  gen  capA  (thuộc 

plasmid pXO1) của B. anthracis.
Sinh phẩm, hoá chất,  thiết  bị:   Sinh phẩm, hóa chất  sử  dụng 
trong các thí nghiệm được đặt mua từ các hãng:  Thermo Scientific, 
Integrated DNA   Technologies­  IDT,  Qiagen,  Norgen,  bioMérieux, 
Biolabs, Gibco, Invitrogen. Các trang thiết bị  Bộ môn Vi sinh y học, 
Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y và 
Phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học,  
Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được thiết kế  theo phương pháp thực nghiệm mô 
tả, phân tích trong phòng thí nghiệm và trên thực địa với các kỹ 
thuật vi sinh kinh điển và sinh học phân tử. Các kỹ thuật sử dụng  
trong nghiên cứu gồm:
2.2.1. Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn
2.2.2. Tách chiết DNA tổng số 
2.2.3. Khuếch đại gen bằng PCR
2.2.4. Điện di DNA trên gel agarose 
2.2.5. Tinh sạch DNA
2.2.6. Thiết kế  kỹ thuật mPCR xác định đồng thời gen đặc trưng 
và gen độc lực của B. anthracis và Y. pestis
2.2.7. Tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. 
pestis
2.2.8. Thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp của kỹ thuật mPCR
2.2.9. Tối ưu kỹ thuật mPCR chứa chứng nội tại 
2.2.10. Thiết lập và đánh giá bộ mẫu chuẩn đánh giá độ nhạy, đặc 
hiệu và ổn định của kit mPCR


2.2.11. Xác định các chủng phân lập bằng nuôi cấy, định danh
2.2.12. Thử nghiệm kỹ thuật mPCR trên các chủng phân lập

2.2.13. Kiểm tra các chủng vi khuẩn bằng giải trình tự 

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH 
NHANH ĐỒNG THỜI B. anthracis VÀ Y. pestis 
3.1.1. Nghiên cứu thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho mPCR 
Kỹ thuật mPCR ly t
́ ưởng đê ̉ xác định đồng thời B. anthracis và 
Y. pestis  phải  được thiêt kê phat hiên đông th
́ ́
́
̣
̀
ơì  B. anthracis,  Y. 
pestis và đánh giá đầy đủ các mức độ độc lực khác nhau của chúng 
trong   tự   nhiên.   Trong   đó,   với  B.   anthracis  cần   1   cặp   mồi   trên 
nhiễm   sắc   thể   (lựa   chọn   gen  vrrA)   và   2  cặp   mồi   trên  plasmid 
pXO1 và pXO2 tương ứng là gen pagA và capA. Tương tự, với Y.  
pestis,   gen  ypo2088  (trên   nhiễm   sắc   thể),  pla  (pPCP1)   và  caf1 
(pMT1) được lựa chọn. Như  vậy, 6 cặp  mồi đặc hiệu cho mPCR  
được thiết kế  đảm bảo khuếch đại 6 gen đích kích thước khác 
nhau. 
Với gen vrrA, dựa vào trình tự  tham chiếu trên NCBI, đã thiết 
kế  được  5  cặp mồi  cho  khuếch đại  một phần trình tự  gen đích 
(Hình 3.2). Cặp mồi gen  vrrA  chưa được lựa chọn ngay bởi còn 
phụ thuộc vào kết quả thiết kế các cặp mồi cho 5 gen đích còn lại. 
Tương tự cho thiết kế các cặp mồi gen pagA, capA (B. anthracis) 
và  ypo2088, pla, caf1  (Y. pestis).  Sau khi kiểm tra về  khả  năng 
hình thành cấu trúc bậc 2 hay bắt cặp chéo giữa các mồi cũng 
như sự phù hợp về kích thước sản phẩm, 6 cặp mồi đã được lựa  

chọn.

vrrA 


Hình 3. 2. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen vrrA
Bảng 3. 1. Thông tin 6 cặp mồi của mPCR xác định B. anthracis và 
Y. pestis
Tên mồi

Trình tự (5’-3’)

Tổng số
base

Tm*

Kích thước
(bp)

vrrAF1/R1

CTGTAAGCCCTGTCGTCGAA-F
CCTCGCGCACTTCTTTTTCT-R

20

59.76
59.13

222

pagAF1/R1

AAATGGAGCACGGCTTCTGA-F
AGCCTGTATCCACCCTCACT-R

20

59.96
59.96

751

capAF1/R1

TGACGATGACGATGGTTGGT-F
GCTTCCTGTCTAGGACTCGG-R

20

59.39
59.26

610

ypoF1/R1

GGATGAGATAACGCGGGTGT-F
AGAGAATCGTGATGCCGTCC-R

20

59.90
59.90

103

plaF1/R1

CGGGATGCTGAGTGGAAAGT-F
ATTACCCGCACTCCTTTCGG-R

20

60.04
60.11

438

cafF1/R1

CGCTTACTCTTGGCGGCTAT-F
GCTGCAAGTTTACCGCCTTT-R

20

60.25
59.69

271

*Tm. Nhiệt độ nóng chảy

3.1.2. Nghiên cứu thiết kế kỹ thuật mPCR 
Kỹ  thuật mPCR được thiết kế  và đánh giá trên 2 chủng chuẩn  
có đầy đủ  độc lực là  B.  anthracis  Ba và  Y.  pestis  Yp  cùng đối 
chứng âm là B. cereus và E. coli, Y. enterocolitica. 
3.1.2.1.   PCR   đơn   mồi   phát   hiện   gen   vrrA,   pagA,   capA   của   B.  
anthracis
Để có cơ sở cho thiết kế kỹ thuật mPCR phát hiện đồng thời 3  
gen đích B. anthracis, PCR đơn mồi được thực hiện ban đầu giúp 
kiểm tra sự  có mặt của gen quan tâm và độ  đặc hiệu từng cặp  
mồi. 


Hình 3. 8. Sản phẩm khuếch   đại 3 gen 
đích pagA, vrrA, capA của B. anthracis Ba 
bằng PCR đơn mồi
ĐC(­). Đối chứng âm là nước khử  ion;  M. 
Marker 100 bp (Thermo Scientific)

                                                                  
 
Các gen pagA (751 bp), vrrA (222 bp) và capA (610 bp) đều xuất 
hiện băng đặc hiệu và không có băng phụ  (Hình 3.8). Như  vậy, 
nồng độ các thành phần, chu trình nhiệt trong PCR đơn mồi này sẽ 
được sử dụng cho mPCR tiếp theo.
3.1.2.2.  Kỹ  thuật  mPCR  phát  hiện đồng thời 3 gen vrrA,  pagA,  
capA của B. anthracis

Kỹ  thuật  mPCR đã khuếch đại đồng thời 3 gen đích của  B. 
anthracis. 
3.1.2.3.   PCR   đơn   mồi   phát   hiện   gen   ypo2088,   pla,   caf1   của   Y.  
pestis
PCR đơn mồi cho Y. pestis được thực hiện tương tự, sản phẩm 
là pla (438 bp), caf1 (271 bp), ypo2088 (103 bp) (Hình 3.10).
Hình 3. 10. Sản phẩm khuếch đại 3 gen 
đích  pla, caf1, ypo  của  Y. pestis  Yp bằng 
PCR đơn mồi
ĐC(­). Đối chứng âm là nước khử  ion;  M. 
Marker 100 bp (Thermo Scientific)

                                                                 
 
3.1.2.4. Kỹ  thuật mPCR  phát hiện đồng thời 3 gen  ypo2088, pla, 
caf1 của Y. pestis
Kỹ  thuật mPCR  đã khuếch đại đồng thời 3 gen  đích của  Y.  
pestis. 
3.1.2.5. Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và từng tác nhân


Để  kiểm tra các cặp mồi của tác nhân này có bắt cặp chéo với  
DNA tác nhân còn lại, kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và 1 khuôn 
hoặc   DNA  B.   anthracis  hoặc  Y.   pestis  được   thực   hiện.   Đường 
chạy Yp với khuôn là DNA Y. pestis chỉ xuất hiện 3 băng đích của 
Y. pestis. Tương tự, đường chạy Ba chỉ xuất hiện 3 băng đích của  
B. anthracis (Hình 3.12). Như  vậy, các cặp mồi đã được thiết kế 
đặc hiệu cho  B. anthracis,  Y. pestis  và không có hiện tượng bắt 
cặp chéo.                                               
bp

ĐC(-) Yp Ba M

bp

Hình 3. 12. Sản phẩm PCR với 6 cặp mồi, 
từng loại DNA khuôn
ĐC(­). Đối chứng âm là nước khử ion; Yp. Sản  
phẩm mPCR với khuôn DNA Y. pestis; Ba. Sản  
phẩm mPCR với khuôn DNA B. anthracis; M.  
Marker 100 bp (Thermo Scientific)

3.1.2.6. Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và 2 tác nhân  
Kỹ  thuật mPCR với 6 cặp mồi và 2 loại khuôn chỉ  thu được 3 
băng đích của Y. pestis. 
3.1.3. Nghiên cứu tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B.  
anthracis và Y. pestis 
Cần tối  ưu các thông số của mPCR để đảm bảo xác định đồng  
thời  B.   anthracis  và  Y.   pestis  như:   nồng   độ   mồi,   đệm,   MgCl2, 
dNTPs cũng như  các điều kiện về  chu trình nhiệt để  thu được 
đồng thời 6 băng sản phẩm đích đặc hiệu.
Nồng độ các mồi Y. pestis 0,1 μM và B. anthracis 0,6 μM là tối 
ưu trong mPCR (Hình 3.14). 


Hình 3. 14. Tối ưu nồng độ mồi của mPCR
M.   Marker   100  bp   (Thermo   Scientific);   1.   0,1  
μM; 2. 0,2 μM; 3. 0,4 μM; 4. 0,6 μM

                               

Với nhiệt độ  gắn mồi 56oC,  nông đô
̀
̣  MgCl2  và dNTPs tối  ưu 
tương  ứng la ̀0,6 mM và 0,25 mM, phan 
̉ ưng mPCR cho kêt qua 
́
́
̉ 6 
băng đặc hiệu rõ nét nhất. Nồng độ dung dịch đệm được khảo sát  
ở 4 mức là (1; 1,2; 1,4; 1,5X), và nông đô 1,2X
̀
̣
 được lựa chọn.
3.1.4. Nghiên cứu thiết kế  chứng nội tại tái tổ  hợp trong kỹ 
thuật mPCR
Trong chẩn đoán phân tử, chứng nội tại (Internal amplification  
control ­ IC) là rất cần thiết để loại trừ các trường hợp âm tính giả 
do quá trình tách chiết không hiệu quả hay những chất ức chế ảnh 
hưởng   đến  kỹ   thuật   PCR.   Do  đó,   song   song   với   việc   thiết   kế 
mPCR, chúng tôi đã thiết kế IC cho mPCR, đảm bảo kết quả chẩn  
đoán là chính xác bằng con đường tái tổ hợp. Quá trình  tạo dòng IC 
đạt được kết quả  như sau: một đoạn gen lef (IC1) phân lập từ  B.  
anthracis  bằng  cặp mồi IC1F­BamHI/R­NdeI,  tạo dòng phụ  trong 
vector pJET1.2­blunt, kiểm tra vector pJET1.2­IC1 tái tổ hợp bằng 
PCR khuẩn lạc (Hình 3.18). Cặp enzyme BamHI và NdeI được sử 
dụng   cắt   đồng   thời   các   vector   pJET1.2­IC1   và   pJET1.2­capA. 
Đoạn IC1 (0,65 kb từ  pJET1.2­IC1) và phần còn lại của vector  
pJET1.2­capA (~4 kb) được tinh sạch gel, nối ghép tạo thể  tái tổ 
hợp pJET1.2­capA­IC1. Plasmid này được kiểm tra bằng enzyme 

giới hạn và giải trình tự. Plasmid này chứa trình tự  nhận biết của  
cặp mồi capAF1/R1 nên cũng được khuếch đại trong mPCR, cho 
sản phẩm kích thước 1000 bp phân biệt với sáu sản phẩm của gen 
chẩn đoán.
              


Hình 3. 18. Phân lập gen lef bằng cặp mồi IC1F­BamHI/R­NdeI và 
tạo dòng phụ trong vector pJET1.2/blunt
                                             
a) Sản phẩm khuếch đại gen lef (IC1) trên gel agarose 1,2%; M. Marker  
100 bp (Thermo Scientific); 1. Sản phẩm khuếch đại gen lef.
b) Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng PCR khuẩn lạc trên gel agarose  
             
1,2%, M. Marker 1 kb (Thermo Scientific); 1­3. Các dòng khuẩn lạc 1­3  
Hình 3. 20. Kiểm tra mPCR bổ  sung 
chứa vector tái tổ hợp pJET1.2­IC1.
IC trong quá trình tách chiết DNA  ở 
các nồng độ  khác nhau với mẫu  B.  
anthracis
M. Marker 100 bp (Thermo Scientific);  
109­103.   Các   mức   nồng   độ   IC   tương  
ứng.

Để  kiểm soát toàn bộ  các công đoạn của xét nghiệm, IC được 
bổ  sung vào trong quá trình tách chiết với một lượng tối thiểu có  
thể  phát hiện được nhằm loại bỏ  tối đa sự   ảnh hưởng đến hiệu  
quả tách chiết cũng như mPCR. Kết quả trên cho thấy, băng chứng 
nội tại (1 kb) xuất hiện rõ ở  các mức nồng độ  plasmid từ  109­105 
copy/ mẫu. Ở mức nồng độ IC là 106­105 copy/ mẫu xuất hiện đầy 

đủ 3 băng đích của B. anthracis và băng IC. Trong đó, băng IC xuất 
hiện rõ nét, không bị smear và quan trọng hơn, băng đích capA cũng 
xuất hiện. Còn mức nồng độ IC là 104 và 103 copy không còn xuất 
hiện băng IC (Hình 3.20). Qua quá trình tối  ưu trên các mẫu   B.  
anthracis,  Y. pestis, mPCR­IC cho các băng đích rõ nét, tách biệt  
gồm 6 băng cho xác định B. anthracis và Y. pestis và 1 băng IC. Có 
thể  thấy rằng, mức nồng độ  IC 5x104copy/ mẫu cho các băng rõ 
nét nhất và đây chính là nồng độ được lựa chọn sau khi tối ưu lại  
nồng độ của cặp mồi capAF1/R1 (0,64 µM), các thông số khác của 
mPCR đã tối ưu ban đầu cơ bản vẫn giữ nguyên (Hình 3.21). Như 
vậy, đã thiết kế  thành công kỹ  thuật mPCR­IC tại xác định đồng 
thời  B.  anthracis  và  Y.  pestis.  Chu trình nhiệt:  Biến tính 94oC/4 
phút, 32 chu kỳ (94oC/1 phút; 56oC/45 giây; 72oC/50 giây), 72oC/10 
phút.


Hình 3. 21. Kiểm tra mPCR tối 
ưu có bổ sung IC ở các nồng độ 
105 và 5x104 copy
M.   Marker   100   bp   (Thermo  
Scientific); 1, 2. Mẫu Y. pestis; 3,  
4. Mẫu B. anthracis và Y. pestis; 5,  
6. Mẫu B. anthracis. 

3.1.5. Chế tạo kit mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y.  
pestis
Sau khi xây dựng được quy trình kỹ  thuật mPCR, chúng tôi đã 
tiến hành chế tạo master mix theo thành phần tối ưu. Bước đầu đã 
chế tạo 1000 test, 50 test/bộ, bảo quản ở điều kiện ­20oC cho đánh 
giá độ  nhạy, độ  đặc hiệu, ngưỡng phát hiện,  độ   ổn định  của kit 

mPCR theo thời gian và thử  nghiệm trên các chủng phân lập (Ký 
hiệu kit BaYp­mPCR) (Hình 3.22).

Hình 3. 22. Master mix mPCR được đóng gói kèm hướng dẫn sử 
dụng

3.2. ĐÁNH GIÁ KHẢ  NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ  THUẬT  
mPCR   TRÊN   CÁC   BỘ   MẪU   CHUẨN   VÀ   CÁC   CHỦNG 
PHÂN LẬP


3.2.1. Đánh giá khả  năng phát hiện của kỹ  thuật mPCR trên 
các bộ mẫu chuẩn
Nghiên   cứu   thiết   lập  bộ  mẫu   chuẩn   xác  định  độ   nhạy   của   kit  
mPCR
Ngưỡng nồng độ  DNA tối thiểu có thể  phát hiện được bằng  
PCR là thông số  cần khảo sát trước khi xây dựng bộ  mẫu chuẩn  
độ  nhạy. Mẫu gốc DNA được tách chiết, tinh sạch đạt nồng độ 
120 ng/µl, từ mẫu này pha loãng trong nước khử ion.
B50 B51 B52 B53 B54 B55 B56 B57 B58 B59 M ĐC(-)

Hình 3. 23. Xác định ngưỡng phát hiện B. anthracis
M. Marker 50 bp; B50­B59. các mức nồng độ DNA; ĐC(­). Đối chứng âm

Mẫu có nồng độ  DNA thấp nhất còn cho khả  năng phát hiện 
được là B55 (mã số  gốc PBA19) (Hình 3.23), nồng độ  0,000092 
ng/µl tương đương 81,5 copy/ phản ứng mPCR sử dụng 5 µl DNA. 
Với kết quả xác định ngưỡng của mPCR phát hiện B. anthracis 
như  trên, tiến hành thiết lập bộ mẫu chuẩn độ  nhạy 100 ống (50 
µl/ống), bao gồm: 10 hàng (ký hiệu EB1 đến EB10) x 10 cột. Sử 

dụng 10 mức nồng độ   ở  bộ  mẫu chuẩn  xác định ngưỡng mPCR 
phát   hiện  B.   anthracis  từ   PBA10   (0,046875  ng/µl)   ­   PBA19 
(0,000092 ng/µl) tương ứng ký hiệu EB1 ­ EB10. 
Tương tự, ngưỡng  phát hiện của  bộ  mẫu chuẩn  Y. pestis  là 
130,5 copy/ phản ứng. Bộ  mẫu chuẩn độ nhạy mPCR xác định Y.  


pestis cũng được thiết lập gồm 100 ống  (50 µl/ống), bao gồm: 10  
hàng (ký hiệu EY1 đến EY10) x 10 cột. 
Nghiên cứu thiết lập bộ  mẫu chuẩn độ  đặc hiệu chẩn đoán của  
kit mPCR
Các bộ  mẫu chuẩn  độ  đặc hiệu mPCR  đối với  B. anthracis 
được thiết lập tương tự với các bộ  mẫu chuẩn độ nhạy, sử  dụng  
chủng  B.   cereus.  Tương   tự,   sử   dụng  chủng  E.   coli  và  Y. 
enterocolitica cho Y. pestis.
Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn  xác định độ nhạy, độ đặc hiệu  
của kit mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis
Để  thuận tiện cho việc đánh giá nội bộ, sau khi thiết lập bộ 
mẫu chuẩn độ nhạy và đặc hiệu xác định từng tác nhân, chúng tôi  
tiến hành phối trộn các bộ mẫu chuẩn riêng rẽ  tương ứng để  tạo 
các bộ mẫu chuẩn hỗn hợp đồng thời B. anthracis và Y. pestis. 
Đánh giá kit mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis trên bộ mẫu 
chuẩn
Khả  năng phát hiện B. anthracis của bộ  kit mPCR được kiểm 
tra trên 100 mẫu (từ mẫu EB1 đến EB10, mỗi mẫu lặp lại 10 lần)  
của bộ  mẫu chuẩn độ  nhạy với B. anthracis cho kết quả là 100% 
các mẫu đều phát hiện đầy đủ các gen đặc trưng của  B. anthracis. 
Tương tự cho đánh giá độ nhạy của bộ kit mPCR đối với Y. pestis, 
đồng thời B. anthracis và Y. pestis đều cho kết quả 100%.
Chúng tôi tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu của kit BaYp ­ mPCR  

trên 100 mẫu (từ C1 đến C10 mỗi mẫu lặp lại 10 lần) của bộ mẫu 
chuẩn độ  đặc hiệu đã thiết lập từ  B. cereus. Kết quả  100% các 
mẫu không xuất hiện gen đặc trưng capA, pagA của  B. anthracis 
nhưng 100% các mẫu dương tính với gen  vrrA. Với  Y. pestis,  độ 
đặc hiệu của bộ kit mPCR là 100%. 
Cac thanh phân cua kit BaYp­mPCR co s
́
̀
̀ ̉
́ ự ôn đinh trên 12 thang
̉
̣
́  
bao quan 
̉
̉ ở điều kiện ­20oC (Hình 3.32). 


Hình   3.   32.   Kiểm   tra 
độ   ổn định mPCR sau 
thời gian 12 tháng
M.  Marker  100 bp; 1­10.  
Các mẫu DNA EBY2 

3.2.2. Đánh giá khả  năng phát hiện của kỹ  thuật mPCR trên 
các chủng phân lập
Kỹ  thuật mPCR với  6 cặp mồi  xác định đồng thời gen  đặc  
trưng, gen độc lực của B. anthracis và Y. pestis đã được thiết kế và 
tối  ưu thành công trên chủng chuẩn.  Việc đánh giá khả  năng phát 
hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu chuẩn là trong điều kiện 

lý tưởng ­điều kiện tiên quyết cho bất kỳ bộ kit nào trước khi đưa 
ra thử nghiệm lâm sàng. Với các chủng lâm sàng B. anthracis cũng 
như  Y. pestis, đặc biệt là các mẫu phân lập ngoài môi trường hay  
lưu trữ  thời gian dài trong phòng thí nghiệm, một số  tính chất về 
kiểu hình, kiểu gen có thể bị biến đổi. Do đó, để khẳng định việc  
thiết   kế   thành   công   kỹ   thuật   mPCR,   các   chủng   phân   lập  B.  
anthracis  và  Y. pestis  sau khi được kiểm tra, xác định bằng nuôi 
cấy, được xác định bằng kỹ  thuật mPCR. Kết quả  xác định của  
mPCR được khẳng định bằng phân tích trình tự  toàn bộ  chiều dài 
một số gen tiêu biểu trên nhiễm sắc thể, các plasmid độc lực.
Xác định chủng phân lập bằng nuôi cấy, định danh 
Các chủng nghi ngờ  B. anthracis  và chủng chuẩn  B. anthracis  
Ba (đối chứng dương) được nuôi cấy trên môi trường thạch máu 
cừu  ở 37oC/CO2 5%/ 24 giờ. Kết quả, tất cả   các chủng cho khuẩn 
lạc dạng R, màu xám, trực khuẩn Gram dương, hình vuông hai 
đầu, xếp đôi, chuỗi, bào tử   ở  giữa và không làm biến đổi hình  
dạng vi khuẩn, trong đó 11 chủng không tan máu β trên môi trường 
thạch máu cừu ­ có 4 chủng hình thành vỏ  ( B. anthracis  Ba, Ba1, 
Ba3, Ba4). 13 chủng còn lại tan máu β. Định danh cho 11 chủng là 
B. anthracis, còn lại là B. cereus (ID > 90%). Chủng Y. pestis Yp1, 
Yp2 cho kết quả mọc các khuẩn lạc kích thước 1 ­ 2 mm dạng S,  


màu  xám   đục,   bờ   đều,   bề   mặt   nhẵn,   trung  tâm   lồi   giống   hình  
trứng oplet và không tan máu, là trực khuẩn Gram âm nhỏ, oxydase 
(­).  Định danh  là  Y. pestis  với ID Yp1, Yp2 lần lượt là 98,6 và 
96,4%.
Thử nghiệm kỹ thuật mPCR
Kỹ  thuật mPCR được thử  nghiệm trên các mẫu nghiên cứu  B.  
anthracis, Y. pestis và các mẫu đối chứng âm là B. cereus, E. coli. 

Mẫu hỗn hợp được tạo ra bằng cách trộn lẫn chủng  B. anthracis 
và Y. pestis sau đó tiến hành tách DNA tổng số.  Ở tất cả các mẫu 
đối chứng và mẫu thử  nghiệm đều xuất hiện băng chứng nội tại  
IC, điều này chứng tỏ  quá trình tách chiết DNA và mPCR đảm  
bảo, theo đó các kết quả xác định là đáng tin cậy (minh họa ở Hình 
3.36). Mẫu đối chứng âm chỉ xuất hiện băng có kích thước khoảng 
220 bp ­ tương  ứng với gen  vrrA, ngoài ra không xuất hiện thêm 
băng nào khác. Điều này là phù hợp, vì đối chứng âm sử  dụng  
chủng B. cereus, gen vrrA có mặt trong các loài nhóm “B. cereus”. 
Còn mẫu đối chứng dương xuất hiện cả  6 gen đích đối với cả  2 
tác nhân (Hình 3.36a), hoặc xuất hiện 3 gen đích đối với từng tác  
nhân (Hình 3.36b). 


    

(+) (-)

M BY2 Yp1 Yp2 Ba4 M Ba5 Ba6

(+) (-)

M

Ba3 Ec

 
Hình 3. 36. Xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis bằng kỹ thuật 
mPCR tối ưu chứa chứng nội tại IC
M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); a) (+). Đối chứng dương là hỗn hợp  B.  

anthracis và Y. pestis; (­). Đối chứng âm là hỗn hợp B. cereus và E. coli; BY2.  
Mẫu thử nghiệm hỗn hợp B. anthracis Ba4 và Y. pestis Yp2; Yp1. Y. pestis Yp1;  
Yp2.   Y.   pestis   Yp2;   Ba4.   B.   anthracis   Ba4;   Ba5.   B.   anthracis   Ba5;   Ba6.   B.  
anthracis Ba6; b) (+). Đối chứng dương là mẫu B. anthracis Ba; (­). Đối chứng  
âm B. cereus; Ba3. B. anthracis Ba3; Ec. E. coli

Kết quả  thử  nghiệm kỹ  thuật mPCR cho thấy, khi chỉ  xuất  
hiện 1 băng có kích thước tương ứng với gen đích vrrA (mẫu Ba5 
Hình   3.36a)   hay   không   xuất   hiện   băng   đích   nào   (mẫu   Ec   Hình  
3.36b), được xác định là mẫu âm tính với B. anthracis và Y. pestis 
gây bệnh (tương  ứng là mẫu B. anthracis Ba5 và E. coli). Cụ  thể, 
kết quả Hình 3.36a, đường chạy ký hiệu BY2 xuất hiện đầy đủ  6  
băng đích có kích thước đúng với mẫu đối chứng dương, được xác  
định là mẫu dương tính đồng thời với B. anthracis và Y. pestis có 
đầy đủ độc lực. Mẫu ký hiệu Yp1, Yp2, Ba4 (Hình 3.36a) và mẫu 
Ba3 (Hình 3.36b) xuất hiện đầy đủ  3 băng của các gen đích cho 
từng đối tượng, được xác định lần lượt là chủng  Y. pestis  và  B.  
anthracis gây bệnh. Trong khi đó, đáng chú ý trên Hình 3.36a, mẫu 
Ba6 chỉ  xuất hiện 2 băng có kích thước tương  ứng với 2 gen đích  
là  pagA  và  vrrA, không xuất hiện băng chỉ  thị  gen  capA. Đây là 
mẫu  B. anthracis  bị  thiếu plasmid pXO2, không đầy đủ  độc lực 


(chủng  B. anthracis  Ba6). Như  vậy, trong 10 chủng phân lập  B. 
anthracis,   bằng   kỹ   thuật   mPCR   đã   xác   định   được   3   chủng   B.  
anthracis đầy đủ độc lực (Ba1, Ba3 và Ba4), 1 chủng giảm độc do  
thiếu gen  capA  thuộc plasmid pXO2 (chủng   B. anthracis  Ba6), 6 
chủng còn lại là  B. anthracis  không độc. Đồng thời với   Y. pestis, 
kỹ thuật mPCR đã xác định được 2/2 chủng Y. pestis có đầy đủ gen 
độc lực.

Để khẳng định kết quả, băng điện di đặc hiệu cho các gen đích 
chẩn đoán được tinh sạch gel và giải trình tự. Kết quả, tất cả các 
trình tự  đều thuộc các gen đích tương  ứng của  B. anthracis và Y. 
pestis. Như  vậy, kỹ  thuật mPCR đã được thử  nghiệm thành công 
trên chủng chuẩn và chủng phân lập.
Phân tích trình tự gen đặc trưng và gen độc lực của B. anthracis 
và Y. pestis
Kỹ thuật mPCR được phát triển ở trên chứa 6 cặp mồi xác định 
các đoạn ngắn trình tự bảo thủ của gen đích tương ứng. Tuy nhiên, 
mỗi gen đích có chiều dài khác nhau và phân bố   ở  các vị  trí khác  
nhau. Cụ  thể, với  B. anthracis, gen đặc trưng  vrrA  thuộc nhiễm 
sắc thể, gen độc lực pagA, capA thuộc plasmid pXO1, pXO2. Với 
Y. pestis, gen đặc trưng ypo2088 thuộc nhiễm sắc thể, gen độc lực 
pla, caf1 thuộc plasmid pPCP1, pMT1. Để đánh giá kỹ thuật mPCR 
được phát triển, đồng thời nghiên cứu trình tự các gen đặc trưng và 
gen độc  ở  các chủng phân lập được  ở  Việt Nam có sự  giống và 
khác nhau như thế nào với các chủng quốc tế, chúng tôi tiến hành 
phân tích trình tự  toàn bộ  chiều dài gen độc lực và gen đặc trưng 
của B. anthracis và Y. pestis.
Phân lập toàn bộ chiều dài gen đặc trưng và gen độc lực
Đối với  B. anthracis, 7 gen  vrrA, pagA, cya, lef, capA, capB,  
capC đã được nhân dòng cho xác định toàn bộ trình tự. Các gen này 
đã khuếch đại thành công, sản phẩm PCR có kích thước lần lượt  
là 551, 2323, 2544, 2580, 1325, 1439 và 561 bp đúng với lý thuyết.  
Đối với Y. pestis, gen đặc trưng trên nhiễm sắc thể là ypo2088 và 2 
gen trên plasmid pPCP1 và pMT1 tương ứng là pla và caf1 cho sản 
phẩm kích thước là 645, 1019 và 654 bp. 


Nghiên cứu tạo dòng toàn bộ  chiều dài gen đặc trưng và gen độc  

lực 
Sản phẩm khuếch đại các gen đích được tinh sạch và tạo dòng 
trong vector pJET1.2/blunt. Chúng tôi lựa chọn một số enzyme giới 
hạn để  cắt kiểm tra các dòng plasmid tái tổ  hợp,  BglII được sử 
dụng trong tất cả các trường hợp bởi nằm trên vùng đa điểm cắt. 
Ngoài ra, trong một số trường hợp, chúng tôi sử dụng thêm một số 
enzyme khác có trình tự  nhận biết  ở  trên vector và trong trình tự 
gen đích. Quá trình cắt kiểm tra bằng các enzyme giới hạn được 
minh họa với vector tái tổ hợp pJET1.2­pagA (Hình 3.39). 

          a)                                                                       b)
                                                                                           

Hình 3. 39. Tạo dòng gen pagA trong vector pJET1.2/blunt
a) Sơ đồ biểu hiện quá trình cắt kiểm tra vector pJET1.2­pagA bằng  
BglII; b) Cắt kiểm tra vector pJET1.2­pagA trên gel agarose 1,2%.

Sử  dụng enzyme giới hạn   BglII, cặp enzyme  XbaI và  EcoRI, 
chúng tôi đã chọn được các dòng tế  bào mang plasmid chứa gen  
pagA  cho sản phẩm kích thước khoảng 4,0 và 1,2 kb (cắt bằng 
XbaI và EcoRI) và khoảng 2,8; 2,4 kb đối với BglII. Như  vậy, các 
gen đích đã được tách dòng thành công.
Phân tích trình tự các gen đích đặc trưng và gen độc lực 
Phân tích trình tự gen vrrA trên 10 chủng B. anthracis  phân lập 
cho thấy, gen  vrrA  giống nhau hoàn toàn, độ  tương đồng từ  99­
100% so với chủng tham chiếu.  Phân tích trình tự  gen pagA của 3 
chủng B. anthracis độc lực (Ba1, Ba3 và Ba4) xác định được 3 đột  


biến điểm (T C), trong đó 1 đột biến đồng nghĩa (T C)195, 2 đột 

biến sai nghĩa là (T C)1693  và (T C)1799  khi so sánh với chủng  B. 
anthracis Vollum­USA. Nghiên cứu trình tự gen cya và lef (pXO1), 
chỉ  xác định được 1 đột biến đồng nghĩa (T C)600  trên gen  cya 
chủng B. anthracis Ba3 và Ba4, còn gen lef có mức độ tương đồng 
100% so với chủng tham chiếu. Một đột biến sai nghĩa hoàn toàn 
mới (A G)1048 ở gen capA chủng B. anthracis Ba1 làm thay đổi axit 
amin lysine thành glutamic (Hình 3.43).  Hai gen còn lại là  capB,  
capC  có tính bảo tồn cao, không xảy ra đột biến  ở  bất cứ  điểm 
nào.  Các   gen   này   đã   được   đăng   ký   trên   Genbank   với   mã   số: 
KP213102­7; KP759885­93.

Hình 3. 43. So sánh trình tự axit amin của protein được mã hóa bởi 
gen capA 3 chủng B. anthracis Ba1, Ba3 và Ba4 với 12 chủng tham 
chiếu

Với  Y. pestis, gen  ypo2088  và  caf1  của 2 chủng  Y. pestis  Yp1, 
Yp2 có mức độ tương đồng 100% so với chủng tham chiếu. Chỉ có 
1 đột biến điểm được xác định ở gen pla (T C)836 khi so sánh với 
chủng  Y. pestis  Angola. Trình tự  phân tích các gen được đăng ký 
trên Genbank với mã số KM880025­7.
Như vậy, kỹ thuật mPCR được thiết kế  xác định đồng thời  B. 
anthracis, Y. pestis  và thử  nghiệm dựa trên các chủng phân lập 
trong nước hoàn toàn có thể  chẩn đoán cho các chủng từ  các khu 
vực khác trên thế giới.


3.2.3. Kiểm định bộ kit BaYp­mPCR chẩn đoán B. anthracis và  
Y. pestis 
Kỹ  thuật mPCR xác định nhanh, đồng thời  B. anthracis  và  Y. 
pestis  được phát triển thành kit BaYp­mPCR, kiểm định tại Viện 

kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm, Bộ  Y tế  cho kết quả 
đạt tiêu chuẩn cơ sở, độ  nhạy, độ  đặc hiệu 100% trên panel mẫu 
chuẩn.


Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ
4.1.   THIẾT   KẾ   KỸ   THUẬT   mPCR   XÁC   ĐỊNH   NHANH 
ĐỒNG THỜI B. anthracis VÀ Y. pestis
Kỹ  thuật mPCR cho phép tiết kiệm thời gian,  kinh phí và đóng 
vai trò quan trọng trong chẩn đoán phân tử.  Thực tế, việc nghiên 
cứu  thiết kế  mPCR tối  ưu đòi hỏi nhiều công đoạn hơn so với 
PCR thông thường. Các thành phần tham gia trong phản  ứng  cũng 
như  chu trình nhiệt  cần được  đánh giá, tối  ưu.  Đồng thời, việc 
nghiên cứu, thiết kế  mồi trong mPCR có vai trò rất quan trọng. 
Đối với 2 tác nhân B. anthracis và Y. pestis, cần chỉ ra được chủng 
gây bệnh (có đầy đủ  độc lực) hay không. Với  B. anthracis,  gen 
pagA  (pXO1) được WHO khuyến cáo sử  dụng bởi khi chủng  B.  
anthracis thiếu gen này sẽ  không thể  gây độc. Ngoài ra, gen capA 
(pXO2)  được lựa chọn nhiều trong chẩn  đoán (Skottman, 2007;  
Kurosaki, 2009). Một gen đích nữa được sử dụng để  phát hiện tất 
cả  các chủng vi khuẩn than là  vrrA  nằm trên nhiễm sắc thể  ­ có 
tính  ổn định cao và bền vững.  Trong xác định Y. pestis,  pla,  caf1, 
ypo2088 là các gen đích thường được sử dụng, cho phép chẩn đoán  
chính xác Y. pestis. Như vậy, cần thiết kế 6 cặp mồi trong mPCR  
cho xác định đồng thời  B. anthracis  và  Y. pestis.  Khi thực hiện 
mPCR với nhiều cặp mồi, xác suất tạo sản phẩm không đặc hiệu,  
bắt cặp chéo giữa các mồi tăng lên. Do đó, sau khi nghiên cứu thiết  
kế  mồi, tối  ưu mPCR là điều kiện tiên quyết để  hạn chế  tối đa 
những tương tác lẫn nhau giữa các cặp mồi cũng như  việc tạo  
thành các sản phẩm phụ.

Cho đến trước nghiên cứu này, có rất ít công trình phát triển kỹ 
thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis cũng như 
các tác nhân truyền nhiễm khác có kết hợp các cặp mồi chẩn đoán  
xác định cả gen đặc trưng trên nhiễm sắc thể và gen độc lực trên  
plasmid cùng chứng nội tại để xác minh kết quả. Hầu hết các công 
trình  chỉ   lựa chọn  một   trong  các  gen  đích  độc   lực  trên  plasmid 
(Batra, 2013; Safari Foroshani, 2013; Whiteduck­Leveillee, 2016), 
như  vậy sẽ  không đánh giá được đầy đủ  tình trạng độc lực của  
các chủng vi khuẩn gây bệnh và có thể bỏ sót chẩn đoán. Để khắc 


phục  hạn  chế   này,   một   số   nghiên  cứu  đã   kết   hợp  cả   gen  trên 
nhiễm sắc thể  và gen độc lực, tuy nhiên lại trên từng tác nhân  
riêng rẽ  (Chen, 2012; Ogawa, 2015; Riojas, 2015; Lindsey, 2017). 
Mặt khác, nhiều công trình lại không thiết kế  chứng nội tại để 
kiểm soát kết quả chẩn đoán lâm sàng. Kỹ thuật mPCR được phát 
triển trong luận án sử dụng 6 cặp mồi trong đó có cả chứng nội tại 
để phát hiện nhanh, đồng thời và chính xác B. anthracis và Y. pestis 
gây bệnh bằng cách kết hợp 1 gen đích trên nhiễm sắc thể  và 2  
gen đích độc lực trên plasmid cho mỗi loại tác nhân. Đặc  biệt, 
chúng tôi đã thiết kế IC cạnh tranh (Abdulmawjood, 2002; Hoorfar,  
2004), sử dụng chung cặp mồi chẩn đoán là capAF1/R1. Như vậy, 
sẽ không phải thiết kế thêm cặp mồi cho IC và công đoạn tối ưu 
sẽ  được rút ngắn. Như  vậy,   kỹ  thuật mPCR có chứa 6 cặp mồi  
cho phép khuếch đại đồng thời 7 sản phẩm gồm 3 gen đích của  B. 
anthracis, 3 gen đích của  Y. pestis  và 1 gen IC.  Kỹ  thuật này đã 
cung cấp một công cụ hữu ích góp phần xác định nhanh, đồng thời  
2 tác nhân vi khuẩn có nguy cơ  cao sử  dụng làm vũ khí sinh học  
này chỉ trong một  ống phản  ứng, giúp giảm giá thành, công sức và 
thời gian chẩn đoán.

4.2. KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR TRÊN  
CÁC BỘ MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN LẬP
Kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis sau 
khi thiết kế, tối ưu thành công đã được chế tạo thử  nghiệm thành  
kit (kit BaYp­mPCR). Để  đảm bảo chất lượng, kit mới chế  tạo  
phải được đánh giá với các tiêu chí quan trọng là: độ nhạy, độ đặc 
hiệu và độ  ổn định trên các bộ  mẫu chuẩn ­ điều kiện tiên quyết 
cho bất kỳ  bộ  kit chẩn đoán nào trước khi đưa vào thử  nghiệm  
thực địa   (WHO, 2004; Bunk, 2007; Madej, 2010; NIBSC, 2014).  
Các loại mẫu chuẩn dùng trong kiểm định có thể  tìm trong danh 
mục của WHO hoặc NIBSC là lý tưởng nhất. Tuy nhiên, khi không  
có các loại trên thì thiết lập các bộ mẫu chuẩn nội bộ là cần thiết 
(Belak,  2001),   đặc bệt  với  B.  anthracis  và  Y.  pestis  là  2  loài  vi 
khuẩn tối nguy hiểm, không có sẵn mẫu chuẩn. Các chủng chuẩn 
sử dụng trong tách chiết DNA cho thiết lập mẫu chuẩn nội bộ đều 
được kiểm tra, đánh giá tính chất sinh vật, hóa học điển hình.  Các 


mẫu DNA có độ tinh sạch và nồng độ cao được sử dụng làm mẫu  
chuẩn.  Theo cách này, bộ  mẫu chuẩn có độ  đồng nhất cao và có 
thể pha loãng thành các nồng độ chính xác, cũng là hướng thiết lập 
được WHO khuyến cáo. Giá trị ngưỡng phát hiện cho B. anthracis  
và  Y.   pestis  tương   ứng   là   81,5   và   130,5   copy/phản   ứng,   tương  
đương với kết quả của các công trình đã công bố  (Heinz Ellerbrok, 
2002; Batra, 2013; Nghiem, 2015), độ  nhạy 100% thử  nghiệm trên 
số mẫu đủ lớn là 100, đạt tiêu chuẩn cơ sở.
Kết quả đánh giá độ đặc hiệu cho thấy, nếu chỉ sử dụng 1 gen  
trên   nhiễm   sắc   thể   (vrrA)   có   thể   chẩn   đoán   nhầm   giữa 
B. anthracis và B. cereus (Bode, 2004; Rasko, 2004). Mặt khác, nếu 
chỉ  dựa vào 1 gen trên plasmid thì nguy cơ  âm tính giả  với chủng  

mất một trong các plasmid độc lực.  Với  B. anthracis, để  khẳng 
định là vi khuẩn than gây bệnh cần có mặt đồng thời 3 gen là vrrA, 
pagA, capA. Kết quả này cũng minh chứng cho yêu cầu phải kiểm  
định trên panel mẫu với tất cả các kit thương mại trước khi đưa ra  
thị  trường. Như  vậy, các bộ  panel độ  nhạy và độ  đặc hiệu được  
thiết lập là đảm bảo và có ý nghĩa đánh giá giá trị khoa học của bộ 
kit, có khả  năng kiểm định các tiêu chuẩn của một bộ  kit PCR 
chẩn đoán  B. anthracis  và  Y. pestis  với nhiều cách thiết kế  mồi 
khác nhau. 
Đánh giá kit PCR chẩn đoán trên các bộ  mẫu chuẩn là kiểm 
định trong điều kiện lý tưởng. Trên thực tế,   B. anthracis  và  Y. 
pestis có thể tồn tại tự nhiên hay bị gây nhiễm ngoài môi trường, là 
những mẫu phức tạp, có nhiều yếu tố   ảnh hưởng đến kỹ  thuật  
PCR,  đòi   hỏi   cần   được   xác  định  nhanh,   chính   xác   trong   những 
trường hợp nghi ngờ.  Kỹ  thuật mPCR này đã được thử  nghiệm 
trên chủng chuẩn và chủng phân lập (sau khi đã được kiểm tra tính 
chất sinh vật, hóa học, định danh). Đồng thời, để có cơ sở đánh giá  
kỹ  thuật mPCR được phát triển cho  ứng dụng xác định chủng địa  
phương và chủng quốc tế, chúng tôi tiến hành phân tích trình tự 
toàn bộ  chiều dài các gen đặc trưng và gen độc lực tiêu biểu của 
B. anthracis (thuộc plasmid pXO1, pXO2), Y. pestis (thuộc pPCP1, 
pMT1).  Kết quả  này đã  cung cấp dữ  liệu nucleotide tương  đối 
hoàn chỉnh về một số gen tiêu biểu của các chủng  B. anthracis, Y.