Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, ph, tỉ lệ diện tích trên thể tích đến quá trình tạo màng biocellulose từ môi trường bổ sing tảo xoắn (spirulina) (2017)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

======

ĐỖ THỊ HÒA

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ, pH,
TỶ LỆ DIỆN TÍCH TRÊN THỂ TÍCH ĐẾN QUÁ
TRÌNH TẠO MÀNG BIOCELLULOSE TỪ MÔI
TRƯỜNG BỔ SUNG TẢO XOẮN (SPIRULINA)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật

Người hướng dẫn khoa học
ThS. NGUYỄN THỊ KIM NGOAN

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Bằng tất cả tấm lòng kính trọng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc đến ThS. Nguyễn Thị Kim Ngoan, người đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ
em hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2 và Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi cho em
hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã quan
tâm giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian qua.

Em xin chân thành cảm ơn!

Ha Nội, ngày 03 tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Đỗ Thị Hòa


LỜI CAM ĐOAN
Đề tài được thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS. Nguyễn Thị Kim
Ngoan, em xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật. Đây
là kết quả nghiên cứu của riêng em. Đề tài này không trùng với bất cứ đề tài
nào đã từng được công bố.
Nếu sai em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Ha Nội, ngày 03 tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Đỗ Thị Hòa


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài............................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu..................................................................................... 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu .................................................................................... 3
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 3
4.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................. 3
4.2. Phạm vi nghiên cứu.................................................................................... 3

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 3
5.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 3
5.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 3
6. Điểm mới....................................................................................................... 4
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................ 5
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng và màng BC ........................................ 5
1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới ......................... 5
1.1.2. Đặc điểm hình thái, tế bào học................................................................ 5
1.1.3. Đặc điểm sinh lí, sinh hóa của Gluconacetobacter ................................ 6
1.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo màng Bacterial cellulose (BC).... 6
1.2.1. Nhu cầu nguồn cacbon ............................................................................ 6
1.2.2. Nhu cầu nguồn Nitơ ................................................................................ 7
1.2.3. Nhu cầu Photpho ..................................................................................... 7
1.2.4. Điều kiện nuôi cấy .................................................................................. 8
1.2.4.1. Nhiệt độ ................................................................................................ 8
1.2.4.2. Độ pH ................................................................................................... 8
1.2.4.3. Độ thông khí......................................................................................... 8
1.2.4.4. Thời gian nuôi cấy................................................................................ 8


1.3. Bacterial cellulose (BC)............................................................................. 9
1.3.1. Cấu trúc ................................................................................................... 9
1.3.2. Một số tính chất của màng BC................................................................ 9
1.3.3. Quá trình tổng hợp BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter....................... 10
1.4. Ứng dụng của màng BC........................................................................... 13
1.4.1. Ứng dụng của BC trong một số lĩnh vực .............................................. 13
1.4.1.1. Thực phẩm.......................................................................................... 13
1.4.1.2. Y học .................................................................................................. 14
1.4.1.3. Mỹ phẩm ............................................................................................ 14
1.5. Sơ lược về tảo xoắn Spirulina.................................................................. 15

1.5.1. Phân loại tảo Spirulina .......................................................................... 16
1.5.2. Đặc điểm sinh học của tảo Spirulina .................................................... 16
1.5.3. Cấu tạo tảo Spirulina............................................................................. 16
1.5.4. Sinh sản của tảo Spirulina..................................................................... 17
1.5.5. Vài nghiên cứu ứng dụng...................................................................... 18
1.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất BC hiện nay ....................................... 18
1.6.1. Tình hình nghiên cứu màng BC trên thế giới ....................................... 18
1.6.2. Tình hình nghiên cứu màng BC ở trong nước ...................................... 20
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............. 22
2.1. Đối tượng và thiết bị nghiên cứu ............................................................. 22
2.1.1. Đối tượng .............................................................................................. 22
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................... 22
2.1.2.1 Hóa chất............................................................................................... 22
2.1.2.2. Thiết bị ............................................................................................... 22
2.1.3. Môi trường nghiên cứu.......................................................................... 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 23
2.2.1. Phương pháp vi sinh.............................................................................. 23


2.2.1.1. Phân lập chủng Gluconacetobacter theo phương pháp truyền
thống (Phương pháp Vinogradski và Beijerinck) ........................................... 23
2.2.1.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế
bào trên tiêu bản nhuộm kép ........................................................................... 24
2.2.1.3. Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch
nghiêng ............................................................................................................ 25
2.2.1.4. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Gluconacetobacter cho
màng mỏng...................................................................................................... 25
2.2.2. Phương pháp hóa sinh ........................................................................... 26
2.2.2.1. Phương pháp kiểm tra hoạt tính catalase ........................................... 26
2.2.2.2. Phương pháp kiểm tra khả năng oxi hóa ethanol thành acit acetic.... 26

2.2.2.3. Xác định khả năng oxy hóa acit acetic............................................... 26
2.2.2.4. Xác định khả năng tổng hợp cellulose .............................................. 27
2.2.2.5. Xác định khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton ...... 27
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu sự ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới
khả năng lên men tạo màng BC ...................................................................... 27
2.2.3.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự hình thành
màng BC của chủng G.xylinus T6 .................................................................. 27
2.2.3.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng
tạo màng BC của chủng G.xylinus T6............................................................. 28
2.2.3.3. Phương pháp nghiên cứu tỉ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC
tốt nhất của chủng G.xylinus T6...................................................................... 28
2.2.4. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng............................... 29
2.2.5. Phương pháp thống kê và xử lí số liệu.................................................. 29
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................ 30
3.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng Biocellulose trong môi
trường bổ sung tảo xoắn Spirulina.................................................................. 30


3.1.1. Phân lập vi khuẩn acetic từ môi trường tảo xoắn Spirulina.................. 30
3.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khẳ năng hình thành màng Biocellulose
......................................................................................................................... 34
3.2. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới khả năng tạo màng Biocellulose
từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus T6 .......................................... 38
3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ ........................................................................ 38
3.2.2. Ảnh hưởng của pH ................................................................................ 40
3.2.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ S/V....................................................................... 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 45
1. Kết luận ....................................................................................................... 45
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 46

PHỤ LỤC ............................................................................................................


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Tính quy đổi S/V thí nghiệm nghiên cứu ....................................... 28
Bảng 3.1.Đặc trưng vi khuẩn của các chủng................................................... 31
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thành màng cellulose của 3 chủng
Gluconacetobacter .......................................................................................... 35
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 3 chủng..................................... 36
Bảng 3.4.kết quả nhuộm Gram của 3 chủng ................................................... 37
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự hình thành màng Biocellulose của
chủng G. xylinus T6......................................................................................... 39
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men tạo màng Biocellulose của
chủng G. xylinus T6......................................................................................... 41
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ S/V đến khả năng hình thành màng
Biocellulose của chủng G.xylinus T6 .............................................................. 43


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter
......................................................................................................................... 12
Hình 1.2. Hình dạng tảo Spirulina quan sát dưới kính hiển vi ....................... 14
Hình 3.1.Dịch tảo xoắn lên men ..................................................................... 30
Hình 3.2. Khuẩn lạc vi khuẩn acetic của mẫu phân lập.................................. 30
Hình 3.3.Vi khuẩn acetic của mẫu phân lập trên môi trường thạch nghiêng . 31
Hình 3.4. Khả năng oxy hóa acid acetic của vi khuẩn acetic ......................... 34
Hình 3.5. Hoạt tính catalase ............................................................................ 37
Hình 3.6. Màng Biocellulose thu được ở 300 .................................................. 39
Hình 3.7. Màng Biocellulose thu được ở pH = 5 ............................................ 41
Hình 3.8. Màng BC hình thành trên tỷ lệ S/V = 0,8 ....................................... 43

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BC

Bacterrial cellulose

Cs

Cộng sự

G. xylinus T6

Gluconacetobacter xylinus T6

PC

Plant cellulose

S

Diện tích lên men tạo màng BC (cm2)

V

Thể tích dịch lên men tạo màng (cm3)

S/V

Tỷ lệ diện tích bề mặt tạo màng trên thể tích dịch tạo
màng (cm-1)


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài

1


Ngày nay công nghệ sinh học đang dần trở thành một ngành kĩ thuật
chủ đạo và chiếm giữ một vị trí cao của nhiều quốc gia trên thế giới. Là một
bộ phận của ngành công nghệ sinh học, công nghệ vi sinh đã và đang phát
triển mạnh mẽ với những thành tựu lớn có ý nghĩa trong đời sống, trong các
ngành như: công nghiệp, nông nghiệp, y học,... Cho đến ngày nay một trong
những nguồn nguyên liệu đã và đang được quan tâm gần đây đó là cellulose
vi khuẩn hay Bacterial cellulose (BC). Màng sinh học (Bacterial cellulose;
Biocellulose; BC ) do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra có cấu trúc và đặc
tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với
nhau bằng liên kết β-1,4 glucozit). Cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực
vật ở chỗ không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, peptin,
hemicellulose, và sáp nến... Do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ
dẻo dai, độ bền, chắc khỏe, độ đàn hồi. Với những đặc tính hóa, lí ưu việt trên
nên màng Biocellulose được xem như là một nguồn polymer sinh học mới, nó
thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay từ nửa sau thế kỉ XIX
Hiện nay màng BC được xem là nguồn nguyên liệu mới có tiềm năng được
ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp thực phẩm,
công nghệ giấy, công nghệ sản xuất pin...đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng
BC đã được một số nước trên thế giới nghiên cứu ứng dụng làm màng trị
bỏng, mặt nạ dưỡng da, mạch máu nhân tạo... Trên thế giới việc nghiên cứu

Gluconacetobacter và quá trình sinh tổng hợp BC cũng như ứng dụng của BC
bắt đầu từ rất sớm. Những nghiên cứu đầu tiên là của Brown A.J và cộng sự
năm (1886).
Trải qua hơn 1 thế kỷ nhưng cho đến nay Gluconacetobacter và màng
BC vẫn đang thu hút được sự chú ý của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới.
Ở Việt Nam, nghiên cứu về Gluconacetobacter, màng BC và ứng dụng của nó

2


còn là vấn đề khá mới mẻ, chỉ mới được quan tâm gần đây. Các nghiên cứu
và công bố về vấn đề này còn rất khiêm tốn. Các nghiên cứu hiện mới dừng ở
nghiên cứu quá trình tạo màng BC ứng dụng trong sản xuất thạch dừa, làm
giá thể gắn kết tế bào vi khuẩn và làm màng trị bỏng.
Nguyên liệu dùng để nuôi Gluconacetobacter rất đa dạng: nước dừa
già, rỉ đường, nước mía, nước vo gạo. Các loại môi trường này đã được
nghiên cứu khá nhiều. Tuy nhiên môi trường dinh dưỡng tảo xoắn dùng để
nuôi Gluconacetobacter chưa được nghiên cứu.Tảo Spirulina được phát hiện
ở Nam Mỹ và châu Phi trong hồ nước tự nhiên. Tảo có hình xoắn ốc và là một
nguồn thức ăn phong phú. Từ những năm 1970, tảo Spirulina đã được biết
đến và sử dụng rộng rãi như là một thực phẩm bổ sung chế độ ăn uống ở một
số nước. Spirulina có chứa protein thực vật phong phú (cao hơn so với cá
hoặc thịt bò 4 lần), nhiều vitamin (vitamin B 12 cao hơn so với gan động vật
4 lần), đó là những chất dinh dưỡng đặc biệt rất thiếu trong chế độ ăn
chay. Tảo gồm một loạt các khoáng chất (bao gồm cả sắt, kali, magiê natri,
phốt pho, canxi v..v), một số lượng lớn beta-carotene, bảo vệ tế bào (gấp 5 lần
so với cà rốt, 40 lần so với rau bina), với khối lượng lớn acid gamma-Linolein
(mà có thể làm giảm cholesterol và ngăn ngừa bệnh tim). Hơn nữa, tảo
Spirulina có chứa Phycocyanin -chỉ có thể được tìm thấy trong tảo Spirulina
[35].

Với thành phần dinh dưỡng và các tác dụng nói trên, tảo xoắn rất có thể
là môi trường lý tưởng để nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter vì vậy tôi lựa
chọn đề tài : “Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, tỷ lệ diện tích trên
thể tích đến quá trình tạo màng Biocellulose từ môi trường bổ sung Tảo
xoắn (Spirulina)”.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của mốt số yếu tố môi trường từ đó tìm được
nhiệt độ, pH, tỷ lệ diện tích trên thể tích thích hợp đến quá trình tạo màng
Biocellulose từ môi trường bổ sung Tảo xoắn (Spirulina).
3


3. Nhiệm vụ nghiên cứu
3.1. Phân lập, tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng
Biocellulose trên nguồn nguyên liệu tảo xoắn Spirulina.
3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, tỷ lệ diện tích trên thể tích
đến quá trình tạo màng Biocellulose từ môi trường bổ sung Tảo xoắn
(Spirulina).
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
4.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn G.xylinus T6 có khả năng tạo màng Biocellulose phân
lập từ môi trường tảo xoắn.
4.2. Phạm vi nghiên cứu
Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng tạo màng
Biocellulose của chủng G.xylinus T6 đã tuyển chọn.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
Tìm hiểu sự đa dạng của các chủng Gluconacetobacter có khả năng tạo
màng BC trên nguồn nguyên liệu mới, qua đó nghiên cứu đặc tính sinh lý,
sinh hóa của chủng vi khuẩn G.xylinus T6 có khả năng lên men tạo màng

Biocellulose trên môi trường tảo xoắn Spirulina. Kết quả nghiên cứu là dữ
liệu bổ sung cho các nghiên cứu và ứng dụng của chủng vi khuẩn G. xylinus
trong đời sống.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tìm ra hướng đi mới trong công nghệ sản xuất màng BC từ nguồn
nguyên liệu tảo xoắn Spirulina, đồng thời ứng dụng trong quá công nghiệp
thực phẩm, công nghệ giấy, công nghệ sản xuất pin...đặc biệt trong lĩnh vực y
học, màng BC đã được một số nước trên thế giới nghiên cứu ứng dụng làm
màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da, mạch máu nhân tạo...

4


6. Điểm mới
Phân lập được 12 chủng vi khuẩn axetic từ môi trường bổ sung tảo
xoắn Spirulina và tuyển chọn được chủng Gluconacetobacter xylinus T6 làm
đối tượng nghiên cứu tiếp theo trên môi trường tạo màng cơ bản với hàm
lượng bột tảo xoắn là 16 (g/l). Trên cơ sở đó tìm được môi trường có pH = 5,
nhiệt độ là 300C và tỷ lệ diện tích trên thể tích là 0,8 thích hợp cho chủng
G.xylinus T6 sinh trưởng và phát triển, rút ngắn thời gian tạo màng

5


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng và màng BC
1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới
Theo

hệ

thống

phân

loại

của

nhà

khoa

học

Bergey

thì

Gluconacetobacter thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizommycetes. Gluconacetobacter thuộc nhóm vi
khuẩn acetic, là loài vi khuẩn tạo được nhiều Biocellulose nhất trong tự nhiên.
Mỗi tế bào Gluconacetobacter có thể chuyển hóa 108 phân tử glucose thành
cellulose trong 1 giờ [24].
Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn
Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điểm khác nhau. Vì vậy,
vấn đề này vẫn đang gây nhiều tranh cãi, đòi hỏi cần có nhiều hơn những
nghiên cứu tiếp theo.
1.1.2. Đặc điểm hình thái, tế bao học
Gluconacetobacter là loại trực khuẩn, hình que, thẳng hay hơi cong

kích thước khoảng 2 �� đứng riêng rẽ xếp thành chuỗi, không có khả năng
di động. Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, hiếu
dị dưỡng, tế bào của chúng tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả
hay trong đất [2]. Khuẩn lạc Gluconacetobacter có kích thước nhỏ ( đường
kính khuẩn lạc đạt 1 - 2 mm ), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa
khuẩn lạc lồi lên và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc
nhẵn.
Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng : “ Vi khuẩn Gluconacetobacter có bao
nhầy cấu tạo bởi cellulose. Thành phần cấu tạo chủ yếu cau bao nhầy là
polysaccarit ( chủ yếu là glucose ). Ngoài ra, còn có các polypepetit, protein.
Bao nhầy còn có tác dụng bảo vệ, cung cấp chất dinh dưỡng, giúp vi khuẩn
bám vào giá thể” [2].
6


1.1.3. Đặc điểm sinh lí, sinh hóa của Gluconacetobacter
Đăc điểm sinh lí: Vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng và phát
triển tốt ở điều kiện

nhiệt độ 25oC-35oC; pH 4 - 6. Các

chủng vi khuẩn

Gluconacetobacter sinh trưởng được trong điều kiện pH thấp, vì vậy có thể bổ
sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
Đặc điểm sinh hóa của

các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter bao

gồm: Oxy hóa ethanol thành acetic, CO2, H2O; Phản ứng catalase dương tính,

không tăng trương trên môi trường Hoyer, chuyển hóa glucose thành acid,
chuyển hóa glyxerol thành dihydroxyaceton, không sinh sắc tố nâu, tổng hợp
cellulose [4].
1.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo màng Bacterial cellulose (BC)
Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn
Gluconacetobacter hình thành nên lớp màng có bản chất là cenlulose, được
tập hợp bởi nhiều bó sợi cenlulose liên kết với nhau được gọi là màng
Bacterial cellulose hay màng BC. Cấu trúc của màng Bacterial cellulose:
được cấu tạo bởi chuỗi polyme β-1,4 glucopynanose mạch thẳng, có thành
phần hóa học đồng nhất với cenlulozo thực vật, nhưng khác nhau về cấu trúc,
đặc tính. Để đảm bảo cho hoạt động bình thường của vi khuẩn, chúng ta nên
bổ sung thêm muối khoáng, nguồn cacbon, nguồn nito dễ hấp thụ như:
(NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, KH2PO4….[8].
1.2.1. Nhu cầu nguồn cacbon
Theo nghiên cứu của ThS. Ngyễn Thị Nguyệt trên chủng A.xylium
HN5 thì nguồn cacbon có ảnh hưởng lớn đến sự hình thành màng của
Gluconacetobacter [15].
Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử
enzim, axitnucleic và các sản phẩm trao đổi chất. Chính vì vậy, những
hợp chất hữu cơ có chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đới sống

7


của vi sinh vật. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất màng BC
được thể hiện ở bảng 1.1
Bảng 1.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng sự tạo màng BC
Nguồn cacbon

Năng suất tổng

Nguồn cacbon

Năng suất tổng

Monosaccharide

hợp cellulose

Disaccharide

hợp cellulose

D- Glucose

100

Lactose

D-Fructose

92

Maltose

16

D-Galactose

15

Sucrose

7

D-Xylose

11

Cellobiose

33

D-Arabinos

14

D-Sorbose

11

7 – 11

1.2.2. Nhu cầu nguồn Nitơ
Vi sinh vật và và tất cả các thể sống đều cần Nitơ trong quá trình
sống để xây dựng tế bào. Vì vậy nếu nguốn Nito trong mối trường quá ít
sẽ ảnh hưởng đến hoạt động sống của tế bào. Ở nồng độ 2,0g cho hiệu
suất màng BC cao nhất. Khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter người
ta thường sử dụng nguồn nito vô vơ là (NH4)2SO4, NH4NO3, nguồn nitơ
hữu cơ là peptone, cao thịt, cao nấm men [2].

1.2.3. Nhu cầu Photpho
Ngoài vai trò tham gia cấu trúc của tế bào, Photpho còn đóngvai
trò hết sức quan trọng trong tổng hợp cellulose ở chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter. Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng photpho, người ta sử
dụng các loại photpho vô cơ như : KH2PO4, K2HPO4, KNO3....Việc bổ
sung photphat (nhất là photphat kali ) vào các môi trường dinh dưỡng
còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường. Đối với khuẩn
Gluconacetobacter, nguyên liệu chủ yếu hiện nay được dùng là dịch hoa

8


quả, rỉ đường...khi nuôi cấy không cần bổ sung các nguyên tố vi lượng
nữa [2], [23].
1.2.4. Điều kiện nuôi cấy
1.2.4.1. Nhiệt đô
Theo Beyger nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn Gluconacetobacter vào
khoảng 25 – 30oC. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ
đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm.
1.2.4.2. Đô pH
pH được đo bằng nồng độ ion H+ trong dung dịch, pH ảnh hưởng đến
tính thấm hút của màng tế bào, vì thế nó ảnh hưởng trực tiếp đến sự trao đổi
chất của vi khuẩn. Sự tổng hợp ATP, đặc biệt là hoạt tính của enzym rất nhạy
cảm vói sự thay đổi của pH. pH ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của
vi khuẩn, ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp cellulose và pH kính thích quá
trình trao đổi chất của tế bào, độ pH quá cao hay quá thấp cũng gây ức chế
cho vi khuẩn. Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển thuận lợi trên môi
trường có pH thấp. Do đó trong môi trường nuối cấy cần bổ sung thêm acid
acetic nhằm axit hóa môi trường. Đồng thời acid acetic còn có tác dụng sát
khuẩn, giúp ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật có hại [17], [29].

1.2.4.3. Đô thông khí
Vi khuẩn Gluconacetobacter là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Do đó điều
kiện tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong thực
tế độ thông khí quyết định đến năng suất tổng hợp màng BC [11].
1.2.4.4. Thời gian nuôi cấy
Theo Thesis Holemes (2004), hàm lượng glucose trong môi trường
giảm nhất sau 150 giờ nuôi cấy. Sau khi glucose trong môi trường hết thì vi
khuẩn bắt đầu sử dụng axit gluconic và 5- keto axit gluconic trong quá trình
trao đôỉ chất.Tác giả cho rằng sau 6 ngày độ kết tinh của màng đạt trạng thái
tốt nhất.
9


1.3. Bacterial cellulose (BC)
1.3.1. Cấu trúc
BC có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (PCplant cellulose). Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi polyme ��1,4- glucopynanose. Có thành phần hóa học đồng nhất với cellulose thực
vật, nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác nhau [19].
Chuỗi polyme � – 1,4 – glucopynanose mới hình thành liên kết với
nhau tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết
tinh tạo thành sợi lớn – sợi vĩ mô (microfibril) (Jonas and Farah,1998), những
sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon
(Yamanakact.al 2000). Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1- 9 nm.
Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon
của tế bào khác bằng lên kết hidro hoặc lực Van Der Waals tạo thành cấu trúc
mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuối cấy [5], [9].
1.3.2. Một số tính chất của mang BC
Màng Biocellulose có cơ chế kết tinh khác hẳn cellulose của thực vật ở
chỗ chúng không có sự kết hợp hemixellulose, lignin hay những thành phần
phụ khác mà được cấu tạo từ các sợi microfibil tạo nên những bó sợi song
song cấu thành mạng lưới cellulose [1]. Do đó màng Biocellulose có độ bền

cơ học cao, độ tinh khiết cao, khả năng thấm hút nước lớn… hơn hẳn
cellulose của thực vật. Cụ thể:
+ Độ tinh sạch: màng Biocellulose có độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so
với các cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn
toàn.
+ Độ bền cơ học: màng Biocellulose có độ bền tinh thể cao, sức căng
lớn, trọng lượng lớn, ổn định về kích thước.
+ Tính hút nước: màng Biocellulose có khả năng giữ nước đáng kể (lên
đến 99%), có tính tơi xốp, độ ẩm cao.
10


1.3.3. Quá trình
Gluconacetobacter

tổng

hợp

BC

từ

vi

khuẩn

Khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trường có nguồn
dinh dưỡng đầy đủ (chủ yếu là carbohydrate, vitamin B1, B2, B12…và các chất
kích thích sinh trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình

bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào cơ thể, một phần
để cơ thể sinh trưởng và phát triển, một phần để tổng hợp cellulose và thải ra
môi trường. Ta thấy các sợi tơ nhỏ phát triển ngày càng dài hướng từ đáy lên
bề mặt trong môi trường nuôi cấy. Thiaman (1962) đã giải thích cách tạo
thành cellulose như sau: Các tế bào Gluconacetobacter khi sống trong môi
trường lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ
đường glucose, kết hợp đường với axit béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng
tế bào. Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế
bào cùng với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose.
Quá trình tổng hợp Biocellulose là một tiến trình bao gồm nhiều bước
được điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa
nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác các loại protein điều hòa [25].
Theo Alaban C.A và cs (1967) [18] các enzim tham gia vào quá trình
sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn gồm:
1PKF : Fructose -1- photphate kinase

PGI:Phosphoglucoisomerase

PMG : Phosphoglucomutase

PTS: Hệ thống phosphotransferrase

UGP: UPD – glucose pyrophosphate

Fru-bi-P:Fructose-1,6-bi-phosphate

Fru-6-P: Glucose-1-phosphate

Glc-6-P: Glucose-6-phosphate

Glc-1-P: Glucose-1-phosphate

PGA: Phosphogluconic acid acid

UDPGlc:Uridine diphosphoglucose

CS: Cellulose synthase

GK: glucokinase

FK: fructokinase

FBP: fructose-1,6- biphosphate phosphatase
G6PDH: glucose -6-phosphate dehydrogenase

11


Hai giai đoạn chính sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn
Giai đoạn polymer hóa
Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa
chuyển

glucose

thành

glucose

-

6-

phosphate.

Enzyme

phosphoglucomutase tiếp tục chuyển hóa glucose -6 - phosphate thành glucose
-1- phosphate thông qua phản ứng isome hóa. Glucose-1- phosphate nhờ
enzyme UDP-glucose pyrophosphorylase

chuyển

hóa

thành

UDP

-

glucose. Cuối cùng, UDP - glucose được tổng hợp nên sẽ được chuyển hóa
thành cellulose và cellulose được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức
hợp protein màng là cellulose synthase.Enzym này được hoạt hóa nhờ một
nucleotide vòng là cyclic-di-GMP. Một số chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
có khả năng sử dụng đường fructose hiệu quả hơn. Hệ thống enzyme
phosphotransferase sẽ chuyển fructose thành fructose-1-phosphate. Sau đó
fructose-1- phosphate sẽ chuyển hóa thành fructose-bi-phosphate nhờ enzym
fructose-1-phosphatekinase. Enzyme phosphoglucose isomerase có hoạt
tính cao, sẽ giúp chuyển hóa thành fructose-6-phosphate. Glucose-1phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hóa tương tự như trên để tạo ra

cellulose.
Giai đoạn kết tinh
Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết -1,4-glucan. Trong đó
các chuỗi glucan kết hợp tạo thành chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der
Waals. Lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó
chúng kết hợp với nhau bằng liên kết hidro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16
chuỗi glucan. Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi,
sau đó các vi sợi lại tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi.

12


Hình 1.1. Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn
Gluconacetobacter
Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter

Lớp màng cellulose do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra bao xung
quanh môi trường hạn chế nguồn oxy từ bên ngoài vào môi trường, điều này
ngăn cản sự cung cấp oxy cho các vi khuẩn hiếu khác, tạo điều kiện thuận lợi
cho quá trình cạnh tranh sinh tồn của vi khuẩn Gluconacetobacter. Màng
cellulose có khả năng giữ nước nên nên giúp cho vi khuẩn phân hủy các chất
dinh dưỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại ảnh hưởng của tia UV (tia tử
ngoại). Nhờ tính dẻo dai và tính thấm nước của các lớp cellulose mà các tế
bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi không thuận lợi trong môi trường
sống như: giảm độ ẩm, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc hại. Các vi khuẩn
Gluconacetobacter có thể tăng trưởng và phát triển bên trong lớp vỏ bao.
Thực nghiệm chỉ ra rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ
chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23 % số tế bào Gluconacetobacter được bao
bọc bởi Biocellulose sống sót sau 1 giờ xử lý bởi tia cực tím. Khi tách
Biocellulose ra khỏi tế bào, khả năng sống sót của tế bào giảm chỉ còn khoảng

3 % [34].
13


Ngoài ra, màng Biocellulose là giá thể chống đỡ cho vi khuẩn
Gluconacetobacter luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng và không
khí. Chính mạng lưới này làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi
trường và làm tế bào thu nhận chất dinh dưỡng một cách dễ dàng hơn so với
khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose. Trong môi
trường tự nhiên, đa số vi khuẩn tổng hợp các polysaccharide ngoại bào để hình
thành nên lớp vỏ bao quanh tế bào và màng Biocellulose là một điển hình.
Một vài nghiên cứu còn cho thấy, cellulose được tổng hợp bởi
Gluconacetobacter còn đóng vai trò tích trữ và có thể sử dụng khi vi sinh vật
này bị thiếu dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme exo
gluconase hay endo glucanase.
1.4. Ứng dụng của màng BC
1.4.1. Ứng dụng của BC trong một số lĩnh vực
Màng BC có nhiều lợi điểm vượt trội như : độ tinh sạch, độ kết tinh, độ
bền sức căng, độ đàn hồi, độ căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình
dạng ban đầu, khả năng giữ nước và hút nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn
bột gỗ thường, bề dày của vi sợi dưới 100 nm, bị phân hủy sinh học, có tính
tương thích sinh học, tính trơ chuyển hóa, không độc và không gây dị ứng.
Màng BC có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.
1.4.1.1. Thực phẩm
Sản phẩm cellulose được sử dụng trong nước ép trái cây và những thức
uống khác, trong mứt kẹo, trong kem, salad, thức ăn tráng miệng có tác dụng
như chất làm dặc, vật liệu ổn định dịch huyền phù, vật liệu làm vỏ bọc thực
phẩm. Các sản phẩm ứng dụng cellulose vi khuẩn trong lĩnh vực thực phẩm:
Món tráng miệng (thạch dừa, thức ăn nhanh, kẹo), chất nhũ hóa trong nước ép
trái cây và những thức uống khác, màng bao thực phẩm…

14


1.4.1.2. Y học
Màng trị bỏng : màng cellulose vi khuẩn Gluconacetobacter tẩm dầu
mủ u có tác dụng tương tự màng sinh học trị bỏng.
Tác nhân vận chuyển thuốc (qua đường miệng và da) : dựa vào đặc tính
trương nở của bột BC người ta ứng dụng làm tác nhân vận chuyển thuốc, làm
tá dược tự rã, dùng huyền phù BC để ổn định các tá dược dạng nước, là cho
chúng không bị tách pha khi bảo quản lâu ngày.
Da nhân tạo: ở Brazil, màng BC ướt tinh sạch được sản xuất và bán ra
thị trường như một loại da nhân tạo dùng để đắp vết thương.
1.4.1.3. Mỹ phẩm
BC vừa có khả năng giữ ẩm cao mà không bám lại lên làn dấu khi rửa
và cũng không gây các tác dụng phụ như các chất giữ ẩm khác, do đó được
ứng dụng: kem dưỡng da, chất làm nên cho móng nhân tạo, chất tăng độ dày
và bền cho nước làm móng tay.
Mặt nạ dưỡng da (Biocellulose mask)
Hiện nay trên thế giới xu hướng làm đẹp từ các sản phẩm tự nhiên
không chứa chất hóa học đang rất thịnh hành. Hàng loạt các hãng mĩ phẩm
lớn đều tập trung nghiên cứu cho ra những sản phẩm làm đẹp có nguồn gốc
tự nhiên không có hoặc rất ít tác dụng phụ trong đó có mặt nạ dưỡng
da (Biocellulose mask). Biocellulose mask được sản xuất bằng công nghệ vi
sinh và nguồn nguyên liệu chính là nước dừa. Màng thu được được xử lí
thành phẩm và bổ sung thêm các hoạt chất với các hướng ứng dụng khác
nhau như: làm trắng da, trị mụn hay làm mờ vết nám…
Ở Việt Nam, mặt nạ Biocellulose từ nước dừa lần đầu tiên được sản
xuất tại tỉnh Bến Tre được kiểm nghiệm nhiều lần tại trung tâm kiểm nghiệm
dược và mĩ phẩm Bến Tre và được sở y tế xét duyệt chấp nhận (Số công bố

013/11CBMP-BT do sở y tế Bến Tre cấp). Đây là lần đầu tiên mặt nạ 100%

15