Đồ án môn học: Công nghệ cố định Enzym và ứng dụng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
Bộ MÔN CÔNG NGHỆ THựC PHẨM
C5S CQ ỈO

ĐỒ ÁN MÔN HỌC

CÔNG NGHỆ CỐ ĐỊNH ENZYM
YÀ ỨNG DỤNG
SVTH

:

NGUYỄN BẢO Dư

MSSV

:

60700443

GYHD

:

TS. TRẦN BÍCH LAM

TP Hồ Chí Minh, 6/2011

NH? N X? T C? A GI? O VI? N H? ? NG D? N
?? ?n m ?n h?c

Tp. H?  Ch?  Minh, th? ng  6 n? m 2011 Ch?  k?  c ? a g i? o  vi? n

/V

~


/V

?? ?n m ?n h?c

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm  ơn TS. Trần Bích Lam đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ  tôi  
trong suốt thời gian thực hiện đồ án.
Cảm ơn quý thầy cô bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Kỹ thuật Hóa Học, trường  
Đại học Bách Khoa TpHCM đã giảng dạy nhiệt tình và truyền đạt những kiến thức quý báu 
của mình giúp tôi hoàn thành đồ án.
Xin cảm ơn tất cả bạn bè, những người đã quan tâm, giúp đỡ tôi hoàn thành đồ án
này.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6/2011 
Nguyễn Bảo Dư

iii ~


?? ?n m ?n h?c
MỤC LỤC

TRANG BÌA.................................................................................................................................i
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN.......................................................................ii
LỜI CẢM ƠN............................................................................................................................iii
MỤC LỤC...................................................................................................................................iv
DANH MỤC HÌNH....................................................................................................................vi
DANH MỤC BẢNG...................................................................................................................vi
Chương 1:

TỒNG QUAN........................................................................................................1

11.Lịch sử phát triển của enzym cố định.....................................................................................1
12.Sơ lược về enzym cố định......................................................................................................2
1.21.Định nghĩa ...................................................................................................................2
1.22.Đặc điểm của enzym cố định.....................................................................................2
1.23.Ưu nhược điểm của enzym cố định ..........................................................................3
1.24.Các phương pháp cố định enzym................................................................................3
1.25.Vật liệu cố định........................................................................................................  5
1.26.Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định enzyme ...................................................7
Chương 2:

ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH................................................................9

21.ứng dụng trong công nghệ thực phẩm...................................................................................9
2.11.Enzym ß­galactosidase.................................................................................................9
2.1.11.Giới thiệu về enzym ß­galactosidase .................................................................9
2.1.12.Nguồn thu nhận enzym ß­galactosidase................................................................9
2.1.13.Các phương pháp cố định enzym ß­galactosidase...............................................10
2.1.14.ứng dụng của enzym ß­galactosidase cố định....................................................13
2.1.1.41.Thủy phân lactose trong sữa và lactoserum..................................................13
2.1.1.42.Tổng họp Galacto­Ohgosaccharides (GOSs)................................................16

2.12.Enzym lipase..............................................................................................................17
2.L2.1. Giới thiệu về enzym hpase................................................................................17
2.L2.2. Nguồn thu nhận enzym lipase...........................................................................17
2.1.23.Các phương pháp cố định enzym lipase.............................................................18
2.1.24.ứng dụng enzym lipase cố định trong công nghệ thực phẩm............................20
2.1.2.41.ứng dụng lipase cố định tổng họp các ester có hương trái cây...................20

/V

~


?? ?n m ?n h?c
ứng dụng enzyme lipase cố định để sản xuất Mên tục monoacylglycerol
từ olein dầu cọ .......................................................................................................  21
2.13.Enzym a­galactosidase (raffinase)..............................................................................23
2.1.31.Giói thiệu về enzym a­galactosidase ..................................................................23
2.L3.2.

Nguồn thu nhận enzym a­galactosidase........................................................23

2.L3.3.

Cách phương pháp cố định enzym a­galactosidase.......................................23

2.L3.4.

ứng dụng của enzym riffinase cố định.........................................................26

22.ứng dụng trong phân tích.....................................................................................................27

2.21.Tổng quan về cảm biến sinh học (biosensor)..........................................................27
2.2.11.Giới thiệu về cảm biến sinh học .......................................................................27
2.2.12.Lịch sử phát triển cảm biến sinh học ................................................................27
2.2.13.Phân loại..............................................................................................................28
2.2.14.Các yếu tố sinh học............................................................................................29
2.2.14.L

Enzym ....................................................................................................29

2.2.1.42.Kháng thể ....................................................................................................29
2.2.1.43.Vi sinh vật ...................................................................................................30
2.2.15.Bộ chuyển đổi (transducer)................................................................................30
2.2.1.51.Chuyển đổi điện hóa....................................................................................30
2.2.1.52.Chuyển đổi quang........................................................................................30
2.2.1.53.Chuyển đổi nhiệt.........................................................................................30
2.2.1.54.Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric) ......................................30
2.22.Cảm biến sinh học sử dụng L­glutamate oxidase và L­glutamate dehydrogenase
cố định dùng để phân tích monosodium glutamate trong thực phẩm................................31
2.2.21.Giới thiệu............................................................................................................31
2.2.22.Phương pháp thí nghiệm.....................................................................................31
2.2.2.21.Các hóa chất sử dụng ..................................................................................31
2.2.2.22.Sự cố định enzym .......................................................................................31
2.2.223.Điện cực ......................................................................................................32
2.2.2.2A

Thử nghiệm ..........................................................................................32
/V

~

?? ?n m ?n h?c

2.2.2.25.Quá trinh phản ứng .....................................................................................33
2.2.22.Ó.

Cấu hình nhiệt độ và pH .......................................................................33

2.2.223.Xác định giá trị Km và Vmax.........................................................................34
2.2.2.2.8.

Sự ổn định của màng cố định................................................................35

/V

~


?? ?n m ?n h?c
TÀI
 
LIỆU
 
THAM
 
KHẢO
..................................................................................................................................................
36DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Mô hình biosensor.....................................................................................................27
Hình 2.2: Mô hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L­GLOD­L­GLDH cố định.......32

Hình 2.3: Đường hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG của cặp L­GLOD­L­
GLDH cố định trong cảm biến sinh học..................................................................................33
Hình 2.4: pH ở nhiệt độ 25 ± 2 °c có mặt 2mM NADPH và lOmM ammonium với nồng độ
MSG 1.2mg/L..............’...........................’...............................................................................34
Hình 2.5: Nhiệt độ ở pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL.......................................................34
Hình 2.6: Hoạt túứi của enzym cố định trên cảm biến sinh học trong thời gian 60 ngày:
L­
GLOD 25U­L­GLDH 143.2U; L­GLOD 25U­L­GLDH 35U; L­GLOD 25U..........................35

DANH MỤC BẢNG
•

Bảng 1.1: Ưu ­ Nhược điểm của các phưorng pháp cố định enzyme........................................4
Bảng 2.1: Tóm tắt các phưcmg pháp cố định enzym P­galactosidase.......................................13
Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng các kỹ thuật cố định khác nhau....................................15
Bảng 2.3: Nguồn vsv thu nhận enzym lipase và tứứi chất enzyme lipase ...............................18


Ch??ng 1: T?ng quan

Chương 1:

?? ?n m ?n h?c

TỔNG QUAN

11.Lịch sử phát triển của enzym cố định [1]
­Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và cho thấy rằng enzym invertase của nấm men
(EC.3.2.1.2.6) khi hấp thụ vào than có khả  năng thủy phân đường  saccharose. Sau đó  ữên thế  giới xuất hiện nhiều báo cáo về  khả

năng cố định enzym bằng liên kết đồng hóa trị trên chất mang. Trước năm 1953 chưa có một nghiên cửu nào về   enzym không hòa tan 
được ứng dụng vào thực tế.

­Năm 1953,  Grubhofer  và Schleith đã cố  định được một số  enzym  như  carboxy  peptidase, diastase, pepsin  và ribonuclease trên 
polyaminostyrene bằng liên kết đồng hóa trị và các nghiên cửu trên mới bắt đầu thử nghiệm ứng dụng qui mô pilot.
­Năm 1954, Chang đã tạo ra được các vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzym để chống lại dị ứng khi đưa enzym vào cơ thể.

­Năm 1963,  Bemfeld  và  Wan  đã thí nghiệm thành công việc nhốt các  enzym  như  amylase, trypsin, papain,  ribonuclease vào  gel
polyacrylamide.

­Năm 1964, Quiociio và Richards đã mô tả phương pháp liên kết chéo cố định carboxy peptidase A với glutaraldehyde. Cũng trong 
năm này Chang đã triển khai phương pháp tạo vi nang để nhốt enzym carbonic anhydrase.
­Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose bằng glucoamylase cố định.
­Năm 1969, Chibata và những người cộng tác ở công ty Tanabe Seiyaku ­ Nhật đã là những người đầu tiên thực hiện thành công

việc áp dụng enzym cố  định vào sản xuất công nghiệp. Theo phương pháp cố  định enzym của các tác giả  người Nhật, enzym
aminoacylase của nấm sợi đã được gắn vào DEAE­sephadex thông qua liên kết ion và sử dụng chúng cho các quá trình thủy phân.
­Năm 1970, Mosbach đã tiến hành cố định ba loại  enzym: P­galactosidase, hexokinase, glucophosphatase bằng hên kết cộng hóa trị
với các hạt sephadex.
­Năm 1971, Gregoriadis đã triển khai liposome có chứa amyloglucosidase.
­Năm 1973, Chibata và các cộng tác viên cũng là những người đầu tiên thành công trong việc cố  định tế  bào vi sinh vật để  sản
xuất L­aspartate từ ammonium fumarate bằng gel acrylamid. Tế bào E.coli chứa trong gel có hoạt tính aspartate rất cao.

­Đến năm 1987, bằng công nghệ ứng dụng enzym glucoisomerase cố định, đã tiến hành sản xuất sữo  fructose từ glucose theo qui 
mô công nghiệp. Cho đến nay cổ khoảng 4,5 triệu tấn sừo fructose được sản xuất theo phưong pháp enzym cố định.
­Ngoài sàn phẩm trên, enzym cố định còn được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men, chống ô nhiễm môi trường và cả trong
y học.
11.Sơ luợc về enzym cố định
1.21.Định nghĩa [1]
Enzym cố định có thể hiểu theo 2 nghĩa:

­Nghĩa hẹp: enzym không hòa tan là enzym được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này có thể tách riêng vói môi trường dung dịch  
phàn ứng. Pha enzym không hòa tan trong nước và được gắn với các polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn.
­Nghĩa rộng: cắc chất xúc tác cố định là các enzym, tế bào, cơ thể sống ờ trạng thái cho phép sử dụng lại. Như vậy, theo nghĩa
/V

~


Ch??ng 1: T?ng quan

?? ?n m ?n h?c

rộng, enzym không hòa tan bao gồm cả  enzym được cố định vào một chất mang, cả  enzym có trong tế bào sống, chúng được cố 
định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần.

­Enzym không hòa tan hay enzym cố định thường là những enzym hòa tan được gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác
nhau. Nhờ quấ trình gắn này mà enzym từ trạng thái hòa tan chuyển sang không hòa tan.
1.22.Đặc điểm của enzym cố định [1]
Enzym cố định có đặc điểm như sau:
­Hoạt tính của enzym  cố  định thường nhỏ  hơn hoạt tính của  enzym tự  do cùng loại. Sở  dĩ có sự  thay đổi hoạt tính riêng của
enzym cố định là do những nguyên nhân sau:

•Do  ảnh hưởng điện tích của chất mang: khi điện tích của chất mang có sự  khác biệt với điện tích của  enzym thì khi gắn
enzym vào chất mang, cấu trúc không gian của enzym có sự thay đổi ở mức độ nhất định. Chính vì sự thay đổi cấu trúc này mà
sự kết họp giữa enzym và cơ chất sẽ kém đi, dẫn đến hoạt tính của chứng cùng giảm.
•Do enzym bị nhốt vào mạng lưới hoặc bị liên kết bởi chất mang khiến cho sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất bị kém đi.
­Enzym cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis ­ Menten nhưng có một số sai khác nhất định:
•Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzym và chất mang.
• Xảy ra hiện tượng cản trở khuếch tán của cơ chất và sản phẩm làm giảm tốc độ phản ứng.

­Enzym cố định thường có tính bền nhiệt hơn enzym tự do nhờ có tác dụng che chở của chất mang.
­Enzym cố định thường có pH tối ưu không trùng với enzym tự do cùng loại.
­Enzym cố định do có chất mang che chắn nên được bảo vệ tốt hơn enzym tự do.
­Enzym cố  định có thể  tái sử  dụng nhiều lần và dễ  dàng tách ra khỏi cơ  chất một cách dễ  dàng sau phản  ứng và độ  bền của
enzym cố định cao hơn enzym tự do.
1.23.Ưu nhược điểm của enzym cố định [1]
Ưu điểm:
­Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài.
­Enzym cố định không lẫn vào trong sàn phẩm cuối của phản  ứng enzym, do đó nó không gây  ảnh hường xấu đến chất lượng
sản phẩm, hay nói cách khác chúng ta không tốn chi phí cho việc tách enzym ra khỏi sản phẩm
­Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang ­ enzym ra khỏi dung dịch cơ chất.
­Enzym cố định tương đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn enzym tự do.
­Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phương pháp liên tục.
Nhươc điểm:
­Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzym.
­Trong đa số trường họp, enzym có thể bị giảm hoạt mất hoạt tính sau quấ trình cố định.
­Tuy nhiên, những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà  enzym cố định mang lại. Do vậy, ngày càng có nhiều
/V


Ch??ng 1: T?ng quan

?? ?n m ?n h?c

nghiên cứu về cố định enzym cũng như ứng dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp.
1.24.Các phương pháp cố định enzym [1]
Các phương pháp cố định enzym được chia thành 2 nhóm: hóa học và vật lý.

/V

~


Ch??ng 1: T?ng quan

?? ?n m ?n h?c

Bảng 1.1: Ưu ­ Nhược điểm của các phương pháp cổ định enzyme [1]
Phương pháp hóa học
Phương pháp

Ưu điểm

Nhược điểm

Phương   pháp   gắn   enzym Liên kết giữa enzym và chất mang Hoạt   tính   enzym   có   thể   bị 
lên   chất   mang   bằng   liên là Mên kết bền, do đó hạn chế tối  giảm   do   những   biến   đổi   về 
kết cộng hóa trị

đa   sự   mất   mát   enzym   trong   quá cấu trúc của enzym trong quá 
trình phản ứng.

trình cố định.

Phương pháp gắn các phân Tạo được Mên kết rất bền trước Chi phí cao, thao tác thực hiên 
tử   enzym   lại   với   nhau các tấc nhân pH, nhiệt độ...
bằng liên kết cộng hóa trị

tương đối phức tạp.

Thường được dùng phối họp với Hoạt   tính   enzym   có   thể   bị 
các phương pháp khác.

giảm   do   những   biến   đổi   về 
cấu trúc của enzym trong quấ 
trình cố định.

Phương pháp vật lý
Phương pháp
Phương   pháp   gắn   enzym 

Ưu điểm

Nhược điểm

Thao tấc thực hiện đơn giản.

Do lực tương tác giữa  enzym 
lên   chất   mang   bằng   tác 
và chất mang yếu nên dễ  xảy 
Điều   kiện   tiến   hành   cố   định 
nhân vật lý
ra   hiện   tượng   nhả   hấp   phụ 
enzym  ôn hòa nên không làm mất 
trong quá trình sử  dụng enzym 
hoạt   tính   của  enzym  trong   quá 
cố  định do khuấy trộn hay do  
trình cố định.
thay đổi nhiệt độ, pH của môi 
Có   khả   năng   tái   sử   dụng   chất  

trường.
mang.
Phương pháp nhốt enzym Thao tác đơn giản.
Chỉ   thích   họp   cho   phản   ứng 
với   cơ   chất   có   khối   lượng  
Không   đòi   hỏi   phải   có  các   nhóm phân tử nhỏ.
tạo   Mên   kết   nên   phù   họp   với 
nhiều loại enzym.
Hiệu quả cố định enzym cao.

Có   thể   cố   định   đồng   thòi   nhiều 
 Phương pháp hóa  hoc:
   enzym.
/V

~


Ch??ng 1: T?ng quan

?? ?n m ?n h?c

­Gắn enzym lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị.
­Gắn các phân tử enzym lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị.
Phương pháp vât lý:
­Hấp phụ  enzym lên chất mang bằng liên kết vật lý như  sau: lực mao quản, liên kết ion, 
lực Van der Walls....
­Phương pháp nhốt enzym trong khuôn gel hoặc màng bao vi thể.
1.2.5. Vật liệu cố định [1]
Vật liệu và phương pháp cố định là hai yếu tố có tính chất quyết định đến hiệu quả của  

quá trình cố định enzym Trong đó, không có đặc điểm, tính chất của vật liệu cố định nào thích 
họp cho tất cả  các loại enzym và cũng không có enzym nào thích họp với tất cả  các loại vật 
liệu cố định.
Vật liệu cố định enzym và tế bào có thể chia làm hai loại: vật liệu vô cơ và vật liệu hữu 
cơ.
Vât liêu vô cơ:
­Đặc điểm: chất mang vô cơ bền với các tác động bên ngoài, không bị vi sinh vật ăn mòn,  
phân hủy, nhưng việc gắn với enzym thường khó khăn hơn.
­Một số  chất mang vô cơ  thông dụng như: thủy tinh xốp, cấc oxid kim loại như oxid nhôm, 
oxid mangan, oxid magie, Silicagel...

Vât liêu hữu cơ:
­Đặc điểm:  chất mang hữu cơ  thường có các nhóm hoạt động hóa học như: ­NH 2, ­ 
COOH, ­OH, ­SH,... nên dễ kết gắn với  enzym nhưng độ bền với tác động của môi trường  
không cao, đặc biệt các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấn công.
• Các 
   polymer 
 
 t  ư nhiên: 
­Tinh bột là vật liệu phong phú rẻ  tiền. Tinh bột dùng để  đóng mạch, diethanolamin tinh 
bột   đã   được   dùng   làm   chất   mang   cố   định  enzym  như  lipase,  glucoisomerase,  trypsin, 
amylase. Nhược điểm của tinh bột là độ  trương kém, thiếu các nhóm chức năng nên khả 
năng cố định và hoạt tính enzym còn thấp. Tinh bột thường được ghép copolymer với các 
vinyl  monomer  ưa nước như  acrylamide,  acrylic acid  để  cải thiện tính chất cơ  lý, độ 
trương nở và tạo các nhóm chức năng trên bề mặt.
­Cellulose  và dẫn xuất của  Cellulose  là CM­cellulose, DEAE­cellulose,  nitrocellulose...  là 
những vật liệu rẻ  hơn so với  agarose nhưng lại không đồng nhất, thường chỉ sử dụng  ở 
dạng sợi, và dạng tinh thể   (microcrystalline). Cellulose  là vật liệu được nghiên cứu cố 
định  enzym  đầu tiên, các quy trình cố  định trên vật liệu này được nghiên cứu khá hoàn  
/V

~


Ch??ng 1: T?ng quan

?? ?n m ?n h?c

chỉnh.  Cellulose  thường được dùng để  hấp thụ, hên kết ion, Mên kết cộng hóa trị  với 
enzym hoặc nhốt trong gel.
­Chitin là họp chất được Braconnot phân lập từ năm 1811 và Odier đặt tên là chitin từ năm  
1823. Chitin là một polymer sinh học có nhiều triển vọng trong nghiên cứu và  ứng dụng  
làm vật liệu cố định enzym và tế bào. Chitin là một polymer sinh học rất phổ biến trong tự 
nhiên, chỉ đứng sau cellulose.
­Chitin có cấu trúc tương tự cellulose, là một polymer của các gốc 2­acetoamide­2­ deoxy­
ß­D­glucoza, Mên kết với nhau bởi Mên kết ß­l,4­glycoside. Chitin có trong thành phần cấu 
trúc vỏ  của côn trùng, vỏ  tôm cua, sò, vách tế  bào sinh vật,... Chitin  là một vật Mệu có 
chứa nhóm chức ­OH và cho Mên kết với  enzym, có cấu trúc siêu lỗ, có khả năng hấp thụ 
tốt, dễ  tạo màng.  Chitin  có cấu trúc mạng tinh thể  chặt chẽ, không chỉ  có các Mên kết  
hydro hình thành trong chuỗi mà còn có giữa cấc lóp với nhau trong mạng tinh thể. Chitin 
là một polymer kỵ  nước, độ  trương thấp, diện tích bề  mặt tiếp xúc nhỏ  và bền về  mặt 
hóa   học.   Gần  đây  có   rất   nhiều   nghiên   cứu   cố   định   enzym  trên   chitin,   chủ   yếu   bằng  
phương pháp hấp thụ và Mên kết công hóa trị qua cầu nối glutaraldehyde.  Chitin được tìm 
thấy trong thành tế  bào của nấm sợi. Nó là chất hữu cơ  chiếm lượng lớn để  hình thành 
nên lóp vỏ ngoài của động vật không xương sống (côn trùng, giáp xác...). về mặt cấu trúc, 
chitin  có   cấu  trúc  tương   tự   như  cellulose,  điểm   khác   biệt   hóa   học   duy  nhất   là   nhóm 
acetamido  ở  vị  trí số  2 trên khung carbon của chitin được thay thế  cho nhóm hydroxyl  (­
OH) ờ ceUulose.
­Chitosan là dẫn xuất của chitin khi được deacetyl hóa trong kiềm mạnh. Chitosan dễ tạo  
màng, tạo hạt, có cấu trúc siêu lỗ, có nhóm ­ NH 2. Chitosan có thể  cố  định enzym bằng 

phương pháp hấp phụ, phương pháp cộng hóa trị, hoặc nhốt   enzym  trong gel chitosan. 
Chitosan không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như  acid formic, acid dipic, acid 
acetic. Chitosan  là một  polymer  sinh học có trọng lượng phân tử  cao, có các nhóm amin  
hoạt động, cấc nhóm hydroxyl có thể tham gia phàn ứng hóa học.
­Anginate, carrageenan, cả hai vật Mệu này tạo gel trong dung dịch CaCỈ2 dùng để nhốt tế 
bào, enzym.

/V

~


Ch??ng 1: T?ng quan

?? ?n m ?n h?c

Chất mang protein thường là gelatin, keratin, albumin,... thường có khả  năng dễ  tạo 
màng, tạo hạt, nhốt enzym trong khuôn gel với tác nhân đóng mạch là glutaraldehyde; nhược  
điểm của nhóm này là thường kém bền, dễ bị nhiễm khuẩn.• Các 
   polymer tone 
 
 h
  ơp: 
­Cấc polymer tổng họp được sử dụng làm chất mang cố định enzym như polyacrylamide, 
polyester,  polyvinylalcohol,  polyvinylacetate,   polyacrylic,  polyhydroxyethylacrylate, 
polystyrene,...
­Ưu điểm chung của các polymer tổng họp này là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ 
với sự  tấn công của vi khuẩn, độ  trương tốt, một số   polymer  có thể  điều chỉnh kích 
thước siêu lỗ.
­Nhược điểm là một số  polymer  có giá thành cao, khả  năng tương họp sinh học kém, 

không thể phân hủy trong môi trường tự nhiên nên gây ô nhiễm môi trường.
1.2.6. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định enzyme [1]
 Ảnh hưởne của chất  mans
 
 
­Cấc tính chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền cơ hóa, diện tích, tính háo  
nước và kỵ  nước,.. .đều có  ảnh hưởng nhất định đến lượng enzym được liên kết, đến 
tính bền và hoạt tính sinh học của các chất dẫn xuất enzym không tan.
­Bản chất hóa học của chất mang cũng  ảnh hưởng đến khả  năng tạo thành dẫn xuất 
enzym và tới khả năng chất mang hấp phụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản  
ứng.
­Sự định vị  enzym giúp cho dẫn xuất enzym không tan có tính bền nhiệt cao hơn enzym 
tan.
­Chất mang có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzym trong các dung môi, làm đứt nối 
liên kết hydro và liên kết kỵ nước
Ảnh hưởns của vH
­Khi lực ion thấp thì nồng độ  H+ gần chất mang tích điện âm cao hơn, còn gần chất  
mang tích điện dương cao hơn trong dung dịch. Kết quả là pH tối ưu của enzym liên kết 
đồng hóa trị với chất mang tích điện âm sẽ chuyển dịch sang pH kiềm so với enzym hòa 
tan, trái lại nếu enzym liên kết đồng hóa trị với chất mang tích điện dương thì  pH tối ưu 
sẽ chuyển dịch sang phía pH acid.
­Khi lực ion lớn thì điện tích của chất mang được trung hòa bởi các ion trái dấu và  pH tối 
ưu của enzym cố định gần giống enzym hòa tan.
 Ảnh hưởne của  enzyme
 
 
Theo Poltorak, một trong những nguyên nhân làm giảm hoạt độ của enzym cố định là 


Ch??ng 1: T?ng quan

?? ?n m ?n h?c

sự tương tác protein­protein giữa các phân tử enzym đã được liên kết.
Trong mọi trường họp đều thấy hoạt độ riêng của chế phẩm bị giảm đi cùng với sự 
tăng lượng enzym được kết họp trên một đơn vị diện tích chất mang.
'J 
/N/ 

/%/


Ch??ng 1: T?ng quan

?? ?n m ?n h?c

Ảnh hưởne của phươns pháp cố đinh
­Khi cố định bằng phương pháp hấp phụ vật lí, các  enzym ít bị thay đổi cấu trúc không gian  
do đó ft ảnh hường đến hoạt tính. Nhưng do phương pháp này sử dụng các liên kết yếu như 
liên kết kị nước, liên kết hydro,... nên enzym dễ bị giải hấp phụ.
­Khi cố định bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị sẽ có độ ổn định cao khi sử dụng dưói  
các điều kiện như nhiệt độ, pH, có khả năng chống chịu cao đối với sự ảnh hường của các  
dung môi hữu cơ và các tác nhân vật lí khác. Tuy nhiên, liên kết cộng hổa trị sẽ làm thay đổi 
mạnh mẽ cấu trúc không gian của  enzym nên hoạt tính của enzym cố định thường bị giảm đi 
đáng kể.
­Khi cố  định bằng phương pháp bao gói, quá trình hoạt động của  enzym phụ  thuộc vào hai 
yếu tố chính là kích thước chất mang polyme và trọng lượng của phân tử cơ chất. Hai yếu tố 
này sẽ làm giảm tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác. Hơn nữa, cùng 
với hoạt tính xúc tác cao của  enzym sẽ làm xuất hiện gradient nồng độ của cơ chất và sản  
phẩm của dung dịch và chất mang chứa enzym cố định. Điều này làm cho các thông số công 

nghệ thay đổi, đó là điều cần để ý khi thiết lập quy mô của quá trình.
Chương 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH
21.ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
2.11.Enzym p­galactosidase
2.1.11.Giói thiệu về enzym Ịỉ­galactosỉdase [2]
Enzym P­galactosidase (EC.3.2.1.23) là một lactase thủy phân đường lactose thành
các monomer là glucose và galactose. Việc sử dụng P­galactosidase để thủy phân lactose trong sữa 
và whey là một trong những  ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp chế  biến thực phẩm và các  
sàn phẩm từ sữa. Enzym này có thể được sử  dụng dưới dạng hòa tan hoặc dạng cố định nhưng 
dạng hòa tan chỉ có thể  sử  dụng trong qui trình sản xuất gián đoạn, còn dạng cố định có lợi thế 
hon là có thể sử dụng tốt cho cả hai qui trình sản xuất gián đoạn và liên tục.
Mặc dù hầu hết các ngành công nghiệp vẫn thủy phân  lactose  với  enzym  tự  do, nhưng 
việc sử  dụng enzym P­galactosidase cố  định là một lĩnh vực đáng quan tâm vì những tiềm năng  
của nó.
2.1.12.Nguồn thu nhận enzym p­galactosỉdase [2]
Enzym P­galactosidase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như vi sinh
vật, thực vật, và động vật. Tuy nhiên, tính chất của  enzym  được thu nhận từ  các nguồn khấc 
nhau có sự  khác nhau rõ rệt.  Enzym  thu nhận từ  nguồn thực vật và động vật có giá trị  kinh tế 
/V


Ch??ng 2: ?ng d?ng

?? ?n m ?n h?c

thấp, nhưng thu nhận từ nguồn vi sinh vật lại có nhiều ưu thế như dễ dàng xử lí thu nhận, tốc độ 
nhân giống vi sinh vật cao, năng suất thu nhận sản phẩm cao. Một số vi sinh vật được xem là 
nguồn thu nhận tiềm năng của loại enzym này.
Bacteria:  Alicyclobacỉllus   acidocaldarìus  subsp,  Rittmannii   Arthrobacter  sp,_Bacittus 
acidocaldarỉus,   B.   circulans,   B.   coagulans,   B.   subtilis,   B.   megaterum,   B.   stearothermoph ỉlus,  

Bacteriodes   polypragmatus,  Bifidobacterium   bifidum,  B.  infantis,   Clostridium   acetobutylicum,  
c.thermosulfurogens,   Corynebacterium   murisepticum,   Enterobacter   agglomerans,E.   cloaceae,  
Escherichia coll, Klebsiella pneumonia, Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus,L. helviticus, L.  
kefiranofaciens, L. lactis, L. sporogenes, L. themophilus, L. delbrueckii, Leuconostoc citrovorum,  
Pediococcus  acidilactỉ,  p.   pento,   Propioionibacterium   shermanii,   Pseudomonas   fluorescens,  
Pseudoalteromonas haloplanktis
Streptococcus   cremoris,  s.  lactis,  s.  thermophius,   Sulfolobus   solfatarius,   Thermoanaerobacter  
sp.,Thermus rubus, T. aquaticus, Trichoderma reesei, Vibrio cholera, Xanthomonas campestris.
Fungí: Alternaría alternate, A. palmi, Aspergillus foelidis, A. fonsecaeus, A. fonsecaeus, A.  
Carbonarius, A. Oryzae, Auerobasidium pullulans, Curvularia inaequalis,  Fusarium  monilliforme,  
F.   oxysporum,   Mucor   meihei,   M.   pusillus,   Neurospora   crassa,   Penicillum   canescens,   p.  
chrysogenum,   p.   expansum,   Saccharopolyspora   rectivergula,   Scopulariapsis   sp,   Streptomyces  
violaceus.
Yeast: Bullera singularis, Candida pseudotropicalis, Saccharomyces anamensis, s. lactis, 
S.fragilis, Kluyveromyces bulgaricus, K.fragüis, K. lactis, K.marxianus.
2.1.13.Các phương pháp cố định enzym ß­galactosidase [2]
Phươns pháp hấữ phu vât lý
Cấc chất vô cơ  như  nhôm, silic, thủy tinh xốp,  đất sét,   bentonite,...  chất hữu cơ  như 
cellulose, tinh bột, than hoạt tính, nhựa trao đổi  ion,... được sử dụng làm chất mang hấp phụ trong  
cố định enzym. Hơn nữa có thể xử lí thêm với glutaraldehyde để tăng sự ổn định.
Enzym ß­galactosidase  từ  K.  fragilis  và  K. lactis  được cố  định trên chitosan có hoạt độ 
riêng 0.9­2.2 u/mg trọng lượng khô của tế  bào. Hoạt tính của enzym được cố định từ  K. fragilis 
thì cao hơn nhưng độ ổn định của  enzym cố định từ A. oryzae thì cao hơn 5­14 lần tùy thuộc vào 
phương pháp cố định. Khi dùng phương pháp hấp phụ người ta nhận thấy hoạt tính cao nhất thu 
được khi dùng enzym từ  nấm men với chất mang là Ostsorb­DEAE. Hơn nữa, sự cố định tối đa 
đạt được ở  pH 5.5 và kết quả tối  ưu thu được khi có mặt dung dịch đệm citrate/phosphate trong 
suốt   quá   trình   cố   định   /?­galactosidase   từ  E.   coli  bằng   phương   pháp   hấp   phụ   vật   lí   trên 
chromosorb­W. Một thiết bị phản ứng mới chứa /?­galactosidase t ừ  B. circulans được cố định trên 
màng có gờ làm từ PVC và silica được sử dụng để thủy phân lactose trong sữa gầy. Việc cố định 
/V

~


Ch??ng 1: T?ng quan

?? ?n m ?n h?c

yổ­galactosidase   từ  Bullera  singularis  trên   hạt   Chitopearl  BCW  3510   (970   GƯ/g   nhựa)   bằng 
phương pháp hấp phụ đơn giản cũng được thực hiện.
Các   nghiên   cứu   về   động   học   của  enzym   ß­galactosidase  từ  Kluyveromces   marxianus  
(Saccharomyces) lactis được cố định trên những chất mang khác nhau như  nhôm và  silica đã cho 
thấy rằng hoạt tính của enzym cố định phụ vào bản chất hóa học tự nhiên và cấu trúc vật lí của  
chất mang. Khi kích thước lỗ của các hạt chất mang tăng thì hoạt tính của enzym giảm mạnh. Sự 
cố  định ß­ galactosidase từ  Thermus sp. diễn ra rất nhanh trên PEI­Sepabeads và DEAE­Agarose.  
Tuy nhiên, độ mạnh hấp phụ thì cao hơn trong trường họp của PEI­ Sepabeads.
Enzym ß­galactosidase từ  B. stearothermophilus chịu nhiệt được cố  định trên chitosan sử 
dụng Tris (hydroxymethyl) phosphine (THP) và glutaraldehyde dùng để  thủy phân đường lactose 
trong sữa. Khả năng chịu nhiệt và hoạt tính của enzym ß­galactosidase được cố định 

/V


Ch??ng 2: ?ng d?ng

?? ?n m ?n h?c

trên   THP   thì   vượt   trội   hơn   so   với   enzym  tự   do   và  enzym  được   cố   định   bằng 
glutaraldehyde. Enzym ß­galactosidase được cố  định trên THP cho thấy hoạt tính cao hơn enzym 
tự do khi có mặt ion Ca2+ và ổn định trong suốt thời gian bảo quản  ờ  4°c trong 6 tuần, trong khi 

enzym tự do bị mất 31% hoạt tính trong cùng điều kiện. Hai phương pháp quy hoạch thực nghiệm 
là phương pháp “Response surfacemethodology” (RSM) và “Centre composite design” (CCD) được 
dùng để tối ưu sự cố định enzym ß­galactosidase từ  Pisum sativum trên hai vật liệu khung mạng: 
Sephadex G­75 và hạt chitosan. Hiệu suất cố  định đạt được 75.66% và 75.19% tương  ứng với  
Sephadex G­75 và chitosan.
Enzym ß­galactosidase từ A. oryzae được cố định trên một chất mang rẻ tiền concanavalin  
A­cellulose. Chế  phẩm  ß­galactosidase  được  hấp phụ  và hên kết chéo bằng Concanavalin A­
cellulose, giúp giữ lại 78% hoạt tính ban đầu. Nhiệt độ tối ưu của enzym cố định tăng từ 50°c lên 
60°c. Enzym cố định bằng phương pháp hấp phụ và liên kết chéo giữ được 93% hoạt tính sau 1 
tháng bảo quản trong khi enzym tự nhiên chỉ giữ được 63% hoạt tính.
Phươns pháp bao eói
Khung mạng sử  dựng để  cố  định thường được làm từ  các nguyên liệu như  Ca­alginate,  
agar, k­carragenin, polyacrylamide và collagen. Tuy nhiên, một vài khung mạng rắn như than hoạt  
tính, ceramic,... cũng có thể dùng để  cố  định. Các loại màng dùng để  nhốt  enzym được sử dụng 
phổ biến là nylon, cellulose, polysulfone, và polyacrylmide.
Enzym ß­galactosidase  từ  nấm sợi được cố  định trong  gel polyvinyl alcohol  có tính chịu 
nhiệt cao hơn enzym tự do, giữ được 70% hoạt tính sau 24h  ở   50°c. Các tế bào K. bulgarìcus có 
chứa enzym ß­galactosidase được xử lí với glutaraldehyde được nhốt trong alginate sử dụng dung 
dịch BaCỈ2. Cấc hạt alginate thu được sau khi xử lí tiếp theo với polyethyleneimine thì đạt được  
độ   ổn định cao.  Enzym ß­galactosidase  của  E. coli  cũng được cố  định trong  gel polyacrylamide 
thông qua việc chuẩn bị các dẫn xuất hên kết chéo của enzym với bisimidoesters.
Tế bào K. marxianus có chứa lactase hoạt động được nhốt toong gel calcium pectate (CPG) 
và toong  gel calcium alginate  (CAG) được làm cứng bằng polyethyleneimine và glutaraldehyde.  
Các tế bào được cố định trong CPG đã thủy phân hơn 80% lactose trong quá trình liên tục và bán 
hên tục.
So sánh các phương pháp cố  định  enzym ß­galactosidase  từ  Thermus aquaticus  cho thấy 
rằng việc cố định bằng hên kết chéo sau đó nhốt  enzym toong hạt agarose có thể  cho hiệu suất 
hoạt động tốt hơn. Việc nhốt enzym ß­galactosidase từ  A. oryzae trong gel polyvinyl alcohol lạnh 
xốp sẽ tăng cường độ ổn định với nhiệt độ, pH, lực ion hơn so với enzym tự do. Khung dạng sợi 
được làm từ  alginate và gelatin được bổ  sung chất làm cứng là glutaraldehyde cổ  thể  giữ  được 

56% hoạt tính của enzym trong 35 ngày mà không có bất kì sự giảm hoạt tính.
~


Ch??ng 2: ?ng d?ng

?? ?n m ?n h?c

Người ta nhận thấy rằng chế phẩm  ß­galactosidase được liên kết chéo bằng canavalin A  
có thể  thủy phân lactose vượt trội trong hàng loạt quá trình so với các chế  phẩm khác vì chúng 
vẫn giữ  được hoạt tính cao, cụ  thể  là giữ  được 95% hoạt tính sau 7 lần sử  dụng, và giữ  được 
93% hoạt tính sau 2 ngày bảo quản ở 4°c.
 Phương pháp liên kấ cone 
  
 hóa tri
 
 
Các phân tử  enzym  liên kết với chất mang thông qua cấc nhóm chức năng không nằm  
trong trung tâm hoạt động của enzym như amino, carboxyl, hydroxyl, và sulfydryl. Các nhóm chức 
năng trên chất mang thường được hoạt hóa bằng cách sử  dụng các chất hóa học như  cyanogen 
bromide, carbodimide, và glutaraldehyde.
Enzym từ A. oryzae được cố định trên bột nylon­6 và zeolite. Zeolite thì không lý tưởng vì 
lượng liên kết tạo thành ft trong khi đó nylon­6 tạo ra được khung mạng  ổn định. Các dẫn xuất  
thu được hoạt hóa bằng diazo hoặc bằng carbodiimide cho thấy hoạt tính cao nhất trong suốt quá  
trình cố định enzym trên thủy tinh xốp có phủ lóp glycophase.
Enzym  ß­galactosidase  từ  E.  coli  được  cố  định  trên  gelatin  sử  dụng  chất  hoạt  hóa  là 
chromium (III) acetate và glutaraldehyde vẫn giữ được tương  ứng 25% và 22% hoạt tính.  Enzym 
được cố định trên silica­alumina ổn định hơn enzym tự do ở pH acid.
Các dẫn xuất ß­galactosidase cố  định cho thấy nhiều sự cải thiện nhưng hoạt tính khấc 
nhau sau khi được tạo điều kiện cho liên kết cộng hóa trị  đa điểm bằng cách  ủ  trong dung dịch 

kiềm một thời gian dài, enzym được cố định trên Sepabeads­epoxy­boronic được xem là  ổn định 
nhất. Dan xuất tốt nhất rất hoạt động trong việc thủy phân lactose thậm chí ờ 70°c.
Gần đây sự liên kết ngang của ß­galactosidase trên các hạt từ tính có nguồn gốc khác nhau 
được thực hiện với sự có mặt của glutaraldehyde. Ket quả là hoạt tính của enzym cố định được 
tăng lên.
Khi cố định ß­galactosidase chịu nhiệt trên Sepabeads để thủy phân lactose người ta nhận 
thấy sự   ức chế  enzym do sản phẩm tạo ra giảm, điều này hữu dụng trong việc cải thiện hiệu 
suất hoạt động của enzym trong công nghiệp.

/V

~


Ch??ng 2: ?ng d?ng

?? ?n m ?n h?c

Bàng 2.1: Tóm tắt các phương pháp cố định enzym ịỉ­galactosỉdase
Phương pháp cố định
Nguồn P­galactosidase
K. fragilis and K. lactis
A. oryzae
E. coli
Hấp phụ vật lý

B. circulans
B. stearothermophilus
A. niger
K. fragilis

K. lactỉs
K. bulgaricus

Bao gói

Tác nhân cố định

Chitosan
Phenol­formaldehyde resin
Chromosorb­W
Polyvinyl chloride, Silica gel
Chitosan
Porous ceramic monolith
Chitosan beads
CPC­silica, agarose
Alginate using BaCỈ3

E. coli

Polyacrylamide gel

A. oryzae

Nylon­6 and zeolite

Thermus aquaticus YT­1

Agarose bead

Pénicillium expansum F3 Calcium alginate

K. lactis
Poly(vinylalcohol) hydrogel

Liên kết cộng hóa trị

L. bulgarìcus

Egg shells

s. anamensỉs

Calcium alginate

E. coli
K. latỉs
A. nỉger
A. oryzjae

Hen egg white
Cotton fabric
Magnetic polysiloxane­ polyvinyl 
alcohol
Silica

2.1.14.ứng dụng của enzym p­galactosidase cố định
2.1.1.41.Thủy phân lactose trong sữa và lactoserum [2]
Sữa được thủy phân lactose được sử dụng cho việc chế biến hưcrag liệu sữa, phô
mai, và sữa chua. Sự thủy phân lactose trong sữa và dùng sữa chế biến thực phẩm cũng ngăn 
ngừa sự  kết tinh lactose khi đông lạnh sữa và sàn phẩm sữa cô đặc. Hơn nữa việc sử  dụng  
sữa đã thủy phân trong sản xuất sữa chua và pho mát sẽ  làm tăng quá trình acid hóa, bởi vì  

thủy phân lactose thường là bước làm chậm tốc độ của quá trình, làm giảm thòi gian đông đặc  
của sữa chua và tăng tốc độ phất triển cấu trúc và hương vị cho phó mat. Chất lượng của sữa  
đông lạnh và kem làm từ sữa cũng được cải thiện đáng kể khi thêm enzym lactase. Nó chống
/V


Ch??ng 2: ?ng d?ng

?? ?n m ?n h?c

lại sự kết tinh đường lactose bằng cách thủy phân thành glucose và galactose và làm giảm cấu 
trúc cát sạn.
Thủy phân lactose trong whey là một  ứng dụng quan trọng khác của  ß­galactosidase 
trong ngành công nghiệp chế biến sữa. Whey thủy phân và cô đặc hay whey thu được qua lọc 
màng có thể được sử dụng như chất tạo ngọt trong sản xuất sữo rau quả đóng họp và nước  
giải khất.
yổ­galactosidase từ  nấm  (Miles  Chemie)  được cố  định trong  gel polyvinyl alcohol 
được nhận thấy là bền nhiệt hon so với  enzym tự do, giữ được 70% hoạt tính sau 24h ở  50°c 
và 5% hoạt tính ở 60 °c. Thủy phân được 75% lactose trong 5­6h và mức độ chuyển đổi giảm 
50%  sau  30  lần sử  dụng. Các nghiên cứu về  thủy phân  lactose  sử  dụng  enzym  cố  định  ß­ 
galactosidase (Aspergillus niger) trên nhựa phenol formaldehyde cho thấy nhiệt độ tối  ưu phụ 
thuộc vào thời gian thực hiện quá trình nhưng không phụ thuộc vào nồng độ và sự chuyển đổi  
lactose. Enzym /?­galactosidase từ A. niger thủy phân được 70% lactose trong sữa gầy ở  40°c 
trong 10 phút. Enzym ^­galactosidase có nguồn gốc từ  nấm cố  định trên hydrogel được dùng 
để thủy phân whey, sau 7h thủy phân được 70­75% whey. Sự cố định enzym yổ­galactosidase 
từ A. niger trên silica gel đã được kích hoạt, kết quả là hầu hết các chế phẩm  enzym cố định 
sử dụng silica gel được kích hoạt bằng TÌCI3 và FeCỈ3 sẽ thủy phân được 81% đến 84% trong 
dung dịch chứa 4% lactose.
Enzym ß­galactosidase từ  K. lactis được cố  định trên CPC­silica (đã được silan hóa 
và kích hoạt với glutaraldehyde) và agarose (được kích hoạt bằng tác nhân cyanua) chuyển đổi 

được 90%  lactose  trong thiết bị  phản  ứng  “packed bed  minireactor”. yể­galactosidase được 
nhốt trong gel đồng polymer hóa N­isopropylacrylamide và acrylamide có hiệu quả  trong quấ 
trình thủy phân lactose ờ  5°c cho quấ trình sản xuất sửa nghèo lactose. Mô hình động học sử 
dụng cho enzym yổ­galactosidase từ K. lactis cũng được khảo sất. Enzym cố định có thể hoạt 
động ở nhiệt độ thấp và áp dựng được cho sản xuất các sản phẩm sữa đông lạnh, ngăn chặn  
sự kết tinh của lactose, tăng khả  năng tiêu hóa và tạo hưcmg vi cho sản phẩm sữa.  Enzym ß­  
galactosidase từ  K. lactỉs cố định trên vải cotton sử  dụng glutaraldehyde làm tác nhân liên kết 
chéo được dùng để  thủy phân lactose toong sữa nguyên kem và chuyển đổi được 95% lactose 
trong 2h toong thiết bị phản ứng gián đoạn, và khi được cố định bằng hên kết cộng hóa trị với  
polysiloxane­polyvinyl alcohol, sử  dụng glutaraldehyde như là tác nhân liên kết chéo cho thấy 
độ  hoạt động cao hon và độ   ổn định nhiệt cao hon so với  enzym hòa tan. Vì thế  enzym này 
được sử dụng có hiệu quả  trong thủy phân lactose từ sữa. yổ­galactosidases từ  K. lactìs cũng 
được cố định trên viên nang LentiKats polyvinylalcohol hydrogel dạng thấu kính được
dụng để  sản xuất D­galactose từ  lactose (200 g. L_1) trong một quá trình gián đoạn vừa đường 
/V

~


Ch??ng 2: ?ng d?ng

?? ?n m ?n h?c

hóa vừa lên men đồng thời.
yổ­galactosidase từ  A. oryzae cố định trên chất mang concanavalin A­cellulose được sử 
dụng để thủy phân liên tục lactose từ whey và sữa. Người ta nhận thấy rằng pH tối ưu của enzym 
hòa tan và  enzym cố  định là 4.8 nhưng nhiệt độ  tối  ưu tăng từ  50°c  lên 60°c đối với enzym  cố 
định. Enzym cố định có sự  ổn định nhiệt cao hơn  ở   60°c. Gần đây thiết bị phản  ứng  packed bed 
cùng với tế bào có tính thấm được nhốt  ừong alginate được sử dụng để  thủy phân lactose trong 
sữa trong hệ thống liên tục, đạt hiệu suất 87.2%.  ß­ galactosidase từ A. oryzae được cố định bằng 

3 kĩ thuật khấc nhau: hấp phụ trên celite, hên kết cộng hóa trị với chitosan, hoặc kết họp lại với  
nhau bằng liên kết chéo. Các chế phẩm enzym cũng được so sánh với nhau về hiệu suất cố định, 
đặc tính của enzym, độ ổn định, và hiệu quả tổng hợp oligosaccharide. Các enzym ß­galactosidase 
được kết họp lại với nhau bằng hên kết chéo được cho là có hiệu quả  trong việc thủy phân  
lactose, đạt hiệu suất 78% trong 12h. ß­ galactosidase từ  A. oryzae được cố  định trên silica, hoạt 
tính cũng như  độ   ổn định của enzym đã được thẩm định, và kết quả  cố  định tốt nhất thu được 
bằng cấch sử  dụng glutaraldehyde như  chất hỗ  trợ  hoạt hóa và  ổn định cho   enzym.  Trong các 
phương pháp xử  lí whey khác nhau (vi lọc, siêu lọc, xử  lí nhiệt), siêu lọc được xem là phương 
pháp tốt nhất đối với dung dịch cơ chất để cho vào thiết bị phản ứng.
Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng các kỹ thuật cổ định khác nhau
Nguồn vsv

Hiệu su
Thòi gian th
ất 
ủy phân

Tác nhân cố định

thủy phân
75%

Fungal galactosỉdase Polyvinyl­alcohol
E. coli
K. lactis
K. fragilis
K. lactis

Polyacrylamide gel

47%

Thiosulfinate/thiosulfonae

85%­90%

Cellulose beads
Cotton fabric

>90%
95%

Fungal ß­galactosidase Hydrogels
K. marxianus
Calcium alginate

70%­75%
84.8%

A. oryzae

5­6 h
6 h
2.5 h
5 h
2 h
7 h
2.5 h

89%

3 h

>80%

2 h

Concanavalin   A   layered   calcium 
alginate­starch hybrid
Bacillus stearothermophilus
Chitosan
2.I.I.42.Tổng hợp Galacto­Oligosaccharides (GOSs) [2]
Bên cạnh hoạt động thủy phân, enzym yổ­galactosidase còn có tác dụng chuyển nhóm
bằng cách thủy phân và sản xuất ra nhiều  oligosaccharide, các oligosaccharide tác dụng có lợi cho 
các vi sinh vật có ít trong đường ruột. Hơn nữa, phản ứng chuyển nhóm có thể được dùng để gắn  
/V


Ch??ng 2: ?ng d?ng

?? ?n m ?n h?c

galactose vào họp chất hóa học khác, kết quả  tạo thành galacto­oligosaccharide. Do đó cho thấy  
tiềm năng trong việc sản xuất các thành phần thực phẩm, dược phẩm, và các họp chất có hoạt  
tính sinh học khác. Các điều kiện của phản  ứng chuyển nhóm galactose nên có nồng độ  lactose 
cao, nâng nhiệt độ và giảm hoạt độ nước trong môi trường phản ứng. Nhiệt độ, nồng độ cơ chất  
và nguồn gốc enzym đóng vai  ữò quan ừọng trong việc tổng họp oligosaccharide. Tuy nhiên  ảnh 
hưởng của nồng độ lactose ban đầu thì lớn hơn. Nói chung với nồng độ   lactose ban đầu càng cao 
thì càng nhiều galacto­oligosaccharide được tổng họp. Nhiệt độ  cao cũng có thể  làm tăng hiệu  
suất tổng họp oligosaccharide. Hiệu suất cao hơn  ở nhiệt độ  cao hơn là một lợi thế  bổ  sung khi 

tiến hành phản  ứng  ở  nồng độ  lactose ban đầu cao. Do đó, enzym  p­galactosidase nên được  ổn 
định ờ nhiệt độ cao hàm lượng nước thấp để làm cho hoạt động chuyển nhóm galactose tăng lên.
Việc tổng họp galacto­oligosaccharide bằng yổ­galactosidase t ừ  A. oryzae được tối ưu hóa 
bởi nồng độ  lactose, enzym, ti lệ  cơ  chất. Trong quá trình sản xuất gián đoạn liên tiếp galacto­
oligosaccharide, hiệu quả  xúc tác tăng lên 190% đối với enzym tự  do trong dung dịch, và 8500g 
galacto­oligosaccharide trên lg enzym  được sản xuất trong 10 đợt.  Enzym  P­ galactosidase từ  A.  
oryzae được cố  định trên Fe304­chitosan cho kết quà hiệu suất tổng họp galacto­oligosaccharide  
cao nhất là 15,5%. Việc tổng họp galacto­oligosaccharide sử d ụng  ịì­ galactosidase từ A. oryzae cố 
định   trên   polysiloxane­polyvinyl  alcohol  (mPOS­PVA)   đã   được   thực   hiện.   Lượng   galacto­
oligosaccharide đạt được khoảng 26% (w/v) so với lượng đường tổng, có khoảng 55%  lactose 
được   chuyển   đổi   từ   dung   dịch   có   nồng   độ  lactose  là   50%   (w/v)   ờpH   4,5   và   nhiệt   độ  40°c. 
Trisaccharides chiếm hơn 81% tổng lượng GOS được sản xuất. Việc hình thành GOS không bị 
ảnh hưởng đáng kể bởi nhiệt độ và pH.
Hệ thống enzym cố định dùng polyethyleneimine, ghỉtaraldehyde, và cotton được nghiên 
cứu và so sánh sự  sản xuất galacto­oligosaccharide trong hệ  thống siêu lọc  enzym  tự  do và hệ 
thống sử dụng enzym cố định. Trong quá trinh cố định sử dụng kết họp PEI và GA, người ta nhận  
thấy khoảng 50% đến 90% enzym bị  hoạt hóa. Hệ  thống enzym tự  do và enzym cố  định tương 
đương cho thấy quá trình sản xuất GOS rất giống nhau, xấp xỉ 22% (w/v) và 20% (w/v) trong thời  
gian khoảng 15 ­ 17 phút, và chuyển đổi được 50% lactose.

/V

~


Ch??ng 2: ?ng d?ng

?? ?n m ?n h?c

P­galactosidase   tinh   khiết   từ   Buttera  singularis  ATCC   24193   được   cố   định   trên   hạt  

Chitopearl  BCW  3510 được sử  dụng cho phản  ứng tổng họp galacto­oligosaccharide (GOSs)   từ 
lactose trong thiết bị phản ứng packed bed, kết quả tổng họp được 55% GOS với năng suất 4.4 g/
(L­h) hoạt động trong 15 ngày. Năng suất GOS đạt cao nhất khi nồng độ   lactose ban đầu là 27% 
(w/w), 50% lactose được chuyển đổi với nồng độ  ban đầu là 500 g/L. Trisaccharides là một sản 
phẩm được tạo ra nhiều nhất, chiếm hơn 70% tổng lượng GOS được tạo ra. yổ­galactosidase từ 
A. oryzae được cố  định trên hạt chitosan tạo ra lượng trisaccharides cao nhất (17,3% trong t ổng  
lượng đường), sử dụng 20% (w/v) lactose trong vong 2h so với đối với enzym tự do và 4,6 % đối 
với tập họp enzym có liên kết chéo.
2.12.Enzym lipase
2.1.21.Giói thiệu về enzym lipase
Lipase (EC 3.1.1.3) là một họ  các enzym mà trong môi trường tự nhiên chúng xúc tác cho 
các phản ứng thủy phân chất béo. Tuy nhiên, trong các điều kiện phản ứng phù họp lipase còn cho 
thấy khả năng xúc tác các phản ứng ester hóa, chuyển ester và phản ứng alcoholysis [4].
Sự  phát triển nhanh chóng của công nghệ  enzym  đã mang lại sự  quan tâm đáng kể  đến 
việc  ứng dụng  enzym lipase  trong ngành công nghiệp dầu béo. Cấc phản  ứng sử  dụng   enzym 
lipase mang lại nhiều lợi thế hơn các phản ứng hóa học thông thường. Lipase có thể sử dụng một 
cách có hiệu quả và kinh tế trong điều kiện ôn hòa. Đây là đặc điểm quan trọng bởi vì điều kiện  
khắc nghiệt sẽ gây ra cấc phản  ứng trùng họp chất béo và sinh ra nhiều sản phẩm phụ. Do đó,  
việc sử dụng lipase sẽ làm giảm nhu cầu loại bỏ cấc họp chất màu và các sản phẩm phụ bằng 
cách phương pháp tốn kém năng lượng [3].
Tuy nhiên, việc ứng dụng enzym lipase vẫn còn nhiều trở ngại do chi phí cao. vấn đề này  
có thể được khắc phục bằng cách sử dụng enzym cố định, khi đó enzym lipase có thể được tái sử 
dụng dễ dàng và qui trình sản xuất có thể được vận hành liên tục [3].
2.1.22.Nguồn thu nhận enzym lipase
Enzym lipase thương mại thường được thu nhận từ động vật (tuyến tụy hoặc dạ dày của 
động   vật   nhai   lại)   hoặc   từ   nấm   sợi   như   (Pénicillium  spp.,  Aspergillus  spp.,  Rhizopus  spp., 
Rhizomucor  spp., Mucor spp.  or Candida spp...). Enzym  lipase  từ  động vật có tính đặc hiệu cao 
trong việc giải phóng các acid béo ở vị trí số 1 và số 3 trong phân tử   triglyceride, trong khi đó các 
lipase từ nguồn vi sinh vật có khả năng hoạt động và tính đặc hiệu rộng hơn [5].

/V