Bước đầu chuyển gen Bt vào cây mía (Saccharum officinarum L.)

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179

BƯỚC ĐẦU CHUYỂN GEN Bt VÀO CÂY MÍA (Saccharum officinarum L.)
Phan Tường Lộc*, Hoàng Văn Dương, Mai Trường, Lê Tấn Đức, Trần Thị Ngọc Hà,
Văn Đắc Thành, Phạm Đức Trí, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Hữu Hổ
Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)
TÓM TẮT: Nhóm sâu đục thân là một trong những loài sâu hại làm giảm năng suất đáng kể cho mía.
Việc phun thuốc bảo vệ mía gặp một số trở ngại do mật độ mía ở ruộng rất dày, lá mía sắc và sâu đục thân
lại sống bên trong thân mía. Chuyển gen kháng sâu (Bt- tổng hợp) cry1Ab và cry1B-cry1Ab (gen lai) vào
hai giống mía VN 84 4137 và Suphanbury 7 nhằm mong muốn tạo ra các giống mía có khả năng kháng
sâu hiệu quả, chủ yếu là sâu đục thân. Hai dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được biến nạp
các plasmid mang gen cry1Ab và gen cry1B-cry1Ab dùng để chuyển gen vào thực vật. Khảo sát các điều
kiện nuôi cấy mô mía cho thấy, khi nuôi cấy tạo mô sẹo từ mảnh lá non ở lõi ngọn mía ex vitro, tỉ lệ tạo
mô sẹo cao nhất của giống VN84 4137 trên môi trường có 2,4-D ở nồng độ 3 mg/l là 93,33%, trong khi
của giống Suphanbury 7 ở nồng độ 2 mg/l là 96,67%. Tỉ lệ mô sẹo tái sinh chồi cao nhất trên môi trường
có tổ hợp BAP 2 mg/l và NAA 1 mg/l là 100% ở cả hai giống. Bước đầu chuyển gen cry1Ab và cry1Bcry1Ab gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào mía đã thu được các khối mô sẹo có biểu
hiện GUS và kháng chất chọn lọc phosphinothricin ở nồng độ 3 mg/l, là nồng độ gây chết khi khảo sát khả
năng chống chịu phosphinothricin ở mô sẹo không chuyển gen.
Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Bt, chuyển gen, sâu đục thân cây mía.
MỞ ĐẦU

Hơn một thập niên qua, ngành mía đường
Việt Nam vẫn luôn gặp khó khăn do nguồn
nguyên liệu mía cung cấp không đủ để sản xuất.
Với nhu cầu ngày càng tăng, và theo dự kiến
của ngành, đến năm 2020 cả nước sẽ đạt mức
tiêu thụ đường 2 triệu tấn/năm [25], việc bảo
đảm sản lượng mía đáp ứng đủ và ổn định cho
sản xuất là vấn đề cần thiết.
Một trong những nguyên nhân làm giảm sản
lượng mía là do sâu hại, trong đó, nhóm sâu đục

thân thuộc bộ Cánh vảy (Lepidoptera) có thể
gây thiệt hại có thể lên đến 30% [14, 24]. Ứng
dụng chuyển gen Bt là một giải pháp tiềm năng
để tạo ra được các giống mía có khả năng kháng
các loại sâu đục thân [3, 9, 18, 21], mà tập tính
sống của chúng thường gây khó khăn cho việc
xử lý bằng hóa chất [14].
Độc tố kháng côn trùng từ Bacillus
thuringiensis (Bt) là các độc tố crystal viết tắt là
Cry do các gen cry mã hóa [20]. Độc tố Cry
được phân loại dựa trên cơ sở đồng dạng của
trình tự amino acid của tiền độc tố. Các protein
tiền độc tố với ít hơn 45% sự đồng nhất trình tự
sẽ có hệ số khác nhau trong dãy phân hạng đầu
tiên (ví dụ Cry1, Cry2) và ở mức dưới 78% và
95% đồng dạng sẽ thiết lập ranh giới cho các
dãy phân hạng thứ hai và thứ ba (ví dụ Cry1Ab)
170

[12]. Tính đặc hiệu và hoạt tính của độc tố Cry
là kết quả của sự tương tác và ly giải của tiền
độc tố bên trong hệ thống tiêu hóa của từng loài
côn trùng cụ thể [12]. Do biến nạp vào thực vật
dùng các gen cry đơn, nguyên bản cho biểu hiện
độc tố không cao trong giai đoạn ban đầu,
nghiên cứu chuyển gen Bt đã có những cải tiến
trong giai đoạn sau này. Các gen cry được tổng
hợp có nhiều thay đổi trình tự so với nguyên
bản, như giảm các thành phần A, T, tăng tỷ lệ C
+ G, để thích hợp biểu hiện cao ở thực vật [5,

9]; hoặc áp dụng mô hình hiệu quả quy tụ
(pyramiding) để tạo hiệu quả kháng sâu cao khi
lai các gen cry có tác động khác nhau lại và
đồng chuyển vào thực vật [9].
Theo các công bố, gen cry1Ab có tính kháng
chủ yếu với côn trùng thuộc bộ Lepidoptera [1,
2, 6, 12] và cry1B có tính kháng kép trên
Lepidoptera và Coleoptera [5, 12]. Protein lai
Cry1B-Cry1Ab có thể tạo hiệu ứng kháng hiệu
quả hơn đối với Lepidoptera và cả Coleoptera
[4].
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu
Giống mía: Hai giống mía được dùng để
chuyển gen là Suphanbury 7 (Thái Lan) và
VN84 4137 (Việt Nam), được cung cấp bởi


Phan Tuong Loc et al.
Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Mía
Đường, xã Phú An, huyện Bến Cát, tỉnh Bình
Dương.
Chủng vi khuẩn: Chủng vi khuẩn E. coli
mang plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab và
chủng E. coli DH5α. Chủng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens EHA 105 có mang
sẵn helper plasmid chứa các gen vir và gen
kháng kháng sinh rifampicin.
Plasmid: Plasmid pCRY1B-1Ab, kích thước

khoảng 17 kb, mang tổ hợp gen Pubi/cry1Bcry1Ab/Tnos (cry1B-cry1Ab: gen lai - tổng hợp)
và gen chọn lọc P70S/bar/T35S trong T-DNA
A
B

KaR

LB

LB

T35S

bar

T35S

bar

P35S

P70S

PUbi

biểu hiện ở thực vật, và gen nptII kháng
kanamycin biểu hiện ở vi khuẩn. Gen bar quy
định tính kháng phosphinothricin (PPT) dùng để
chọn lọc đối tượng chuyển gen (hình 1A).
Plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab, có kích

thước 15,6 kb, từ plasmid pCAMBIA3301 được
chèn thêm tổ hợp gene Pubi-1/cry1Ab/Tnos
trong TDNA (Pubi : maize ubiquitin-1 (Ubi-1)
promoter, Tnos: nopaline synthase (NOS)
terminator, cry1Ab: gen tổng hợp) (hình 1B).
Các gen cry1Ab, cry1B-cry1Ab có nguồn gốc
từ Altosaar I. (Canada), chương trình trao đổi
khoa học.
cry1Ab

Tnos

cry1Ab

Tnos

cry1B

P35S

5'UTR Ubi

gus

Tnos

PUbi

RB

RB

KaR

Hình 1. Sơ đồ plasmid
A. Plasmid pCRY1B-1Ab; B. Plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab

Môi trường
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn gồm môi
trường LB (Luria-Bertani) dùng nuôi cấy và giữ
giống E. coli và Agrobacterium tumefaciens;
môi trường AB (Chilton) dùng để chuyển gen.
Môi trường nuôi cấy thực vật gồm môi
trường khoáng cơ bản MS, vitamin MS, vitamin
B5, đường 30 g/l, pH 5,8; chất điều hòa sinh
trưởng BAP, NAA.
Phương pháp
Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli bằng
xung điện
Biến nạp được thực hiện bằng xung điện
trên máy BTX ECM 830 ở 2500 V, 40 uF, 5 ms,
cuvette 2 mm. Vi khuẩn sau khi biến nạp được
chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung
kanamycin 100 mg/l và được ly trích plasmid
để kiểm tra đặc điểm, kích thước bằng enzyme
cắt giới hạn HindIII [8, 15].
Biến nạp plasmid vào vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens
Biến nạp được thực hiện bằng phương pháp
CaCl2 nhiệt. Vi khuẩn sau khi biến nạp được

cấy chọn lọc trên môi trường có bổ sung
rifampicin 100 mg/l và kanamycin 100 mg/l.
Theo dõi kết quả sau 24-48 giờ [10, 11, 16].

Kiểm tra sự hiện diện của các gen cry1Ab và
gen cry1B-cry1Ab bằng phương pháp PCR
Đối với gen cry1Ab, trình tự mồi xuôi là
(F): 5’-TTC CT T GGA CGA AAT CCC ACC3’ và mồi ngược là (R): 5’-GCC AGA ATT
GAA CAC ATG AGC GC-3’ kích thước đoạn
khuếch đại tương ứng 559 bp. Đối với gen
cry1B-cry1Ab, trình tự mồi xuôi là (F): 5’-GAT
AGC AGG ACC TAT CCA AT-3’ và mồi
ngược là (R): 5’-GCC GAA GAG GGA GGC
GTC AA-3’, kích thước đoạn khuếch đại tương
ứng là 0,5 kb. Chương trình nhiệt phản ứng
PCR: 94oC/4 phút (94oC/30 giây, 50-54oC/1
phút, 72oC/30-90 giây), 72oC/10 phút, với 35
chu kỳ. Hỗn hợp các thành phần của phản ứng
PCR gồm có 5 l buffer PCR 5X, 0,5 l dNTP
10 mM, 0,25 l taq polymerase 5 U/l, 2 l mồi
xuôi 1 M, 2 l mồi ngược 1 M, 1 l DNA
plasmid, thêm nước cất đủ thể tích 25 l [7].
Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D lên quá trình tạo
mô sẹo từ lá non
Phần lõi lá non bên trong ngọn mía, thường
ở tình trạng vô trùng, được cắt thành các khoanh
dày 2 mm và tách các lớp lá để nuôi cấy trên
môi trường tạo mô sẹo gồm thành phần khoáng
MS, vitamin MS, casein 0,5 g/l và agar 10 g/l,
có bổ sung 2,4-D ở các nồng độ khác nhau

171


TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179

(0; 1; 2; 3; 4 mg/l) để đánh giá ảnh hưởng của
2,4-D lên quá trình tạo mô sẹo của mẫu [19].
Khảo sát ảnh hưởng của BAP và NAA lên quá
trình tái sinh chồi từ mô sẹo
Mô sẹo sau thời gian nuôi sẽ được cho tái
sinh chồi trên môi trường có thành phần khoáng
MS, vitamin B5, bổ sung tổ hợp chất điều hòa
sinh trưởng BAP (1; 2 mg/l) NAA (0,2; 0,5; 1
mg/l) [23].
Khảo sát ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT lên
sự phát triển mô sẹo, cây con in vitro
Nuôi cấy tạo mô sẹo và nuôi cấy cây con
trên môi trường có bổ sung PPT ở các nồng độ
khác nhau (0; 1; 2; 3; 4; 5 mg/l) vào môi trường,
để đánh giá ảnh hưởng của PPT lên sự phát
triển của mô sẹo và cây con [13].
Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens và chọn lọc
mô chuyển gen
Vi khuẩn A. tumefaciens được nuôi cấy lắc
qua đêm ở 28oC trong môi trường LB có bổ
sung kháng sinh kanamycin 100 mg/l và
rifampicin 50 mg/l, sau đó, được ly tâm lấy
sinh khối ở 4000 g, trong 5 phút và chuyển sang
nuôi mới trong môi trường AB ở các điều kiện

như trên có bổ sung thêm acetocyringone 200
M trong 1 giờ. Mô sẹo được để khô bớt độ ẩm
trong tủ cấy vô trùng khoảng 30 phút, rồi ngâm
10 phút trong dịch vi khuẩn ở điều kiện áp suất
thường, sau đó đưa vào điệu kiện chân không 50 kPa trong 3 phút rồi đưa trở lại môi trường
áp suất thường 5 phút, trước khi được mang ra
thấm khô và chuyển sang ủ chung với vi khuẩn
trên môi trường tạo mô sẹo, khoảng 2-3 ngày.
Mô sẹo sau đó được rửa sạch bằng dung
dịch kháng sinh cefotaxime 500 mg/l để diệt
khuẩn Agrobacterium tumefaciens, rồi chuyển
sang chọn lọc mô chuyển gen trên môi trường
tạo mô sẹo, có bổ sung cefotaxime ở nồng độ
500 mg/l và PPT ở nồng độ ngưỡng gây chết
[17].
Khảo sát sự biểu hiện của gen chỉ thị gus bằng
kỹ thuật hóa mô [13]
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Biến nạp tạo chủng vi khuẩn E. coli chứa
vector plasmid pCRY1B-1Ab
172

Để có thể lưu giữ và nhân bản, plasmid
pCRY1B-1Ab được biến nạp vào dòng E. coli
DH5 bằng phương pháp xung điện. Vi khuẩn
sau khi chuyển gen được cấy trải để chọn lọc
trên môi trường LB rắn có bổ sung kanamycin
100 mg/l. Sau 2 ngày, nhận được khoảng 70
khuẩn lạc mọc trên đĩa petri nuôi cấy, được giả

định đã biến nạp plasmid pCRY1B-1Ab, trong
khi ở đĩa đối chứng nuôi cấy vi khuẩn E. coli
DH5 không biến nạp, không có khuẩn lạc nào
xuất hiện.
Các khuẩn lạc giả định biến nạp plasmid
được chọn và nuôi cấy trong môi trường LB
lỏng có bổ sung kanamycin 100 mg/l để tách
plasmid và phân tích.
Plasmid sau khi tách chiết, được cắt bằng
enzyme giới hạn HindIII và điện di kiểm tra
trên gel agarose, cho thấy có 1 băng DNA 17 kb
phù hợp với kích thước plasmid pCRY1B-1Ab
chứng tỏ các dòng E. coli DH5 đã được biến
nạp plasmid pCRY1B-1Ab (hình 2).
L

1
17 kb

Hình 2. Kiểm tra plasmid cry1B-cry1Ab sau khi
biến nạp vào dòng vi khuẩn E.coli DH5
L. Thang chuẩn DNA -HindIII; 1. Plasmid kiểm tra
được cắt bằng enzyme HindIII có kích thước khoảng
17 kb.

Biến nạp tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens mang plasmid pCAMBIA3301cry1Ab và dòngvi khuẩn A. tumefaciens
mang plasmid pCRY1B-1Ab
Hai dòng E. coli mang plasmid
pCAMBIA3301-cry1Ab và pCRY1B-1Ab được

nhân lên và tách plasmid. Biến nạp plasmid
pCAMBIA3301-cry1Ab và pCRY1B-1Ab vào


Phan Tuong Loc et al.
vi khuẩn Agrobacterium tumefacien EHA 105
được thực hiện bằng phương pháp xử lý nhiệt
với CaCl2.
Vi khuẩn sau khi biến nạp được cấy chọn
lọc trên môi trường LB rắn có bổ sung
kanamycin 100 mg/l và rifampicin 100 mg/l (hệ
thống binary vector) ở 28oC. Sau 2 ngày, trên
các đĩa nuôi cấy xuất hiện khoảng 20 khuẩn lạc
Agrobacterium tumefaciens EHA 105 giả định
đã biến nạp plasmid.
Tách khuẩn lạc và kiểm tra sự có mặt của
các gen cry1Ab và cry1B-cry1Ab trong cấu trúc
bằng phương pháp PCR với các mồi đặc hiệu.
Kết quả biểu hiện trên gel agarose với marker
1 kb cho thấy, ở dòng A. tumefaciens biến
nạp plasmid pCAMBIA-Cry1Ab và dòng
A. tumefaciens biến nạp plasmid pCRY1B-1Ab,
sản phẩm PCR từ các plasmid được tách đều có
băng khuếch đại của gen cry1Ab giống với đối
chứng dương
(được khuếch đại từ
pCAMBIA3301-cry1Ab của E. coli), phù hợp
với trình tự mục tiêu là 559 bp (hình 3). Trong
khi đó ở dòng A. tumefaciens biến nạp
pCRY1B-1Ab còn có thêm băng khuếch đại

trình tự đặc hiệu của đoạn DNA cry1B-cry1Ab
giống với đối chứng dương (được khuếch đại từ
pCRY1B-1Ab của E. coli) phù hợp với trình tự
mục tiêu là khoảng 0,5 kb (hình 4).
L

PC H2O 1

500 bp

Hình 3. Kết quả kiểm tra bằng PCR sự hiện diện
gen cry1Ab trên các plasmid của vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens.
L. Thang chuẩn DNA 1 kb; PC. Băng DNA 559 bp
được khuếch đại từ vi khuẩn E. coli mang
pCAMBIA3301-cry1Ab; 1. Băng DNA 559 bp được

khuếch đại từ vi khuẩn A. tumefaciens biến nạp
pCAMBIA3301-cry1Ab; 2. Băng DNA 559 bp được
khuếch đại từ vi khuẩn A. tumefaciens biến nạp
pCRY1B1Ab.

L
2

PC H2O

1

559 bp

Hình 4. Kết quả kiểm tra bằng PCR sự hiện diện
của gen cry1B-cry1Ab trên plasmid của vi
khuẩn A. tumefaciens bằng PCR.
L. Thang chuẩn DNA 1 kb; PC. Băng DNA 0,5 Kb
được khuếch đại từ vi khuẩn E. coli mang pCRY1BAb; 1. Băng DNA 0,5 Kb được khuếch đại từ vi
khuẩn A. tumefaciens biến nạp pCRY1B-1Ab.

Như vậy, dòng vi khuẩn A. tumefaciens EHA
105 biến nạp plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab
và dòng vi khuẩn A. tumefaciens EHA 105 biến
nạp plasmid pCRY1B-1Ab đã được thực hiện
thành công và có thể dùng để chuyển gen vào
thực vật.
Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D lên quá trình
tạo mô sẹo của mô lá
Mô lá non mía được nuôi cấy trên môi
trường tạo mô sẹo có bổ sung chất điều hòa sinh
trưởng 2,4-D ở các nồng độ khác nhau. Mô sẹo
bắt đầu hình thành sau 12 ngày ở các mép mô.
Mô sẹo của giống Suphanbury 7 mềm và ướt
hơn ở giai đoạn đầu, màu sắc khối mô vàng nhạt
hơn so với giống VN84 4137 (hình 5). Sau 28
ngày, tỉ lệ mô sẹo hình thành khác biệt rõ rệt
nhất giữa các công thức. Công thức với nồng độ
2,4-D 3 mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo cao nhất
ở giống VN84 4137 và 2,4-D 2 mg/l ở giống
Suphanbury 7 (bảng 1). Tiếp tục nuôi cấy
khoảng 1,5 tháng, mô sẹo phát triển thành các
khối mô chắc, có bề mặt căng láng (hình 6).

173


TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179

Bảng 1. Kết quả tạo mô sẹo của giống VN84 4137 và giống Suphanbury 7 trên môi trường MS có
bổ sung nồng độ 2,4-D khác nhau
Công thức
thí nghiệm
1
2
3
4
5

2,4-D (mg/l)
0
1
2
3
4

Tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo
ở giống VN84 4137 (%)
0a
40 b
76,67 c
93,33 d
63,33 e

Tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo ở
giống Suphanbury 7 (%)
0 a
76,66 bd
96,67 c
80 bd
66,67 bde

Các giá trị trung bình không theo cùng nhóm có mẫu chữ giống nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở
mức p = 0,01 dựa theo kiểm định thống kê LSD.

Giống VN84 4137

Giống Suphanbury 7

Hình 5. Khối mô sẹo phát sinh từ mô lá non mía sau
khoảng 20 ngày nuôi cấy
Các khối mô này được mang đi tái sinh trên
môi trường MS có bổ sung các tổ hợp chất điều
hòa sinh trưởng BAP và NAA khác nhau. Sau 1
tuần, chồi có dấu hiệu hình thành. Số liệu được
lấy ở các công thức đạt tỷ lệ tạo chồi tuyệt đối
sau 21 ngày.
Kết quả kiểm tra ở ngày 21 cho thấy, ở

Hình 6. Mô sẹo phát triển hình thành
các khối tế bào có khả năng tái sinh

công thức gồm tổ hợp NAA 1 mg/l và BAP 2

mg/l có 100% mẫu tạo chồi ở cả hai giống mía,
số lượng chồi trên mẫu nhiều, chồi có hình dạng
bình thường. Các công thức khác cũng hình
thành chồi nhưng chậm hơn, số lượng ít hơn và
các chồi có hình dạng không đồng đều trên cùng
khối mô hoặc dị dạng (bảng 2, hình 7).

Bảng 2. Kết quả tái sinh chồi của giống mía VN84 4137 và giống Suphanbury 7 trên môi trường
MS có bổ sung các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và NAA khác nhau
Công
Tỷ lệ mô sẹo hình thành chồi
Tỷ lệ mô sẹo hình thành chồi trên
BAP
NAA
thức
trên một nghiệm thức ở giống
một nghiệm thức ở giống
(mg/l) (mg/l)
TN
VN84 4137 (%)
Suphanbury 7 (%)
1
0
0
13,33 a
0 a
2
1
0,2
80,00 cd

60,00 c
3
1
0,5
86,67 de
73,33 cd
4
1
1
53,33 b
40,00 b
5
2
0,2
80,00 cd
80,00 d
6
2
0,5
66,67 bc
86,67 de
7
2
1
100 e
100 e
Các giá trị trung bình không theo cùng nhóm có mẫu chữ giống nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở
mức p = 0,01 dựa theo kiểm định thống kê Duncan.

174

Phan Tuong Loc et al.

VN84 4137
Suphanbury 7
Hình 7. Chồi giống VN84 4137 và Suphanbury 7 hình thành từ mô sẹo
trên môi trường có các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP 2 mg/l và NAA 1 mg/l
Nghiên cứu ảnh hưởng của PPT lên khả năng
phát triển mô sẹo, cây con in vitro
Mô sẹo sau một tháng nuôi cấy của cả hai
giống mía VN84 4137 và Suphanbury 7 được
chuyển sang môi trường có bổ sung PPT ở các
nồng khác nhau. Từ nồng độ 1 mg/l các khối
mô sẹo bắt đầu chuyển sang màu vàng đậm hơn
do tích tụ ammonia sau 2 tuần. Ở nồng độ 3
mg/l tất cả các mô sẹo hóa nâu đen và chết ở cả

VN84 4137

hai giống mía sau một tháng, trong khi ở các
nồng độ cao hơn thời gian chết trong khoảng 12 tuần (hình 8).
Các cây mía con in vitro của cả hai giống
mía VN84 4137 và Suphanbury 7 được nuôi
cấy trên môi trường MS có bổ sung PPT ở các
nồng độ khác nhau như trên. Sau 10 ngày, ở
nồng độ PPT từ 3 mg/l, các cây con đều vàng lá
và chết dần (hình 9).

Suphanbury 7

Hình 8. Ảnh hưởng của PPT ở nồng độ 3 mg/l gây chết mô sẹo

PPT 2 mg/l

PPT 3 mg/l

Hình 9. Ảnh hưởng của PPT ở các nồng độ khác nhau
đối với sự phát triển của cây mía con VN84 4137 in vitro

175


TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179

Bước đầu chuyển gen mô sẹo mía thông qua
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Mô sẹo mía sau 1 tháng nuôi cấy trên môi
trường có 2,4-D ở 3 mg/l cho giống VN84 4137
và 2 mg/l cho giống Suphanbury 7 có hình thái
đồng nhất sẽ được xử lý chuyển gen với hai
dòng vi khuẩn A.tumefaciens mang plamid
pCAMBIA3301-cry1Ab và pCRY1B-1Ab. Các
mô sẹo được tiếp tục nuôi cấy chọn lọc trên môi
trường tạo mô sẹo có bổ sung PPT 3 mg/l. Sau 2

VN84 4137

tuần chuyển gen, nhuộm sơ bộ một số cụm mô
chuyển gen với plasmid pCAMBIA3301cry1Ab trong dung dịch X-Gluc thu được các

mô có màu xanh dương đậm đặc trưng, có thể
giả định các mô này đã được chuyển gen và có
biểu hiện GUS (hình 10). Sau 4 tuần hầu hết các
mô sẹo nâu hóa và chết, một số cụm mô nhỏ có
khả năng sống trên PPT ở nồng độ 3 mg/l tiếp
tục phát triển mô mới. Số lượng mô kháng được
PPT 3 mg/l khoảng từ 2-4% mẫu chuyển gen
(bảng 3, hình 11).

Suphanbury 7

Hình 10. Mô sẹo chuyển gen plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab biểu hiện
gen gus khi nhuộm trong dung dịch X-Gluc

Giống VN84 4137 pCAMBIA3301-cry1Ab

Giống Suphanbury 7 pCRY1B-1Ab

Giống Suphanbury 7 pCAMBIA3301-cry1Ab

Giống VN84 4137 pCRY1B-1Ab

Hình 11. Mô sẹo chuyển gen được chọn lọc trên môi trường tạo mô sẹo
176


Phan Tuong Loc et al.
Bảng 3. Tỷ lệ mô sẹo phát triển trên môi trường chọn lọc PPT 3 mg/l sau 4 tuần chuyển gen
Giống VN84 4137
Giống Suphanbury 7

pCAMBIA3301-cry1Ab
2%
4%

Thảo luận
Suphanbury 7 và VN84 4137 là hai giống
mía có năng suất và hàm lượng đường cao, CCS
trên 11% đang được trồng nhiều trong các vùng
nguyên liệu mía. Việc có thể thích hợp nuôi cấy
in vitro, làm cơ sở cho các ứng dụng công nghệ
sinh học đối với hai giống mía này, mang ý
nghĩa thực tiễn cao.
Mô lá non tạo mô sẹo 93,33-96,67% trên
môi trường có bổ sung 2,4-D ở nồng độ 2-3
mg/l tương tự với nghiên cứu của một số tác giả
trước đây [2, 19, 23], các mẫu mô sẹo tái sinh
chồi đạt tỉ lệ 100% trên môi trường có bổ sung
BAP 2 mg/l và NAA 1 mg/l là các điều kiện
thuận lợi để ứng dụng chuyển gen.
Mô sẹo và cây mía con khá nhạy cảm với
PPT, là một chất chọn lọc mạnh, bị ức chế sinh
trưởng và chết ở nồng độ 3 mg/l, Điều này giúp
khả năng chọn lọc cây thuần cao, tuy nhiên, sẽ
khó nhân mô và tái sinh cây trong quá trình
chọn lọc.
Các dòng Agrobacterium tumefaciens sau
khi được biến nạp plasmid pCAMBIA3301cry1Ab và pCRY1B-1Ab được dùng để chuyển
gen vào hai giống mía. Kết quả bước đầu nhận
được các mô sẹo biểu hiện GUS ở hai giống mía

chuyển gen với plasmid pCAMBIA3301cry1Ab và các mô sẹo chuyển gen từ cả hai
plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab và pCRY1B1Ab có khả năng chống chịu và tiếp tục phát
triển trên môi trường có bổ sung PPT 3 mg/l,
điều này cho thấy, biến nạp gen từ
Agrobacterium vào mô sẹo mía đã được thực
hiện. Các mô sẹo chuyển gen sẽ được tiếp tục
chọn lọc và cho tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
KẾT LUẬN

Tạo được hai chủng Agrobacterium
tumefaciens dùng để chuyển gen mía, gồm
chủng chứa plasmid pCRY1B-1Ab và chủng
chứa plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab.
Xác định được nồng độ 2,4-D thích hợp

pCRY1B-1Ab
3%
3%

cảm ứng tạo mô sẹo ở giống mía VN84 4137 là
3 mg/l, Suphanbury 7 là 2 mg/l. Tổ hợp chất
điều hòa sinh trưởng cho tỉ lệ tái sinh chồi
100% từ mô sẹo ở hai giống mía VN84 4137 và
Suphanbury 7 cao nhất là BAP 2 mg/l, NAA 1
mg/l.
Xác định được nồng độ PPT gây chết mô
sẹo và cây con có thể dùng làm nồng độ bắt đầu
chọn lọc các đối tượng chuyển gen trong điều
kiện in vitro là 3 mg/l.
Bước đầu thu được 2-4% mô sẹo chuyển

gen giả định có biểu hiện gen gus và phát triển
tốt trên môi trường chọn lọc với PPT 3 mg/l.
Các mô chuyển gen giả định sẽ được tiếp
tục chọn lọc trên môi trường có bổ sung PPT ở
nồng độ cao hơn (5 mg/l) để chọn lọc mô và tái
sinh cây thuần. Cây chuyển gen sẽ được phân
tích bằng các kỹ thuật sinh học phân tử để xác
định đặc điểm di truyền và biểu hiện gen.
Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn
Bộ Khoa học và Công nghệ, Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ về kinh phí cho
công trình này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Arvinth
S.,
Selvakesavan
R.
K.,
Subramonian N., Premachandran M. N.,
2009. Transmission and expression of
transgenes in progeny of sugarcane clones
with cry1Ab and aprotinin genes, Sug Tech,
11(3): 290-295.
2. Arvinth S., Arun S., Selvakesavan R. K.,
Srikanth J., Mukunthan N., Ananda Kumar
P., Premachandran M. N., Subramonian N.,
2010.
Genetic
transformation

and
pyramiding
of
aprotinin-expressing
sugarcane with cry1Ab for shoot borer
(Chilo infuscatellus) resistance, Plant Cell
Rep., 29: 383-395.
3. Arencibia A. D., Vaquez R. I., Prieto D.,
Tellez P., Carmona E. R., Coego A.,
Hernandez L., de La Riva G. A., Housein G.
177


TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179

S., 1997. Transgenic sugarcane plants
resistant to stem borer attack. Mol. Breed, 3:
247-255.
4. Bano-Maqbool S., Riazuddin S., Loc N. T.,
Gatehouse A. M. R., Gatehouse J. A.,
Christou P., 2001. Expression of multiple
insecticidal genes confers broad resistance
against a range of different rice pests. Mol.
Breed, 7: 85-93.
5. Bohorova N., Frutos R., Royer M., Estanol
P., Pacheco M., Rascon Q., Mclean S.,
Hoisington D., 2001. Novel synthetic
Bacillus thuringiensis cry1B gene and the
cry1B-cry1Ab translational fusion confer
resistance to southwestern corn borer,

sugarcane borer and fall armyworm in
transgenic tropical maize. Theor. Appl.
Genet., 103: 817-826.
6. Braga D. P. V., Arrigoni E. D. P., SilviaFilho M. C., Ulian E. C., 2003. Expression
of the Cry1Ab protein in genetically
modified sugarcane for the control of
Diatraea
saccharalis
(Lepidoptera:
Crambidae). J. New Seeds, 5: 209-222.
7. Casali N., Preston A., 2003. Methods in
molecular Biology. E.coli plasmid vector.
Methods and applications, Humana Press,
235: 316.
8. Chassy B.M. and Flickinger J.L., 1987.
Transformation of Lacobacillus casei by
electroporation. FEMS Microbiol Lett, 44:
173-177.
9. Christou P., Capell T., Kohli A., Gatehouse
J. A., Gatehouse A. M. R., 2006. Recent
developments and future prospects in insect
pest control in transgenic crops. TRENDS
in Plant Science, 11(6): 302-308.
10. Cohen S. N., Chang A. C. Y., Hsu L., 1972.
Nonchromosomal antibiotic resistance in
bacteria:
genetic
transformation
of
Escherichia coli by R-factor DNA. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110-2114.
11. Dagert M., Erlich S. D., 1979. Prolonged
incubation in calcium chloride improves the
competence of Escherichia coli cells. Gene,
6: 23-28.
12. de Maagd R. A., Bravo A., Crickmore N.,
178

2001. How Bacillus thuringiensis has
evolved specific toxins to colonize the
insect world. TRENDS in Genetics, 17(4):
193-199.
13. Enriquez-Obregon G. A., 1998. Herbicideresistant sugarcane (Saccharum offcinarum
L.) plants by Agrobacterium-mediated
transformation. Planta, 206: 20-27.
14. Fauconnier R., 1993. Sugar
Macmillan Press Ltd, London, UK.

cane,

15. Fiedler S., Wirth R., 1988. Transformation
of bacteria with plasmid DNA by
electroporation. Anal. Biochem., 170: 3844.
16. Hanahan D., 1983. Studies on the
transformation of Escherichia coli with
plasmids. J. Mol. Biol., 166: 557-580.
17. Joyce P., Kuwahata M., Turner N.,
Lakshmanan P., 2010. Selection system and
co-cultivation medium are important
determinants of Agrobacterium-mediated

transformation of sugarcane. Plant Cell
Rep., 29: 173-183.
18. Kim S., Kim C., Li W., Kim T., Li Y., Zaidi
M. A., Altosaar I., 2008. Inheritance and
field performance of transgenic Korean Bt
rice lines resistant to rice yellow stem borer.
Euphytica, 164: 829-839.
19. Rashid H., Khan S. A., Zia M., Chaudhary
M. F., Hanif Z., Chaudary Z., 2009. Callus
induction and regeneration in elite
sugarcane cultivar hsf-240. Pak. J. Bot.,
41(4): 1645-1649.
20. Schnepf H. E., Crickmore N., Van Rie N.,
Dereclus J., Baum J., Feitelson J., Zeigler
D.R., Dean D. H., 1998. Bacillus
thuringiensis and its pesticidal crystal
proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62:
775-806.
21. Valderrama A. M., Velasquez N., Rodriguez
E., Zapata A., Zaidi M. A., Altosaar I.,
Arango R., 2007. Resistance to Tecia
solanivora (Lepidoptera : Gelechiidae) in
three transgenic Andean varieties of potato
expressing Bacillus thuringiensis Cry1Ac
protein. J. Econ. Entomol., 100: 172-179.


Phan Tuong Loc et al.
22. Weng L. X., Deng H., Xu J. L., Wang L. H.,
Jiang Z., Zhang H. B., Li Q., Zhang L. H.,

2006. Regeneration of sugarcane elite
breeding lines and engineering of stem borer
resistance. Pest Manage Sci., 62:178-187.
23. Xu L. P., Que Y. X., Xu J. S., Fang S. R.,
Zhang M. Q., Chen Y. Q., Chen R. K.,
2008.
Establishment
of
genetic
transformation system and obtaining

transgenic
sugarcane
(var.
badila)
transformed with RS gene. Sugar Tech,
10(2): 128-132.
24. Http://www.baodongnai.com.vn/tuvan/2012
04/Phong-tru-sau-benh-hai-mia-2150229/.
25. Http:
//www.thesaigontimes.vn/Home/
kinhdoanh/dautu/45285/10-nam-i-ach-1trieu-tan-duong.html.

PRELIMINARY TRANSFORMATION OF Saccharum officinarum L.
WITH Bt GENE
Phan Tuong Loc, Hoang Van Duong, Mai Truong, Le Tan Duc, Tran Thi Ngoc Ha,
Van Dac Thanh, Pham Duc Tri, Nguyen Thi Thanh, Nguyen Huu Ho
Institute of Tropcial Biology, VAST

SUMMARY

Borer is one of the major pests of sugarcane that can cause a loss of crop yield. Spraying pesticides for
the control of borer faces obstacles because the pest lives inside sugarcane stem and sugarcanes with sharp
leaves are planted at high density in fields. Transformation of two sugarcane varieties, VN 84 4137 and
Suphabury 7, with synthetic Bt genes, cry1Ab and hybrid cry1B-cry1Ab, aims to provide effective resistance
against pests, mainly borer. Two strains of Agrobacterium tumefaciens were transformed with plasmids
containing cry1Ab gene or cry1B-cry1Ab gene for plant transformation. Sugarcanes were investigated in vitro
conditions of cultivation, which indicated that the highest calli formation from the young leaf rolls was
obtained on the medium with 3 mg/l 2,4-D for VN84 4137 at 93.33% and 2 mg/l 2,4-D for Suphanbury 7 at
96.67%. The highest number of calli forming shoots was achieved on the medium with the combination of 2
mg/l BAP and 1 mg/l NAA at 100% for two varieties. Preliminary Agrobacterium-mediated transformation of
sugarcane was obtained with calli expressing GUS and/or resistant to phosphinothricin at 3 mg/l, which was
the lethal threshold for wild-type callus and in vitro young plants.
Keywords: Agrobacterium tumefaciens, Bt, sugarcane, gen-transformation.
Ngày nhận bài: 21-6-2012

179