Xây dựng quy trình định lượng Zedoarondiol trong thân rễ ngải trắng (Rhizoma curcumae Aromaticae) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Nghiên cứu Y học

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ZEDOARONDIOL
TRONG THÂN RỄ NGẢI TRẮNG (RHIZOMA CURCUMAE AROMATICAE)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Võ Thanh Hóa*, Lê Nữ Huỳnh Như*, Nguyễn Thị Quỳnh Trang*, Nguyễn Đức Hạnh*

TÓMTẮT
Mở đầu – mục tiêu: Ngải trắng (Curcuma aromatica) là một vị thuốc nam phổ biến ở các tỉnh miền
Tây Nam Bộ với các tác dụng đáng chú ý như kháng viêm, kháng ung thư… Zedoarondiol là một trong
những hoạt chất của Ngải trắng có tác dụng kháng viêm. Hiện nay, Dược Điển Việt Nam V chưa quy định
tiêu chuẩn cho dược liệu này. Nhằm mục tiêu đánh giá chất lượng dược liệu, quy trình định lượng
zedoarondiol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được xây dựng và thẩm định.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Các điều kiện khác nhau của quy trình xử lý mẫu và quy
trình sắc ký HPLC được sàng lọc và chọn lựa. Quy trình định lượng zedoarondiol được thẩm định tính đặc
hiệu, tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng theo hướng dẫn của ICH.
Kết quả: Phương pháp chuẩn bị mẫu được chọn sử dụng dung môi methanol 100% để chiết xuất
zedoarondiol từ thân rễ Ngải trắng bằng phương pháp chiết Soxhlet. Điều kiện sắc ký HPLC tối ưu bao
gồm cột Hypersil gold C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), bước sóng phát hiện ở 258 nm, nhiệt độ cột 30 oC, tốc độ
dòng 1 ml/phút. Hỗn hợp acetonitril - nước được chọn làm dung môi pha động với tỷ lệ acetonitril lần lượt
là 2%, 8%, 16% và 18% ở thời điểm 0-3, 4-8, 9-18 và 22 - 30 phút. Quy trình định lượng đạt yêu cầu độ
đặc hiệu, tính tương thích hệ thống. Tính tuyến tính được ghi nhận trong khoảng 7,47– 224,1 µg/mL (ŷ =
22,078x, R2=0,997). Độ lặp lại được xác định là 1,69%. Độ đúng đạt yêu cầu với độ phục hồi trong khoảng
91,02-100,78%.
Kết luận: Quy trình định lượng zedoarondiol từ thân rễ Ngải trắng bằng phương pháp HPLC đã được
xây dựng. Quy trình định lượng đạt yêu cầu về thẩm định theo hướng dẫn của ICH và có thể được ứng
dụng để xây dựng tiêu chuẩn dược liệu thân rễ Ngải trắng và các sản phẩm liên quan.
Từ khóa: Rhizoma Curcumae aromaticae, zedoarondiol, định lượng, HPLC

ABSTRACT
ZEDOARONDIOL DETERMINATION FROM RHIZOMA CURCUMAE AROMATICAE
BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD
Vo Thanh Hoa, Le Nu Huynh Nhu, Nguyen Thi Quynh Trang, Nguyen Duc Hanh
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 249-255
Background – Objectives: Ngai trang (Curcuma aromatica) is a popularly medicine material of South
Vietnam folk medicine. Zedoarondiol, one of the major bioactive compounds of C. aromatica, has been
reported to possess the anti-inflammatory activity. Until now Vietnamese Pharmacopoeia has no monograph
on C. aromatica. The aim of this study was to develop an analytical procedure for zedoarondiol
determination from C. aromatica by using high performance liquid chromatography (HPLC) method.
Methods: The sample preparation methods and HPLC conditions were screened and selected. The
HPLC analytical method was validated according to the ICH guidelines including the specificity,
suitability, linearity, precision and accuracy.
*

Khoa Dược, Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Đức Hạnh
ĐT: 0913576748

Chuyên Đề Dược

Email:

249


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Results: Methanol 100% and Soxhlet extraction were chosen as the best solvent and method for the
sample preparation. The optimized HPLC condition employed Hypersil Gold C18 column (250 x 4.6 mm; 5
µm), a detection wavelength of 258 nm, a column temperature of 30 oC, a flow rate of 1 ml/min and a
mixture of acetonitrile and water as a mobile phase. The ratios of acetonitrile were 2%, 8%, 16% and 18%
at 0-3 min, 4-8 min, 9-18 min and 22 - 30 min, respectively. The specificity and system suitability were
found to meet the requirements. The good correlations between peak areas and concentrations were obtained
within a range of 7.47– 224.1 µg/mL (R2 = 0.997). The RSD value of precision and the recovery percentages
were found to be at 1.69% and within a range of 91.02 – 100.78%, respectively.
Conclusions: The analytical procedure for zedoarondiol determination from rhizoma Curcumae
aromaticae by using HPLC method has been successfully developed. The quantitation method met the
requirements of validation and could be useful for establishing the quality standard of rhizoma Curcumae
aromaticae and its related products.
Keywords: Rhizoma Curumae aromaticae, zedoarondiol, quantitation, HPLC.

ĐẶTVẤNĐỀ

ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU

Ngải trắng (Curcuma aromatica Salisb.,
Zingiberaceae) là một trong những thành
phần quan trọng của bài thuốc chữa bệnh kinh
nguyệt không đều, băng huyết, đau bụng
kinh, viêm gan mạn tính, ho gà, sỏi tắc mật,
bệnh mạch vành(1),... tại tỉnh An Giang. Với các
tác dụng dược lý quan trọng nêu trên, nhiều
công trình nghiên cứu khoa học đã xác định
thành phần hóa học và tác dụng dược lý của
Ngải trắng. Zedoarondiol (Hình 1) là một hoạt
chất của Ngải trắng có nhiều tác dụng sinh
học đã được công bố như kháng viêm(5), chống

xơ vữa động mạch(3), bảo vệ tế bào gan(4)…
Tuy nhiên, hiện nay chưa có nghiên cứu về
quy trình định lượng zedoarondiol trong dược
liệu này. Vì vậy, đề tài được thực hiện nhằm
mục tiêu xây dựng quy trình định lượng
zedoarondiol trong thân rễ Ngải trắng
(Rhizoma curcumae aromaticae) bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), góp
phần phục vụ công tác kiểm soát chất lượng
dược liệu.

Đối tượng, nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

Hình 1: Công thức cấu tạo của zedoarondiol

250

Thân rễ của cây Ngải trắng (C. aromatica)
được thu hái tại tỉnh An Giang và đã được
định danh bằng phương pháp giải trình tự
gen tại Trung tâm Y Sinh học phân tử, Đại học
Y Dược TP. Hồ Chí Minh . Chất chuẩn làm việc
zedoarondiol (hàm lượng nguyên trạng 98,6%)
được cung cấp bởi khoa Dược, Đại học Y Dược
TP. Hồ Chí Minh . Acetonitril (Labscan,
Ireland) và nước cất đạt yêu cầu HPLC.
Methanol, ethanol 96% (Labscan, Ireland) đạt
yêu cầu phân tích.
Khảo sát quy trình xử lí mẫu

Chọn loại dung môi chiết xuất zedoarondiol
Bột thân rễ Ngải trắng (cân chính xác
khoảng 1 g) được chiết xuất bằng thiết bị
Soxhlet, sử dụng methanol 100% hoặc ethanol
96% trong cùng điều kiện nhiệt độ 100oC và
thời gian chiết xuất là 120 phút. Dịch chiết
được cô dưới áp suất giảm tới cắn khô. Hòa
cắn với methanol 30% và cho vào bình định
mức 25 ml, bổ sung thể tích vừa đủ, lọc qua
màng lọc 0,22 μm và định lượng bằng phương
pháp HPLC. Chọn dung môi chiết được nhiều
zedoaondiol và ít tạp nhất.
Khảo sát thời gian chiết bằng Soxhlet
Bột thân rễ Ngải trắng (cân chính xác
khoảng 1 g) được chiết xuất bằng thiết bị

Chuyên Đề Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019
Soxhlet, sử dụng dung môi được chọn ở trên
trong các thời gian chiết xuất khảo sát lần lượt
là 60, 120 và 180 phút và nhiệt độ 100oC. Dịch
chiết được cô dưới áp suất giảm tới cắn khô.
Hòa cắn với methanol 30% và cho vào bình
định mức 25 ml, bổ sung thể tích vừa đủ, lọc
qua màng lọc 0,22 μm và định lượng bằng
phương pháp HPLC. Chọn thời gian khảo sát
cho kết quả chiết xuât thu được nhiều
zedoaondiol nhất.

Khảo sát điều kiện HPLC định lượng
zedoarondiol
Khảo sát điều kiện HPLC định lượng
zedoarondiol trong thân rễ Ngải trắng sử
dụng máy HPLC Azura (Knauer, Đức),
detector UVD 2.1L (Đức), cột sắc ký Hypersil
gold C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) và tiền cột
HQ 105 C18 (10 ×4,6 mm; 5 μm) (Thermo
Scientific, Mỹ), nhiệt độ cột 30oC, bước sóng
phát hiện 258 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút và
thể tích tiêm mẫu 20 μl. Thăm dò 4 chương
trình gradient pha động sử dụng hỗn hợp
acetonitril - nước làm dung môi rửa giải. Chọn
điều kiện HPLC sao cho pic zedoarondiol tách
hoàn toàn khỏi các pic tạp và các thông số sắc
ký đạt yêu cầu.

Nghiên cứu Y học

Thẩm định quy trình định lượng zedoarondiol
Thẩm

định

quy

trình

định

lượng

zedoarondiol trong thân rễ Ngải trắng theo
hướng dẫn của ICH(2) về tính tương thích hệ
thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính
xác và độ đúng.

KẾTQUẢ
Khảo sát điều kiện HPLC định lượng
zedoarondiol
Khảo sát các chương trình pha động với
các tỷ lệ dung môi acetonitril – nước khác
nhau trình bày trong Bảng 1.
Kết quả khảo sát chương trình pha động
được trình bày trong Hình 2.
Bảng 1: Các chương trình pha động HPLC định
lượng zedoarondiol
Chương
trình pha
động
I
II
III
IV

Thời gian và tỉ lệ dung môi nước:
acetonitril
0 - 20 phút (90:10); 27 - 40 phút (10:90)
0 - 15 phút (98:2); 20 - 40 phút (27:73)
0 - 15 phút (98:2); 20 - 40 phút (85 : 15)

0 - 3 phút (98:2); 4 - 8 phút (92:8); 9 - 18
phút (84:16); 22 - 30 phút (82:18)

Zedoarondiol

Zedaoarondiol

Chương trình II

Chương trình III

Zedoarondio
l

Zedoarondi
ol

Chương trình I

Chương trình IV

Hình 2: Sắc ký đồ HPLC phân tích mẫu thử với các chương trình pha động khác nhau

Chuyên Đề Dược

251


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Chương trình I, II (Hình 2) cho pic
zedoarondiol rửa giải ở thời gian lưu khoảng 25
phút, tuy nhiên, pic zedoarondiol chưa tách hòa
toàn khỏi các pic liền trước và sau. Chương trình
III cho pic zedoarondiol đã tách ra khỏi tạp, độ
phân giải cao. Tuy nhiên, thời gian lưu của pic
zedoarondiol kéo dài khoảng 33 phút. Chương
trình IV có pic zedoarondiol gọn, cân đối, độ
phân giải cao, thời gian lưu khoảng 25 phút, các
thông số khác của pic đều nằm trong khoảng cho
phép. Vì vậy, điều kiện IV được chọn để tiến
hành thẩm định quy trình định lượng
zedoarondiol thân rễ Ngải trắng.
Khảo sát quy trình xử lí mẫu

Chọn loại dung môi chiết xuất zedoarondiol
Bảng 2: Kết quả khảo sát dung môi chiết zedoarondiol (n=3)
STT

Dung môi chiết

1
2

Methanol 100%
Ethanol 96%

Methanol 100% và ethanol 96% đều chiết
được zedoarondiol. Tuy nhiên, methanol 100%
chiết được nhiều zedoarondiol hơn ethanol 96%

(Bảng 2). Vì vậy, methanol 100% được chọn làm
dung môi chiết xuất zedoarondiol từ thân rễ
Ngải trắng.

Khảo sát thời gian chiết bằng Soxhlet
Bảng 3: Kết quả khảo sát thời gian chiết zedoarondiol
(n=3)
STT Thời gian chiết (phút)
1
2
3

60
120
180

Trung bình diện tích pic
zedoarondiol (mAu.s)
1404,922
1699,891
1701,164

60 phút
Zedoarondiol

Nghiên cứu Y học

Trung bình diện tích pic
zedoarondiol (mAu.s)
1756,966

1418,551

Ethanol 96%

Zedoarondiol

120 phút

Zedoarondi
ol

180 phút

Zedoarondiol

Zedoarondi
ol

Methanol 100%

Hình 4: Kết quả sắc ký đồ HPLC khảo sát thời gian
chiết zedoarondiol
Hình 3: Sắc ký đồ HPLC khảo sát dung môi chiết
zedoarondiol

Kết quả sắc ký HPLC khảo sát thành phần
dịch chiết thân rễ Ngải trắng được chiết bằng

Kết quả sắc ký HPLC khảo sát thành phần

phương pháp Soxhlet, sử dụng dung môi

dịch chiết thân rễ Ngải trắng bằng Soxhlet với 2

được chọn methanol 100% với các thời gian

dung môi methanol 100% và ethanol 96% trong

chiết khác nhau được trình bày trong Hình 4.

120 phút được trình bày trong Hình 3.

252

Chuyên Đề Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019
Bảng 3 cho thấy thời gian chiết Soxhlet càng
dài, lượng zedoarondiol thu được càng lớn. Tuy
nhiên, sau 2 giờ và 3 giờ chiết, diện tích pic
zedoarondiol thu được thay đổi không đáng kể
(p>0,05). Vì vậy, 120 phút được chọn là thời gian
chiết xuất phù hợp bằng Soxhlet với dung môi
methanol 100%.
Quy trình định lượng zedoarondiol trong
thân rễ Ngải trắng

Mẫu thử
Cân chính xác 1 g bột thân rễ Ngải trắng

cho vào bình chiết Soxhlet. Tiến hành chiết với
methanol 100% ở 100oC trong 120 phút. Dịch

Nghiên cứu Y học

Thẩm định quy trình định lượng zedoarondiol
trong thân rễ Ngải trắng

Tính tương thích hệ thống
Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống
được trình bày trong Bảng 4. Các thông số thời
gian lưu, diện tích pic có RSD% ≤ 2%. Hệ số
bất đối, độ phân giải, số đĩa lý thuyết đạt yêu
cầu phân tích. Vậy, phương pháp đã xây dựng
đạt tính tương thích hệ thống.
Bảng 4: Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống
Rt
S (mAU.s)
N
(phút)
Trung bình 25,461 1723,782 815726
SD
0,029
14,156
2965
RSD (%) 0,114
0,821
0,360

AS

RS

0,800 1,980
0,004 0,028
0,544 1,400

chiết được cô dưới áp suất giảm tới khi thu

Tính đặc hiệu

được cắn khô. Hòa tan cắn với methanol 30%

Hình 5 cho thấy sắc ký đồ mẫu trắng
(dung môi methanol 30%) không có pic xuất
hiện trong khoảng thời gian lưu tương ứng
với thời gian lưu của pic zedoarondiol trong
mẫu chuẩn. Sắc ký đồ của mẫu thử có pic có
thời gian lưu tương ứng với pic zedoarondiol
trong mẫu chuẩn. Khi thêm chuẩn vào mẫu
thử thì chiều cao và diện tích pic zedoarondiol
trong mẫu thử tăng lên. Độ tinh khiết pic
zedoarondiol (trên hệ thống máy HPLC
Alliance Water, đầu dò PDA 2969, phần mềm
Empower) đạt yêu cầu.

và cho vào bình định mức 25 ml, bổ sung thể
tích vừa đủ, lọc qua màng lọc 0,22 μm.

Mẫu đối chiếu

Dung dịch chuẩn đối chiếu zedoarondiol
nồng độ 100 μg/ml trong methanol.
Điều kiện sắc ký HPLC: Điều kiện IV
Hàm lượng zedoarondiol (%) trong thân rễ
Ngải trắng đươc tính theo công thức sau:
X 

St
V
 CC 
k
SC
m 1  h   10000

X: % zedoarondiol trong dược liệu
St, Sc: lần lượt là diện tích pic zedoarondiol
của dung dịch thử và dung dịch chuẩn đối chiếu
Cc: nồng độ zedoarondiol của dung dịch
đối chiếu (μg/ml)
V: thể tích dung dịch thử (ml)

Kết quả khảo sát mối tương quan giữa
diện tích pic và nồng độ zedoarondiol được
trình bày trong Hình 6. Kết quả xử lý thống kê
cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa
diện tích pic và nồng độ zedoarondiol trong
khoảng nồng độ 7,47– 224,1 (R2=0,997).
Độ lặp lại

m: khối lượng cân của dược liệu (g)

Kết quả khảo sát độ lặp lại (Bảng 5) cho

h: độ ẩm của dược liệu

thấy %RSD=1,69% < 2%. Vì vậy, quy trình đạt

k: độ tinh khiết của chuẩn

yêu cầu về độ lặp lại.

Bảng 5: Kết quả độ lặp lại
STT
Rt (phút)
Diện tích pic (mAU.s)

Chuyên Đề Dược

1
25,533
1757,0

2
25,583
1706,4

3
25,733
1749,1

4
25,217
1689,5

5
25,583
1710,2

6
25,433
1692,1

Trung bình
25,514
1716,9

RSD (%)
0,69
1,69

253


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Mẫu trắng

Zedoarondiol

Mẫu chuẩn

Mẫu thử

Mẫu thử thêm chuẩn

Hình 5: Kết quả HPLC khảo sát độ đặc hiệu (Rt pic zedoarondiol ≈ 25 phút)Khoảng tuyến tính
Nồng độ (µg/ml)
7,47
44,82
89,64
134,46
179,28
224,10

Diện tích pic (mAU.s)
121,6
979,0
1854,3
2927,5
4102,1
4795,2

Hình 6: Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic zedoarondiol
quả khảo sát độ đúng được trình bày trong
Độ đúng
Bảng 6.
Bảng 6: Kết quả khảo sát độ đúng
Ứng dụng quy trình định lượng để khảo

Mức nồng độ Tỷ lệ phục hồi
Số liệu thống kê
thêm vào
(%)
sát hàm lượng zedoarondiol trong mẫu thân
94,27
TB = 96,73
rễ Ngải trắng X được thu hái tại tỉnh An
SD = 2,18
80%
97,55
Giang. Kết quả được trình bày trong bảng 7.
100%

120%

98,39
100,78
94,05
94,92
100,69
96,64
91,02

RSD = 2,25%
TB = 96,65
SD = 3,77
RSD = 3,91%
TB = 96,12
SD = 4,86

RSD = 5,05%

Độ đúng được tiến hành bằng cách thêm
chất chuẩn vào mẫu dược liệu 3 mức 80%,
100% và 120% so với nồng độ định lượng
zedoarondiol. Mỗi mức chuẩn bị 3 mẫu. Kết
quả đánh giá dựa vào tỷ lệ phục hồi. Kết

254

Bảng 7: Hàm lượng zedoarondiol trong mẫu X
STT
1
2
3

Hàm lượng
(%)
0,246
0,239
0,245

STT
4
5
6

Hàm lượng
Trung bình
(μg/g)

0,236
TB = 0,241
%
0,239
0,237

BÀNLUẬN
Quy trình xử lý mẫu định lượng
zedoarondiol trong thân rễ Ngải trắng đã
được khảo sát dựa trên 2 yếu tố ảnh hưởng
đáng kể đến lượng zedoarondiol chiết được là

Chuyên Đề Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019
loại dung môi chiết và thời gian chiết xuất
bằng phương pháp Soxhlet. Dung môi
methanol 100% được chọn làm dung môi chiết
xuất vì cho lượng zedoarondiol chiết được
nhiều hơn dung môi ethanol 96% trong cùng
một điều kiện chiết xuất. Thời gian chiết bằng
phương pháp Soxhlet đã được xác định có ảnh
hưởng đáng kể kến lượng zedoarondiol chiết
được. Thời gian tốt nhất để xử lý mẫu thử là
120 phút với dung môi được chọn là methanol
100%. Tỷ lệ phục hồi của phương pháp định
lượng trong khoảng 91,02-100,78% thuộc
khoảng cho phép 90 - 107% và các giá trị
%RSD đều nhỏ hơn 5,3%. Vì vậy, quy trình

định định lượng zedoarondiol trong thân rễ
Ngải trắng đạt yêu cầu thẩm định của một quy
trình định lượng.

KẾTLUẬN
Quy trình định lượng zedoarondiol trong
thân rễ Ngải trắng đã được xây dựng và thẩm
định. Kết quả thẩm định đạt các yêu cầu về độ
đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, tính tuyến
tính, độ lặp lại (1,69%) và độ đúng với độ
phục hồi trong khoảng 91,02 - 100,78%. Quy
trình này có thể được ứng dụng trong việc

Chuyên Đề Dược

Nghiên cứu Y học

định lượng và xây dựng tiêu chuẩn thân rễ
Ngải trắng, đồng thời là dữ liệu quan trọng
cho việc xây dựng quy trình định lượng cho
các sản phẩm liên quan.

TÀILIỆUTHAMKHẢO
1.
2.
3.

4.

5.

Đỗ Huy Bích (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt
Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 391-2.
Guideline ICH “Q2A text on validation of Analytical
Procedures”, Fed. Regist. 60.
Huimin M, Tianqi T, Dandan S (2016), “Zedoarondiol
inhibits platelet-derived growth factor-induced vascular
smooth muscle cells proliferation via regulatin AMPactivated protein kinase signaling pathway”, Cell Physiol
Biochem, 40, pp. 1506-20.
Toshio M, Hisashi M (2002), “Potent protective effects of
sesquiterpenes and curcumin from Zedoariae rhizoma on
liver
injury
induced
by
Dgalactosamine/lipopolysaccharide or tumor necrosis factorα”, Biol Pharm Bull, 25 (5), pp. 627-31.
Woong C, Joo WN, Hyun JK (2009), “Zedoarondiol isolated
from the rhizoma of Curcuma heyneana is involved in the
inhibition of iNOS, COX-2 and pro-inflammatory cytokines
via the down regulation of NF-κB pathway in LPSstimulated murine macrophages”, Int Immunopharmacol, 9,
pp. 1049-57.

Ngày nhận bài báo:

18/10/2018

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

01/11/2018

Ngày bài báo được đăng:

15/03/2019

255