FoxG1 thúc đẩy sự hình thành các gai thần kinh ở nơron – một cơ chế tiềm năng trong sinh lý bệnh của hội chứng West

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016

FOXG1 THÚC ĐẨY SỰ HÌNH THÀNH CÁC GAI THẦN KINH Ở
NƠRON – MỘT CƠ CHẾ TIỀM NĂNG TRONG SINH LÝ BỆNH CỦA
HỘI CHỨNG WEST
Mai Phương Thảo*, Đỗ Đức Minh**

TÓM TẮT
Mục tiêu: Khảo sát ảnh hưởng của sự biểu hiện vượt mức của protein FoxG1 đối với sự hình thành các gai
thần kinh (dendritic spine) ở tế bào thần kinh (neuron) trên mô hình nuôi cấy tế bào.
Đối tượng – Phương pháp: Mô tả hàng loạt ca, nuôi cấy các tế bào thần kinh não chuột.
Kết quả: Biểu hiện vượt mức protein FoxG1 thúc đẩy sự hình thành các gai thần kinh trên các sợi đuôi gai
của tế bào thần kinh.
Kết luận: Nghiên cứu này góp phần củng cố mối liên quan giữa hội chứng West và protein FoxG1 đồng thời
cũng phần nào làm sáng tỏ cơ chế sinh bệnh của hội chứng West vốn chưa được hiểu biết tường tận.
Từ Khóa: Protein FoxG1, biểu hiện vượt mức, tế bào thần kinh (neuron), sợi thần kinh (neurite), sợi trục
(axon), đuôi gai (dendrite), gai thần kinh (dendritic spine), hội chứng West.

ABSTRACT
FOXG1 PROMOTES THE FORMATION OF DENDRITIC SPINES – A POTENTIAL MECHANISM FOR
WEST SYNDROME PATHOPHYSYOLOGY
Mai Phuong Thao, Do Duc Minh* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 1 - 2016: 24 - 28
Objective: Evaluating effects of FoxG1 overexpression in the formation of dendritic spines in vitro.
Materials – Methods: Case series report using mouse neuronal culture.
Results: Overexpression of FoxG1 promotesthe formation of dendritic spine.
Conclusion: These findings consolidate the role of FoxG1 in West syndrome pathophysiology which remains
unclear.
Key words: FoxG1 (forkhead box protein G1), overexpression, neuron, neurite, axon, dendrite, dendritic
spine, West syndrome.

sinh của hội chứng West và protein FoxG1, cụ
ĐẶT VẤN ĐỀ
thể là khi được tăng cường biểu hiện protein
Các gai thần kinh (dendritic spine) là phần
FoxG1, các nơron thần kinh có khuynh hướng
màng tế bào lồi ra trên sợi đuôi gai thần kinh, là
hình thành nhiều sợi thần kinh (neurite) hơn,
nơi tiếp hợp của các xi náp thần kinh, mà chủ
đặc biệt là các sợi đuôi gai (dendrite). Forkhead
yếu là các xi náp kích thích (excitatory synapses)
box protein G1 (FoxG1) là protein được mã hóa
của vùng vỏ đại não(15). Các gai thần kinh này
từ gen FOXG1 trên nhánh dài nhiễm sắc thể 14
được hình thành và biến mất nhanh chóng,
(14q12). Đây là protein kiểm soát phiên mã có
thông thường, chúng sẽ được tăng cường hình
vai trò quan trọng trong việc hình thành não bộ
thành tại khu vực có hoạt động điện thế mạnh
trong giai đoạn phôi thai (hình thành não bộ,
với vai trò hỗ trợ các tín hiệu điện thế trong quá
phân vùng não bộ, kiểm soát sự phân bào của
trình dẫn truyền thần kinh(16). Gần đây, chúng tôi
các tế bào đầu dòng thần kinh…)(10,11) và trong
phát hiện được mối liên quan giữa cơ chế bệnh
* Bộ sinh Sinh lý học, ĐH Y Dược TPHCM
** Trung tâm Y sinh học phân tử, ĐH Y Dược TPHCM
Tác giả liên lạc: TS. Đỗ Đức Minh, ĐT: 0932999989,
Email:

24

Chuyên Đề Nội Khoa II


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016
giai đoạn trưởng thành (duy trì sự tân tạo các
neuron nhằm phục vụ cho các chức năng thần
kinh cao cấp)(6,14). Hội chứng West (West
syndrome), được đặt theo tên của bác sĩ người
anh William James West, là mội hội chứng động
kinh hiếm gặp ở trẻ em và trẻ nhũ nhi. Tần suất
mắc bệnh ở trẻ mới sinh vào khoảng 1/2000 đến
1/4000(8). Biểu hiện lâm sàng của hội chứng West
gồm có tam chứng: động kinh, bất thường trên
EEG đột ngột, lan tỏa với hình ảnh sóng cao
không đồng dạng (hypsarrhythmia) đặc trưng
và chậm phát triển trí tuệ. Các biểu hiện lâm
sàng này có thể giải thích bằng tình trạng tăng
hoạt động điện quá mức ở não bộ(3, 5). Như đã mô
tả ở trên, các gai thần kinh sẽ được tăng cường
hình thành tại khu vực hoạt động điện thế
mạnh, vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu
này nhằm khảo sát sự thay đổi của mật độ gai
thần kinh trên các sợi đuôi gai của các tế bào
thần kinh khi chúng được tăng cường biểu hiện
protein FoxG1.

ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU
Động vật thực nghiệm
Dòng chuột CD1 wild-type (wt) được dùng

trong nghiên cứu này được nuôi dưỡng và phát
triển tại cơ sở động vật của viện SISSA, TriesteItaly.

Nuôi cấy tế bào thần kinh
Mô não chuột 16.5 ngày tuổi sẽ được cắt nhỏ
trong vòng 5-8 phút trong dung dịch lạnh chứa
1X PBS-0,6% glucose-0,1% DNaseI. Các mẫu này
sau đó được ủ với dung dịch trypsin nồng độ
1mg/ml trong 5 phút. Dung dịch trypsin được
trung hòa bằng FBS 10%, các mẫu mô lớn sẽ lắng
xuống đáy ống nghiệm sau 5 phút và được tách
bỏ, phần tế bào trong dung dịch phía trên sẽ
được thu và đếm số lượng. Cuối cùng các tế bào
này sẽ được nuôi cấy trong môi trường dành
riêng cho nơron: 1:1 Neurobasal A, 1X Glutamax
(Gibco), 1X yếu tố B27 (Invitrogen), 0,5mM
glutamine, 25μM β-Mercaptoethanol, 1X
Penicillin/Streptomycin (Gibco), 10 pg/ml
fungizone (Gibco) với mật độ ban đầu là 3*105 tế

Thần kinh

Nghiên cứu Y học

bào/giếng trong đĩa nuôi cấy 24 giếng. Môi
trường nuôi cấy được thay mới mỗi 3,5 ngày.

Lenti virus vector
Lenti virus thế hệ thứ 3 được chuẩn bị theo
protocol của Follenzi và Naldini bằng cách biến

nạp các plasmid khung của virus và các plasmid
mang bộ gen cần biểu hiện vào tế bào
HEK293T(7). Sau 24 – 48 giờ, đem môi trường
nuôi cấy tế bào ly tâm 100.000g để thu các virion
và hòa tan virion trong PBS. Nồng độ virion
được định lượng bằng RT-PCR(13).

Miễn dịch huỳnh quang
Tế bào nuôi cấy được cố định bằng dung
dịch paraformaldehyt 4% trong 20 phút. Sau đó,
các tế bào được ủ với dung dịch blocking (1X
PBS, 10% FBS, 1mg/ml BSA và 0.1% Triton X100)
trong 1 giờ, kháng thể 1 được ủ qua đêm ở nhiệt
độ 4oC, và kháng thể 2 được ủ trong 2 giờ ở nhiệt
độ phòng. Cuối cùng, các tế bào được nhuộm với
dung dich DAPI (4’,6’-diamino-2-phenylindone)
trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.

Phân tích và xử lý hình ảnh
Hình ảnh được chụp bằng kính hiển vi
Confocal Leica vật kính 63X và sau đó được xử
lý bằng phần mềm GIMP 2.6 và Image J để phân
tích. Các gai thần kinh sẽ được đếm số lượng và
chia cho diện tích bề mặt của sợi đuôi gai để thu
được thông số mật độ gai thần kinh trên một
điện tích sợi đuôi gai.

Phân tích thống kê
Các thí nghiệm đều được thực hiện lặp lại
ít nhất 3 lần. Kết quả được kiểm định bằng ttest và được cho là có ý nghĩa thống kê khi trị

số p < 0,05.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
FoxG1 thúc đẩy sự hình thành các gai thần
kinh trên các nơron
Để đánh giá tác động của FoxG1 trên sự
hình thành các gai thần kinh, chúng tôi phân
lập các tế bào thần kinh từ phôi chuột 16,5 ngày
tuổi và sau đó gây nhiễm các tế bào này với

25


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016

phức hợp các vector lenti virus như hình 1. Mỗi
vector virus sẽ được dùng để gây nhiễm với hệ
số là 8 (MOI=8, trong đó MOI: Multiplicity of
infection), nghĩa là dùng 8 virion để gây nhiễm
1 tế bào. Để có thể kích hoạt và bất hoạt gen
FoxG1 vào bất kì thời điểm nào trong quá trình
thí nghiệm, chúng tôi sử dụng kĩ thuật
TetON(2). Trong kĩ thuật này, FoxG1 sẽ không
được biểu hiện trực tiếp dưới sự tác động của
promoter ptα1 mà sẽ được kích hoạt gián tiếp
qua promoter TRE (tetracycline respone
element), promoter TRE lại chịu sự kiểm soát
của phức hợp ptα1-rtTA. Trong môi trường

nuôi cấy có chứa Doxycycline (dẫn xuất của
nhóm tetracycline) thì rtTA sẽ kích hoạt TRE và
từ đó phiên mã gen FoxG1 và ngược lại trong
môi trường không có Doxycycline, quá trình
này sẽ bị bất hoạt. Các tế bào được chia làm 2
nhóm, nhóm được gây nhiễm với vector giúp
tăng biểu hiện protein FoxG1 (phức hợp a-b1)
và nhóm chứng được gây nhiễm với vector
biểu hiện protein PLAP (phức hợp a-b2); một
protein không có hoạt tính sinh học trên tế bào
thần kinh.

ở các nơron khi các tế bào này tăng cường hoạt
động điện(9).

Hình 2: Tóm tắt quy trình thực hiện nghiên cứu
Cuối cùng các tế bào này sẽ được nhuộm
miễn dịch huỳnh quang với Map2 (nhằm đánh
giá cấu trúc của các sợi đuôi gai) và PSD95 (đánh
giá các gai thần kinh) (hình 3).

Hình 3: Kết quả miễn dịch huỳnh quang các sợi đuôi
gai (MAP2) và các gai thần kinh (PSD95)

Hình 1: Các vector lenti virus dùng trong nghiên cứu
Sau khi được gây nhiễm, các tế bào này sẽ
được nuôi cấy và biệt hóa trong vòng 5 ngày mà
không có doxycyclin (các gen tăng biểu hiện
protein FoxG1 và PLAP chưa được kích hoạt).
Sau 5 ngày, 2μg/ml Doxycyclin được thêm vào

môi trường nuôi cấy nhằm kích hoạt sản xuất
protein FoxG1 và PLAP ở các tế bào. Đến ngày
thứ 10 (5 ngày sau khi thêm Doxycyclin), các tế
bào ở 2 nhóm FoxG1 và PLAP lại được chia làm
2 nhóm với 1 nhóm chứng và một nhóm được
kích thích gây khử cực bằng cách thêm vào môi
trường nuôi cấy 50mM KCl trong vòng 12 giờ
(hình 2). Mục đích của việc khử cực này nhằm
đánh giá khả năng hình thành các gai thần kinh

26

Vì hình ảnh thu được từ kính hiển vi
confocal là các hình ảnh 2 chiều, đồng thời do
cấu trúc của các sợi đuôi gai khác nhau, nên
chúng tôi lựa chọn phân tích mật độ của các gai
thần kinh trên một đơn vị diện tích đuôi gai. Từ
các hình ảnh thu được sau khi chụp với kính
hiển vi confocal, chúng tôi đếm số lượng các gai
thần kinh trên từng sợi đuôi gai, diện tích của
các sợi đuôi gai sẽ được tính bằng phần mềm
ImageJ. Như đã được mô tả trước đó, khi ta khử
cực các nơron bằng dung dịch kali clorua, mật
độ các gai thần kinh tăng lên 1,66 lần. Điều đặc
biệt là đối với các tế bào được tăng cường biểu
hiện FoxG1 đơn thuần, mật độ gai thần kinh
tăng lên 2,63 lần so với các tế bào chứng, và khi
kết hợp kali clorua và tăng biểu hiện protein
FoxG1, mật độ gai thần kinh tăng lên đến 3,34

Chuyên Đề Nội Khoa II


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016

Nghiên cứu Y học

lần (mật độ gai thần kinh của nhóm chứng trung
bình là 0,17±0,03/μm2) (hình 4).
Hình 5: Cơ chế phân tử giả thiết để giải thích hiện
tượng FoxG1 thúc đẩy hình thành các gai thần kinh

KẾT LUẬN
Các nơron thần kinh biểu hiện vượt mức
protein FoxG1 hình thành nhiều gai thần kinh
hơn như là một bằng chứng gián tiếp cho thấy
sự tăng cường hoạt động điện thế ở các nơron
này. Từ đó cho thấy protein FoxG1 là một
nguyên nhân tiềm năng trong sinh lý bệnh của
hội chứng West.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Hình 4: Biểu đồ so sánh mật độ gai thần kinh trên
một diện tích đuôi gai ở các thí nghiệm (so với nhóm
chứng không khử cực bằng kali clorua và không tăng
cường biểu hiện FoxG1)

2.

3.

BÀN LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi có thể
kết luận rằng việc tăng cường biểu hiện FoxG1
trên tế bào thần kinh sẽ thúc đẩy sự hình thành
các gai thần kinh nhiều hơn so với các tế bào
thần kinh thông thường. Kết quả này như là một
bằng chứng gián tiếp cho thấy sự tăng cường
hoạt động điện của các nơ ron thần kinh được
tăng biểu hiện protein FoxG1 và từ đó cho thấy
mối liên quan giữa tình trạng lặp đoạn trên
nhiễm sắc thể số 14 mang gene FOXG1 và hội
chứng West. Cơ chế phân tử của việc thúc đẩy
hình thành các gai thần kinh bởi FoxG1 được
kiến nghị như hình 5, trong đó FoxG1 ức chế các
protein pSmad (pSmad2,3), các protein pSmad
này cần thiết cho sự hình thành protein Mdm2
để 1 lần nữa ức chế PSD95 là một protein rất
quan trọng trong việc hình thành và duy trì sự
ổn định của các gai thần kinh(1,4, 12). Bước tiếp theo
chúng tôi sẽ đào sâu con đường tín hiệu này
nhằm hiểu biết rõ hơn về vai trò phân tử của
FoxG1 trong hôi chứng West.

Thần kinh

4.

5.

6.

7.
8.
9.

10.

11.

Araki S, Eitel JA, Batuello CN, Bijangi-Vishehsaraei K, Xie XJ,
Danielpour D, Pollok KE, Boothman DA, Mayo LD (2010).
TGF-beta1-induced expression of human Mdm2 correlates
with late-stage metastatic breast cancer. J Clin Invest,
120(1):290–302
Brancaccio M, Pivetta C, Granzotto M, Filippis C, Mallamaci
A (2010). Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote
neuronogenesis. Stem Cells Dayt Ohio, 28(7):1206–1218
Chugani HT, Shields WD, Shewmon DA, Olson DM, Phelps
ME, Peacock WJ (1990). Infantile spasms: I. PET identifies focal
cortical dysgenesis in cryptogenic cases for surgical treatment.
Ann Neurol, 27(4):406–413
Colledge M, Snyder EM, Crozier RA, Soderling JA, Jin Y,
Langeberg LK, Lu H, Bear MF, Scott JD (2003). Ubiquitination
regulates PSD-95 degradation and AMPA receptor surface
expression. Neuron, 40(3):595–607
Desguerre I, Pinton F, Nabbout R, Moutard ML, N’Guyen S,
Marsac C, Ponsot G, Dulac O (2003). Infantile spasms with

basal ganglia MRI hypersignal may reveal mitochondrial
disorder due to T8993G MT DNA mutation. Neuropediatrics,
34(5):265–269
Fasano CA, Phoenix TN, Kokovay E, Lowry N, Elkabetz Y,
Dimos JT, Lemischka IR, Studer L, Temple S (2009). Bmi-1
cooperates with Foxg1 to maintain neural stem cell selfrenewal in the forebrain. Genes Dev, 23(5):561–574
Follenzi A, Naldini L (2002). HIV-based vectors. Preparation
and use. Methods Mol Med, 69:259–274
Hrachovy RA, Frost JD (1989). Infantile spasms. Pediatr Clin
North Am, 36(2):311–329
Kim TK, Hemberg M, Gray JM, et al (2010). Widespread
transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature,
465(7295):182–187
Martynoga B, Morrison H, Price DJ, Mason JO (2005). Foxg1 is
required for specification of ventral telencephalon and regionspecific regulation of dorsal telencephalic precursor
proliferation and apoptosis. Dev Biol, 283(1):113–127
Muzio L, Mallamaci A (2005). Foxg1 confines Cajal-Retzius
neuronogenesis and hippocampal morphogenesis to the
dorsomedial pallium. J Neurosci Off J Soc Neurosci,
25(17):4435–4441

27


Nghiên cứu Y học
12.

13.

14.

28

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016

Rodriguez C, Huang LJ, Son JK, McKee A, Xiao Z, Lodish HF
(2001). Functional cloning of the proto-oncogene brain factor-1
(BF-1) as a Smad-binding antagonist of transforming growth
factor-beta signaling. J Biol Chem, 276(32):30224–30230
Sastry L, Johnson T, Hobson MJ, Smucker B, Cornetta K
(2002). Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA
and marker expression methods. Gene Ther, 9(17):1155–1162
Shen L, Nam HS, Song P, Moore H, Anderson SA (2006).
FoxG1 haploinsufficiency results in impaired neurogenesis in
the postnatal hippocampus and contextual memory deficits.
Hippocampus, 16(10):875–890

15.
16.

Spruston N (2008). Pyramidal neurons: dendritic structure and
synaptic integration. Nat Rev Neurosci, 9(3):206–221
Yuste R (2013). Electrical compartmentalization in dendritic
spines. Annu Rev Neurosci, 36:429–449

Ngày nhận bài báo:

24/11/2015

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

30/11/2015

Ngày bài báo được đăng:

15/02/2016

Chuyên Đề Nội Khoa II