Luận án tiến sĩ Sinh học: Tách dòng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất của endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam

1

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRỊNH THỊ THU HÀ

TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH
CHẤT CỦA ENDOCHITINASE TỪ Bacillus thuringiensis
PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 9420107

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2018

1


2

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRỊNH THỊ THU HÀ

TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH
CHẤT CỦA ENDOCHITINASE TỪ Bacillus

thuringiensis PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 9420107

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Ngô Đình Bính
Viện Công nghệ sinh học
2. PGS.TS. Đồng Văn Quyền

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2018

2


i

LỜI CÁM ƠN
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Ngô Đình Bính, giáo viên
hướng dẫn khoa học, người đã tạo điều kiện và luôn ở bên truyền dạy kiến thức, kinh
nghiệm và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin trân trọng cám ơn người hướng dẫn khoa học - PGS. TS. Đồng Văn
Quyền - Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã hướng cho tôi những ý tưởng
khoa học, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản
luận án này.
Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám đốc Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn
gen vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học cùng các cán bộ thuộc Trung tâm đã động

viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi xin cám ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện làm việc thuận lơi nhất cho tôi hoàn
thành khóa học và bản luận án này.
Tôi xin cám ơn Bộ phận đào tạo, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng
dẫn tôi hoàn thành mọi thủ tục trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến các đồng nghiệp, bạn bè trong và ngoài
Viện Công nghệ sinh học đã luôn quan tâm, động viên và chỉ dẫn cho tôi để tôi
hoàn thành luận án.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thân trong gia đình,
những người luôn bên tôi động viện, chia sẻ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong
suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày……tháng…..năm 2018
Tác giả

Trịnh Thị Thu Hà


ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được
công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các
đồng tác giả;
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các số liệu, nội dung đã trình bày trong
luận án.

Hà Nội, ngày …..tháng …….năm 2018
Tác giả

Trịnh Thị Thu Hà


iii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU………………………………………………………….

1

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

5

1.1.

Vi khu n Bacillus thuringiensis…………………………………

5

1.1.1.

S

5

1.1.2.

S phát tri n và ng

1.2.

Chitinase t nhiên……………………………………………….

10

1.2.1.

Ngu n g c c

chitin s ……………………………………………….

11

1.2.2.

Ph n o i chitin s ……………………………………………………..

12

1.2.3.

Cấu trúc c

14

1.2.4.

C ch ho t ộng c

1.2.5.

Các y u t

nh h

ng

n ho t t nh c

chitin s …………………...

18

1.2.6.

Các y u t

nh h

ng

n quá tr nh sinh t ng h p chitin s ...........

20

1.3.

Chitinase tái tổ h p..........................................................................

22

1.3.1.

Hệ i u hiện Esch richi co i.............................................................

26

1.3.2.

Một s y u t

cv

. thuringi nsis…………………………………………….
ng c

chitin s t

. thuringi nsis tr n th gi i

chitin s ………………………………………………….

nh h

chitin s ………………………………………..

ng

n quá tr nh

7

16

n m n t ng h p chitin s

tái t h p…………………………………………………………………

29

1.3.3.

Thu h i và tinh s ch chitin s tái t h p……………………………..

30

1.4.

Ứng d ng c a chitinase.................................................................

31

1.4.1.

Trong nông nghiệp và

ng.........................................

31

1.4.2.

Ứng d ng trong công nghiệp............................................................

33

1.4.3.

Ứng d ng trong y

c......................................................................

34

1.4.4.

Ứng d ng trong

c tính sinh kh i nấm............................................

34

1.4.5.

Ứng d ng trong công nghệ sinh học...............................................

35

1.5.

Sơ lƣ c về tình hình sâu bệnh hại cây trồng……………………..

36

o vệ môi tr


iv

Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

39

2.1.

Vật liệu nghiên cứu...................................................................... .

39

2.1.1.

Ch ng gi ng và p smi …………………………………………………

39

2.1.2.

Thi t bị……………………………………………………………………..

39

2.1.3.

Hóa chất……………………………………………………………………

40

2.1.4.

Môi tr

40

2.1.5.

Dung dịch..........................................................................................

41

2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................

41

2.2.1.

Ph

ng pháp vi sinh......................................................................

41

2.2.2.

Ph

ng pháp hó sinh....................................................................

43

2.2.3.

Ph

ng pháp sinh học phân tử.......................................................

45

2.2.4.

T i u i u kiện i u hiện th o ph

2.2.5.

Nghiên c u tính chất hóa lý c a chitinase tái t h p.......................

52

2.2.6.

Ph

54

2.2.7.

Xử lý s liệu………………………………………………………………..

56

2.2.8.

S

57

ng nuôi cấy………………………………………………………

ng pháp

mặt áp ng.........

ng pháp thử nghiệm...............................................................

nghi n c u..........................................................................

Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.

52

58

Phân lập vi khu n Bacillus thuringiensis có khả năng sinh
chitinase ở Việt Nam………………………………………………

58

3.1.1.

Ph n

58

3.1.2.

Phân lo i

3.1.3.

Sàng ọc ho t t nh th y ph n chitin c

p vi khu n . thuringi nsis……………………………………
i loài các ch ng B. thuringiensis phân l p…………..

các ch ng . thuringi nsis

s rov r kurst ki………………………………………………………..
3.1.4.

Sàng ọc g n n ochitin s

chi

c

Sàng ọc ho t t nh kháng nấm c

các ch ng

65

. thuringi nsis

s rov r kurst ki…………………………………………………………
3.2.

63

các ch ng . thuringi nsis

s rov r kurst ki…………………………………………………………
3.1.5.

61

66

Khảo sát iều kiện sinh tổng h p chitinase c a ch ng Bacillus
thuringiensis var. kurstaki MSS1.1………………………………..

66


v

3.2.1.

Th i gian nuôi cấy………………………………………………………

67

3.2.2.

Nhiệt ộ nuôi cấy………………………………………………………..

67

3.2.3.

Ngu n c chất……………………………………………………………

67

3.2.4.

N ng ộ c chất…………………………………………………………

68

3.2.5.

pH môi tr

ng nuôi cấy………………………………………………..

68

3.2.6.

Ngu n c c on……………………………………………………………

69

3.2.7.

Ngu n ni t ………………………………………………………………

69

3.2.8.

Môi tr

70

3.3.

Nhân d ng gen chiA mã h a chitinase từ ch ng vi khu n B.

ng thay th …………………………………………………….

thuringiensis var. kurstaki MSS1.1..................................................

70

3.4

Biểu hiện gen chiA trong vi khu n E. coli BL21…………………

74

3.4.1.

Thi t k vector bi u hiện gen chiA trong vi khu n E.co i L21……..

74

3.4.2.

Bi u hiện chiA tái t h p trong E. coli L21 DE3 …………………..

77

3.4.3.

Nghiên c u i u kiện bi u hiện gen chiA c a ch ng tái t h p……..

79

3.4.4.

T i u kh năng i u hiện rChi

ằng ph

ng pháp

mặt áp

ng………………………………………………………………………..
3.4.5.

Ki m tra s t

3.4.6.

Tinh s ch và xác ịnh ho t tính c a chitinase tái t h p…………….

89

3.5.

Nghiên cứu tính chất c a chitinase tái tổ h p……………………

90

3.5.1.

Nhiệt ộ t i u và ộ b n nhiệt…………………………………………

90

3.5.2.

pH t i u và ộ b n pH………………………………………………….

91

3.5.3.

Ảnh h

ng c a ion kim lo i và EDTA lên ho t t nh chitin s ………

92

3.5.4.

Ảnh h

ng c a chất t y rử …………………………………………….

92

3.5.5.

Ảnh h

ng c a dung môi hữu c ……………………………………….

93

3.5.6.

Động học c a ph n ng nzym ………………………………………..

93

3.5.7.

S n ph m c a s th y ph n c chất b i chitin s …………………….

95

3.6.

Th

3.6.1.

ng th ch giữa mô hình và th c nghiệm.....................

84
88

nghiệm khả năng kháng nấm gây bệnh th c vật và tăng

hoạt tính diệt sâu c a chitinase tái tổ h p………………………

95

Kh năng kháng nấm gây bệnh th c v t c a chitinase tái t h p…..

95


vi

3.6.2.

4.1.

Hỗ tr ho t tính diệt sâu Bộ cánh v y c a chitinase tái t h p……..

97

Chƣơng 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ

99

Phân lập vi khu n Bacillus thuringiensis có khả năng sinh
chitinase ở Việt Nam…………………………………………….

99

4.1.1.

Ph n

99

4.1.2.

Phân lo i

4.1.3.

Sàng ọc ho t t nh th y ph n chitin c

p vi khu n . thuringi nsis……………………………………..
i loài kurstaki các ch ng B. thuringiensis phân l p…
các ch ng . thuringi nsis

s rov r kurst ki…………………………………………………………..
4.1.4.

Sàng ọc g n n ochitin s

chi

c

Sàng lọc ho t tính kháng nấm c

các ch ng

101

. thuringi nsis

serovar kurst ki………………………………………………………..
4.2.

100

các ch ng . thuringi nsis

s rov r kurst ki………………………………………………………..
4.1.5.

100

101

Khảo sát iều kiện sinh tổng h p chitinase c a ch ng Bacillus
thuringiensis var. kurstaki MSS1.1………………………………..

102

4.2.1.

Th i gi n nuôi cấy……………………………………………………….

102

4.2.2.

Nhiệt ộ nuôi cấy…………………………………………………………

103

4.2.3.

Ngu n c chất……………………………………………………………

103

4.2.4.

N ng ộ c chất………………………………………………………….

104

4.2.5.

pH môi tr

ng nuôi cấy………………………………………………….

104

4.2.6.

Ngu n các on……………………………………………………………..

105

4.2.7.

Ngu n ni t ……………………………………………………………….

105

4.2.8.

Môi tr

106

4.3.

Phân tích trình t gen chiA và cấu trúc mô phỏng c a protein

ng thay th ……………………………………………………..

ChiA ……………………………….……………………………….

107

4.4.

Biểu hiện rChiA trong vi khu n E. coli BL21 (DE3)……………

108

4.4.1.

Bi u hiện rChiA trong vi khu n…………………………………………

108

4.4.2.

T i u i u kiện bi u hiện………………………………………………..

109

4.4.3.

T i u kh năng i u hiện rChiA bằng ph

ng pháp

mặt áp

ng………………………………………………………………………

112


vii

4.4.4.

Tinh s ch và xác ịnh ho t tính c a chitinase tái t h p……………

113

4.5.

Nghiên cứu tính chất c a chitinase tái tổ h p……………………

114

4.5.1.

Nhiệt ộ t i u và ộ b n nhiệt…………………………………………

114

4.5.2.

pH t i u và ộ b n pH…………………………………………………

115

4.5.3.

Ảnh h

ng c a ion kim lo i và EDTA lên ho t t nh chitin s ………

115

4.5.4.

Ảnh h

ng c

chất t y rử ..............................................................

116

4.5.5.

Ảnh h

ng c a dung môi hữu c ......................................................

117

4.5.6.

Động học c a ph n ng enzym........................................................

117

4.5.7.

S n ph m c a s th y ph n c chất b i chitinase.............................

118

4.6.

Th

nghiệm khả năng kháng nấm gây bệnh th c vật và tăng

hoạt tính diệt sâu c a chitinase tái tổ h p......................................

118

4.6.1.

Kh năng kháng nấm gây bệnh th c v t c a chitinase tái t h p.....

118

4.6.2.

Hỗ tr ho t tính diệt sâu Bộ cánh v y c a chitinase tái t h p.........

119

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................

122

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN...

123

TÓM TẮT KẾT QUẢ LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH.……….

124

TÀI LIỆU THAM KHẢO……….………………………………..

130

PHỤ LỤC


viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ch viết tắt
Bp
BSA
BT
Bt
Btk
Colloidal chitin
cs
chiA
ĐC
dH2O
DNA
dNTP
DNS
E. coli
EDTA

EtBr
g/l
GlcNAc
(GlcNAc)2
(GlcNAc)3
(GlcNAc)4
IPTG

Ch viết ầy
Base pair
Bovine serum albumin – albumin huyết thanh bò
Chế phẩm Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis serovar kurstaki
Chitin dạng keo
Cộng sự
Gen mã hóa chitinase
Đối chứng
Nước khử ion
Deoxyribonucleic acid
deoxyribo Nucleotide 5‟- Triphosphate
3,5 - dinitrosalicylic
Escherichia coli
Ethylene diamine tetra- acetic acid
Ethidium Bromide
Gam/lít
N-acetyl-D-glucosamine
Diacetyl-chitobiose
Triacetyl-chitotriose
Tetraacetyl-chitotetraose

Isopropyl-β-D-thiogalactoside – chất cảm ứng

Kana

Kanamycine

kb

Kilo base

kDa
LB
MTCS
OD
PCR

Kilo Dalton
Luria –Bertani – môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường cơ sở
Optical density - mật độ quang học
Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi


ix

PDA
rChiA
SDS
SDS-PAGE
Sol

TAE
TE
U
v/p
X-gal

Môi trường khoai tây
Chitinase tái tổ hợp
Sodium dodecyl sulphate
Điện di trên gel polyacrylamide có chứa sodium
doecyl sulfat
Solution – dung dịch
Tris acetic acid EDTA
Tris EDTA
Unit - đơn vị
Vòng/phút
5- bromo- 4 Cloro- 3 indolyl β- d galactoside


x

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1.

Thành phần các môi trường nuôi cấy…………………………

40

Bảng 2.2.

Thành phần và nồng độ các loại dung dịch…………………..

41

Bảng 3.1.

Kết quả phân lập và kết quả xác định hình dạng tinh thể của
các chủng Bt phân lập…………………………………………

60

Bảng 3.2.

Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh…………………

62

Bảng 3.3.

Hoạt tính thủy phân chitin của các chủng Btk………………..

64

Bảng 3.4.

Hoạt tính kháng nấm của các chủng sinh chitinase…………..

66

Bảng 3.5.

Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide và amino acid……….

72

Bảng 3.6.

Sinh trưởng của tế bào và hoạt tính enzym ở các nhiệt độ cảm
ứng khác nhau………………………………………………...

79

Bảng 3.7.

Kết quả của 20 thí nghiệm cho 3 yếu tố ảnh hưởng………….

84

Bảng 3.8.

Kết quả phân tích hồi quy hoạt độ chitinase…………………

85

Bảng 3.9.

Kết quả kiểm tra giữa mô hình và thực nghiệm………………

88

Bảng 3.10.

Kết quả tinh sạch chitinase tái tổ hợp………………………...

90

Bảng 3.11.

Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính
enzym của rChiA…………………………………………….

92

Bảng 3.12.

Các thông số động học của rChiA với các cơ chất khác nhau..

95

Bảng 3.13.

Nồng độ gây chết 50% (LC50) của protein tinh thể Cry và
rChiA…………………………………………………………..

98


xi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1.

Sơ đồ cấu tạo tế bào Bt……………………………………..

Hình 1.2.

Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bt với kháng nguyên

6

tiêm mao H……………………………..…………………...

6

Hình 1.3.

Cấu trúc không gian họ chitinase 19….…………………….

14

Hình 1.4.

Sự tương đồng vùng xúc tác của chiA74 với chitinase của
các loài khác…………………..…………………………….

16

Hình 1.5.

Cơ chế hoạt động của enzym chitinase ở Trichoderma.……

17

Hình 2.1.

Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng N-acetyl glucosamine
theo phương pháp Miller…………………………………..

44

Hình 2.2.

Đồ thị đường chuẩn hàm lượng BSA theo Bradford………

45

Hình 2.3.

Sơ đồ nghiên cứu…………………………………………..

57

Hình 3.1.

Bản đồ 7 vùng địa lý của Việt Nam……………………….

58

Hình 3.2.

Khuẩn lạc vi khuẩn Bt trên môi trường MPA sau 72 giờ
nuôi cấy……………………………………………………

59

Hình 3.3.

Hình dạng tinh thể dưới kính hiển vi của một số chủng Bt..

61

Hình 3.4.

Hình ảnh ngưng kết của Bt với huyết thanh đ c hiệu 4D4...

63

Hình 3.5.

Hình ảnh sàng lọc hoạt tính thủy phân chitin của một số
chủng Bt (A) và hoạt tính chitinase của 11 chủng Bt có
đường kính vòng phân giải ≥ 25mm (B)…..……………….

Hình 3.6.

Kết quả sàng lọc gen chiA t các chủng Btk phân lập ở Hà
Nội…………………………………….…………………….

Hình 3.7.

67

Ảnh hưởng của nguồn cơ chất (A) và nồng độ cơ chất (B)
lên khả năng sinh tổng hợp chitinase………………………

Hình 3.10.

66

Ảnh hưởng của thời gian (A) và nhiệt độ nuôi cấy (B) lên
khả năng sinh tổng hợp chitinase…………………………..

Hình 3.9.

65

Ảnh kháng nấm R. solani (A) và F. oxysporum (B) của các
chủng Btk…………………………………………………..

Hình 3.8.

65

68

Ảnh hưởng của pH môi trường (A) và nguồn các bon (B)
lên khả năng sinh tổng hợp chitinase………………………

69

xii

Hình 3.11.

Ảnh hưởng của nguồn ni tơ lên khả năng sinh tổng hợp
chitinase……………………………………………………

Hình 3.12.

70

Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen chiA t các dòng
khuẩn lạc trắng (A) và điện di sản phẩm cắt DNA plasmid
tách chiết t các khuẩn lạc dòng pGEM-Teasy/MSS1.1 trên
gel 1% agarose (B)……………………………………...…..

Hình 3.13.

So sánh trình tự nucleotide đoạn gen chiA của chủng B.
thuringiensis MSS1.1 với trình tự EF581163.2……………

Hình 3.14.

71
73

So sánh trình tự amino acid của chủng B. thuringiensis
serovar

kurstaki

MSS1.1

với

trình tự có mã số

ABQ65137.2 trên ngân hàng dữ liệu………………………

73

Hình 3.15.

Cấu trúc 3 vùng của protein ChiA…………………………

74

Hình 3.16.

Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện gen chiA………

75

Hình 3.17.

Điện di đồ gen chiA (A) và vector pET28b(+) tinh sạch (B)

76

Hình 3.18.

Kết quả PCR khuẩn lạc các dòng biến nạp mang gen chiA
với c p mồi đ c hiệu (A) và cắt vector tái tổ hợp
pET28b/chiA với EcoRI và XhoI (B)………………...….....

77

Hình 3.19.

Phổ điện di protein trên gel SDS-PAGE …….……………..

77

Hình 3.20.

Phân tích Western blot (A) và kết quả kiểm tra hoạt tính
chitinase của dịch chiết protein tái tổ hợp trên đĩa thạch
(B)…………..………………………………………………

Hình 3.21.

Phổ điện di protein ChiA tái tổ hợp biểu hiện ở các nhiệt độ
khác nhau………………………………………………..

Hình 3.22.

78
80

Kết quả điện di protein ChiA tái tổ hợp biểu hiện ở các
nồng độ IPTG khác nhau (A) và ảnh hưởng của nồng độ
chất cảm ứng đến hoạt tính protein tái tổ hợp (B)…………

Hình 3.23.

Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng (A) và mật độ tế bào (B)
đến hoạt tính protein tái tổ hợp…………………………….

Hình 3.24.

81
82

Ảnh hưởng của nồng độ lactose đến hoạt tính chitinase,
sinh trưởng của chủng E. coli tái tổ hợp (A) và phổ điện di
protein tái tổ hợp khi cảm ứng bằng lactose (B)……………

83


xiii

Hình 3.25.

Bề m t đáp ứng của t ng c p các yếu tố ảnh hưởng đến
sinh tổng hợp chitinase của chủng E. coli tái tổ hợp.………

Hình 3.26.

87

Điện di SDS-PAGE chitinase tinh sạch (A); kiểm tra hoạt
tính chitinase bằng Zymogram (B) và phân tích Western
blot (C)……………………...……………………...……….

90

Hình 3.27.

Nhiệt độ tối ưu (A) và độ bền nhiệt (B) của rChiA………...

91

Hình 3.28.

pH tối ưu (A) và độ bền pH (B) của rChiA …………..……

91

Hình 3.29.

Ảnh hưởng của chất tẩy rửa (A) và dung môi hữu cơ (B)
lên hoạt tính enzym của rChiA……………………………..

Hình 3.30.

93

Biến đổi vận tốc phản ứng theo nồng độ chitin (A) và 4MU-(GlcNAc)3 (C). Đồ thị Linewever-Burk của rChiA với

cơ chất chitin (B) và cơ chất 4-MU-(GlcNAc)3 (D)………..

Hình 3.31.

Phân tích bản mỏng (TLC) các sản phẩm thủy phân chitin
bởi chitinase………………………………………………...

Hình 3.32.

96

Sợi nấm F. oxysporum, R. solani và Mucor sp. khi xử lý
với enzym đã bất hoạt (A, C, E) và với rChiA (B, D, F)..….

Hình 3.34.

95

Sự ức chế phát triển nấm F. oxysporum (A), R. solani (B)
và Mucor sp. (C) của rChiA sau 3 ngày…………………….

Hình 3.33.

94

97

Thử nghiệm khả năng diệt sâu tơ (A) và sâu khoang (B)
của protein tinh thể Cry, rChiA…………………………….

98

Hình 3.35

Hình ảnh thử sâu tơ (A) và sâu khoang (B)…………..……

98

Hình 4.1.

Cấu trúc không gian mô phỏng của protein ChiA t chủng Btk
MSS1.1…………….………………………………………….

107


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn ề
Trong nhiều năm qua, thuốc tr

sâu sinh học t

vi khuẩn Bacillus

thuringiensis (Bt) đã được nghiên cứu và ứng dụng để diệt tr các loại côn trùng hại
cây trồng và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Cùng với sự phát triển kinh tế - xã hội,
nhu cầu sử dụng các sản phẩm nông nghiệp sạch, hạn chế mức thấp nhất thuốc tr
sâu hóa học trong sản xuất nông nghiệp của con người ngày càng cao. Thuốc tr sâu

sinh học Bt đã được sử dụng, do chúng khắc phục được tính kháng thuốc của côn
trùng và chỉ diệt các loài côn trùng có hại mà không ảnh hưởng đến môi trường sinh
thái cũng như sức khỏe con người.
Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn Bt sản sinh một số chất chuyển hóa có
tiềm năng ứng dụng như: enzym thủy phân chitin (chitinase) và chất kháng sinh.
Các sản phẩm chuyển hóa này có thể ức chế vi khuẩn gây bệnh qua thực phẩm ho c
kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh như vi khuẩn, nấm. Vì vậy, việc tạo
ra một lượng lớn enzym, đ c biệt là chitinase bổ sung vào chế phẩm sinh học Bt để
tăng hoạt tính diệt côn trùng là rất cần thiết.
Chitinase (EC 3.2.1.14) thuộc nhóm enzym thủy phân, xúc tác quá trình phân
hủy cơ chất chitin không tan trong nước thành các sản phẩm chitin-oligosaccharide
hòa tan trong nước thông qua quá trình thủy phân liên kết β-(1,4)- glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Hiện nay,
chitinase được ứng dụng chủ yếu trong sản xuất chitooligosaccharide, nano-chitin,
N-acetyl-D-glucosamine. Đây là những sản phẩm giá trị ứng dụng cao và được sử
dụng trong thực phẩm, nông nghiệp, y dược. Ngoài ra, chitinase đ c biệt là
endochitinase còn được sử dụng như thuốc tr sâu sinh học trong nông nghiệp nhờ
khả năng phân hủy chitin cấu trúc trong thành tế bào của nấm, côn trùng gây bệnh
và xử lý các chất thải giàu chitin... Do kiểu phân cắt mà endochitinase phân cắt cơ
chất chitin và vách tế bào nấm chứa chitin tốt hơn so với chitobiosidase và N –
acetylglucosaminidase. Vì vậy, việc phân lập tìm ra chủng Bt sinh endochitinase


2

cao và qui trình tạo ra endochitinase có hoạt tính cao bằng công nghệ gen nhằm góp
phần tăng hiệu quả của chế phẩm sinh học là rất cần thiết.
Xuất phát t

những lý do trên, chúng tôi tiến hành lựa chọn đề tài luận án:

“Tách d ng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất c a endochitinase từ Bacillus
thuringiensis phân lập ở Việt Nam”.
2. M c tiêu nghiên cứu
2.1. M c tiêu chung
Tuyển chọn được chủng vi khuẩn B. thuringiensis bản địa có khả năng sinh
chitinase cao và biểu hiện được chitinase tái tổ hợp trong E. coli phục vụ nghiên
cứu sản xuất chế phẩm hỗ trợ khả năng diệt côn trùng của chế phẩm BT và ức chế
nấm hại cây trồng.
2.2. M c tiêu c thể
(1) Sàng lọc và thu nhận được chủng vi khuẩn B. thuringiensis Việt Nam có
khả năng sinh tổng hợp chitinase cao và xác định được trình tự nucleotide của gen
mã hóa chitinase t chủng vi khuẩn Bt đã tuyển chọn.
(2) Biểu hiện và tinh sạch được chitinase tái tổ hợp (rChiA) trong E. coli BL21
(DE3).
(3) Đánh giá được tác dụng tương hỗ của chitinase tái tổ hợp với protein tinh
thể Cry trong diệt côn trùng và khả năng ức chế nấm gây bệnh thực vật.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Phân lập và nghiên cứu đ c điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn B.
thuringiensis Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao;
(2) Nghiên cứu một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp
chitinase của chủng B. thuringiensis tuyển chọn;
(3) Nghiên cứu tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa chitinase phân lập
t chủng B. thuringiensis tuyển chọn;
(4) Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chitinase t chủng B. thurigiensis tuyển
chọn được và tinh sạch chitinase tái tổ hợp;
(5) Nghiên cứu một số tính chất hóa lý của chitinase tái tổ hợp;


3

(6) Nghiên cứu khả năng ức chế nấm gây bệnh thực vật của chitinase tái tổ
hợp và tác dụng hỗ trợ của chitinase đối với khả năng diệt côn trùng của protein tinh
thể Cry.
4. Nh ng

ng g p mới c a luận án

(1) Tuyển chọn được 36 chủng vi khuẩn B. thuringiensis Việt Nam có khả
năng sinh tổng hợp chitinase cao.
(2) Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ
thống về endochitinase (tự nhiên và tái tổ hợp) t chủng B. thuringiensis serovar
kurstaki MSS1.1 của Việt Nam có khả năng bảo vệ kép (Dual control) - v a kháng
nấm Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani gây bệnh thực vật v a tăng hoạt tính
diệt côn trùng của chế phẩm BT nhằm phục vụ cho phát triển thuốc tr sâu bệnh
sinh học thế hệ mới.
(3) Bổ sung cơ sở dữ liệu nguồn gen chitinase của các chủng B. thuringiensis
Việt Nam phục vụ cho nghiên cứu, đào tạo và ứng dụng sau này.
5. Ý nghĩa khoa học và th c tiễn c a ề tài
5.1. Ý nghĩa khoa học
Bổ sung thêm cơ sở dữ liệu về gen mã hóa chitinase t các chủng vi khuẩn
phân lập ở Việt Nam, làm cơ sở khoa học và nguyên liệu di truyền để tạo các chủng
vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp và thu hồi chitinase cao hơn so với
chủng tự nhiên, có thể ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. Kết quả của luận án
còn góp phần phát triển công nghệ lên men vi sinh vật tái tổ hợp sản xuất chitinase
có hiệu suất cao.
Công trình đã làm phong phú thêm thông tin trong lĩnh vực công nghệ enzym
nhờ những nghiên cứu về sinh tổng hợp, tinh sạch, đ c tính lí hóa và định hướng
ứng dụng của chitinase.
5.2. Ý nghĩa th c tiễn
Kết quả luận án góp phần khai thác có hiệu quả tiềm năng nguồn gen vi sinh

vật trong nước nói chung và gen chiA nói riêng nhằm tạo ra các sản phẩm enzym
công nghiệp có giá trị ứng dụng trong các lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp,


4

hướng tới phát triển công nghệ sạch và sản phẩm sạch có ích cho sức khỏe con
người, không gây ô nhiễm môi trường.
Tạo được chủng E. coli tái tổ hợp biểu hiện cao chitinase t

chủng B.

thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 của Việt Nam và bước đầu nghiên cứu phát
triển chế phẩm sinh học BT diện côn trùng và nấm gây bệnh nhằm hỗ trợ và thay
thế thuốc tr sâu hóa học.


5

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khu n Bacillus thuringiensis
l

c v B. thuringiensis

Bacillus thuringiensis (Bt) là vi khuẩn đất thuộc chi Bacillus, môi trường sống
chính của Bt gồm đất, côn trùng, hạt ngũ cốc, bề m t thực vật. B. thuringiiensis có
dạng hình que, gram dương, hô hấp hiếu khí ho c kị khí không bắt buộc, sinh bào
tử, bào tử hình oval, trong quá trình hình thành bào tử hầu hết các chủng Bt đều

tổng hợp protein tinh thể. Tinh thể có kích thước 0,6 - 2 µm, có hình dạng không cố
định có thể là hình lập phương, hình lưỡng tháp ho c hình cầu. Tinh thể có thể
chiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào. Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm
coomassie brilliant blue và quan sát dưới kính hiển vi, tinh thể Bt bắt màu xanh đậm
còn bào tử bắt màu xanh nhạt. Trong môi trường lỏng Bt có khả năng chuyển động
nhờ các lông roi trên bề m t tế bào (Hình 1.1) (Ngô Đình Bính, 2011). Bt có khả
năng sinh trưởng, phát triển trong khoảng nhiệt độ 20 - 40ºC, nhiệt độ tối ưu là 28 32ºC, Bt phát triển tối ưu ở pH = 7.
Bt được phân loại theo nhiều phương pháp khác nhau: dựa trên đ c điểm hình
thái và đ c điểm sinh hoá, theo ngoại hình enzym lipase, theo typ huyết thanh kháng
nguyên - O, theo typ huyết thanh kháng protein tinh thể, theo typ huyết thanh kháng
nguyên - H, theo nguồn bệnh và theo gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng.
Trong đó, phương pháp phân loại theo de Barjac và Bonnefoi dựa trên nguyên lý
của phản ứng kháng nguyên - kháng thể được sử dụng rộng rãi (khi kháng nguyên
tiêm mao kết hợp với kháng thể xảy ra phản ứng ngưng kết tạo c n lắng màu trắng
xuống đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường. Dưới kính hiển vi quang
học ho c đối pha có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động
được (Hình 1.2). Đến năm 1999, đã phát hiện được 69 typ huyết thanh bao gồm 82
thứ huyết thanh khác nhau của Bt (de Barjac và Bonnefoi, 1962).


6

Axit nucleic
Màng tế bào

Thành tế bào

Tiêm mao

Ribosome

Plasmide

Mezosome

Hình

đồ cấu tạo tế bào B. thuringiensis
(Ngu n: Ngô Đ nh nh, 2011

Tế bào vi khuẩn Phân tử kháng thể
với kháng nguyên với hai vị trí liên
bề m t
kết đ c hiệu

Hình

Phản ứng ngưng kết
2 Phản ứng ng ng kết của vi khuẩn Bt với kháng nguyên tiêm mao H

Ngu n: Ngô Đ nh

nh, 2011

Các tinh thể protein được hình thành trong quá trình tạo bào tử, chúng được
tạo thành t một ho c một vài gen cry (crystal) và gen cyt (cytolytic) mã hóa tinh
thể độc nằm trên các plasmid lớn và một số ít xuất hiện cả trên nhiễm sắc thể. Tùy
theo thành phần protein cấu tạo khác nhau mà các tinh thể có hình dạng khác nhau.
Hầu hết các tinh thể có hoạt tính với côn trùng bộ cánh vảy có dạng hình lưỡng
tháp, tinh thể có hoạt tính với côn trùng bộ hai cánh có dạng hình cầu, tinh thể có

hoạt tính với côn trùng bộ cánh cứng có dạng hình cầu, hình khối lập phương.
Ngoài ra, trong quá trình sinh trưởng, phát triển vi khuẩn Bt còn sản sinh chất
chuyển hóa có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: môi trường,
thực phẩm, y tế, nông nghiệp, công nghiệp, công nghệ sinh học…đó chính là enzym


7

thủy phân chitin (chitinase).
Hiện nay, trên thế giới có khoảng 38 gen chitinase đã được công bố thuộc các
dưới loài khác nhau như: kenyea, pakistani, colmeri, canadiensis, entomocidus,
kurstaki, israelensis và konkukian. Trong đó chủ yếu được tách dòng ở Trung Quốc
(55%), còn lại là ở Mexico, M , Ai Cập, Thổ Nhĩ Kỳ, Thái Lan, Ấn Độ, Pakistan,
Tunisia và Hàn Quốc ().
2

phát tri n v ứng

ng của chitinase t B thuringiensis trên thế giới

Enzym thủy phân chitin (chitinase) t

Bt được biết đến t

đầu những năm

1970 do tác dụng tương hỗ giữa chitinase và thuốc tr sâu sinh học. Ấu trùng của
Choristoneura fumiferana gây bệnh trên cây thông khi xử lý với hỗn hợp Btchitinase thì chết nhanh hơn và nhiều hơn khi xử lý với một mình chitinase ho c Bt
(Smirnoff, 1973; Morris, 1976). Trộn chitinase với Bt cho thấy t lệ chết của bướm
đêm (Lymantria dispar) tăng nhanh hơn khi thử nghiệm chỉ với Bt (Dubois, 1977).

Hoạt tính diệt ấu trùng sâu bướm tăng khoảng 5 lần khi có sự tương trợ của
chitinase vi khuẩn Bt (Gunner et al., 1985). Độc tính với Spodoptera littoralis đã
tăng đáng kể khi sử dụng hỗn hợp độc tố Bt tái tổ hợp ở nồng độ thấp và
endochitinase t Serratia marcescens (Regev et al., 1996).
Để tăng hiệu quả diệt côn trùng của độc tố Bt và khắc phục tính kháng thuốc
của côn trùng gây hại, các nhà nghiên cứu đã sử dụng hỗn hợp giữa protein độc tố
với chitinase làm tăng hiệu quả của Cry1Ac chống ấu trùng Helicoverpa armigera
và Cry1C chống Spodoptera littoralis (Regev et al., 1996).
Độc tính của hỗn hợp bào tử và tinh thể t chủng B. thuringiensis var. kurstaki
HD-1 đối với ấu trùng sâu bướm tăng lên rõ rệt khi bổ sung chitinase t Bt, đồng
thời đối với côn trùng thử nghiệm xuất hiện tổn thương và sự phân hủy tế bào ở tế
bào biểu mô ruột giữa (Wiwat et al., 2000).
Năm 2002, Liu và cộng sự đã chứng minh chitinase sản sinh t Bt. pakistani
có khả năng làm tăng hoạt tính diệt ấu trùng Spodoptera exigua của chủng Bt
DL5789 lên 2,35 lần (Liu et al., 2002).
Năm 2003, Lertcanawanichakul và cộng sự đã chuyển gen chitinase vào chủng


8

vi khuẩn Bt. aizawai, kết quả thu được hoạt tính chitinase tăng gấp 15 lần và độc
tính đối với ấu trùng bướm đêm cũng cao hơn so với bố m . Cũng trong năm này,
Arora và cộng sự đã biểu hiện gen chitinase tách t chủng Bt HD-1 trong E. coli,
sau đó sử dụng chitinase tái tổ hợp kết hợp với protein Vip của Bt để tăng hoạt tính
chống lại ấu trùng sâu khoang - Spodoptera litura.
Năm 2004, Reyes-ramirez và cộng sự đã nghiên cứu và chứng minh chitinase
t Bt. israelensis ức chế 100% nấm Sclerotium rolfsii, ức chế 55 - 82% đối với các
loài nấm gây bệnh khác như: A. terreus, A. flavus, Nigrospora sp., Rhizopus sp., A.
niger, Fusarium sp., A. candidus, Absidia sp. và Helminthosporium sp., 45% đối
với Curvularia sp. và 10% với nấm A. fumigatus. Khi hạt đậu tương bị nhiễm nấm

S. rolfsii, tỉ lệ nảy mầm đã giảm t 93% xuống 25%, nhưng khi bổ sung chitinase
(0,8 U/mg protein) tỉ lệ nảy mầm tăng lên đến 90%.
Năm 2005, Driss và cộng sự đã tìm ra gen chitinase chi255 là một gen mới t Bt.
kurstaki, enzym này được xếp vào lớp chitobiosidase và có hoạt tính kháng nấm cao.
Năm 2007, Kamil và cộng sự đã phân lập được chủng Bt MS4 sinh chitinase ở
mức độ cao và kháng mạnh với loài nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh thực vật.
Năm 2011, Usharani phân lập được gen exochitinase có kích thước 1129bp,
mã hóa 360 axit amin và kháng 4 loại nấm gây bệnh thực vật.
Năm 2012, Gomaa đã chứng minh được chitinase t
chitinase t

Bt có hiệu quả hơn

B. licheniformis trong việc làm tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu lây

nhiễm nấm gây bệnh. Cũng trong năm này Kuzu và cộng sự đã phân lập được
chủng B. thuringiensis subsp. kurstaki HBK-51 t

đất. Chủng Bt này sản sinh

chitinase có khả năng chịu nhiệt và kiềm (ở 110ºC, hoạt tính còn lại 96% và ở pH 912 thì còn lại 98% hoạt tính). Vì vậy, đây được coi là một chủng rất quan trọng có
thể sử dụng như nhà máy sản xuất chitinase, ứng dụng trong một số lĩnh vực quan
trọng (Kuzu et al., 2012).
Vào năm 2015, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập gen chiA mã hóa
chitinase họ 18 t chủng B. thuringiensis YBT-9602, rồi tiến hành gây đột biến gen
và biểu hiện trong E. coli. Hoạt tính thủy phân chitin của đột biến ChiW50A tăng


9

60% với yêu cầu về pH, nhiệt độ, ion kim loại tương tự như chủng dại. Hơn
nữa, đột biến ChiW50A thể hiện khả năng kiểm soát sâu bệnh và hoạt động
kháng nấm. Tác động cộng hưởng đáng kể của đột biến này với các chế phẩm
bào tử - tinh thể của B. thuringiensis chống lại ấu trùng Helicoverpa armigera
và Caenorhabditis elegans và khả năng ức chế sự phát triển một số nấm gây
bệnh thực vật (Ni et al., 2015).
Qua thời gian dài phát triển đến năm 2016, gen chiA mã hóa endochitinase của
chủng B. thuringiensis subsp. tenebrionis DSM-2803 đã được tạo dòng và biểu hiện
trong E. coli. Protein tái tổ hợp có gắn thêm đoạn 6-Histidine được tinh sạch bằng
sắc ký ái lực. Emzym tái tổ hợp tinh sạch có tác dụng làm giảm sự tăng trưởng của
nấm Colletotrichum gloeosporioides – tác nhân gây bệnh thán thư ở thực vật (de la
Fuente-Salcido et al., 2016).
Dựa vào khả năng diệt côn trùng của vi khuẩn Bt, các nghiên cứu hiện nay
phát triển theo các hướng chính: đi sâu khai thác nguồn gen của vi khuẩn Bt để
phát triển chế phẩm sinh học diệt côn trùng và cung cấp nguyên liệu cho công
tác chuyển gen kháng sâu bệnh vào cây trồng; tìm hiểu vai trò của hệ enzym
(chitinase, protease, lipase, amylase) do vi khuẩn Bt sinh ra trong quá trình sinh
trưởng phát triển.
Các nghiên cứu về chitinase t

vi khuẩn Bt đã được thực hiện theo một số

hướng chính sau: 1) nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase; 2) tinh sạch và
xác định hoạt tính diệt côn trùng, khả năng kháng nấm của chitinase; 3) hiệu suất
tiết protein chitinase trong E. coli; 4) tối ưu quá trình sinh tổng hợp chitinase. Tuy
nhiên, hoạt tính chitinase thu được còn thấp. M t khác, ở các điều kiện môi trường
khác nhau thì quá trình sinh chitinase của các chủng Bt luôn thay đổi. Vì vậy, quá
trình nghiên cứu đầy đủ về chitinase t khâu phân lập chủng Bt có khả năng sinh
chitinase đến việc lựa chọn điều kiện môi trường thích hợp cho việc nâng cao khả
năng tổng hợp chitinase, xác định các điều kiện ảnh hưởng tới hoạt tính enzym;

cũng như việc nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase t vi khuẩn Bt trong E.
coli để nâng cao hoạt tính thủy phân chitin nhằm hỗ trợ hoạt tính diệt sâu của chế


10

phẩm BT và khả năng kháng nấm gây bệnh thực vật là hướng nghiên cứu cần thiết
để tăng hiệu quả của chế phẩm sinh học.
1.2. Chitinase t nhiên
Chitinase là enzym xúc tác quá trình phân hủy cơ chất chitin không hòa tan
trong nước thành các sản phẩm chitooligosaccharide hòa tan trong nước thông qua
quá trình thủy phân liên kết glucosyl.
Chitin là một polysacharide mạch thẳng không cuộn xoắn, có màu trắng,
cứng và không đàn hồi được tạo nên t

các đơn phân N-acetyl glucosamine

thông qua liên kết 1,4-β glycoside. Chitin là chất hữu cơ đứng thứ 2 trong tự
nhiên sau cellulose.
Công thức phân tử của chitin: (C8H13 O5 N)n. Khối lượng phân tử: (203,09)n
với thành phần các nguyên tố: C = 47,29%; H = 6,4%; O = 39,4%; N = 6,91%.
Ở dạng tinh khiết chitin thường dai, nhưng khi tham gia vào thành phần cấu
tạo ở hầu hết các động vật không xương chitin lại là nguyên liệu tổng hợp. Trong vỏ
giáp xác và động vật thân mềm, chitin kết hợp với canxi carbonate tạo thành hỗn
hợp bền vững hơn. Sự kết hợp này giúp cho chitin cứng và đ c hơn so với dạng tinh
khiết, đồng thời bền vững và ít giòn hơn so với canxi carbonate.
Trong tự nhiên, chitin gồm 3 dạng cấu trúc là , β và -chitin. Ở dạng -chitin,
các chuỗi polysaccharide xuôi và ngược được xếp xen k nhau, việc sắp xếp này
làm cho liên kết hydro trở lên mạnh m hơn, do đó làm cho nó ổn định hơn
(Sikorski et al., 2009). Đây là dạng phổ biến nhất trong tự nhiên. Dạng -chitin là

thành phần cấu tạo nên bộ xương ngoài của côn trùng, giáp xác, nhuyễn thể và vách
tế bào của nấm. Dạng β-chitin thường hiếm hơn, có cấu trúc song song gồm các
chuỗi polysaccharide xếp cùng hướng, xen k nhau và tồn tại ở dạng liên kết với
protein. Loại β thu được chủ yếu t động vật thân mềm như mực. Trong khi đó loại
-chitin được hình thành t hỗn hợp hai loại -chitin và β-chitin, cụ thể là 2 chuỗi
xuôi xen k với 2 chuỗi ngược.
Chitin là thành phần chính trong bộ xương ngoài của một số loài động vật
không xương sống (giáp xác, côn trùng, nhện) và thành tế bào của hầu hết vi nấm