Nghiên cứu quá trình tiền xử lý, thủy phân và lên men đồng thời tạo ethanol từ thân chuối bằng nấm men kluyveromyces marxianus cố định trong gel alginate

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HÒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

MAI THỊ HỒNG DIỄM

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ, THỦY PHÂN VÀ
LÊN MEN ĐỒNG THỜI TẠO ETHANOL TỪ THÂN CHUỐI
BẰNG NẤM MEN KLUYVEROMYCES MARXIANVS
CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE

Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm
Mã số: 60 54 01 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Tp.Hồ Chí Minh, Tháng 01 năm 2017


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG TP.HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Tôn Nữ Minh Nguyệt
Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS. Hoàng Kim Anh
Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Huỳnh Tiến Phong
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG TPHCM
ngày 12 tháng 01 năm 2017.
Thành phần hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. GS.TS. Lê Văn Việt Mẩn

- Chủ tịch

2. PGS.TS. Hoàng Kim Anh

- Phản biện 1

3. TS. Huỳnh Tiến Phong

- Phản biện 2

4. PGS. TS. Ngô Đại Nghiệp

- ủy viên

5. TS. Võ Đình Lệ Tâm

- ủy viên, thư ký

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận văn và Trưởng khoa quản lý
chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa.
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên:Mai Thị Hồng Diễm

MSHV: 7141008

Ngày, tháng, năm sinh: 09 - 01 - 1990

Nơi sinh: Tây Ninh

Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm
Mã số: 60540101
I. Tên đề tài: Nghiên cứu quá trình tiền xử lý, thủy phân và lên men đồng thời tạo
ethanol từ thân chuối bằng nấm men Kluyveromyces marxỉanus cố định trong gel alginate
II. Nhiệm vụ và nội dung:
Nhiệm vụ
•

Tiền xử lý bột thân chuối bằng phương pháp hóa học.

•

Cố định nấm men Kluyveromyces marxỉanus trong gel alginate.

• Khảo sát ảnh hưởng của enzyme Viscozyme Cassava c trong quá trình thủy
phân và lên men đồng thời bột thân chuối đã tiền xử lý.
Nội dung
•

Tìm điều kiện tiền xử lý thích hợp cho bột thân chuối sử dụng dung dịch

H2SO4 và

•

dung dịch NaOH.

Xác định điều kiện cố định nấm men Kluyveromyces marxianus ttong gel
alginate phù hợp với quá trình thủy phân và lên men đồng thời bột thân
chuối đã qua tiền xử lý.

•

Khảo sát quá trình thủy phân và lên men đồng thời bột thân chuối đã qua
tiền xử lý sử dụng nấm men Kluyveromyces marxianus cố định trong gel
alginate.

III. Ngày giao nhiệm vụ: 04 - 07 - 2016
IV. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 04 - 12 - 2016
V.

Cán bộ hướng dẫn: TS. Tôn Nữ Minh Nguyệt
Tp. HCM, ngày 02 tháng 01 năm 2017


CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA

LỜI CẢM ƠN
Trong khoảng thời gian thực hiện luận văn, tôi đã gặp phải những khó khăn nhất
định nhưng với sự quan tâm, giúp đỡ của thầy cô và bạn bè tôi đã hoàn thành luận văn.
Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô TS. Tôn Nữ Minh Nguyệt. Cô
đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
thực hiện luận văn.
Kế đến, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã động viên, ủng hộ tôi,
giúp tôi chinh phục những thử thách và hoàn thành ước mơ của mình.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô trong bộ môn Công
Nghệ Thực Phẩm nói riêng và khoa Kỹ Thuật Hóa Học nói chung đã giảng dạy, hỗ trợ
những kiến thức giúp tôi có thể vừa hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng không quên gửi lời cảm ơn đến bạn Nguyễn Vương Thanh Thão, bạn
Nguyễn Thị Yến, bạn Trần Minh Sanh và các anh chị, ban bè trong lớp CH2014 -2 đã
đồng hành, giúp đỡ tôi trong học tập cũng như thực hiện luận văn này.
Tp. HCM, tháng 01 năm 2017

Mai Thị Hồng Diễm


TÓM TẤT LUẬN VĂN
Với mục đích sử dụng thân chuối làm cơ chất cho quá trình thủy phân, lên men
đồng thời tạo ethanol sử dụng nấm men Kluyveromyces marxianus cố định trong gel
alginate, nội dung nghiên cứu của luận văn này gồm 2 phần:
Phần 1: nghiên cứu quá trình tiền xử lý thân chuối với dung dịch NaOH, dung
dịch H2SO4. Khảo sát các yếu tố như nồng độ dung dịch, nhiệt độ và thời gian tiền xử
lý. Thân chuối đã tiền xử lý sẽ được tiến hành thủy phân với enzyme Viscozyme
Cassava c nhằm đánh giá hiệu quả tiền xử lý, chọn ra điều kiện tiền xử lý cho hiệu quả
cao nhất.
Phần 2: khảo sát điều kiện cố định nấm men Kluyveromyces marxỉanus trong gel

alginate bao gồm nồng độ dung dịch alginte, nồng độ dung dịch CaCl2. Nấm men sau
khi cố định sẽ được lên men trong môi trường chứa glucose để đánh giá hiệu quả lên
men, mật độ nấm men tự do thoát ra. Sau khi chọn được điều kiện cố định nấm men sẽ
tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme Viscozyme Cassava c trong quá trình
thủy phân, lên men đồng thời sử dụng thân chuối sau tiền xử lý làm cơ chất.
Kết quả nghiên cứu cho thấy dung dịch NaOH tiền xử lý bột thân chuối hiệu quả
hơn dung dịch H2SO4. Qua quá trình thủy phân, bột thân chuối tiền xử lý với dung dịch
NaOH ở nồng độ 3,0%, nhiệt độ ỐO°C, thời gian ố giờ sau đạt hàm lượng đường khử
tăng 386,27% so với bột thân thân chuối không tiền xử lý. Điều kiện cố định nấm men
phù hợp là dung dịch alginate 1,0%, dung dịch CaCl2 1,0%. Sau quá trình thủy phân và
lên men đồng thời với nồng độ enzyme Viscozyme Cassava c 15 FPU/g thu được
ethanol cao nhất là 13,22 g/L. Qua đây thấy được thân chuối thích hợp làm nguyên liệu
cho quá trình thủy phân, lên men đồng thời tạo ethanol.


ABSTRACT

The objective of tills research was to use banana pseudostem as substrate for
simultaneous saccharification and fermentation for the production of ethanol using
Kluyveromyces marxianus immobilized yeast in alginate gel, the experimentation
consisted of two sections:
Section 1: the research of banana pseudostem pretreatment with NaOH, H 2SO4
solution. Investigation of factors such as the concentration of solution, temperature and
time. Pretreated banana pseudostem will be hydrolyzed with enzyme Viscozyme
Cassava c to evaluate the effectiveness of pretreatment, select the pretreatment
conditions for the highest efficiency.
Section 2: investigation the immobilized conditions of the Kluyveromyces
marxianus yeast in alginate gels including the concentration of alginte and CaCl2
solution. Immobilized yeast will be fermented with the medium containing glucose to
assess the effect of fermentation, free yeast density. After selecting immobilized

conditions, the effect on the concentration of enzyme Viscozyme Cassava c in
simultaneous saccharification and fermentation will surveyed, in wgich pretreated
banana pseudostem is used as substrates.
The experimental results showed that NaOH solution pretreated banana
pseudostem is more efficient than H2SO4 solution. After hydrolyzing, banana
pseudostem powder preheated with NaOH solution at a concenhation of 3.0%,
temperature of 60 °C, time whithin 6 hours reached a increased reducing sugar content
by 386.27% over the non preheated banana pseudostem powder. The suitable
immobilized conditions were concentration of alginate 1.0% and CaCl2 1.0% solution.
After simultaneous saccharification and fermentation which enzyme Viscozyme
Cassava c 15 FPU/g, the highest ethanol is 13.22 g/L was obtained. In sumary, banana
pseudostem is suitable material for simultaneous saccharification and fermentation for
the production of ethanol.


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu của tác giả. Các kết quả nghiên cứu và các
kết luận trong luận văn này là trung thực và không sao chép từ bất kỳ nguồn nào và dưới
bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và
ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định.


i
MỤC LỤC
MỤC LỤC ..................................................................................................................... i
DANH MỤC HÌNH..................................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................. vii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU .......................................................................................... 1
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN ........................................................................................ 2

2.1. Lignocellulose ................................................................................................ 2
2.1.1.

Cấu tạo của lignocellulose...................................................................... 2

2.1.1.1. Cellulose .......................................................................................... 2
2.1.1.2. Hemicellulose .................................................................................. 4
2.1.1.3. Lignin .............................................................................................. 5
2.1.1.4. Chất trích ly và tro ........................................................................... 7
2.1.2.

Nguyên liệu giàu lignocellulose - thân chuối ......................................... 8

2.1.2.1. Đặc điểm tự nhiên ........................................................................... 8
2.1.2.2. Thành phần hóa học của thân chuối ................................................ 8
2.1.2.3. Hiện trạng sử dụng và tiềm năng của thân chuối .......................... 10
2.2. Quá trình tiền xử lý lignocellulose ............................................................... 11
2.2.1. .....................................................................................................
Quá trình tiền xử lý lignocellulose bằng acid ............................................................. 12
2.2.2.

Quá trình tiền xử lý lignocellulose bằng kiềm ..................................... 14

2.3. Quá trình thủy phân và lên men đồng thời ................................................... 16
2.3.1.

Quá trình thủy phân .............................................................................. 16

2.3.1.1. Enzyme cellulase ........................................................................... 17
2.3.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân cellulose bằng

enzyme cellulase ........................................................................................... 18
2.3.2.

Quá trình lên men thu nhận ethanol từ lignocellulose.......................... 19

2.3.2.1. Quá trình thủy phân và lên men đồng thời .................................... 20
2.3.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân và lên men đồng
thời ............................................................................................................... 21


ii
2.3.2.3. Nam men Kluyveromyces marxianus ............................................ 22
2.3.2.4. Nấm men cố định ........................................................................... 23
2.4. Tính mới của luận văn .................................................................................. 24
CHƯƠNG 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 26
3.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị .................................................................. 26
3.1.1.

Nguyên liệu .......................................................................................... 26

3.1.2.

Hóa chất ................................................................................................ 28

3.1.3.

Thiết bị ................................................................................................. 28

3.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 30
3.2.1.

Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 30

3.2.2.

Các quy trình sử dụng trong nghiên cứu .............................................. 31

3.2.2.1. Quy trình tiền xử lý bột thân chuối ................................................ 31
3.2.2.2. Quy trình cố định nấm men Kluyveromyces marxỉanus trong gel
alginate ......................................................................................................... 33
3.2.2.3. Quy trình thủy phân và lên men đồng thời bột thân chuối đã tiền
xử lý sử dụng nấm men Kluyveromyces marxỉanus cố định trong gel alginate
....................................................................................................................... 35
3.2.3.

Thiết kế thí nghiệm............................................................................... 36

3.2.3.1. Khảo sát quá trình tiền xử lý bột thân chuối bằng phương pháp
hóa học ......................................................................................................... 36
3.2.3.2. Khảo sát quá trình thủy phân và lên men đồng thời bột thân chuối
đã tiền xử lý sử dụng nấm men Kluyveromyces marxianus cố định trong gel
alginate ......................................................................................................... 38
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch alginate và nồng độ dung dịch
CaCl2 đến quá trình cố định nấm men........................................................... 38
3.2.4.

Phương pháp phân tích ......................................................................... 40

3.2.4.1. Phân tích hoá lý.............................................................................. 40
3.2.4.2. Phân tích vi sinh ............................................................................. 41

3.2.5.

Công thức tính toán .............................................................................. 41

3.2.6.

Phương pháp xử lý số liệu .................................................................... 41


iii
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................ 42
4.1. Thành phần hóa học của bột thân chuối ....................................................... 42
4.2. Khảo sát quá trình tiền xử lý bột thân chuối bằng phương pháp hóa học ...43
4.2.1.

Tiền xử lý bột thân chuối bằng dung dịch H2SO4.................................................... 43

4.2.1.1. Ảnh hưởng nồng độ dung dịch H2SO4 đến quá trình tiền xử lý bột
thân chuối bằng dung dịch H2SO4 .................................................................................................... 43
4.2.1.2. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tiền xử lý bột thân chuối
bằng dung dịch H2SO4 .............................................................................................................................. 45
4.2.2.

Tiền xử lý bột thân chuối bằng dung dịch NaOH ................................ 47

4.2.2.1

Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaOH đến quá trình tiền xử lý

bột thân chuối bằng dung dịch NaOH ........................................................... 47

4.2.2.2

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tiền xử lý bột thân chuối

bằng dung dịch NaOH .................................................................................. 49
4.2.2.3

Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tiền xử lý bột thân chuối

bằng dung dịch NaOH .................................................................................. 51
4.3. Khảo sát quá trình thủy phân và lên men đồng thời bột thân chuối đã tiền xử
lý sử dụng nấm men Kluyveromyces marxỉanus cố định trong gel alginate ...53
4.3.1 Khảo sát điều kiện cố định nấm men Kluyveromyces marxỉanus trong
gel alginate ........................................................................................................ 53
4.3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch alginate đến quá trình
cố định nấm men Kluyveromyces marxianus ............................................... 53
4.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch CaCl2 đến quá trình
cố định nấm men Kỉuyveromyces marxianus ttong gel alginate ................... 56
4.3.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme Viscozyme Cassava c đến quá trình
thủy phân và lên men đồng thời bột thân chuối đã tiền xử lý............................ 59
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 64
5.1. Kết luận ........................................................................................................ 64
5.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 66


iv
DANH MỤC HÌNH
Hình 2. 1: Mô hình cấu trúc của lignocellulose ........................................................... 2
Hình 2. 2: cấu trúc của cellulose và cellobiose ............................................................ 3

Hình 2. 3: cấu trúc vùng kết tinh và vùng vô định hình của cellulose ......................... 4
Hình 2. 4: Các monomer của hemicellulose ................................................................ 5
Hình 2. 5: Các monomer của lignin ............................................................................. ố
Hình 2. 6: cấu trúc của lignin ....................................................................................... 7
Hình 2. 7: cấu tạo cây chuối ......................................................................................... 8
Hình 2. 8: cấu trúc nguyên liệu lignocellulose trước và sau tiền xử lý ...................... 11
Hình 2. 9: Các chất ức chế sinh ra trong quá trình tiền xử lý lignocellulose bằng dung
dịch acid ..................................................................................................................... 13
Hình 2. 10: Các chất ức chế sinh ra từ lignin khi tiền xử lý lignocellulose bằng dung
dịchNaOH .................................................................................................................. 15
Hình 2. 11: Cơ chế của quá trình thủy phân cellulose với xúc tác enzyme cellulase 18
Hình 3.1: Thân chuối và bột thân chuối ..................................................................... 26
Hình 3. 2: Nấm men Kluyverromyces marxỉanus trên môi trường thạch ................... 27
Hình 3. 3: Sơ đồ nghiên cứu ....................................................................................... 30
Hình 3. 4: Quy trình tiền xử lý bột thân chuối........................................................... 31
Hình 3. 5: Quy trình thủy phân bột thân chuối đã tiền xử lý ..................................... 32
Hình 3. 6: Quy trình cố định nấm men Kluyveromyces marxianus ttong gel alignate 33
Hình 3.7: Quy trình lên men ừong thí nghiệm cố định nấm men Kluyveromyces
marxianus ttong gel alginate....................................................................................... 34
Hình 3. 8: Quy trình thủy phân và lên men đồng thời bột thân chuối đã tiền xử lý .35
Hình 4. 1: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch H2SO4 đến quá trình tiền xử lý bột thân
chuối bằng dung dịch H2SO4 ................................................................................................................................... 44
Hình 4. 2: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tiền xử lý bột thân chuối bằng dung
dịch H2SO4............................................................................................................................................................................ 46


Hình 4. 3: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaOH đến quá trình tiền xử lý bột thân
chuối bằng dung dịch NaOH ....................................................................................... 48
Hình 4. 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tiền xử lý bột thân chuối bằng dung
dịch NaOH ................................................................................................................... 50

Hình 4. 5: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tiền xử lý bột thân chuối bằng dung
dịch NaOH ................................................................................................................... 52
Hình 4. 6: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch alginate đến sự sinh trưởng của nấm
men Kluyveromyces marxianus cố định trong gel alginate ......................................... 54
Hình 4. 7: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch alginate đến sự sinh tổng hợp ethanol
của nấm men Kluyveromyces marxỉanus cố định trong gel alginate ........................... 55
Hình 4. 8: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch CaCl2 đến sự sinh trưởng của nấm men
Kluyveromyces marxianus cố định trong gel alginate ................................................. 57
Hình 4. 9: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch CaCl2 đến sự sinh tổng hợp ethanol của
nấm men Kluyveromyces marxỉanus cố định trong gel alginate ................................. 58
Hình 4. 10: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Viscozyme Cassava c đến sự sinh trưởng
của nấm men Kluveromyces marxỉanus cố định và nấm men Kluveromyces marxianus
tự do ............................................................................................................................. 60
Hình 4.11: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Viscozyme Cassava c đến sự sinh tổng
hợp ethanol của nấm men Kluyveromyces marxỉanus cố định và nấm men
Kluyveromyces marxianus tự do.................................................................................. 61


vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2. 1: Thành phần hóa học của thân chuối (% theo khối lượng chất khô) ........... 9
Bảng 2. 2: Thành phần hóa học của một số loại lignocellulose (% theo khối lượng chất
khô) ............................................................................................................................... 9
Bảng 2. 3: So sánh các điều kiện khi tiền xử lý bằng các loại kiềm khác nhau ........ 16
Bảng 3. 1: Thành phần môi trường nuôi cấy nấm men ............................................. 27
Bảng 3. 2: Danh sách các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ............................ 28
Bảng 3. 3: Danh sách thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu ............................ 28
Bảng 3. 4: Bố trí thí nghiệm tiền xử lý bột thân chuối bằng dung dịch H2SO4....................37
Bảng 3. 5: Bố trí thí nghiệm tiền xử lý bột thân chuối bằng dung dịch NaOH .......... 38
Bảng 3. 6: Bố trí thí nghiệm khảo sát điều kiện cố định nấm men Kluyveromyces

marxỉanus trong gel alginate ...................................................................................... 39
Bảng 3. 7: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme Viscozyme Cassava
c đến quá trình thủy phân và lên men đồng thời bột thân chuối đã tiền xử lý............ 40


7
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DNS: 3,5 - dinitrosalicylic acid
EDTA: ethylendiamin tetraacetic acid
FPU: filter paper unit
5 - HMF: 5 - hydroxymethyfurfural
SHF: separate hydrolysis and fermentation, quá trình thủy phân và lên men riêng biệt
SSCF: simultaneous saccharification and co-fermentation, quá trình đồng thủy phân và
đồng lên men
SSF: simultaneous saccharification and fermentation, quá trình thủy phân và lên men
đồng thời


CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
Nguồn năng lượng hóa thạch đang ngày càng cạn kiệt nên nhu cầu tìm ra nguồn
năng lượng thay thế trở thành mối quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu trên toàn
thế giới. Ethanol sinh học được xem là nguồn năng lượng sạch và có tiềm năng, giúp
giảm hiệu ứng nhà kính [1], [2], Việc nâng cao hiệu quả kỹ thuật và giảm chi phí cho
quy trình sản xuất ethanol sinh học đã được phát triển.
Lignocellulose từ phụ phẩm nông nghiệp có sản lượng rất lớn và được xem là
nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất ethanol. Do cấu trúc xơ sợi đặc biệt nên để có
thể thủy phân và lên men lignocellulose thì phải tiến hành tiền xử lý. Quá trình này giúp
nguyên liệu trở nên xốp, giảm thiểu thành phần lignin, giúp enzyme tiếp cận với
cellulose dễ dàng hơn, làm tăng hiệu quả quá trình thủy phân [3], Quá trình tiền xử lý

hóa học được ứng dụng rộng rãi để tiền xử lý lignocellulose với hiệu quả cao, rẻ tiền,
dễ thực hiện [4], [5],
Ethanol được thu nhận từ lignocellulose thông qua quá trình thủy phân, lên men.
Khi thủy phân và lên men đồng thời nguyên liệu lignocellulose thì đạt hiệu cao hơn so
với quá trình thủy phân và lên men riêng biệt [6], [7], [8]. Nhung trong quá trình này,
có những yếu tố không thuận lợi cho nấm men hoạt động như nhiệt độ, chất ức chế.
Nấm men cố định trong chất mang sẽ sinh trưởng và sinh tổng hợp ethanol tốt hơn nấm
men tự do.
Luận văn với mục đích tận dụng phụ phẩm nông nghiệp phổ biến ở Việt Nam thân chuối để thu nhận ethanol. Thân chuối sẽ được tiền xử lý bằng phương pháp hóa
học sử dụng dung dịch H2SO4 và dung dịch NaOH. Sau đó, bột thân chuối đã tiền xử
lý sẽ được thủy phân và lên men đồng thời sử dụng enzyme Viscozyme Cassava c và
nấm men Kỉuyveromyces marxianus cố định trong gel alginate.


2
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN

2.1.

Lignocellulose
Cấu tạo của lignocellulose

2.1.1.

Lignocellulose là nguồn polymer sinh học cố thành phần chất khô chủ yếu là
cellulose (38 - 50%), hemicellulose (23 - 32%), và lignin (15 - 25%) (Hình 2.1). Ngoài
ra trong lignocellulose còn có thành phần chất trích ly và tro [9]. Tuy nhiên, tỉ lệ của mễỉ
thành phần khác nhau với các nguyên liệu khác nhau [10], [11]. Lignocellulose có thể
bao gồm cảc loại gỗ, phế phẩm của ngành nông nghiệp và đã được nghiên cứu, phát triển
nhằm sản xuất nhiên liệu sinh học [12].

về cơ bản, trong lignocellulose hình thành nên bộ khung chính và được bao xung
quanh bởi những chất có chức năng tạo mạng lưới (hemicellulose) và kết dính (lỉgnỉn).
Mạch chính của hemicellulose cũng được cho là xếp song song với cảc sợi cellulose còn
các nhóm ờ mạch nhánh như arabinose, galactose của hemicellulose thường liên kết với
lignin. Lignin kết dính các chuỗi polysaccharide bằng liên kết ester [13].

2.1.1.

L Cellulose

Cellulose là chuỗi polymer mạch thẳng của D - glucose liên kết vối nhau bằng
liên kết p, 1 - 4 glycoside, khác với liên kết a, 1 - 4 glycoside trong tinh bột, liên kết p, 1
- 4 glycoside khiến cho cellulose có cấu trúc cứng chắc hơn [15]. Ba nhóm hydroxyl (OH) trong từng phân tử glucose cỗ thể hình thành cả liên kết hydro liên phân tử và nội


3
phân tử [12]. Liên kết hydro trong cellulose mạnh hon liên kết van der Waals trong nước
100 lần, nhờ đó cellulose không tan trong nước và phàn lớn các dung môi hữu cơ [16].
Cellulose gồm từng cặp glucose nối tiệp nhau, xoay 180° với nhau được gọi là
cellobiose [15] (Hình 2.2). Độ trùng hợp của cellulose ờ thực vật nằm trong khoảng từ
7000 đến 15000 DP. Hai đầu của chuỗi cellulose có sự khác biệt về hóa học, một đầu có
tính khử do có nhóm D - glucopyranose, trong đó nguyên tử carbon Cl nằm ờ dạng tự do
và một đầu không có tính khử do cỗ nhỏm D - glucopyranosyl, trong đỏ nguyên tử carbon
Cl nằm trong liên kết glycoside [15].
cnđ

Chain potynfiemacicr

Ca lobiow

Hình 2. 2: cấu trúc của cellulose và cellobiose [15]
Liên kết hydro còn giúp các chuỗi cellulose gắn chặt vào nhau, hình thành nên
vùng kết tính [9]. Một đơn vị tinh thể cellulose chứa khoảng 10 chuỗi glucan duỗi thẳng
và song song với nhau, cấu hình tinh thể của cellulose được chia làm 6 dạng: I, n, nij,
nin.IVj và IVn. Trong tự nhiên, vùng kết tinh chủ yếu là cellulose I và được chia thành 2
dạng nhỏ là I(X và Ip liên kết với nhau bằng liên kết hydro . Cellulose tần tại dưới dạng
kết tinh rất khó bị thủy phân bồi các tác nhân hỏa học và sinh học, chỉ cố những phân tử
nằm trên bề mặt vùng kết tỉnh thì mới cố thể bị tác động. Ngoài ra, cellulose trong nguyên
liệu còn nằm ở dạng vô định hình, đây là vừng mà các chuỗi cellulose sắp xếp không có
trật tự và liên kết hydro giữa các chuỗi với nhau rất lỏng lẻo, khiến cho cellulose rất dễ
bị thủy phân [9] (Hình 2.3). Vùng kết tỉnh của cellulose có thể chuyển thành vùng vô


4
định hình khi được xử lý với nước ở nhiệt độ 320°C và áp suất 25 MPa [17].
Vùng kết tfnh

Vùnipỡdĩrih hình

Hình 2. 3: cấu trúc vùng kết tinh và vùng vô định hình của cellulose [18]
2.I.I.2.

Hemicellulose

Hemicellulose là polymer sinh học phân nhánh có thành phần rất đa dạng, bao
gồm pentoses (p - D - xylose, a - L - arabinose), hexoses (p - D - mannose, p - D - glucose,
a - D - galactose) và acid uronic (a - D - glucuronic, a - D - o - methylgalacturonỉc and a
- D - galacturonỉc acids) [19] (Hình 2.4). Trong đó xylan (chuỗi xylose) là thành phần
chính của hemicellulose đối với gỗ cứng (sồi, liễu, thích,...) và phế phẩm nông nghiệp
(rơm, rạ, thân chuối,...), còn đối với gỗ mềm (thông, vân sam,...) thì thành phần chủ yếu

là glucomannan (chuỗi glucomannose). Hàm lượng xylose trong mô của các loại cỏ và
ngũ cốc cỗ thể chiếm tới 50%. Độ trùng hợp của hemicellulose nằm trong khoảng từ 70
đến 200 tùy vào loại gỗ [9].


5
H

H

1H

OH

D-xylose

OH

D-gailactose

D-mannose

It

H

H

OH

L-arabinose

OH

D-gulcuronic acid

Hình 2.4: Các monomer của hemicellulose [20]
Hemicellulose dễ tan hơn cellulose và cố the được tách ra khỏi gỗ bằng phương
pháp chiết. Tuy nhiên nếu dịch chiết là kiềm có thể khử hoàn toàn nhóm acetyl trong
hemicellulose [21]. Xylan có thể xem là phần dễ bị chiết ra nhất của hemicellulose bởi
acỉd hoặc kiềm. Tuy nhiên, glucomannan gần như không bị chiết trong môi trường acỉd
mà cần môi trường kiềm mạnh hơn để có thể chiết ra [22], [23].
Hemicellulose đóng vai trò như là chất kết nổi cellulose và lignin, giúp cho mạng
lưới cellulose - hemicellulose - lignin trở nên chắc chắn hơn [24]. Trong quá trình tiền
xử lý bằng hóa chất và nhiệt độ, các nhỏm ờ mạch nhảnh của hemicellulose sẽ phản ứng
trước, rồi sau đó mới tới mạch chính [25].
2.I.I.3.

Lignin

Lignin là một polymer phức tạp có phân nhánh, monolỉgnol (monomer của lignin)
là những hợp chất có vòng thơm, phổ biến nhất là syringyl (S), guaiacyl (G) và p hydroxyphenyl (H) lần lượt có nguồn gốc từ sinapyl, coniferyl và p - coumaryl alcohol
liên kết với nhau bằng nhiều loại liên kết (Hình 2.5). Tuổi của cây, điều kiện trồng trọt
và stress cũng làm ảnh hưởng đến hàm lượng của các loại monolignol. Lignin trong gỗ
mềm thường chứa G nhiều, còn trong gỗ cứng và phế phẩm nông nghiệp như thân chuối
thì thành phần s lại chiếm đa số [26]. Một yếu tổ khác cần được xem xét là sự tồn tại của
các phức hợp lignin carbohydrate (LCCs) -


6

lignin liên kết với carbohydrate bằng liên kết ester, ether hoặc ketal. LCCs cản làm giảm
hiệu quả quá trình thủy phân do cản trở sự tiếp xúc của enzyme và carbohydrate. Vì vậy,
nguyên liệu cần phải được tiền xử lý để tăng bề mặt tiếp xúc và loại bỏ lỉgnin [26]. Ngoài
ra, do đơn phân của lignin không phải là đường nên sẽ không thể chuyển hoá thành
đường. Vì thế, trong quá trình sản xuất ethanol, lignin
cần được loại bỏ hoặc tách ra để sử dụng với các mục đích khác [27].

sinapỵl alcohol

coiiiĩcrvl alcohol

p-coumaryl alcohol
(H)

Hình 2.5: Các monomer của lignin [28]
Lignin giữ vai trò như chất keo liên kết giữa hemicellulose và cellulose, giúp củng
cố độ bền cho vùng kết tinh của cellulose, giúp cho thực vật phát triển chiều cao dễ dàng
[29], [26], [30]. Hàm lượng lignin thay đổi theo từng loại thực vật, trong các loại cỏ và
phế phẩm nông nghiệp, hàm lượng lỉgnỉn chiếm khoảng từ 10 đến 20% [26] . Sự phân
hủy sinh học của ỉỉgnin chỉ xảy ra dưới nồng độ nitrogen thấp do đó lignin không thề bị
phân hủy dưới những điều kiện bình thường của quá trình lên men ethanol. Lỉgnỉn, cũng
như hemicellulose, hòa tan vào nước ở nhiệt độ 180°C, pH trang hòa [31]. Tuy nhiên,
nhiều nghiên cứu cho thấy, chuỗi lignin bị phân cắt mạnh trong môi trường kiềm do sự
tấn công của ion OH“ vào liên kết p - 0-4 aryl ether - đây là liên kết chính trong mạng
lưới ba chiều của lignin [29], [26] (Hình 2.6).


7

ỘH

Hình 2.6: cấu trúc của lignin [32]
2.I.I.4.

Chất trích ly và tro

Chất trích lỵ và tro chiếm phần rất nhỏ trong lignocellulose. Hàm lượng của chúng
phụ thuộc rất nhiều vào loài cũng như từng bộ phận khác nhau của cây. Ngoài ra, dinh
dưỡng, thổ nhưỡng, thời tiết... cũng có ảnh hưởng; đặc biệt đối với hàm lượng Na, K, Cl,
p của cây nông nghiệp [29],[33]. Những chát này được chia làm hai loại: các chất trích
ly được trong dung mồi và các chất không trích ly được Ưong dung môi. Những chất
trích ly quan trọng nhất là nhựa (chất béo, acỉd béo và phytosterol), terpene (isoprene
alcohol, ketone) và phenol. Phương pháp để tách các chất này trong quá trình phân tích
thành phần xơ sợi là sử dụng hệ dung môi ethanol/toluene (1:2 (v:v)) trong 8 giờ [34].
Các chất không trích ly bao gồm pectin, protein, các chất vô cơ như Sỉ, Ca, Mg,... Các
chất vô cơ thường được xác định ữong hàm lượng tro của nguyên liệu sau khỉ nung. Do
có hàm lượng thấp nên chất trích ly và không trích ly thường không có ảnh hưởng lớn
đến độ bền chắc của lignocellulose [35].
2.1.2.

Nguyên liệu giàu lignocellulose - thân chuối


8
2.1.2.1,

Đặc điềm tự nhiên

Chuối (Musa acuminata) là loại cây ăn trải quan trọng, được trồng rộng rãi ở các
nước nhiệt đới và cận nhiệt đới [36].

Chuối là một trong những loài thân thảo lớn nhất [37]. Cây chuối cao từ 2 - 7 m,
chuối là loại cây có thân ngầm, gọi là củ chuối (com). Thân trên mặt đất chỉ là thân gỉả
do các bẹ lá cấu tạo thành [36]. Hoa chuối mọc ra từ thân chuối gồm hoa cái ở trên
(khoảng 5-15 hàng) và hoa đực ở dưới (bắp chuối). Những bông hoa cái sẽ phát triển
thành quả chuối với thịt màu trắng hoặc màu vàng [38]. Mỗi thân giả có thể ra 1 buồng
chuối. Trước khỉ chết, thân giả sẽ được thay thế bằng thân giả non [36] (Hình 2.7). Chu
kỳ này có thể tiếp tục trong vài thế hệ.

Hình 2.7: cáu tạo cây chuối [39]
2.I.2.2.

Thành phần hóa học của thân chuối

Thân chuối là lignocellulose do có hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin
khá cao (trên 65% khối lượng khô). Thành phần hóa học của các chất trong thân chuối
có thể thay đổi tùy vào giống chuối, tuổi, điều kiện sinh trưởng (Bảng 2.1).
Bảng 2. 1: Thành phần hóa học của thân chuối (% theo khối lượng chất khô)


9
[34], [40], [41], [42], [43]

Corderio

34,50

25,60

12,00

4,60

32,36 ±0,14
44,00 ± 20,00

14,6 ± 0,68
-

18,36 ± 0,09
8,07 ±2,11

-

Oliveừa

37,30

-

13,30

-

Gabhane

44,32

22,00

9,66

Zhang
Gonẹalves Filho

-

—

So sánh với các lignocellulose khác, hàm lượng cellulose trong thân chuối thường
không cao bằng một số loại gỗ như gỗ thông (46,40%) tuy nhiên hàm lượng lignin thấp
hơn, thường dưới 15% (ngoại trừ trong nghiên cứu của Zhang et al. (2013) là trên 18%)
trong khi gỗ thông có hàm lượng lignin là 29,40% [40], Hàm lượng lignin thấp giúp cho
quá trình tiền xử lý sẽ dễ dàng hơn, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân và
lên men. Thành phần hóa học của thân chuối tương đương với các loại phế phẩm nông
nghiệp khác như rơm lúa mì, thân ngô, lõi ngô, lục bình, cỏ kê Mỹ với hàm lượng
cellulose khoảng dưới 40% và lignin 13 - 20%, nên có thể xếp thân chuối vào nhóm
lignocellulose dạng cỏ và phế phẩm nông nghiệp (Bảng 2.2).
Bảng 2. 2: Thành phần hóa học của một số loại lignocellulose (% theo khối
Nguyên liệu

lượng chất khô) [11], [44], [45]
Cellulose
Hemicellulose

Lignin

Thân ngô

37,50

22,40

17,60

Gỗ thông

46,40

8,80

29,40

Rơm lúa mì

38,20

21,20

23,40

Cỏ kê Mỹ

31,00

20,40

17,60

Lõi ngô

40,50

27,80

Lục bình

35,84

19,42

2.I.2.3.

7,00
13,27

Hiện trạng sử dụng và tiềm năng của thân chuối

Chuối là loại cây ăn quả thu hoạch một lần, có nghĩa là sau khi trái đã đạt độ chín
và được thu hoạch thì toàn bộ thân giả của cây chuối sẽ bị chặt để cho cây non phát triển,
chu kỳ này sẽ tiếp tục qua vài thế hệ của cây cho đến khi năng suất cho trái của cây suy
giảm nhiều. Do đó, quá trình này tạo ra rất nhiều phụ phẩm như thân chuối (thân giả), lá,


10
hoa, vỏ chuối,... Thân chuối là phế phẩm chính, hằng năm trung bình một hecta hồng
chuối sẽ tạo ra 100 tấn thân chuối [36]. Thông thường, thân chuối sẽ được để tự phân hủy
trên mặt đất nhằm cung cấp chất dinh dưỡng cho đất. Tuy nhiên, cách giải quyết này gây
ra sự thất thoát một nguồn nguyên liệu lớn, tạo ra lượng lớn khí co2, mùi hôi khó chịu,
gây các vấn đề nghiêm họng về môi trường. Ngoài ra, việc để thân chuối tự phân hủy
trên mặt đất còn tạo điều kiện cho loài nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FOC)

gây ra bệnh Panama trên cây chuối, một trong những nguyên nhân gây hại trầm trọng lên
quá trình trồng trọt và thu hoạch chuối [36], [46]. Do đó, việc sử dụng nguồn nguyên liệu
này một cách thích hợp để giải quyết các vấn đề liên quan đến sinh thái, môi trường và
kinh tế là hết sức cần thiết [40],
Trên thế giới, thân chuối được sử dụng vào rất nhiều mục đích như sản xuất giấy,
sợi công nghiệp, biogas, thức ăn chăn nuôi [47], [48], [36]. Đã có một số nghiên cứu sử
dụng thân chuối có ứng dụng trong công nghệ hóa học và thực phẩm như: sản xuất
enzyme cellulase và sản xuất acid lactic và sản xuất ethanol [49], [50], [51]. Ethanol sinh
học đã được các quốc gia trên thế giới quan tâm và nghiên cứu. Thay vì sử dụng những
nguồn nguyên liệu đắt tiền đi từ tinh bột bắp hay mía để sản xuất ethanol thì
lignocellulose là một sự lựa chọn thích hợp để thay thế vì đây là nguyên liệu không gây
ảnh hưởng lớn lên chuỗi cung cấp thực phẩm cho con người [21], Snehal Ingale et al.
(2014) nghiên cứu sử dụng thân chuối như là nguồn cơ chất cho nấm men Saccharomyces
cerevisiae NCIM 3570 dạng tự do lên men sinh ethanol bằng phương pháp thủy phân,
lên men riêng biệt. Ket quả cho thấy sau 72 giờ, nồng độ ethanol cao nhất là 17,10 g/L,
hiệu suất 84%, như vậy thân chuối hoàn toàn có thể trở thành một nguyên liệu rẻ tiền để
sản xuất ethanol đem lại hiệu quả kinh tế [51],
Riêng ở Việt Nam, theo Lê Bền (2015), diện tích trồng chuối khoảng 150 nghìn
ha, chiếm tới gần 20% tổng diện tích cây ăn trái, sản lượng hàng năm lên tới 1,4 triệu
tấn. Ở nước ta, thân chuối chủ yếu được sử dụng làm thức ăn cho gia súc. Chưa có nghiên
cứu cũng như ứng dụng thực tiễn về việc sử dụng thân chuối như là một nguồn
lignocellulose đề sản xuất ethanol. Do đỗ, một quốc gia nông nghiệp như Việt Nam với
sản lượng phụ phẩm từ nông nghiệp rất lớn, cụ thể ở đây là thân chuối, hoàn toàn có thể
tận dụng nguồn nguyên liệu lignocellulose này để sản xuất ethanol, giúp nâng cao giả trị
sử dụng cùa cây chuối.