Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dung dịch đệm và nồng độ sudan B đối với phản ứng nhuộm lipid bạch cầu người

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA pH DUNG DỊCH ĐỆM
VÀ NỒNG ĐỘ SUDAN B ĐỐI VỚI PHẢN ỨNG
NHUỘM LIPID BẠCH CẦU NGƢỜI
Trần Văn Tính*
TÓM TẮT
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình nhuộm màu lipid bạch cầu người bằng sudan B. Quy hoạch
hóa thực nghiệm theo mô hình mặt hai nhân tố: pH (X 1) và nồng độ sudan B (X2); hàm mục tiêu
là điểm nhuộm lipid (Y) bằng phần mềm Modde 5.0. Phương trình hồi quy thu được: Y = 362,7
2
2
+ 5,2 x X1 -10.5 x X2 - 26,3 x X1 (R = 0,985 với p > 0,95) và điều kiện nhuộm tối ưu: Nồng độ
sudan B là 0,20% pha trong dung dịch đệm với pH = 7,42. Hiệu suất nhuộm tốt nhất trong điều
kiện tối ưu tìm được 95,10 ± 1,0% (p = 0,95).
* Từ khóa: Nhuộm hóa học tế bào; Nhuộm sudan B; Nhuộm lipid.

EFFECT OF pH AND B SUDAN SOLUTION ON
LIPID STRAINING OF HUMAN LEUKOCYTE
SUMMARY

60


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014
A research was conducted on the optimal conditions for the lipid of human leukocyte with sudan
B solution. Experiments were designed by response surface modeling with two factors: pH (X 1)
and sudan B concentrate (X2) to target lipid score function; Regression equation presents dependence
2
of lipid score on two factors quoted above as: Y = 362.7 + 5.2 x X1 -10.5 x X2 - 26.3 x X12 (R = 0.985
with p > 0.95) and the optimal conditions of the lipid staining as: pH = 7.42, sudan B 0,20%.

The best efficiency of the lipid staining in the above optimal conditions is found to be 95.10 ± 1.0%
(p = 0.95).
* Key words: Cytochemistry; Sudan B staining; Lipid staining.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Lipid có trong tế bào bạch cầu người là
este của axít béo với ancol. Xác định các
lipid này bằng phản ứng màu với nhiều
loại phẩm màu: dầu đỏ, scharlach R,
rodamin B, nile blue, sudan... Cơ chế của

phản ứng màu rất khác nhau, bao gồm
khuếch tán vật lý đơn thuần hoặc liên
kết hóa học trực tiếp. Trong các loại
thuốc nhuộm, sudan là một nhóm phẩm
nhuộm được ưa chuộng để nhuộm lipid
từ vàng (sudan III) đến đen (sudan B) [3].

* Bệnh viện 19-8
Người phản hồi (Corresponding): Trần Văn Tính ()
Ngày nhận bài: 17/06/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 28/07/2014
Ngày bài báo được đăng: 11/08/2014

Đối với máu ngoại vi, phản ứng nhuộm
sudan B cho kết quả bạch cầu hạt dương
tính mạnh, monoxit dương tính yếu,
lymphoxit và hồng cầu âm tính. Trong tủy
xương bình thường, các tế bào dòng tủy
dương tính từ tiền tủy bào đến tế bào
trưởng thành, dòng monoxit chỉ dương

tính ở tế bào trưởng thành; mẫu tiểu cầu
và tiểu cầu dương tính ở các giai đoạn.
Trong nhiều trường hợp mắc bệnh bạch
cầu cấp, có thể phân biệt tương đối rõ
dòng tủy và những dòng tế bào khác bằng
kết quả nhuộm sudan B. Kết quả dương
tính sudan B của mẫu bệnh phẩm thường
cho kết quả dương tính với kỹ thuật nhuộm
peroxydase. Chính vì vậy, kết quả nhuộm
sudan B là một trong những tiêu chuẩn
được ứng dụng để phân loại thể bệnh

61

trong bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn
FAB [2].
Chayen (1968) cho rằng, mức độ bắt
màu chọn lọc của các thuốc nhuộm đối
với lipid phụ thuộc rất nhiều vào bản chất
lipid và đặc tính của thuốc nhuộm, thuốc
điều trị, hormon và điều kiện tiến hành
nhuộm [3]. Phản ứng nhuộm sudan B nói
riêng và nhuộm lipid nói chung có thể cho
kết quả tương đối khác nhau trong từng
điều kiện cụ thể. Vì vậy, việc nghiên cứu
tìm ra điều kiện tối ưu để tiến hành phản
ứng, nhằm đảm bảo tính ổn định về mặt
kỹ thuật, nâng cao chất lượng nhuộm và
giảm chi phí là vấn đề có ý nghĩa khoa học
và thực tiễn cần thiết. Mục tiêu của công

trình này: Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình
nhuộm lipid tế bào bạch cầu người bằng


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014

phẩm màu sudan B dùng trong xét nghiệm
để phân loại dòng tế bào ung thư máu.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tƣợng, dụng cụ và hóa chất
nghiên cứu.
* Đối tượng nghiên cứu: bạch cầu lấy
từ máu của người khoẻ mạnh có chứa
lipid. Máu sau khi lấy từ tĩnh mạch, tiến
hành dàn 14 tiêu bản không qua chống
đông, để khô trong điều kiện tự nhiên và
cố định ngay.
* Dụng cụ: máy ủ nhiệt CW-20G 0 - 500C,
độ chính xác ± 0,10C, máy đo pH inoLab
730 với độ chính xác đến 10-3, cân phân
tích Sartorius TE214S có độ chính xác 10-4,
kính hiển vi Nikon với độ phóng đại 1.000
lần, pipet tự động của Hãng Thermo kèm
đầu côn 0,2, 1,0 và 10 ml của Hãng Gilson.
* Hóa chất: sudan B (Hãng SigmaAldrich); phenol (Hãng Sigma-Aldrich);
axít citric 99,5% (Hãng Sigma-Aldrich);
formaldehyd 37% ACS 99,5% (Hãng
Sigma-Aldrich); ethanol 96% (Hãng
Sigma-Aldrich); aceton ACS 99,5% (Hãng

Sigma-Aldrich); Na2HPO4 (Hãng SigmaAldrich); Giemsa (Hãng Sigma-Aldrich).
- Pha chế thuốc thử:
+ Dung dịch cố định tiêu bản:
++ Dung dịch citrat: 25 ml (lấy từ dung
dịch 18 mmol axÝt citric + 9 mmol natri citrat
và 12 mmol NaCl trong 1 lít).

Na2HPO4 0,3% điều chỉnh pH bằng HCl
0,1 M.
+ Dung dịch nhuộm sudan pha theo
bảng 1 trong ethanol 96% và đệm phenolphosphat ở trên theo tỷ lệ 6:4.
+ Dung dịch nhuộm nhân: Giemsa.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Thiết kế thực nghiệm:
Thí nghiệm được thiết kế theo mô hình
khảo sát mặt mục tiêu (Response Surface
Modeling - RSM) cụ thể: tổ hợp mặt tâm
(The Central Composite Face - CCF) 2
nhân tố trên phần mềm MOD5. Mỗi nhân
tố gồm 3 mức: ở tâm (d = 0), ở đỉnh (1)
và ở mặt (d). Mô hình gồm 11 thí nghiệm:
4 thí nghiệm ở đỉnh, 4 thí nghiệm điểm
sao nằm ở mặt không gian mỗi nhân tố
và 3 thí nghiệm lặp ở tâm. Thiết kế quy
hoạch hóa thực nghiệm gồm 2 biến là pH
dung dịch đệm (X1) và nồng độ sudan B
theo g/100 ml (X2). Ảnh hưởng của hai
nhân tố này lên hàm mục tiêu (Y) là điểm
nhuộm tuân theo phương trình:
2

2

Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b1(X1) + b2(X2) + b12X1X2

Các điều kiện mã hóa để nhập dữ liệu
vào chương trình phần mềm (bảng 1):
Bảng 1: Ký hiệu và mức mã hóa thực
nghiệm.

-1

0

1

pH dung dịch đệm

X1

7,2

7,4

7,6

Sudan B (%)

X2

0,2

0,3

0,4

++ Acetone 99,5%: 65 ml.
++ Focmaldehyd 37%: 8 ml.
+ Dung dịch đệm phenol-phosphat với
pH được pha theo bảng 1: phenol 16% và

62

* Kỹ thuật tiến hành nhuộm:


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014

- Cố định tiêu bản trong dung dịch cố
định tiêu bản ở trên với thời gian 30 giây.
Sau đó, gói và đưa các tiêu bản vào hộp
chống ẩm bảo quản ở nhiệt độ 4 - 80C
(thời gian bảo quản có thể kéo dài 2 tháng
[8]).
- Nhúng tiêu bản vào dung dịch nhuộm
sudan ở trên với nồng độ và pH khác nhau
theo quy hoạch thực nghiệm ở bảng 1 trong
30 phút. Sau đó, rửa tiêu bản dưới vòi
nước 5 phút, để khô.
- Nhuộm nền bằng dung dịch Giemsa

10% trong 15 phút và để khô.
- Đọc tiêu bản dưới vật kính dầu với độ
phóng đại 1.000 lần.

Đánh giá bạch cầu trung tính dương tính
thành 5 mức độ:
Độ 0: không có hạt bắt màu đen.
Độ 1: ít hạt trên nguyên sinh chất, hạt
mịn nhỏ, không có hạt trên nhân tế bào.
Độ 2: nhiều hạt to trên nguyên sinh chất,
không có hạt trên nhân tế bào.
Độ 3: nhiều hạt to trên toàn bộ tế bào,
nền xấu.
Độ 4: nhiều hạt to trên toàn bộ tế bào,
nền đẹp.
Công thức tính điểm nhuộm: ∑Y (điểm) =
Y0 x 0 + Y1 x 1 + Y2 x 2 + Y3 x 3 + Y4 x 4.
Như vậy, phản ứng nhuộm sẽ đạt tối
ưu khi toàn bộ tế bào bạch cầu trung tính
dương tính ở độ 4, tổng điểm tối đa 400
và hiệu suất đạt 100%.

Các vùng có chứa lipid trong nguyên
sinh chất bạch cầu sẽ xuất hiện hạt bắt
màu đen. Đối với dòng tủy tế bào càng
trưởng thành, mức độ dương tính càng
mạnh. Đối với dòng lympho bình thường
âm tính.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Bảng 2: Kết quả thực nghiệm nhuộm sudan theo theo mô hình khảo sát mặt mục tiêu.

63

X1

X2

X1

X2

8

-1

-1

7.2

0.2

342

1

1

-1

7.6

0.2

355

2

-1

1

7.2

0.4

322

7

1

1

7.6

0.4

335

6

-1

0

7.2

0.3

335

11

1

0

7.6

0.3

340

10

0

-1

7.4

0.2

378

9

0

1

7.4

0.4

355

3

0

0

7.4

0.3

360

4

0

0

7.4

0.3

362

5

0

0

7.4

0.3

364


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014

Nhập kết quả vào phần mềm Modde 5.0 qua xử lý, được phương trình hồi quy:
Y = 362,7 + 5,2 x X1 -10.5 x X2 - 26,3 x X12 + 2,7 x X22 -5.53x10-6 x X1 x X2.
* Độ tin cậy thống kê của các biến số:

Bảng 3: Hệ số và độ tin cậy thống kê của các hệ số.
±

p

Constant

362,737

1,45222

1,95E-11

3,73306

X1

5,16673

1,15571

0,006576

2,97085

X2

-10,5

1,15571

0,00027

2,97085

X1*X1

-26,3421

1,7786

2,54E-05

4,57205

X2*X2

2,65793

1,7786

0,195304

4,57205

X1*X2

-3,15E-05

1,41545

1

3,63854

N = 11

2

Q =

0,878

Cond. no. =

3,0822

DF = 5

2

0,985

Y-miss =

0

R Adj. =

0,97

RSD =

2,8309

Conf. lev. =

0,95

R =
2

Như vậy, loại bỏ hệ số X22 và X1 x X2 phương trình hồi quy là: Y = 362,7 + 5,2 x X 1 10,5 x X2 - 26,3 x X12. Phân tích Anova cho thấy phương trình mô tả tương đối tốt kết
quả thực nghiệm (hệ số tương quan R2 = 0,985 (p > 0,95)).
Chạy chương trình tối ưu thu được điều kiện tối ưu với pH = 7,419 và nồng độ sudan
là 0,20 g%, khi đó dự đoán điểm nhuộm đạt 376,1. Kết quả tối ưu hóa được trình bày ở
bảng 4 và hình 1, hình 2.

64


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014

Bảng 4: Tối ưu hóa theo phương trình
hồi quy.

7,4431

0,2

375,782

127

-0,564

7,4203

0,2

376,142

24

-0,687

7,4431

0,2

375,782

127

-0,564

7,4192

0,2

376,142

24

-0,687

7,4445

0,2

375,736

114

-0,55

7,4189

0,2

376,14

24

-0,686

7,4445

0,2

375,736

114

-0,55

7,4445

0,2

375,736

114

-0,55

Hình 1: Sơ đồ đường đồng mức mặt tối ưu.

Hình 3: Hình ảnh nhuộm lipid bạch cầu ở
điều kiện tối ưu với sudan B.
Hình 2: Mặt tối ưu thực nghiệm.
Để khẳng định điều kiện tối ưu thu được
ở trên sẽ cho hiệu suất nhuộm cao nhất,
đã tiến hành nhuộm 3 thí nghiệm.
Bảng 5: Kết quả thí nghiệm lặp lại ở
điều kiện tối ưu.
S è
® iÓ m
n g h iÖ m

H iÖ u
(

1

382

95.5%

2

380

95.0%

3

379

94.8%

Trung bình

380,3

95,10%

Sau khi xử lý dữ liệu bằng chương trình
thống kê SPSS 18, thu được khoảng giới
hạn hiệu suất nhuộm trung bình khá cao:

95,10% ± 1,0 (p = 0,95).

65

BÀN LUẬN
- Về pH dung dịch đệm:
pH của dung dịch nhuộm có vai trò
quan trọng trong phản ứng nhuộm, quyết
định tốc độ khuếch tán và giữ nguyên hình
thái của tế bào cũng như lipid ở trạng thái
tự nhiên. Để phản ứng xảy ra tốt nhất,
dung dịch sudan B được pha chế trong
môi trường có độ pH trung tính hoặc
kiềm nhẹ, phenol có trong dung dịch đóng
vai trò như chất cố định màu [4]. Kết quả
thu được của nghiên cứu (pH = 7,42)
tương đương với công bố của Hayhoe,
Sheehan và Storey (pH = 7,4) [1, 3, 4].
- Nồng độ của sudan B:
Nồng độ sudan B quyết định khả năng
khuếch tán từ dung môi vào tổ chức mỡ.
Sudan B nhuộm màu lipid theo 2 cơ chế:
khuếch tán vật lý đơn thuần và liên kết
hóa học. 2 nhóm amino của sudan B phản


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014

ứng với các nhóm axít của lipid. Nồng độ
sudan B (0,20 g%) tối ưu thu được nhỏ

hơn 18,9 lần so với kết quả của Hayhoe
[1, 3, 4].
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu thực nghiệm theo mô
hình khảo sát mặt mục tiêu 2 biến số, đã
tìm được điều kiện tối ưu của phản ứng
nhuộm sudan B: pH dung dịch đệm nhuộm
bằng 7,419 và nồng độ sudan B là 0,2%.
Quy trình tìm được đạt hiệu suất nhuộm
95,10% ± 1,0 (p = 0,95), tạo điều kiện để
có thể triển khai rộng kỹ thuật này trong
phòng xét nghiệm huyết học ở Việt Nam
với giá thành thấp.

66

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Viện Huyết học-Truyền máu. Kỹ thuật xét
nghiệm Huyết học-Truyền máu. NXB Y học. Hà
Nội. 1984.
2. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, et al.
Proposals for the classification of the acute
leukaemias, French-American-British (FAB)
co-operative group. J. Haematol. 1976, 33 (4),
pp.451-458.
3. F.G.J. Hayhoe & D. Quaglino. Haematological
cytochemistry, Churchill Livingstone, London.
1994.
4. Sir John V. Dacie; S.M Lewis. Practical
Haematology. Longman Group Ltd, Hong Kong.

1994.